CN113125422A - 化学发光水凝胶微珠的制备方法、制得的水凝胶微珠及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种化学发光水凝胶微珠的制备方法,涉及发光材料和化学发光分析技术领域,本发明包括以下步骤:(1)将壳聚糖溶解在醋酸溶液中;(2)将化学发光催化剂、化学发光试剂、金纳米溶胶与步骤(1)的壳聚糖凝胶溶液混合;得到水凝胶微珠前驱体凝胶溶液;(3)将水凝胶微珠前驱体凝胶溶液注入强碱溶液中,形成水凝胶微珠,冲洗后,干燥,即获得化学发光水凝胶微珠。本发明还提供上述方法制得的化学发光水凝胶微珠及应用。本发明的优点为:化学发光水凝胶微珠表面含金纳米,可通过化学发光水凝胶微珠上的金纳米直接固载抗体,制备化学发光免疫分析探针。制备方法简单、快捷、结合效果好,无需繁琐的多步交联反应。
Description
技术领域
本发明涉及发光材料和化学发光分析技术领域,具体涉及一种化学发光水凝胶微珠的制备方法、制得的水凝胶微珠及其应用。
背景技术
化学发光,是体系中的一些分子从化学反应中获得能量,被激发至激发态,激发态分子弛豫至基态时以光辐射形式释放能量,产生化学发光。化学发光与抗体-抗原免疫反应结合,可构建化学发光免疫分析技术。化学发光免疫分析技术具有简便、快捷、灵敏、检测范围宽、低成本等优点。化学发光免疫分析技术发展迅猛,其已取代放射性免疫分析技术,在临床检测领域占重要地位。商业化化学发光免疫分析检测仪器主要包括两类,一类是基于96微孔板的化学发光免疫分析仪,另一类是基于磁珠分离技术的微粒子化学发光免疫分析仪。上述两种传统的商业化化学发光分析方法,都是基于化学发光动力学曲线的逐孔检测或逐批检测模式,单次只能检测单一目标物,无法满足日益增长的多种疾病标志物同时智能化检测需求。化学发光成像分析技术具有灵敏、直观、可视,可实现高通量同时检测等优点,是当今世界科技研究的前沿热点。制备可产生高强度化学发光信号的发光材料,是实现化学发光成像分析的关键。
水凝胶是由大量亲水性基团或结构域的交联聚合物网络组成的,这些聚合物网络间形成化学或物理键而无法溶解,但对水有很高的亲和力。水渗透进入这些聚合物网络后导致膨胀,形成水凝胶。水凝胶表面和液体之间的低界面张力大大减少了其对蛋白质的吸附和对细胞的粘附,从而减少免疫反应中的非特异性吸附,提高免疫分析的选择性和抗干扰能力。壳聚糖是一种无毒、稳定、可降解、能除菌的天然多糖,是合成水凝胶的重要材料。壳聚糖水凝胶具有多种不同的几何形状和配方,包括液体凝胶、粉末、微珠、薄膜、片剂、胶囊、海绵和纺织纤维等。如公开号为CN 106833618A的专利公开了“双功能化水凝胶聚合物复合材料、其制备方法和用途”。该专利所公开的双功能化水凝胶聚合物复合材料具有高强度且长时间的持续化学发光性能。但是,所制备的双功能化水凝胶聚合物只能产生蓝色的化学发光信号。此外,所制备的双功能化水凝胶聚合物为无定型液体凝胶材料。液体凝胶材料,形貌不固定,放置过程中,水分会析出,发生分层现象。随着水分含量的变化,产生干燥收缩等不稳定性问题。此外,所制备的双功能化水凝胶聚合物材料表面缺少固载蛋白的基团,故难以直接固载抗体,不利于进一步的化学发光免疫分析应用。水凝胶微珠是将水凝胶形成珠状,然后干燥后制备而得。水凝胶微珠具有较高的稳定性和单分散性,且无需复杂的离心或磁分离,便可直接将其与基质分离,利于构建阵列型检测技术。
因此,探索高强度、稳定、多色化学发光水凝胶微珠复合材料的制备方法及其在化学发光免疫分析中的应用具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于现有技术中的双功能化水凝胶聚合物发光颜色单一、不稳定,且聚合物材料难以直接固载抗体,不利于进一步的化学发光免疫分析应用,提供一种化学发光水凝胶微珠的制备方法、制得的水凝胶微珠及其应用。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题:
一种化学发光水凝胶微珠的制备方法,包括以下步骤:
(1)将壳聚糖溶解在醋酸溶液中,形成壳聚糖凝胶溶液;
(2)将化学发光催化剂、化学发光试剂、金纳米溶胶与步骤(1)的壳聚糖凝胶溶液混合;得到水凝胶微珠前驱体凝胶溶液;
(3)将水凝胶微珠前驱体凝胶溶液注入强碱溶液中,形成水凝胶微珠,冲洗后,干燥,即获得化学发光水凝胶微珠。
上述步骤中,化学发光催化剂、化学发光试剂和金纳米溶胶的加入顺序可调换。
有益效果:本发明制得的化学发光水凝胶微珠具有蓝色化学发光特性,从化学发光成像图片中,可以观察到蓝色圆形发光信号,还具有荧光特性,在紫外光激发下,可产生荧光信号。所产生的化学发光和荧光信号目视可见,且可被智能手机拍摄检测。
本发明制得的化学发光水凝胶微珠为微珠形貌,可在4℃冰箱避光保存2个月以上。所制备多色化学发光水凝胶微珠具有良好的稳定性、易存储和易分离特征。其发光稳定性、形貌稳定性、存储性能与分离性能均优于现有技术CN 106833618 A。
本发明所制备化学发光水凝胶微珠表面含金纳米,可通过化学发光水凝胶微珠上的金纳米直接固载抗体,制备化学发光免疫分析探针。所制备化学发光水凝胶微珠表面的金纳米在强碱溶液中保持稳定,具有显著提升的耐碱性。该化学发光免疫分析探针制备方法简单、快捷、结合效果好,无需繁琐的多步交联反应。
本发明制备方法具有简单、高效、无需特殊条件等优点。
优选地,将化学发光催化剂加入步骤(1)的壳聚糖凝胶溶液中,搅拌,形成复合物A;将化学发光试剂加入复合物A中,搅拌,形成复合物B;最后将金纳米溶胶与复合物B混合,得到水凝胶微珠前驱体凝胶溶液。
有益效果:试剂加入顺序为先加入化学发光催化剂,再加入化学发光试剂,最后加入金纳米溶胶,可最大限度保证金纳米的稳定,同时具有良好的发光性能。
优选地,将制得的化学发光水凝胶微珠与氧化剂混合,所述氧化剂包括但不限于过氧化氢、高锰酸钾、高碘酸钾、过硫酸钾、铁氰化钾、氧气。
有益效果:化学发光水凝胶微珠在与一些氧化试剂共存时,可产生很强的化学发光。
优选地,所述步骤(2)中加入荧光染料试剂。
优选地,所述荧光染料试剂包括荧光素、4,5-二溴荧光素、曙红Y、吖啶黄素、罗丹明、荧光桃红B中的一种或两种。
有益效果:加入荧光染料试剂可制备多色化学发光水凝胶微珠,如加入荧光素后制备绿色化学发光水凝胶微珠,加入罗丹明B后制备紫色化学发光水凝胶微珠,加入荧光素和曙红Y制备黄色化学发光水凝胶微珠。其他颜色包括红色、橙色、粉色等。
优选地,所述步骤(1)中壳聚糖与醋酸溶液的质量体积比为0.4g:10mL,所述醋酸溶液的体积浓度为2%(V/V)。
优选地,所述化学发光催化剂包括但不限于氯化钴、硫酸钴、氯化铜、硫酸铜、钴基金属有机框架结构材料。
优选地,所述化学发光试剂包括但不限于括鲁米诺、光泽精、过氧化草酸酯、吖啶酯。
优选地,所述化学发光试剂为鲁米诺,所述化学发光催化剂为氯化钴或硫酸钴。
有益效果:本发明首次采用鲁米诺、荧光素、钴离子和金纳米修饰壳聚糖水凝胶,制备化学发光水凝胶微珠。鲁米诺、荧光素、钴离子和金纳米通过吸附、包埋和配位作用,连接在所述水凝胶微珠内部及表面。
优选地,所述化学发光催化剂和化学发光试剂的摩尔比为2.5:1。
优选地,所述荧光染料试剂为荧光素。
鲁米诺、荧光素、钴离子和金纳米通过吸附、包埋和配位作用,连接在所述水凝胶微珠内部及表面。
优选地,所述鲁米诺的摩尔浓度为100-1000mM。
优选地,所述金纳米溶胶的制备方法包括以下步骤:将氯金酸溶液加热煮沸,然后加入柠檬酸钠溶液,继续加热煮沸并持续剧烈搅拌,直至溶液呈酒红色,最后停止加热,溶液在室温下搅拌至冷却,合成金纳米溶胶。
优选地,所述氯金酸溶液的摩尔浓度为0.2-2mM,所述氯金酸溶液体积为50-150mL,所述柠檬酸钠溶液的质量浓度为0.01-0.05g/mL,加入的柠檬酸钠溶液体积为2mL。
优选地,所述步骤(2)中金纳米溶胶与化学发光试剂的加入体积比为1:1。
优选地,所述步骤(2)中金纳米溶胶与复合物B的体积比为1:10。
优选地,所述步骤(3)中强碱溶液为1M NaOH配制的0.1M无水柠檬酸三钠溶液。
优选地,所述步骤(3)中采用蠕动泵将水凝胶微珠前驱体凝胶溶液以一定速度通过针筒注入强碱溶液中,所述蠕动泵的速度为100-5000μL/min,所述针筒针尖的尺寸为13-70mm。
优选地,所述步骤(3)中采用依次用纯水和磷酸缓冲液冲洗,所述磷酸缓冲溶液(pH=7.4)配置方法为:0.24g KH2PO4,1.44g Na2HPO4,8g NaCl和0.2g KCl用纯水定容至1L。
本发明还提供采用上述方法制得的化学发光水凝胶微珠。
本发明中水凝胶微珠形貌为单分散球状,且粒径大小可控,粒径大小为0.5-5μm。
本发明还提供采用上述方法制得的化学发光水凝胶微珠在化学发光免疫分析中的应用。
有益效果:本发明将化学发光水凝胶微珠应用于化学发光免疫分析,该无标记化学发光免疫分析方法只需只用单一抗体,无需二抗,且反应条件温和,使用设备少,节约检测成本,简化检测步骤。化学发光信号由手机捕获,无需复杂、昂贵的仪器。
优选地,所述化学发光免疫分析方法包括以下步骤:
(1)将化学发光水凝胶微珠加入特异性抗体的磷酸缓冲溶液中,混合后恒温反应,抗体通过与化学发光水凝胶微珠上金纳米之间的静电吸附、Au-N键和Au-S键作用,组装到化学发光水凝胶微珠上,然后用磷酸缓冲溶液清洗化学发光水凝胶微珠,除去表面未吸附的抗体,制备得到包被抗体的化学发光水凝胶微珠;
(2)将包被抗体的化学发光水凝胶微珠加入到牛血清蛋白磷酸缓冲溶液中,恒温震荡反应封闭化学发光水凝胶微珠表面未结合位点;
(3)将包被抗体的化学发光水凝胶微珠加入待测抗原溶液中,恒温反应,化学发光水凝胶微珠上的抗体特异性吸附抗原,在化学发光水凝胶微珠表面形成抗体-抗原免疫复合物,然后用磷酸缓冲溶液清洗化学发光水凝胶微珠,除去非特异性吸附的蛋白,然后干燥去除化学发光水凝胶微珠表面的水分;
(4)将表面形成抗体-抗原免疫复合物的化学发光水凝胶微珠固定在暗盒内,将手机放入暗盒内打开摄像功能进行延时拍摄,同时注入过氧化氢溶液,激发化学发光反应,获得化学发光成像分析图片。
抗体-抗原免疫复合物对化学发光水凝胶微珠的化学发光性能产生增强或猝灭作用。根据化学发光水凝胶微珠免疫复合物化学发光信号的变化,实现抗原的定量分析。
优选地,所述步骤(1)、(2)、(3)中的反应温度为15-37℃。
优选地,所述牛血清蛋白磷酸缓冲溶液的质量浓度为0.02g/mL。
优选地,所述醋酸溶液的体积浓度为2%(V/V)。
本发明的优点在于:本发明制得的化学发光水凝胶微珠具有蓝色化学发光特性,从化学发光成像图片中,可以观察到蓝色圆形发光信号,还具有荧光特性,在紫外光激发下,可产生荧光信号,其中紫外光波长为365nm。所产生的化学发光和荧光信号目视可见,且可被智能手机拍摄检测。
本发明制得的化学发光水凝胶微珠为微珠形貌,可在4℃冰箱避光保存2个月以上。所制备多色化学发光水凝胶微珠具有良好的稳定性、易存储和易分离特征。其发光稳定性、形貌稳定性、存储性能与分离性能均优于现有技术CN 106833618 A。
本发明所制备化学发光水凝胶微珠表面含金纳米,可通过化学发光水凝胶微珠上的金纳米直接固载抗体,制备化学发光免疫分析探针。所制备化学发光水凝胶微珠表面的金纳米在强碱溶液中保持稳定,具有显著提升的耐碱性。该化学发光免疫分析探针制备方法简单、快捷、结合效果好,无需繁琐的多步交联反应。
本发明制备方法具有简单、高效、无需特殊条件等优点。
本发明将化学发光水凝胶微珠应用于化学发光免疫分析,该无标记化学发光免疫分析方法只需只用单一抗体,无需二抗,且反应条件温和,使用设备少,节约检测成本,简化检测步骤。化学发光信号由手机捕获,无需复杂、昂贵的仪器。
本发明中的化学发光水凝胶微珠在与一些氧化试剂共存时,可产生很强的化学发光。
加入荧光染料试剂荧光素后制备绿色化学发光水凝胶微珠,其他颜色包括红色、橙色、粉色、紫色、黄色等。
附图说明
图1为本发明实施例1中蓝光化学发光水凝胶微珠的照片;
图2为本发明实施例1中蓝光化学发光水凝胶微珠在过氧化氢存在下的化学发光成像图;
图3为本发明实施例1中蓝光化学发光水凝胶微珠的化学发光光谱图;
图4为本发明实施例2中蓝光化学发光水凝胶微珠的扫描电镜图;
图5为本发明实施例2中绿光化学发光水凝胶微珠的照片;
图6为本发明实施例2中绿光化学发光水凝胶微珠在过氧化氢存在下的化学发光成像图;
图7为本发明实施例2中绿光化学发光水凝胶微珠的化学发光光谱图;
图8为本发明实施例2中4个绿光化学发光水凝胶微珠的荧光成像阵列图;
图9为本发明实例3中调整钴离子、鲁米诺和金纳米加入顺序所制备蓝光化学发光水凝胶微珠的化学发光动力学曲线,其中:
A:钴离子+金纳米+鲁米诺所制备蓝光化学发光水凝胶微珠A;
B:钴离子+鲁米诺+金纳米所制备蓝光化学发光水凝胶微珠B;
C:鲁米诺+钴离子+金纳米所制备蓝光化学发光水凝胶微珠C;
D:鲁米诺+金纳米+钴离子所制备蓝光化学发光水凝胶微珠D;
E:金纳米+鲁米诺+钴离子所制备蓝光化学发光水凝胶微珠E;
F:金纳米+钴离子+鲁米诺所制备蓝光化学发光水凝胶微珠F;
图10为本发明实施例6中基于绿光化学发光水凝胶微珠的化学发光免疫分析检测人不同浓度IgG抗原的化学发光成像图;
图11为本发明实施例6中基于绿光化学发光水凝胶微珠的化学发光免疫分析检测人IgG抗原的线性拟合图;
图12为本发明实施例7中三颗绿光化学发光水凝胶微珠和三颗蓝光化学发光水凝胶微珠的化学发光成像阵列图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例中未注明具体技术或条件者,均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1
蓝色化学发光水凝胶微珠的制备方法,具体包括以下步骤:
1)将0.4g壳聚糖溶解在10mL 2%醋酸溶液中,搅拌2h。然后加入500μL 50mM氯化钴溶液,搅拌30min。加入1mL 10mM鲁米诺(3-氨基-苯二甲酰肼),搅拌10h,得到壳聚糖水凝胶-钴离子-鲁米诺混合水凝胶溶液。
2)制备金纳米。首先,向干净锥形瓶中加入100mL 0.2mM氯金酸溶液,搅拌均匀。然后加入2mL 0.01g/mL柠檬酸钠溶液,加热煮沸并持续剧烈搅拌15min,直至溶液呈酒红色。最后停止加热,溶液在室温下搅拌至冷却,得金纳米溶胶溶液,在4℃下储存,以备后续使用。
3)将1.5mL金纳米溶液加入到壳聚糖水凝胶-钴离子-鲁米诺混合水凝胶溶液,搅拌10h,最终得到壳聚糖水凝胶-钴离子-鲁米诺-金纳米混合水凝胶溶液。
4)用蠕动泵,将上述步骤3)中所得的壳聚糖水凝胶-钴离子-鲁米诺-金纳米混合水凝胶溶液,以2000μL/min的速度滴入到1M NaOH配制的0.1M无水柠檬酸三钠强碱溶液中,使之成为胶珠状。将所制备胶珠在强碱溶液中浸泡过夜。所得胶珠,依次用纯水和磷酸缓冲液(pH=7.4)冲洗2次。然后在37℃恒温箱中干燥1h,使表面水分蒸干,最终得到稳定的蓝光化学发光水凝胶微珠。
所制备蓝光化学发光水凝胶微珠的图片如图1所示,可见所制备蓝光化学发光水凝胶微珠为白色小球状,微珠的直径为2.5mm。利用智能手机拍摄所制备蓝光化学发光水凝胶微珠的化学发光成像图片。如图2所示,在直接注入过氧化氢溶液进行发光检测时,所制备蓝光化学发光水凝胶微珠,可产生目视可见的均匀、稳定、高强度的蓝色圆形化学发光成像信号。所制备蓝光化学发光水凝胶微珠的化学发光成像信号以灰度值表示,强度为22.867。
如图3所示,利用荧光光谱仪在激发光源关闭情况下,检测所制备蓝光化学发光水凝胶微珠的化学发光光谱图。所制备蓝光化学发光水凝胶微珠的可产生较强的化学发光信号,化学发光光谱的峰值在425nm,与鲁米诺的化学发光光谱对应。
如图4所示,所制备蓝光化学发光水凝胶微珠的扫描电镜图片数据表明所制备蓝光化学发光水凝胶微珠表面存在微孔道和金纳米颗粒。表明本发明所提供的制备方法,成功将金纳米以纳米颗粒状态固载到水凝胶微珠表面。
将所制备的蓝光化学发光水凝胶微珠放置于棕色塑料离心管中,在室温下密封保存。所制备蓝光化学发光水凝胶微珠的化学发光成像信号在所研究的两个月内保持稳定,信号强度变化值在3%以内,且材料形貌目视几乎无变化。
将所制备的化学发光水凝胶微珠放入液体基质血浆中,通过镊子就可将化学发光水凝胶微珠取出,从而与血浆基质分离,利于进一步开展分析应用。
本发明制备的化学发光水凝胶微珠材料具有显著提升的化学发光稳定性和形貌稳定,且便于存储和易于与基质分离。
对比例1
采用公开号为CN 110238411A的专利公开的方法,使用与实施例1相同量的鲁米诺作为化学发光试剂,使用与实施例1相同量的氯化钴作为催化剂,制备化学发光液体凝胶材料。
在直接注入过氧化氢溶液进行发光检测时,所制备化学发光液体凝胶材料的化学发光成像信号,必然出现不均匀的分层发光现象。所制备化学发光液体凝胶材料的化学发光成像信号以灰度值表示,强度为4.387,大大低于所制备蓝光化学发光水凝胶微珠。
将所制备的化学发光液体凝胶材料置于棕色塑料离心管中,在室温下密封保存。所制备化学发光液体凝胶材料静置一天后即出现分层现象。上层为较稀的凝胶液体,下层为脱水收缩的果冻状凝胶材料。液体凝胶材料的密度、形貌和均匀性随着保存时间发生较大变化,化学发光成像信号强度值也随着保存时间发生显著降低。故所制备蓝光化学发光水凝胶微珠相比较于化学发光液体凝胶材料,具有显著提升的形貌和发光稳定性。
与实施例1相比,将所制备的化学发光液体凝胶材料放入液体基质血浆中,无定型化学发光液体凝胶材料立刻与液体基质混合,难以分离取出。
对比例2
将实施例1中的金纳米溶胶直接注入实施例1中的强碱溶液中。
结果表明:金纳米立刻发生团聚和变质沉淀现象。而本发明所制备的化学发光水凝胶微珠及其表面固载的金纳米,在强碱溶液中保持稳定,克服金纳米易团聚和易产生沉淀变质的问题,具有显著提升的耐碱性。
实施例2
绿色化学发光水凝胶微珠的制备方法,具体包括以下步骤:
1)将0.4g壳聚糖溶解在10mL 2%醋酸溶液中,搅拌2h。然后加入500μL 50mM钴离子溶液,搅拌30min。加入40mg荧光素,搅拌均匀后,再加入1mL 10mM鲁米诺,搅拌12h,得到壳聚糖水凝胶-钴离子-荧光素-鲁米诺混合水凝胶溶液。
2)制备金纳米。首先,向干净锥形瓶中加入150mL 1mM氯金酸溶液,搅拌均匀。然后加入2mL 0.05g/mL柠檬酸钠溶液,加热煮沸并持续剧烈搅拌15min,直至溶液呈酒红色。最后停止加热,溶液在室温下搅拌至冷却,得金纳米溶胶溶液,在4℃下储存,以备后续使用。
3)将2mL金纳米溶液加入到壳聚糖水凝胶-钴离子-荧光素-鲁米诺混合水凝胶溶液,搅拌10h,最终得到壳聚糖水凝胶-钴离子-荧光素-鲁米诺-金纳米混合水凝胶溶液。
4)用蠕动泵,上述步骤3)所得壳聚糖水凝胶-钴离子-荧光素-鲁米诺-金纳米混合水凝胶溶液,以2500μL/min的速度滴入到1M NaOH配制的0.1M无水柠檬酸三钠强碱溶液中,使之成为胶珠状。然后胶珠在强碱溶液中浸泡过夜。所得胶珠,依次用纯水和磷酸缓冲液(pH=7.4)冲洗2次。然后在37℃恒温箱中干燥1h,使表面水分蒸干,最终得到绿光化学发光水凝胶微珠。
所制备绿光化学发光水凝胶微珠的照片如图5所示,可见所制备绿光化学发光水凝胶微珠为黄色小球状,微珠的直径为2mm。
如图6所示,利用智能手机拍摄所制备绿光化学发光水凝胶微珠的化学发光成像图片,所制备绿光化学发光水凝胶微珠在过氧化氢存在下,可产生均匀、稳定、高强度的圆形绿色化学发光成像图片信号。
如图7所示,利用荧光光谱仪在激发光源关闭情况下,检测所制备绿光化学发光水凝胶微珠的化学发光光谱图,所制备绿光化学发光水凝胶微珠的化学发光光谱图有两个化学发光峰值信号,其中一个化学发光峰在425nm,另外一个化学发光峰在530nm,与鲁米诺-荧光素-过氧化氢化学发光共振能量转移反应体系的化学发光光谱对应。
如图8所示,将4个绿光化学发光水凝胶微珠排成正方形阵列,利用365nm的紫外光照射绿光化学发光水凝胶微珠阵列,4个绿光化学发光水凝胶微珠阵列,在紫外光激发下,可产生高强度荧光信号。表明所制备的绿光化学发光水凝胶微珠同时具有良好的化学发光和荧光性能。
实施例3
蓝色化学发光水凝胶微珠制备过程中化学发光催化剂、化学发光试剂和金纳米加入顺序对材料发光强度的影响:
1)试剂加入顺序为钴离子+金纳米+鲁米诺:将0.4g壳聚糖溶解在10mL 2%醋酸溶液中,搅拌2h,制备壳聚糖水凝胶溶液。然后加入500μL 50mM钴离子溶液,搅拌30min。参照实施例1步骤2),制备金纳米。进一步加入2mL金纳米溶胶溶液,搅拌10h。进一步加入1mL10mM鲁米诺,搅拌12h。参照实施例1步骤4),制备蓝光化学发光水凝胶微珠A。
2)试剂加入顺序为钴离子+鲁米诺+金纳米:参照上述步骤1),制备壳聚糖水凝胶溶液。然后加入500μL 50mM钴离子溶液,搅拌30min。进一步加入1mL 10mM鲁米诺,搅拌12h。进一步加入2mL金纳米溶胶溶液,搅拌10h。参照实施例1步骤4),制备蓝光化学发光水凝胶微珠B。
3)试剂加入顺序为鲁米诺+钴离子+金纳米:参照上述步骤1),制备壳聚糖水凝胶溶液。然后加入1mL 10mM鲁米诺,搅拌12h。进一步加入500μL 50mM钴离子溶液,搅拌30min。进一步加入2mL金纳米溶胶溶液,搅拌10h。参照实施例1步骤4),制备蓝光化学发光水凝胶微珠C。
4)试剂加入顺序为鲁米诺+金纳米+钴离子:参照上述步骤1),制备壳聚糖水凝胶溶液。然后加入1mL 10mM鲁米诺,搅拌12h。进一步加入2mL金纳米溶胶溶液,搅拌10h。进一步加入500μL 50mM钴离子溶液,搅拌30min。参照实施例1步骤4),制备蓝光化学发光水凝胶微珠D。
5)试剂加入顺序为金纳米+鲁米诺+钴离子:参照上述步骤1),制备壳聚糖水凝胶溶液。然后加入2mL金纳米溶胶溶液,搅拌10h。进一步加入1mL 10mM鲁米诺,搅拌12h。进一步加入500μL 50mM钴离子溶液,搅拌30min。参照实施例1步骤4),制备蓝光化学发光水凝胶微珠E。
6)试剂加入顺序为金纳米+钴离子+鲁米诺:参照上述步骤1),制备壳聚糖水凝胶溶液。然后加入2mL金纳米溶胶溶液,搅拌10h。进一步加入500μL 50mM钴离子溶液。进一步加入1mL 10mM鲁米诺,搅拌12h,搅拌30min。参照实施例1步骤4),制备蓝光化学发光水凝胶微珠F。
利用化学发光检测仪检测上述所制备系列蓝光化学发光水凝胶微珠A、B、C、D、E和F的化学发光强度。如图9所示,调整化学发光催化剂、化学发光试剂和金纳米加入顺序,均可成功制备蓝光化学发光水凝胶微珠,产生较强的化学发光信号。其中,先加入化学发光催化剂钴离子,再加入金纳米,最后加入化学发光试剂鲁米诺,所制备的蓝光化学发光水凝胶微珠A化学发光光强最强。先加入化学发光催化剂钴离子,再加入化学发光试剂鲁米诺,最后加入金纳米,所制备的蓝光化学发光水凝胶微珠B化学发光光强次强。先加入化学发光试剂鲁米诺,再加入化学发光催化剂钴离子,最后加入金纳米,所制备的蓝光化学发光水凝胶微珠C化学发光光强最弱。此外,先加入化学发光催化剂钴离子,再加入化学发光试剂鲁米诺,最后加入金纳米,可最大限度保证金纳米的稳定,综合考虑发光性能和金纳米稳定性,优选试剂加入顺序为钴离子+鲁米诺+金纳米。
实施例4
紫色化学发光水凝胶微珠的制备方法,具体包括以下步骤:
1)将0.4g壳聚糖溶解在10mL 2%醋酸溶液中,搅拌2h。然后加入500μL 50mM钴离子溶液,搅拌30min。加入40mg罗丹明B,搅拌均匀后,再加入1mL 10mM鲁米诺,搅拌12h,得到壳聚糖水凝胶-钴离子-罗丹明B-鲁米诺混合水凝胶溶液。
2)制备金纳米。首先,向干净锥形瓶中加入100mL 0.5mM氯金酸溶液,搅拌均匀。然后加入2mL 0.02g/mL柠檬酸钠溶液,加热煮沸并持续剧烈搅拌15min,直至溶液呈酒红色。最后停止加热,溶液在室温下搅拌至冷却,得金纳米溶胶溶液,在4℃下储存,以备后续使用。
3)将1mL金纳米溶液加入到壳聚糖水凝胶-钴离子-罗丹明B-鲁米诺混合水凝胶溶液,搅拌10h,最终得到壳聚糖水凝胶-钴离子-罗丹明B-鲁米诺-金纳米混合水凝胶溶液。
4)用蠕动泵,上述步骤3)所得壳聚糖水凝胶-钴离子-罗丹明B-鲁米诺-金纳米混合水凝胶溶液,以2500μL/min的速度滴入到1M NaOH配制的0.1M无水柠檬酸三钠强碱溶液中,使之成为胶珠状。然后胶珠在强碱溶液中浸泡过夜。所得胶珠,依次用纯水和磷酸缓冲液(pH=7.4)冲洗2次。然后在37℃恒温箱中干燥1h,使表面水分蒸干,最终得到红光化学发光水凝胶微珠。
实施例5
黄色化学发光水凝胶微珠的制备方法,主要包括以下步骤:
1)将0.4g壳聚糖溶解在10mL 2%醋酸溶液中,搅拌2h。然后加入500μL 50mM钴离子溶液,搅拌30min。加入20mg荧光素和20mg曙红Y,搅拌均匀后,再加入1mL 10mM光泽精,搅拌12h,得到壳聚糖水凝胶-钴离子-荧光素-曙红Y-光泽精混合水凝胶溶液。
2)参考实施例1步骤2)制备金纳米溶胶,)将1mL金纳米溶胶溶液加入到壳聚糖水凝胶-钴离子-荧光素-曙红Y-光泽精混合水凝胶溶液,搅拌10h,最终得到壳聚糖水凝胶-钴离子-荧光素-曙红Y-光泽精-金纳米混合水凝胶溶液。
3)用蠕动泵,上述步骤3)所得壳聚糖水凝胶-钴离子-荧光素-曙红Y-光泽精-金纳米混合水凝胶溶液,以2000μL/min的速度滴入到1M NaOH配制的0.1M无水柠檬酸三钠强碱溶液中,使之成为胶珠状。然后胶珠在强碱溶液中浸泡过夜。所得胶珠,依次用纯水和磷酸缓冲液(pH=7.4)冲洗2次。然后在37℃恒温箱中干燥1h,使表面水分蒸干,最终得到黄光化学发光水凝胶微珠。
实施例6
基于绿光化学发光水凝胶微珠的无标记免疫分析方法检测IgG抗原:
1)取20μL 100μg/ml羊抗人IgG抗体,移入5mL烧杯中,用1000μL磷酸缓冲液(0.01M,pH=7.4)稀释。将实施例2所制备的20颗绿光化学发光水凝胶微珠放入上述羊抗人IgG抗体溶液中,37℃浸泡1h,然后用PBS缓冲液(pH=7.4)冲洗3次。接着,将1000μL 2%(w/w)BSA溶液添加到上述溶液中,在37℃恒温箱中震荡30min,封闭未结合位点。最后在37℃恒温箱中干燥1h,得包被抗体的绿光化学发光水凝胶微珠。
2)依次将上述步骤1)制备所得的3颗包被抗体的绿光化学发光水凝胶微珠放入含不同浓度IgG抗原的1000μL磷酸缓冲液中,37℃反应1h。然后用磷酸缓冲液(pH=7.4)冲洗绿光化学发光水凝胶微珠3次。之后在37℃恒温箱中存放1h,使表面水分蒸干,得表面形成抗体-抗原免疫复合物的绿光化学发光水凝胶微珠。
3)选取一颗绿光化学发光水凝胶微珠置于500μL棕色离心管的尖端底部,离心管放入密闭的暗盒内固定。再将华为P20智能手机放入暗盒内,打开摄像功能进行延时拍摄,立刻从外部向离心管内注入200μL 0.1M H2O2溶液,50s后停止拍摄。拍摄表面形成抗体-抗原免疫复合物的绿光化学发光水凝胶微珠的化学发光成像图片。如图10所示,从智能手机拍摄的化学发光成像图片中可以观察到一系列圆形发光信号。随着抗原浓度的增加,发光强度不断增加。此外,在抗原浓度较低时,发光成像信号的强度较弱,且颜色为浅灰绿色。
4)利用图片处理软件Image J分别提取水凝胶微珠化学发光成像图片中发光区域的亮度值参数,包括R值、G值、B值和灰度值,作为定量数据输出。建立不同浓度IgG抗原与其各自化学发光成像图片亮度值参数之间的定量关系曲线,建立线性拟合方程,用于IgG抗原的定量测定。如图11所示,水凝胶微珠化学发光图片发光区域灰度值与IgG抗原浓度的对数值呈现良好的线性关系,线性方程为y=13.051+92.124x,检测的线性范围分别为1ng/mL-100μg/mL。
本实施例进一步实现实际样品中人IgG抗原的检测。正常人血清样本经过10000倍稀释后进行测定,测定出原血清样本中IgG抗原含量为8.6mg/mL,与正常人血清中IgG含量相符。向人血清样本中定量加入1mg/mL人IgG抗原,检测加标血样中人IgG抗原的含量,并计算检测的回收率和检测数据之间的标准偏差。
其检测结果表面检测回收率在90%-110%之间,标准偏差小于5%。上述数据表明利用本实施例基于绿光化学发光水凝胶微珠的化学发光免疫分析方法,可实现实际血样中人IgG抗原的准确检测。因此,本发明提供的基于化学发光水凝胶微珠的化学发光免疫分析方法,利用智能手机,便可实现人IgG抗原的简单、快速、低成本、准确、可视化成像检测。
实施例7
基于蓝光和绿光化学发光水凝胶微珠同时检测两种急性心肌梗死标志物心肌肌钙蛋白和肌红蛋白:
1)按照实施例3步骤1)所述,分别制备包被心肌肌钙蛋白抗体的蓝光化学发光水凝胶微珠,和包被肌红蛋白抗体的绿光化学发光水凝胶微珠。
2)将3颗包被心肌肌钙蛋白抗体的蓝光化学发光水凝胶微珠和3颗包被肌红蛋白抗体的绿光化学发光水凝胶微珠放入含不同浓度心肌肌钙蛋白和肌红蛋白抗原的2mL磷酸缓冲液中,37℃反应1h。然后用磷酸缓冲液(pH=7.4)冲洗蓝光和绿光化学发光水凝胶微珠3次。之后在37℃恒温箱中存放1h,使表面水分蒸干,得表面形成抗体-抗原免疫复合物的蓝光和绿光化学发光水凝胶微珠。
3)将上述步骤2)所获取的6颗蓝光和绿光化学发光水凝胶微珠按顺序粘于黑胶带上,将固定化学发光水凝胶微珠的黑胶带放入小烧杯底部,将小烧杯放入暗盒内。再将华为P20智能手机放入暗盒内,打开摄像功能进行延时拍摄,同时从外部向小烧杯内注入1mL0.1M H2O2溶液,50s后停止拍摄。同时拍摄蓝光和绿光化学发光水凝胶微珠的化学发光成像图片。如图12所示,从智能手机拍摄的化学发光成像图片中可以观察到三个绿色圆形光斑和三个蓝色圆形光斑。
4)利用智能手机图片识别软件,分别提取化学发光成像图片中6个发光光斑的灰度值,作为定量数据输出。根据心肌肌钙蛋白抗原浓度与3个蓝光发光光斑灰度值的平均值之间的关系,建立心肌肌钙蛋白定量测定标准曲线。根据肌红蛋白抗原与3个绿光发光光斑灰度值的平均值之间的关系,建立肌红蛋白定量测定标准曲线。分别根据心肌肌钙蛋白和肌红蛋白的定量标准曲线,用于未知样品中心肌肌钙蛋白和肌红蛋白抗原的检测。
因此,本发明提供的多色化学发光水凝胶微珠,可用于构建化学发光阵列型免疫分析方法,利用智能手机检测,实现多种抗原的同时、快速、阵列型、成像检测。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种化学发光水凝胶微珠的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
(1)将壳聚糖溶解在醋酸溶液中,形成壳聚糖凝胶溶液;
(2)将化学发光催化剂、化学发光试剂、金纳米溶胶与步骤(1)的壳聚糖凝胶溶液混合;得到水凝胶微珠前驱体凝胶溶液;
(3)将水凝胶微珠前驱体凝胶溶液注入强碱溶液中,形成水凝胶微珠,冲洗后,干燥,即获得化学发光水凝胶微珠。
2.根据权利要求1所述的化学发光水凝胶微珠的制备方法,其特征在于:将制得的化学发光水凝胶微珠与氧化剂混合,所述氧化剂包括氧化氢、高锰酸钾、高碘酸钾、过硫酸钾、铁氰化钾或氧气。
3.根据权利要求1所述的化学发光水凝胶微珠的制备方法,其特征在于:所述步骤(2)中加入荧光染料试剂。
4.根据权利要求3所述的化学发光水凝胶微珠的制备方法,其特征在于:所述荧光染料试剂包括荧光素、4,5-二溴荧光素、曙红Y、吖啶黄素、罗丹明或荧光桃红B中的一种或两种。
5.根据权利要求1所述的化学发光水凝胶微珠的制备方法,其特征在于:所述化学发光催化剂包括氯化钴、硫酸钴、氯化铜、硫酸铜或钴基金属有机框架结构材料。
6.根据权利要求1所述的化学发光水凝胶微珠的制备方法,其特征在于:所述化学发光试剂包括鲁米诺、光泽精、过氧化草酸酯或吖啶酯。
7.根据权利要求1所述的化学发光水凝胶微珠的制备方法,其特征在于:所述金纳米溶胶的制备方法包括以下步骤:将氯金酸溶液加热煮沸,然后加入柠檬酸钠溶液,继续加热煮沸并持续剧烈搅拌,直至溶液呈酒红色,最后停止加热,溶液在室温下搅拌至冷却,合成金纳米溶胶。
8.采用权利要求1-7中任一项所述的制备方法制得的化学发光水凝胶微珠。
9.采用权利要求1-7中任一项所述的制备方法制得的化学发光水凝胶微珠在化学发光免疫分析中的应用。
10.根据权利要求9所述的化学发光水凝胶微珠在化学发光免疫分析中的应用,其特征在于:包括以下步骤:
(1)将化学发光水凝胶微珠加入特异性抗体的磷酸缓冲溶液中,混合后恒温反应,然后用磷酸缓冲溶液清洗化学发光水凝胶微珠,除去表面未吸附的抗体,制备得到包被抗体的化学发光水凝胶微珠;
(2)将包被抗体的化学发光水凝胶微珠加入到牛血清蛋白磷酸缓冲溶液中,恒温震荡反应封闭化学发光水凝胶微珠表面未结合位点;
(3)将包被抗体的化学发光水凝胶微珠加入待测抗原溶液中,恒温反应,然后用磷酸缓冲溶液清洗化学发光水凝胶微珠,除去非特异性吸附的蛋白,然后干燥去除化学发光水凝胶微珠表面的水分;
(4)将表面形成抗体-抗原免疫复合物的化学发光水凝胶微珠固定在暗盒内,将手机放入暗盒内打开摄像功能进行延时拍摄,同时注入过氧化氢溶液,激发化学发光反应,获得化学发光成像分析图片。
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CN115895279A (zh) * | 2022-11-24 | 2023-04-04 | 西北大学 | 一种SPAN/MOFs@Luminol发光材料及其制备方法和应用 |
CN115895279B (zh) * | 2022-11-24 | 2023-07-21 | 西北大学 | 一种SPAN/MOFs@Luminol发光材料及其制备方法和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN113125422B (zh) | 2023-07-25 |
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