CN112048033A - 水凝胶微载体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种水凝胶微载体及其制备方法和应用,水凝胶微载体以油相溶液为载体,包含引发剂和两种或两种以上的成胶材料的水相溶液分散在所述油相溶液中,通过改变不同成胶材料之间的浓度比,形成密度编码的水凝胶微载体。其制备方法为将两种或两种以上不同浓度比的成胶材料与引发剂混合得到水相溶液;将表面活性剂和TEMED溶于油介质中得到油相溶液,将水相溶液包裹在油相溶液中,形成水凝胶液珠,将水凝胶液珠固化成密度编码的水凝胶微载体。本发明的水凝胶微载体可以实现对疾病相关蛋白的多重检测和肿瘤源性外泌体的可视化检测,具有译码简单,检测成本低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学检测领域,具体涉及一种水凝胶微载体及其制备方法和应用。
背景技术
随着生物医学的迅速发展,在疾病检测、药物发现等领域都需要进行高通量的生物分析。虽然平面芯片技术被广泛的应用在高通量分析中,但他们在反应速度上有一定限制,在可重复性和可靠性上有一定局限性。悬浮阵列是另外一项替代策略,探针分子载体则可以自由散布到反应体系中,不受空间位置的限制。
对于悬浮阵列,主要有两个关键问题。一个是需要对流动载体进行编码。近年来各种新型的编码载体相继出现并得到了广泛应用。其中聚合物微球作为一种固相载体具有显著的优势,比如比表面积大、可以通过搅拌等辅助手段加快反应速度、表面结合的分子在反应后可以从溶液分离出来等等。目前,传统的载体编码方法通常是基于微球的光学性质,但由于荧光编码方法易被光漂白,并且易受生物样本中强烈的自发荧光影响,荧光发射光谱范围宽的特性也极大地限制了其编码能力。因此,更加简单和集成的编码技术将为生物医学应用带来广阔前景。
此外,目标分子的分析是悬浮载体技术中另一个重要部分,通常通过标记在生物分子上的标记物质来检测。而这些目标分子通常就是指肿瘤标志物。它通常是指当人体产生癌变细胞后,癌细胞的新陈代谢与正常细胞会有很大的差别。同时癌细胞也会产生区别于正常细胞的小分子物质,如酶、激素、抗原、多肽和小分子RNA等。定期对这些肿瘤标志物进行检测可以极大地提高患者的生存机会。目前,医学上对肿瘤进行检测的传统手段是组织活检,它主要通过肿瘤组织切片实现。然而,它们是侵入性的,不能用于肿瘤的早期诊断或跟踪疾病的预后和治疗反应。近年来,液体活检作为肿瘤检测的一颗新星,己被广泛应用于肿瘤的早期诊断。它包括从患者体内提取体液以及肿瘤相关生物分子的分析,如:疾病相关蛋白、miRNA、循环肿瘤细胞(CTCs)和外泌体。值得注意的是,肿瘤标志物的含量水平来定量评估癌症不是单一的。亦即细胞发生某一种癌变后。其对应的肿瘤标志物可能有两种或者两种以上,在多个肿瘤标志物标识下,才能精确诊断癌症。因此,发展一种能够同时检测多种肿瘤标志物的分析方法,在癌症的早期预警与诊断方面有及其重要的意义。
适配体,是一小段能够特异性结合目标靶分子的核苷酸序列,通常包含20~50个核苷酸长度。与传统的免疫结合作用相比,适配体与目标靶分子的结合强度与抗原抗体的结合强度相当,甚至前者之间的亲和性要大于后者,并且适配体能够大批量地合成,且其制得方法比较简易。近年来,有研究表明,当适配体的目标靶分子为蛋白质或者多肽时,其结合能力要强于DNA与DNA之间碱基互补配对的强度。因此,当目标靶分子存在时,适配体与其互补序列之间的碱基互补配对作用将会遭到破坏,利用这一点不仅可以实现目标物的特异性识别,还可以把目标分子的信号转化为DNA序列的信号从而进行检测。
外泌体,是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡,直径大约30~150nm,具有脂质双层膜结构,能很好地保护其包被的物质。外泌体独特的性质,包括它们运载miRNA的能力、在循环系统中的稳定性、分离和分析相对容易且无侵入性等,更为重要的是他们能够反应来源癌细胞的状态,这些特性使外泌体在开发高灵敏度的快速诊断策略并对癌症患者的病理状态进行无创监测变得至关重要。外泌体作为一种预后的生物标志物,相比miRNA、cfDNA和CTCs显示出许多优势。首先,肿瘤相关的外泌体在生物体液中的浓度高于miRNA、CTCs和cfDNA。其次,肿瘤细胞分泌的特异性外泌体含有多种关键的生物活性分子。第三,这些生物活性分子被外泌体脂质双分子层保护,不受外部蛋白酶和其他酶的干扰。外泌体的蛋白、核酸都可以作为疾病标志物。而且,它的稳定性高,即使在冷库里保存30年的血液,也可以用于分离和检测外泌体。目前,已经开发了很多检测肿瘤源性外泌体的方法,但这些方法大多需要借助大型仪器的配合,且检测步骤较为复杂。所以,开发一种简单,经济的方法检测出疾病相关的特异性外泌体对于癌症的早期检测是至关重要的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足,提供一种基于密度编码的水凝胶微载体及其制备方法和在多重疾病相关蛋白检测和外泌体可视化检测方面的功能化应用。这种密度编码水凝胶微载体可以与大小编码和荧光编码结合实现微球三维编码,扩充其编码容量。同时,该密度编码水凝胶微载体可以实现对疾病相关蛋白的多重检测和肿瘤源性外泌体的可视化检测,具有译码简单,检测成本低等优点。
为了实现上述目的,本发明提供了一种水凝胶微载体(又名水凝胶微球),以油相溶液为载体,包含引发剂和两种或两种以上的成胶材料的水相溶液分散在所述油相溶液中,通过改变不同成胶材料之间的浓度比,形成密度编码的水凝胶微载体。
上述的水凝胶微载体,进一步的,将所述水凝胶微载体用异氰酸酯修饰的染料标记,形成密度和颜色二维编码的水凝胶微载体。微球通过化学键可连多种不同颜色的染料,从而可以简便高效地改变所获得的荧光微球的颜色,以获得多色的荧光编码水凝胶微载体。
上述的水凝胶微载体,进一步的,利用微流控技术,不同流速的油相溶液通过剪切力将水相溶液斩断形成粒径不同的水凝胶液珠,形成大小、密度和颜色三维编码的水凝胶微载体。
上述的水凝胶微载体,进一步的,生物分子通过化学键偶联在水凝胶微载体上。
上述的水凝胶微载体,进一步的,所述生物分子为核酸适配体(aptamer),抗体,多肽或蛋白中的一种或多种。这种功能性的密度编码水凝胶微载体可以用于多重蛋白,核酸,外泌体,循环肿瘤细胞等疾病生物标志物的检测。
上述的水凝胶微载体,进一步的,生物分子为包含人端粒重复序列HTG和靶标蛋白的核酸适配体。
上述的水凝胶微载体,进一步的,所述核酸适配体为TMB-PSA、TMB-MUC1、TMB-PDGF、TMB-CEA中的一种或多种;
所述TMB-PSA的DNA序列为SEQ ID NO.1所示的序列;
所述TMB-MUC1的DNA序列为SEQ ID NO.2所示的序列;
所述TMB-PDGF的DNA序列为SEQ ID NO.3所示的序列;
所述TMB-CEA的DNA序列为SEQ ID NO.4所示的序列。
上述的水凝胶微载体,进一步的,所述水相溶液中成胶材料为聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、甲基丙烯酰胺(MAA)、丝素蛋白和明胶中的一种或多种的组合物。所述的成胶材料还可以为任何一种密度不同的一种或几种能形成水凝胶的聚合物单体。这种合成微球的方法适用于不同浓度聚合物单体,可通过改变聚合物单体的成分和浓度获得不同密度编码的水凝胶微珠。
上述的水凝胶微载体,进一步的,所示引发剂为过硫酸铵(APS)。APS是一种引发自由基聚合反应的引发剂,所有成胶材料形成水凝胶是通过自由基聚合反应的都可以使用APS。
上述的水凝胶微载体,进一步的,所述油相溶液为含氟油。
上述的水凝胶微载体,进一步的,所述油相溶液包括表面活性剂、催化剂和油。表面活性剂能够对液滴的表面张力产生一定的影响,使其在油相中保持稳定。催化剂可以催化过硫酸铵产生自由基,从而加速成胶材料的聚合。
上述的水凝胶微载体,进一步的,所述催化剂为四甲基乙二胺(TEMED)。通过TEMED催化过硫酸铵产生自由基,然后引发PEGDA和MAA单体、丝素蛋白和明胶的聚合。也可通过紫外辐射,将液珠固化成微球。
上述的水凝胶微载体,进一步的,所述表面活性剂为FSL表面活性剂。
上述的水凝胶微载体,进一步的,所述含氟油为HFE-7500油或FC-40油。
基于一个总的技术构思,本发明还提供了一种所述的水凝胶微载体的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
S1-1、将两种或两种以上不同浓度比的成胶材料与引发剂混合得到水相溶液;将表面活性剂和TEMED溶于油介质中得到油相溶液,
S1-2、将水相溶液包裹在油相溶液中,形成水凝胶液珠,
S1-3、将所述水凝胶液珠固化成密度编码的水凝胶微载体。
上述的制备方法,进一步的,S1-1具体为:
将两种或两种以上不同浓度比的成胶材料、引发剂和生物分子混合得到水相溶液。
进一步的,所述,S1-1还包括:将表面活性剂和TEMED溶于油介质中得到油相溶液。
上述的制备方法,进一步的,所述制备方法还包括S1-4、将所述水凝胶微载体和含有异氰酸酯修饰的染料的溶液孵育,获得荧光编码的水凝胶微载体。
上述的制备方法,进一步的,所述S1-2替换为:将水相溶液和油相溶液分别装入注射器中,连接到微流控器件上,在所述微流控器件中水相和油相通道的交汇处,不同流速的油相溶液通过剪切力将水相溶液斩断成粒径不同的水凝胶液珠。
基于一个总的技术构思,本发明还提供了一种所述的水凝胶微载体在制备检测多种肿瘤标志物的试剂盒中的应用;其特征在于,所述应用的方法为:
A1、针对不同的靶标分子,设计不同的检测DNA分子;
A2、用不同密度的水凝胶微载体包被不同种类分子的检测DNA分子,在PBS中反应3小时,染色;
A3、制备梯度浓度的蔗糖梯度,将捕获了不同靶标分子的密度编码水凝胶微载体添加到密度梯度溶液的顶层,并离心分散;
A4、取出分散在不同浓度层蔗糖溶液中的水凝胶微载体,进行荧光强度的测定。
靶标分子可以是蛋白、重金属离子,葡萄糖分子等。
基于一个总的技术构思,本发明还提供了一种所述的水凝胶微载体在制备可视化检测肿瘤源性外泌体、核酸、蛋白的试剂盒中的应用,其特征在于,所述应用的方法为:
B1、根据肿瘤源性外泌体、核酸、蛋白设计核酸适配体,将核酸适配体与所述水凝胶微载体通过化学键连接得到功能化的水凝胶微载体;
B2、将所述功能化的水凝胶微载体与外泌体、核酸或蛋白孵育获得混合溶液;
B3、制备梯度浓度的蔗糖梯度,将所述混合溶液添加到密度梯度溶液的顶层,并离心分散;
B4、使用与适配体的互补DNA序列破坏外泌体、核酸或蛋白的识别,检测释放的外泌体、核酸或蛋白。
核酸适配体功能化的密度编码水凝胶微载体通过斜率变化快速检测外泌体的方法,也适用于那些表面含有多个核酸适配体识别蛋白的疾病相关生物标志物,如循环肿瘤细胞等。
上述的应用,进一步的,所述核酸适配体为AptHER2 ref2、AptMUC1 ref1、AptCD63 ref3、AptEpCAM ref3中的一种或多种;
所述AptHER2 ref2的DNA序列如SEQ ID NO.5所示;所述AptHER2 ref2的互补DNA序列如SEQ ID NO.6所示;
所述AptMUC1 ref1的DNA序列如SEQ ID NO.7所示;所述AptMUC1 ref1的互补DNA序列如SEQ ID NO.8所示;
所述AptCD63 ref3的DNA序列如SEQ ID NO.9所示;所述AptCD63 ref3的互补DNA序列如SEQ ID NO.10所示;
所述AptEpCAM ref3的DNA序列如SEQ ID NO.11所示;所述AptEpCAM ref3的互补DNA序列如SEQ ID NO.12所示。
与现有技术相比,本发明的优点在于:
(1)本发明提供了一种基于密度编码的水凝胶微载体,通过简单的改变不同成胶材料的浓度比,就可以得到不同密度编码的微球,通过微流控技术可以控制微球生成的大小,从而轻松的实现大小维度的编码。同时由于得到的微球表面含有氨基,所以可以很容易的将异氰酸酯修饰的染料连到微球上面,成功实现荧光编码。本发明相较于之前的研究中新引入了密度编码这一个维度的编码,对这一维度进行高通量解码仅需一台低成本的普通离心机,这极大的降低了解码成本。同时,通过水凝胶微载体还可以通过化学键将类似于抗体功能的aptamer修饰在微球上,可以精确的实现对目标分子的分析。综上,本发明的水凝胶微载体具有译码简单,检测成本低、检测灵敏度高等优点,可以应用于核酸、蛋白、外泌体等多元生物分析领域。
(2)本发明提供了一种基于密度编码的水凝胶微载体,通过化学键将类似于抗体功能的aptamer修饰在微球上,可以精确的实现对目标分子的分析。
(3)本发明提供了一种基于密度编码的水凝胶微载体的制备方法,采用微流控技术,将不同浓度的成胶材料混合分散在水相溶液中,油相溶液作为载体,在微流控器件中,油相溶液通过剪切力将水相溶液斩断成水凝胶液珠,通过控制不同的油速,可以得到不同大小的液滴。水凝胶液珠在37℃过夜固化后成可编码水凝胶微载体,通过荧光染色可以获得颜色编码的微球,该方法具有操作简便,尺寸均匀性和荧光均匀性好,产量大和性质可控等优点。
(4)本发明提出了一种基于密度编码的水凝胶微载体在多重疾病相关蛋白检测和外泌体可视化检测方面的功能化应用,可以实现对疾病相关蛋白的多重检测和肿瘤源性外泌体的可视化检测。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例1中生成密度编码水凝胶微载体的解码图。
图2为本发明实施例2中密度编码水凝胶微载体的分离结果图。
图3为本发明实施例3中密度编码水凝胶微载体的分离结果图。
图4为本发明实施例4中密度编码水凝胶微载体的分离结果图。
图5为本发明实施例5中利用液滴微流控生产大小,密度编码水凝胶微载体的示意图和结果图。
图6为本发明实施例5中生成荧光编码水凝胶微载体的原理图。
图7为本发明实施例5中利用液滴微流控生产大小,密度编码水凝胶微载体的示意图。
图8为本发明实施例5中利用液滴微流控生产大小,密度编码水凝胶微载体的结果图。
图9为本发明实施例6中将核酸适配体标记在密度编码的水凝胶微载体上的原理和结果图。(a)适配体序列在5'末端用Acrydite修饰,在PEGDA聚合过程中缀合的反应方程式。(b)用与适配体互补的修饰了FAM的DNA链证明核酸适配体成功修饰在密度编码水凝胶微载体上;其中Ι表示密度编码水凝胶微载体上没有修饰适配体;Π表示密度编码水凝胶微载体上连接上适配体。
图10为本发明实施例6的基于核酸适配体功能化的密度编码水凝胶微载体用于4重蛋白质检测原理和结果。(a)基于ThT的分子信标用于检测目标蛋白的示意图。(b)通过TMB-PSA ADM特异性检测PSA蛋白。(c)荧光强度变化与PSA蛋白浓度之间的线性关系。(d)使用ADM同时检测一种,两种,三种和四种蛋白质;其中I:仅PSA,II:PSA+MUC1,III:PSA+MUC1+PDGF,IV:所有四种蛋白质。(e)相应的荧光强度变化与PSA,MUC1,PDGF和CEA蛋白之间的线性关系。
图11为本发明中使用aptamer功能化的密度编码水凝胶微载体可视化的检测肿瘤来源的外泌体。(a)将HER2功能化的密度编码水凝胶微载体与I:HepG2外泌体,II:LO2外泌体和III:HepG2+LO2外泌体一起温育后倾斜图片。(b)倾斜角度与HepG2外泌体的浓度成正比的关系图。(c)将HER2功能化的密度编码水凝胶微载体与I:LO2外泌体II:HepG2外泌体孵育后成像图片。(d)释放和分析捕获的囊泡图片;其中,I:将aptamer功能化的密度编码水凝胶微载体与HER2适配体的互补链一起孵育,以释放HepG2外泌体;比例尺=500μm。II:释放的HepG2外泌体的TEM图像;比例尺=200nm。III:释放的HepG2外泌体的DLS分析。IV:释放的HepG2外泌体的CD63表达的WB分析。(e)EPCAM功能化的密度编码水凝胶微载体,MUC1功能化的密度编码水凝胶微载体和HER2功能化的密度编码水凝胶微载体用于检测来自肺癌患者和健康供体的血浆中的肿瘤源性外泌体结果。(f)Aptamer功能化的密度编码水凝胶微载体用肉眼检测肿瘤源性外泌体的示意图。
具体实施方式
以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述,但并不因此而限制本发明的保护范围。
本发明实施例中所提到的材料和仪器均为市售。其中HFE-7500购于3M公司;聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、甲基丙烯酰胺(MAA)、过硫酸铵(APS)、N,N,N',N'-三亚甲基二胺(TEMED)购于Sigma-Aldrich;PEGDA、1H,1H,2H,2H全氟辛醇(PFO)、Tris–HCl、NaCl、KCl、EDTA、Triton X-100、Span 80、己烷、Optiprep、硫黄素T(ThT)、MAA、荧光素异硫氰酸酯购于阿拉丁化学试剂网。Cy5异硫氰酸酯(Cy5-NHS)购于美伦生物技术有限公司(中国大连)。FSL表面活性剂购于Krytox,其主要成分包括:全氯聚醚羧酸。
本文所用到DNA序列均在北京擎科生物科技有限公司合成并采用HPLC法纯化。所有蛋白质来源于普健生物(武汉)科技有限公司。CD63抗体来源于Abcam。EPCAM,MUC1,HER2抗体来源于正能生物技术有限公司(中国成都)。健康人和肺癌患者的血液样本从中南湘雅三医院获得,所有的参与者均已签署认同书。
实施例
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1:
一种本发明的水凝胶微载体,其制备方法包括以下步骤:
(1)配制水相前体溶液和油相前体溶液:
1.1、配制水相前体溶液:
将PEGDA单体(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)和MAA(0%,w/v)混合得到水相前体溶液A1。
将PEGDA单体(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)和MAA(10%,w/v)混合,得到水相前体溶液A2;
将PEGDA单体(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)和MAA(20%,w/v)混合,得到水相前体溶液A3;
将PEGDA单体(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)和MAA(30%,w/v)混合,得到水相前体溶液A4。
1.2、配制油相前体溶液:将2%(w/w)FSL表面活性剂和0.4%(v/v)TEMED溶于HFE-7500油中。
(2)制备水凝胶液珠:分别将0.25mL水相前体溶液A1、A2、A3、A4和0.5mL油相前体溶液混合,在室温下以800rpm搅拌5分钟以形成反相悬浮液。
(3)将反相悬浮液在37℃下继续聚合3小时,形成密度编码的水凝胶微载体。
(4)微球荧光编码:将100μL含有5mg·mL-1Cy5-NHS酯的H2O溶液或100μL含有4mg·mL-1FITC-NHS酯的H2O溶液添加到30μL上述制得的密度编码的水凝胶微载体中得到反应混合物。将反应混合物在室温下孵育2小时,并避光过夜获得荧光和密度编码的水凝胶微载体。
图1为本发明生成密度编码水凝胶微载体的解码图。
实施例2:
一种本发明的水凝胶微载体,其制备方法包括以下步骤:
(1)配制水相前体溶液和油相前体溶液:
1.1、配制水相前体溶液:
将PEGDA单体(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)和明胶(0%,w/v)混合得到水相前体溶液B1。
将PEGDA单体(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)和明胶(2%,w/v)混合,得到水相前体溶液B2。
将PEGDA单体(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)和明胶(4%,w/v)混合,得到水相前体溶液B3。
1.2、配制油相前体溶液:将2%(w/w)FSL表面活性剂和0.4%(v/v)TEMED溶于HFE-7500油中。
(2)制备水凝胶液珠:分别将0.25mL水相前体溶液B1、B2、B3和0.5mL油相前体溶液混合,在室温下以800rpm搅拌5分钟以形成反相悬浮液。
(3)将反相悬浮液在37℃下继续聚合3小时,形成密度编码的水凝胶微载体。
(4)微球荧光编码:将100μL含有5mg·mL-1Cy5-NHS酯的H2O溶液或100μL含有4mg·mL-1FITC-NHS酯的H2O溶液添加到30μL上述制得的密度编码的水凝胶微载体中得到反应混合物。将反应混合物在室温下孵育2小时,并避光过夜获得荧光和密度编码的水凝胶微载体。
实施例2的密度编码的水凝胶微载体,用不同浓度的蔗糖溶液:27%(w/v)、30%(w/v)、33%(w/v)在15000rpm的转速下1h分离不同浓度的PEGDA和Gelatin(明胶)。分离结果参见图2。从图2中可以看出,通过离心,可以将不同密码的水凝胶微载体分离。
实施例3:
一种本发明的水凝胶微载体,其制备方法包括以下步骤:
(1)配制水相前体溶液和油相前体溶液:
1.1、配制水相前体溶液:
将丝素蛋白(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)和明胶(0%,w/v)混合得到水相前体溶液C1。
将丝素蛋白单体(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)和明胶(2%,w/v)混合,得到水相前体溶液C2。
1.2、配制油相前体溶液:将2%(w/w)FSL表面活性剂和0.4%(v/v)TEMED溶于HFE-7500油中。
(2)制备水凝胶液珠:分别将0.25mL水相前体溶液C1、C2和0.5mL油相前体溶液混合,在室温下以800rpm搅拌5分钟以形成反相悬浮液。
(3)将反相悬浮液在37℃下继续聚合3小时,形成密度编码的水凝胶微载体。
(4)微球荧光编码:将100μL含有5mg·mL-1Cy5-NHS酯的H2O溶液或100μL含有4mg·mL-1FITC-NHS酯的H2O溶液添加到30μL上述制得的密度编码的水凝胶微载体中得到反应混合物。将反应混合物在室温下孵育2小时,并避光过夜获得荧光和密度编码的水凝胶微载体。
实施例3的密度编码的水凝胶微载体,用不同浓度的optiprep溶液:20%(v/v)、30%(v/v)、35%(v/v)、40%(v/v)、45%(v/v)、50%(v/v)在15000rpm的转速下1h分离不同浓度的silk fibroin(丝素蛋白)和Gelatin(明胶)。分离结果参见图3,从图3中可以看出,通过离心,可以将不同密码的水凝胶微载体分离。
实施例4:
一种本发明的水凝胶微载体,其制备方法包括以下步骤:
(1)配制水相前体溶液和油相前体溶液:
1.1、配制水相前体溶液:
将PEGDA单体(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)和丝素蛋白(0%,w/v)混合得到水相前体溶液D1。
将PEGDA单体(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)和丝素蛋白(1.3%,w/v)混合,得到水相前体溶液D2。
将PEGDA单体(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)和丝素蛋白(2.7%,w/v)混合,得到水相前体溶液D3。
1.2、配制油相前体溶液:将2%(w/w)FSL表面活性剂和0.4%(v/v)TEMED溶于HFE-7500油中。
(2)制备水凝胶液珠:分别将0.25mL水相前体溶液D1、D2、D3和0.5mL油相前体溶液混合,在室温下以800rpm搅拌5分钟以形成反相悬浮液。
(3)将反相悬浮液在37℃下继续聚合3小时,形成密度编码的水凝胶微载体。
(4)微球荧光编码:将100μL含有5mg·mL-1Cy5-NHS酯的H2O溶液或100μL含有4mg·mL-1FITC-NHS酯的H2O溶液添加到30μL上述制得的密度编码的水凝胶微载体中得到反应混合物。将反应混合物在室温下孵育2小时,并避光过夜获得荧光和密度编码的水凝胶微载体。
实施例4的密度编码的水凝胶微载体,用不同浓度的蔗糖溶液:20%(w/v)、25%(w/v)、27%(w/v)在15000rpm的转速下1h分离不同浓度的PEGDA和silk fibroin(丝素蛋白)。分离结果参见图4,从图4中可以看出,通过离心,可以将不同密度的水凝胶微载体分离。
实施例5:
一种本发明的水凝胶微载体,其制备方法包括以下步骤:
(1)配制水相前体溶液和油相前体溶液:
1.1、配制水相前体溶液:
将PEGDA单体(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)和MAA(0%,w/v)混合得到水相前体溶液A1。
将PEGDA单体(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)和MAA(10%,w/v)混合,得到水相前体溶液A2。
将PEGDA单体(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)和MAA(20%,w/v)混合,得到水相前体溶液A3。
将PEGDA单体(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)和MAA(30%,w/v)混合,得到水相前体溶液A4。
1.2、配制油相前体溶液:将2%(w/w)FSL表面活性剂和0.4%(v/v)TEMED溶于HFE-7500油中。
(2)制备水凝胶液珠:
将1ml水相前体溶液A1和1ml油相前体溶液填充到1ml玻璃注射器(Hamilton)中,以注射泵驱动水相和油相流出,其中水相的流速为:1μL·min-1;油相的流速分别为2、4和6μL·min-1。使得水相和油相共同流过微流体装置,得到大小不同的水凝胶液珠A1-1、A1-2、A1-3。
将1ml水相前体溶液A2和1ml油相前体溶液填充到1ml玻璃注射器(Hamilton)中,以注射泵驱动水相和油相流出,其中水相的流速为:1μL·min-1;油相的流速分别为2、4和6μL·min-1。使得水相和油相共同流过微流体装置,得到大小不同的水凝胶液珠A2-1、A2-2、A2-3。
将1ml水相前体溶液A3和1ml油相前体溶液填充到1ml玻璃注射器(Hamilton)中,以注射泵驱动水相和油相流出,其中水相的流速为:1μL·min-1;油相的流速分别为2、4和6μL·min-1。使得水相和油相共同流过微流体装置,得到大小不同的水凝胶液珠A3-1、A3-2、A3-3。
将1ml水相前体溶液A4和1ml油相前体溶液填充到1ml玻璃注射器(Hamilton)中,以注射泵驱动水相和油相流出,其中水相的流速为:1μL·min-1;油相的流速分别为2、4和6μL·min-1。使得水相和油相共同流过微流体装置,得到大小不同的水凝胶液珠A4-1、A4-2、A4-3。
图5为本发明利用液滴微流控生产大小,密度编码水凝胶微载体的示意图和结果图。
将上述大小不同的水凝胶液珠分别用HFE-7500中的20%(v/v)PFO洗涤第一次、1%(v/v)Span-80的己烷洗涤第二次和TBSET溶液洗涤第三次。
TBSET缓冲液的配方是:822mL无核酸酶的水,10mL 1M Tris-HCl(pH 8.0),137mL1M NaCl,1.35mL 2M KCl,20mL 0.5M EDTA和10mL 10%(vol/vol)Triton X-100。
(3)固化:将上述水凝胶液珠在37℃过夜固化,形成密度和大小编码的水凝胶微载体。
(4)微球荧光编码:将100μL含有5mg·mL-1Cy5-NHS酯的H2O溶液或100μL含有4mg·mL-1FITC-NHS酯的H2O溶液添加到30μL上述制得的水凝胶微载体中得到反应混合物。将反应混合物在室温下孵育2小时,并避光过夜获得密度、大小和荧光三维编码的水凝胶微载体。
图6为本发明生成荧光编码水凝胶微载体的原理图。
(5)检测:将水凝胶微载体C通过离心清洗,纯化十次。随后,在20倍物镜以及560nm和488nm氩激光的多维活细胞成像系统OLYMPUS FV1200(FV1200)上成像。
图7为利用液滴微流控生产大小,密度编码水凝胶微载体的示意图。
图8为利用液滴微流控生产大小,密度编码水凝胶微载体的结果图。
实施例6
一种本发明的水凝胶微载体,其制备方法包括以下步骤:
(1)针对不同的靶标蛋白,设计不同的核酸适配体。核酸适配体包含人端粒重复序列HTG(HTG的序列为:TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG)和靶标蛋白。具体的DNA分子信息参见表1。
表一:DNA详细的序列信息
(2)配制水相前体溶液和油相前体溶液:
1.1、配制水相前体溶液:
将10μL 100μM的TMB-PSA、PEGDA单体(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)和MAA(0%,w/v)混合得到水相前体溶液E1。
将10μL 100μM的TMB-MUC1、PEGDA单体(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)和甲基丙烯酰胺(10%,w/v)混合,得到水相前体溶液E2。
将10μL 100μM的TMB-PDGF、PEGDA单体(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)和甲基丙烯酰胺(20%,w/v)混合,得到水相前体溶液E3。
将10μL 100μM的TMB-CEA、PEGDA单体(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)和甲基丙烯酰胺(30%,w/v)混合,得到水相前体溶液E4。
1.2、配制油相前体溶液:将2%(w/w)FSL表面活性剂和0.4%(v/v)TEMED溶于HFE-7500油中。
其余步骤与实施例1一致,得到水凝胶微载体e1、e2、e3、e4。
图9为本发明中将核酸适配体标记在密度编码的水凝胶微载体上的原理和结果图。其中(a)为核酸适配体序列在5'末端用Acrydite修饰,在PEGDA聚合过程中缀合的反应方程式。(b)为用与核酸适配体互补的修饰了FAM的DNA链验证核酸适配体是否成功修饰在密度编码水凝胶微载体上;图中,Ι表示密度编码水凝胶微载体上没有修饰核酸适配体;Π表示密度编码水凝胶微载体上连接上核酸适配体。从图中可知:核酸适配体成功修饰在密度编码的水凝胶微载体上。
实验一:通过DNA功能化的密度编码微珠检测多重疾病相关蛋白质
(1)将50μL实施例6的水凝胶微载体e1、e2、e3、e4与四种不同浓度的蛋白质同时在PBS中反应3小时。
四种蛋白质分别为:
前列腺特异抗原(PSA):10ng/mL、90ng/mL、370ng/mL、550ng/mL、730ng/mL。
粘蛋白1(MUC1):10ng/mL、120ng/mL、490ng/mL、740ng/mL、980ng/mL。
血小板衍生生长因子(PDGF):10ng/mL、120ng/mL、480ng/mL、730ng/mL、970ng/mL。
癌胚抗原(CEA):10ng/mL、78ng/mL、310ng/mL、470ng/mL、630ng/mL。
将反应后的水凝胶微载体用PBS洗涤两次后,在TMB缓冲液(含75mM KCl的20mMTris,pH 8.3)中用5μM ThT染色1h,再用TMB缓冲液洗两次。
(2)制备梯度浓度的蔗糖溶液:
2.1、配制不同浓度的蔗糖溶液:10w/v%、20w/v%、25w/v%、30w/v%、35w/v%、40w/v%、45w/v%、50w/v%。
2.2、通过逐层添加浓度降低的蔗糖溶液,可在离心管中直接制备密度梯度的蔗糖液。具体为:首先将0.2mL的50%蔗糖密度培养基添加到离心管中,然后,在第一层的顶部添加0.2mL的45%蔗糖密度培养基,以形成第二层。按照浓度递减的方式,逐步添加所有8层后,创建1.6mL 8层密度梯度介质。
(3)将四种不同的捕获了靶标蛋白的密度编码水凝胶微载体添加到密度梯度介质的顶层,并用离心管以2000rpm离心30分钟。然后用移液枪在离心管的各个位置手动取出每一层的微珠,得到的每层微珠用流式细胞仪进行荧光强度的测定。
图10为基于核酸适配体功能化的密度编码水凝胶微载体用于4重蛋白质检测原理和结果。
其中(a)为原理图,从图中可以看出:一旦设计的序列与靶标蛋白结合将释放HTG发夹,使HTG展开,并与ThT结合发出荧光,图中仅在靶标蛋白存在的情况下,水凝胶微载体的荧光强度会显著增强。
(b)是通过TMB-PSAADM特异性检测PSA蛋白的结果(在第五组中使用随机链代替PSA适体序列)。
(c)是荧光强度变化与PSA蛋白浓度之间的线性关系。
(d)是使用ADM同时检测一种,两种,三种和四种蛋白质。其中,I:仅PSA,II:PSA+MUC1,III:PSA+MUC1+PDGF,IV:所有四种蛋白质。
(e)是相应的荧光强度变化与PSA,MUC1,PDGF和CEA蛋白之间的线性关系。对b,c和e进行了三次重复,数据以平均值±SD显示。
从图10的结果可知:当四种蛋白同时存在检测体系中时,其各自的检测信倍比随着蛋白浓度的增大而增大。
实施例7:
一种本发明的HER2功能化的水凝胶微载体,其制备方法包括以下步骤:
(1)配制水相前体溶液和油相前体溶液:
1.1、配制水相前体溶液:
将PEGDA单体(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)、AptHER2 ref2和甲基丙烯酰胺(0%,w/v)混合得到水相前体溶液F1。
AptHER2 ref2的序列为:Acrydite-AAAAAGGGCCGTCGAACACGAGCATGGTGCGTGGACCTAGGATGACCTGAGTACTGTCC(SEQ ID NO.5)。
互补DNA序列-CO-HER2的序列为:GGACAGTACTCAGGTCATCCTAGGTCCACG(SEQ IDNO.6)。
其余步骤与实施例1一致,得到水凝胶微载体f1。
实施例8:
一种本发明的MUC1功能化的水凝胶微载体,制备方法包括以下步骤:
(1)配制水相前体溶液和油相前体溶液:
1.1、配制水相前体溶液:
将PEGDA单体(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)、AptMUC1 ref1和甲基丙烯酰胺(0%,w/v)混合得到水相前体溶液G1。
AptMUC1 ref1的序列为:Acrydite-AAAAAGCAGTTGATCCTTTGGATACCCTGG(SEQ IDNO.7)。
互补DNA序列CO-MUC1序列为:CCAGGGTATCCAAAGGATCAACTGC(SEQ ID NO.8)。
其余步骤与实施例1一致,得到水凝胶微载体g1。
实施例9:
一种本发明的CD63功能化的水凝胶微载体,其制备方法包括以下步骤:
(1)配制水相前体溶液和油相前体溶液:
1.1、配制水相前体溶液:
将PEGDA单体(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)、AptCD63 ref3和甲基丙烯酰胺(0%,w/v)混合得到水相前体溶液H1。
AptCD63 ref3的序列为:Acrydite-AAAAACACCCCACCTCGCTCCCGTGACACTAATGCTA(SEQID NO.9)。
互补DNA序列CO-CD63的序列为:TAGCATTAGTGTCACGGGAG(SEQ ID NO.10)。
其余步骤与实施例7一致,得到水凝胶微载体h1。
实施例10:
一种本发明的EpCAM功能化的水凝胶微载体,其制备方法包括以下步骤:
(1)配制水相前体溶液和油相前体溶液:
1.1、配制水相前体溶液:
将PEGDA单体(20%,w/v)、APS(0.3%,w/v)、AptEpCAM ref3和甲基丙烯酰胺(0%,w/v)混合得到水相前体溶液I1。
AptEpCAM ref3的序列为:Acrydite-AAAAACACTACAGAGGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGGGTTGGCCTG(SEQ ID NO.11)。
互补DNA序列CO-EpCAM的序列为CAGGCCAACCCCCCATGACAACGTGGGACA(SEQ IDNO.12)。
其余步骤与实施例7一致,得到水凝胶微载体i1。
实验2:通过HER2功能化的水凝胶微载体可视化的检测肿瘤源性外泌体:
(1)外泌体的分离和鉴定:
1.1、在37℃,含5%CO2(v/v)的潮湿环境中,人肝癌细胞系(HepG2)在DMEM培养基中培养,人正常肝细胞系LO2细胞在RPMI 1640培养基中培养。
1.2、将HepG2细胞和LO2细胞分别接种到细胞培养瓶中,并培养直至达到80%的汇合度。
1.3、收集步骤1.2的细胞培养上清液并离心。具体为:将细胞培养上清液以300g离心10分钟以去除分离的细胞,收集上清液并通过0.22μm过滤器(Merck Millipore)过滤以去除污染的凋亡小体,微囊泡和细胞碎片,得到过滤液。
1.4、将过滤液在Beckman Coulter OptimaTM L-100XP超速离心机中以100,000gavg在4℃下用32Ti转子离心70分钟,以沉淀外泌体。小心除去上清液,将含粗制外泌体的沉淀重悬于40mL冰冷的PBS中并合并。
1.5、进行第二轮超速离心(100000gavg,在4℃下进行70分钟),取沉淀,即为HepG2外泌体、LO2外泌体。
将两种外泌体重悬于500μL PBS中,并保存在-80℃下。
(2)将100μL水凝胶微载体f1分别与含有外泌体HepG2的500μL PBS溶液、含有外泌体LO2的500μL PBS溶液、含有HepG2和LO2的500μL PBS溶液,孵育15分钟。(对于临床样品,将10μL血浆用490μL PBS稀释)。
(3)制备梯度浓度的蔗糖溶液:
3.1、配制不同浓度的蔗糖溶液:10%(w/v)、20%(w/v)、25%(w/v)、30%(w/v)、35%(w/v)、40%(w/v)、45%(w/v)、50%(w/v)。
3.2、通过逐层添加浓度降低的蔗糖溶液,可在离心管中直接制备密度梯度液。具体为:首先将0.2mL的50%蔗糖密度培养基添加到离心管中,然后,在第一层的顶部添加0.2mL的45%蔗糖密度培养基,以形成第二层。按照浓度递减的方式,逐步添加所有8层后,创建1.6mL 8层密度梯度介质。
(4)将捕获了不同外泌体的水凝胶微载体f1添加到密度梯度介质的顶层,在15000rpm离心力下离心2h。
可以通过斜率变化肉眼分辨某些肿瘤源性外泌体的存在与大概的外泌体浓度。
图11为实验2检测的结果。
(a)为密度编码的水凝胶微载体与不同外泌体一起温育的结果;
I:将HER2功能化的密度编码水凝胶f1与HepG2外泌体一起温育的结果;
II:将HER2功能化的密度编码水凝胶f1与LO2外泌体一起温育的结果;
III:将HER2功能化的密度编码水凝胶f1与HepG2+LO2外泌体一起温育的结果。
从图中可以看出:仅在HepG2外泌体存在的情况下,密度梯度离心后才观察到倾斜。
(b)为倾斜角度与HepG2外泌体的浓度的关系图,从图中可以看出;倾斜角度与HepG2外泌体的浓度成正比。
(c)为将HER2功能化的密度编码水凝胶f1分别与LO2外泌体、HepG2外泌体孵育后成像结果。图中,I:LO2外泌体II:HepG2外泌体。从图中可以看出:HepG2外泌体一起孵育后,观察到紧密接触的aptamer功能化的密度编码水凝胶微载体。比例尺=500μm。
(5)为了释放捕获的肿瘤源性外泌体,使用与适配体的互补DNA序列:CO-HER2破坏外泌体识别。
CO-HER2的序列为:GGACAGTACTCAGGTCATCCTAGGTCCACG(SEQ ID NO.6)。
(6)用TEM,DLS和WB进一步分析释放的外泌体。
TEM检测:
通过动态光散射(DLS)检测器(Malvern Zetasizer 3000HS)测定粒度分布。
外泌体的TEM分析:将1μL外泌体悬浮液用9μL PBS稀释,然后吸附到镀铜的网格上10分钟。用滤纸除去多余的悬浮液,并使铜网干燥。然后将外泌体用1%磷钨酸钠进行负染10分钟。用JEOL-3010透射电子显微镜观察样品。
蛋白质印迹分析:
1、外泌体裂解物的制备:取超速离心获得的外泌体标准品和PBS洗涤后的细胞悬液各50μL,加入50μL裂解液(50μL RIPA和0.5μL PMSF混合液)于冰上裂解30min,4℃16000g离心20min,将上清液转移至放置在冰上的新离心管中。然后用BCA法确定蛋白浓度。
2、样品制备:取一定量的外泌体裂解液加入1/4体积的5xLoading buffer;混匀后,100℃煮沸5min,置于冰上冷却。
3、凝胶制备和电泳:按照常规配方配制12%的蛋白分离胶。外泌体样品按照每孔20网的蛋白量上样到SDS-PAGE凝胶孔中,细胞裂解液样品按照每孔15μL的蛋白量上样到SDS-PAGE凝胶孔中,设置初始电压80V,待全部样品进入分离胶后调节电压为100V,电泳1h。
4、转膜:根据胶的大小剪取合适大小的PVDF膜,甲醇活化5min,随后放入转膜液中,按照顺序依次放置滤纸、PVDF膜、胶、滤纸,用转膜夹夹好,对应好电极,加入转膜缓冲液,100mA电流转膜60min。
5、封闭:将转好的PVDF膜放入TBST溶液中置于摇床上清洗两次,每次10min,然后加入封闭液(5%脱脂奶粉)室温下封闭2h,再用TBST清洗3次。
6、抗体孵育:将膜放在含有适当浓度一抗的TBST溶液中,4℃过夜孵育膜;再次用TBST溶液清洗3次,每次10min,加入含有适当浓度二抗的TBST溶液,置于摇床上室温孵育2h。
7、显色和拍照:配置好显色液(显色液采用碧云天公司的BeyoECL moon极超敏ECL化学发光试剂盒中的1mlA液加1mlB液)滴加在膜上,利用显影技术采集化学发光图像。
图11中(d)为释放和分析捕获的囊泡图像。其中I为aptamer功能化的密度编码水凝胶捕获外泌体后用互补链竞争释放后的aptamer功能化的密度编码水凝胶微载体的明场图,比例尺=500μm。II:释放的HepG2外泌体的TEM图像。比例尺=200nm。III:释放的HepG2外泌体的DLS分析。IV:释放的HepG2外泌体的CD63表达的WB分析。从图中可以看出:本发明的密度相关的水凝胶微载体在血清中可以成功实现对肿瘤源性外泌体的捕获与释放。
实验3:通过EPCAM功能化的密度编码水凝胶微载体,MUC1功能化的密度编码水凝胶微载体和HER2功能化的密度编码水凝胶微载体可视化的检测肿瘤源性外泌体:
检测方法与实验2一致。
图11中(e)为EPCAM功能化的密度编码水凝胶微载体,MUC1功能化的密度编码水凝胶微载体和HER2功能化的密度编码水凝胶微载体用于检测来自肺癌患者和健康供体的血浆中的肿瘤源性外泌体结果:从图中的结果可知:预计患者血浆中的外泌体过表达EPCAM和HER2,这是两种与癌症相关的生物标志物。
图11中(f)为功能化的密度编码水凝胶微载体用肉眼检测肿瘤源性外泌体的示意图。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上,然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员,在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下,都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰,或修改为等同变化的等效实施例。因此,凡是未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰,均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 湖南大学
<120> 水凝胶微载体及其制备方法和应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aaaaaaaaaa agggttaggg ttagggttag gggctattaa ttaaagctcg ccatcaaata 60
gcccctaac 69
<210> 2
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaaaaaaaaa agggttaggg ttagggttag ggccaggggc agttgatcct ttggataccc 60
tggccct 67
<210> 3
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aaaaaaaaaa agggttaggg ttagggttag ggcaggacag gctacggcac gtagagcatc 60
accatgatcc tgccc 75
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaaaaaaaaa agggttaggg ttagggttag ggaattgata ccagcttatt caattccc 58
<210> 5
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaaaagggcc gtcgaacacg agcatggtgc gtggacctag gatgacctga gtactgtcc 59
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggacagtact caggtcatcc taggtccacg 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aaaaagcagt tgatcctttg gataccctgg 30
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccagggtatc caaaggatca actgc 25
<210> 9
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaaaacaccc cacctcgctc ccgtgacact aatgcta 37
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tagcattagt gtcacgggag 20
<210> 11
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaaaacacta cagaggttgc gtctgtccca cgttgtcatg gggggttggc ctg 53
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caggccaacc ccccatgaca acgtgggaca 30
Claims (11)
1.一种水凝胶微载体,其特征在于,以油相溶液为载体,包含引发剂和两种或两种以上的成胶材料的水相溶液分散在所述油相溶液中,通过改变不同成胶材料之间的浓度比,形成密度编码的水凝胶微载体。
2.根据权利要求1所述的水凝胶微载体,其特征在于,将所述水凝胶微载体用异氰酸酯修饰的染料标记,形成密度和颜色二维编码的水凝胶微载体。
3.根据权利要求2所述的水凝胶微载体,其特征在于,利用微流控技术,不同流速的油相溶液通过剪切力将水相溶液斩断形成粒径不同的水凝胶液珠,形成大小、密度和颜色三维编码的水凝胶微载体。
4.根据权利要求1所述的水凝胶微载体,其特征在于,生物分子通过化学键偶联在水凝胶微载体上。
5.根据权利要求4所述的水凝胶微载体,其特征在于,所述生物分子为包含人端粒重复序列HTG和靶标蛋白的核酸适配体,所述核酸适配体为TMB-PSA、TMB-MUC1、TMB-PDGF、TMB-CEA中的一种或多种;
所述TMB-PSA的DNA序列为SEQ ID NO.1所示的序列;
所述TMB-MUC1的DNA序列为SEQ ID NO.2所示的序列;
所述TMB-PDGF的DNA序列为SEQ ID NO.3所示的序列;
所述TMB-CEA的DNA序列为SEQ ID NO.4所示的序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的水凝胶微载体,其特征在于,所述水相溶液中成胶材料为聚乙二醇二丙烯酸酯、甲基丙烯酰胺、丝素蛋白和明胶中的一种或多种的组合物;
和/或,所示引发剂为过硫酸铵;
和/或,所述油相溶液为含氟油;
和/或,所述油相溶液包括表面活性剂、催化剂和含氟油;所述催化剂为四甲基乙二胺;所述表面活性剂为FSL表面活性剂;所述含氟油为HFE-7500油或FC-40油。
7.一种权利要求1至6中任一项所述的水凝胶微载体的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
S1-1、将两种或两种以上不同浓度比的成胶材料与引发剂混合得到水相溶液;
S1-2、将水相溶液包裹在油相溶液中,形成水凝胶液珠,
S1-3、将所述水凝胶液珠固化成密度编码的水凝胶微载体。
8.根据权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述制备方法中,S1-1具体为:
将两种或两种以上不同浓度比的成胶材料、引发剂和生物分子混合得到水相溶液,将表面活性剂和TEMED溶于油介质中得到油相溶液;
和/或,所述S1-2具体为:将水相溶液和油相溶液分别装入注射器中,连接到微流控器件上,在所述微流控器件中水相和油相通道的交汇处,不同流速的油相溶液通过剪切力将水相溶液斩断成粒径不同的水凝胶液珠;
和/或,所述制备方法还包括:
S1-4、将所述水凝胶微载体和含有异氰酸酯修饰的染料的溶液孵育,获得荧光编码的水凝胶微载体。
9.一种权利要求1至6中任一项所述的水凝胶微载体在制备检测多种肿瘤标志物的试剂盒中的应用;其特征在于,所述应用的方法为:
A1、针对不同的靶标蛋白,设计不同的检测DNA分子;
A2、用不同密度的水凝胶微载体包被不同种类蛋白质的检测DNA分子,在PBS中反应3小时,染色;
A3、制备梯度浓度的蔗糖梯度,将捕获了不同靶标蛋白的密度编码水凝胶微载体添加到密度梯度溶液的顶层,并离心分散;
A4、取出分散在不同浓度层蔗糖溶液中的水凝胶微载体,进行荧光强度的测定。
10.一种权利要求1至6中任一项所述的水凝胶微载体在制备可视化检测肿瘤源性外泌体、核酸、蛋白的试剂盒中的应用,其特征在于,所述应用的方法为:
B1、根据肿瘤源性外泌体、核酸或蛋白设计核酸适配体,将核酸适配体与所述水凝胶微载体通过化学键连接得到功能化的水凝胶微载体;
B2、将所述功能化的水凝胶微载体与外泌体、核酸或蛋白孵育获得混合溶液;
B3、制备梯度浓度的蔗糖梯度,将所述混合溶液添加到密度梯度溶液的顶层,并离心分散;
B4、使用与适配体的互补DNA序列破坏肿瘤源性外泌体、核酸或蛋白的识别,检测释放的外泌体、核酸或蛋白。
11.根据权利要求10所述的应用,其特征在于,所述核酸适配体为AptHER2 ref2、AptMUC1 ref1、AptCD63 ref3、AptEpCAM ref3中的一种或多种;
所述AptHER2 ref2的DNA序列如SEQ ID NO.5所示;所述AptHER2 ref2的互补DNA序列如SEQ IDNO.6所示;
所述AptMUC1 ref1的DNA序列如SEQ ID NO.7所示;所述AptMUC1 ref1的互补DNA序列如SEQ IDNO.8所示;
所述AptCD63 ref3的DNA序列如SEQ ID NO.9所示;所述AptCD63 ref3的互补DNA序列如SEQ IDNO.10所示;
所述AptEpCAM ref3的DNA序列如SEQ ID NO.11所示;所述AptEpCAM ref3的互补DNA序列如SEQID NO.12所示。
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