CN108663355A - 一种化学发光时间分辨检测微流控纸芯片及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种化学发光时间分辨检测微流控纸芯片及其制备方法和应用，所述纸芯片是以滤纸为基底，在所述基底上设置有进样孔、流通通道以及检测孔；所述流通通道包括一个主流通通道和多个次级流通通道；主流通通道的一端连接进样孔，另一端连接检测孔，从主流通通道的中部以一定角度发生偏转分流即为二级流通通道，二级流通通道的一端与主流通通道的中部相连，另一端连接检测孔，以此类推；所述检测孔内依次置有壳聚糖、特异性氧化酶和化学发光催化剂。本发明微流控纸芯片通过微流控流路设计，达到化学发光的时间分辨检测，无需修饰，面积小，可用于葡萄糖、尿酸、胆固醇等的同时检测。

Description

一种化学发光时间分辨检测微流控纸芯片及其制备方法和 应用

技术领域

本发明涉及一种化学发光时间分辨检测微流控纸芯片及其制备方法和应用，属于微流控纸芯片制作技术领域。

背景技术

微流控纸芯片是近几年发展起来的一种基于纸的微流控分析技术平台，其以纸作为制作材料，用一定的技术手段，包括蜡印、等离子处理、喷墨打印、绘图和激光光刻等技术，在纸上加工出具有一定结构的亲疏水的微细通道网络。微流控纸芯片集成了进样、反应、检测等一系列操作，具有成本低廉、便携、操作简便、试剂消耗少、分析速度快、生物相容性好、可多元检测等优点，在临床检测、环境监控、食品安全分析以及快速检测、即时诊断分析器件的研制等领域具有广阔的应用前景。

目前，微流控纸芯片主要采用比色法进行检测。比色法通过目视检测可进行简单的“是/否”响应或给出半定量结果。但纸芯片比色分析法的检测灵敏度较低，选择性较差，不利于低含量样品的准确定量测定。因此，开发基于微流控纸芯片的高灵敏、高选择性分析方法是当然研究领域的热点之一。

化学发光是物质在进行化学反应过程中伴随的一种光辐射现象，其不需要外部光源，因而消除了由于光源带来的分析误差，使得该方法具有灵敏度高、线性范围宽、仪器简单、分析速度快等优点。将微流控纸芯片与化学发光检测方法相结合，可望开发出新型化学发光微流控纸芯片。而此方面的研究，在国内外仍处于起步阶段。已开发的化学发光型纸芯片，通常使用超微弱化学发光检测仪检测发光信号，在检测过程中，检测仪器只能记录总发光强度随时间变化的信号。因此，难以实现不同物质的高通量同时检测。如果能通过纸芯片的流路设计，使不同检测区域按一定时间顺序先后发生化学发光反应，从而使检测仪器按一定的时间顺序先后接收到来自不同检测区域的化学发光信号，达到化学发光信号的时间分辨检测，可望实现不同物质的多通道同时检测。

CN 103055967A公开了一种操作简单、低成本、多通道微流控化学发光纸芯片的制备及在现场检测中的应用，其通过设计具有不同流通通道长度的纸芯片以实现化学发光信号的时间分辨检测。

CN 105944773A公开了一种用于化学发光时间分辨的纸芯片及其制作方法，是一种通过在相同长度的流通通道上覆盖不同长度的聚二甲基硅氧烷，实现纸芯片上样品迁移速率的控制以实现不同检测区域化学发光信号的时间分辨检测。

上述两个工作开创了化学发光时间分辨检测微流控纸芯片的新方法，但是在实施起来仍存在一些缺陷。比如，前者设计了直线行流通通道，需要相当长的通道以及较长的通道间长度差，才可实现较好的化学发光时间分辨检测，通道过长容易使纸芯片由于面积过大超过仪器检测光窗面积，以及容易出现溶液迁移到一定长度而无法前进的情况；而后者使用了聚二甲基硅氧烷修饰流通通道，给操作带来一定的麻烦，此外通道中的聚二甲基硅氧烷，对样品溶液以及化学发光信号可能产生一定影响，从而限制了其使用范围。

发明内容

本发明旨在提供一种化学发光时间分辨检测微流控纸芯片及其制备方法和应用。本发明微流控纸芯片通过微流控流路设计，达到化学发光的时间分辨检测，无需修饰，面积小，可用于葡萄糖、尿酸、胆固醇等的同时检测。

本发明化学发光时间分辨检测微流控纸芯片，是以滤纸为基底，在所述基底上设置有进样孔、流通通道以及检测孔。

所述流通通道包括一个主流通通道和多个次级流通通道，所述多个次级流通通道按顺序依次称为二级流通通道、三级流通通道……，n级流通通道，n为≥2的整数；主流通通道的一端连接进样孔，另一端连接检测孔，从主流通通道的中部以一定角度发生偏转分流即为二级流通通道，二级流通通道的一端与主流通通道的中部相连，另一端连接检测孔，以此类推，下一级流通通道的一端与上一级流通通道的中部相连，另一端连接检测孔。

下一级流通通道相对于上一级流通通道的偏转方向相同；进一步地，下一级流通通道相对于上一级流通通道的偏转角度相同，优选为60°。

本发明流通通道为环形分叉设计，流通通道的数量与检测孔的数量对应相同，通过控制流通通道以及检测孔的数目，可实现多个化学发光峰的时间分辨检测。

所述进样孔为圆形，直径为8mm；检测孔为圆形，直径为6mm。

所述一级流通通道的长度设置为5mm，各次级流通通道的长度设置为8mm，各流通通道的宽度设置为3mm。

纸芯片可裁剪为圆形，圆形纸芯片的直径≤28mm。

本发明化学发光时间分辨检测微流控纸芯片中，进样孔、流通通道以及检测孔为亲水通道，通过滤纸直接构建；其余部分均为疏水材料。所述疏水材料优选为石蜡。

所述滤纸优选Whatman 1号滤纸。

所述检测孔内依次置有壳聚糖、特异性氧化酶和化学发光催化剂。每个检测孔内可添加相同或不同的特异性氧化酶。当检测孔内添加相同的特异性氧化酶，与特异性底物反应后产生的化学发光峰的相对强度值之间的相对标准偏差在5％以内；当检测孔内添加不同的特异性氧化酶，可用于不同特异性底物的同时检测。

所述特异性氧化酶包括葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、胆固醇氧化酶、乳酸氧化酶、胆碱氧化酶、血红素氧化酶、甘油磷酸氧化酶等。

所述化学发光催化剂为辣根过氧化物酶或含钴离子的金属盐。所述含钴离子的金属盐优选氯化钴或硫酸钴。

本发明化学发光时间分辨检测微流控纸芯片的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：首先在计算机上利用画图软件设计微流控纸芯片图案，制备纸芯片图案的丝网印刷模板，利用石蜡作为疏水材料，通过丝网印刷的方式在滤纸上印制纸芯片图案，随后放入恒温干燥箱，于120℃加热3分钟，使石蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成亲疏水的微通道网络，得到微流控纸芯片；

步骤2：将壳聚糖、特异性氧化酶、化学发光催化剂依次加入检测孔中，4℃下干燥保存，即得化学发光时间分辨检测微流控纸芯片。

本发明化学发光时间分辨检测微流控纸芯片的应用，包括如下步骤：

1、将5.0μL待测样品溶液分别滴加至微流控纸芯片的检测孔中，室温下反应10min；

2、将微流控纸芯片放入超微弱化学发光检测仪中的固定位置，使微流控纸芯片的进样孔正对超微弱化学发光检测仪的进样管管口，将化学发光试剂通过进样管滴加至微流控纸芯片的进样孔中，开始检测；通过依次出现的化学发光峰的峰值大小判断目标物是否存在并对其含量进行测定。

所述化学发光试剂为能与过氧化氢发生化学发光反应的化学发光试剂，优选鲁米诺、异鲁米诺或光泽精。

本发明实现葡萄糖、尿酸以及胆固醇同时检测的方式为：待测样品溶液中的葡萄糖、尿酸以及胆固醇在各自检测区上特异性氧化酶的催化下定量产生过氧化氢，化学发光试剂在毛细作用的驱动下，依次流经四个检测区，并与上述各自检测区产生的过氧化氢在化学发光催化剂的催化下迅速发生化学发光反应，产生化学发光信号。由于化学发光试剂到达四个检测区的时间不同，可实现不同检测区化学发光信号的时间分辨检测，从而实现在同一个化学发光检测窗口下多物质的同时检测。

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、本发明的纸芯片为环形分叉设计，可裁剪为圆形，圆形纸芯片直径不超过28mm，通过控制各级流通通道的方向和数目，可实现二个、三个、四个、五个等化学发光峰的时间分辨检测，克服了直线型流通通道由于通道长度过长超过超微弱化学发光检测仪的检测光窗面积(检测光窗直径50mm)，以及由于通道长度过长样品在通道内迁移受限等缺点；且流通通道无需延迟试剂修饰，克服了延迟试剂对样品溶液以及化学发光反应信号的影响。

2、本发明用于葡萄糖、尿酸以及胆固醇同时检测的化学发光时间分辨微流控纸芯片，以壳聚糖修饰纸芯片检测区纸基基底，壳聚糖保护并稳定纸芯片检测区的试剂以及酶，克服了由于试剂在检测区域的毛细迁移现象引起的信号不稳定问题，且上述微流控纸芯片具有制作方法简单、成本低廉、快速、可多元检测等优点，适合于在纸芯片上实现不同物质的同时测定。

附图说明

图1是实施例1中化学发光时间分辨检测微流控纸芯片设计图案。

图2是实施例1中化学发光时间分辨检测微流控纸芯片实现试液按照一定时间顺序先后到达四个检测孔的实际效果图。

图3是实施例2利用化学发光时间分辨检测微流控纸芯片实现三个化学发光峰的时间分辨检测的化学发光信号图。

图4是实施例3中获得的葡萄糖浓度与检测孔相对发光强度信号之间的曲线图。

图5是实施例3中获得的尿酸浓度与检测孔相对发光强度信号之间的曲线图。

图6是实施例3中获得的胆固醇浓度与检测孔相对发光强度信号之间的曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

具体制作、组装和检测过程如下：

1)首先利用Computer Aided Design(CAD)画图软件设计化学发光时间分辨检测微流控纸芯片的图案(如附图1所示)。纸芯片的设计参数如下：

圆形进样孔连接一级流通通道，一级流通通道中部分叉出二级流通通道，二级流通通道向一方向偏转60°分叉出三级流通通道，三级流通通道向同一方向偏转60°分叉出四级流通通道。各次级流通通道一端连接上一级流通通道中部，另一端连接圆形检测孔。

上述圆形进样孔直径为8mm，上述各检测直径为6mm，上述一级流通通道从进样孔到检测孔之间的长度为5mm，各次流流通通道从分叉点到检测孔之间的长度为8mm，各流通通道的宽为3mm。

本实施例微流控纸芯片的流通通道总数为四个，检测孔总数为四个。按附图1虚线所示裁剪为圆形纸芯片，圆形纸芯片最大直径28mm。

上述四个检测孔依次标号为1，2，3，4号，进样孔标号为5号。

2)依据附图1设计的微流控纸芯片图案，制备丝网印刷模板，利用石蜡作为疏水材料，通过丝网印刷方法在滤纸上印制微流控纸芯片图案，将经丝网印刷后的滤纸放入恒温干燥箱，于120℃加热3分钟，使石蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成亲疏水的微通道网络，得到用于化学发光时间分辨检测的微流控纸芯片。

3)在本实施例制备得到微流控纸芯片的进样区域滴加100μL黄色百里香酚蓝—酚酞混合指示剂溶液，记录黄色指示剂溶液的毛细迁移过程，记录黄色指示剂溶液迁移至各二级流通通道上四个检测孔的时间，分别测定出指示剂溶液充满各个检测孔的时间依次为5s、10s、25s、38s，结果见附图2。由图2可见，该微流控纸芯片可实现试液按照一定时间顺序先后到达各个检测孔。

实施例2：

为了证明本发明的微流控纸芯片可实现化学发光信号的时间分辨检测，发明人组装化学发光功能化的微流控纸芯片，利用化学发光仪检测过氧化氢。具体方法如下：

1)首先利用Photoshop CS4软件设计用于化学发光时间分辨检测的微流控纸芯片的图案。纸芯片的设计参数如下：

圆形进样孔连接一级流通通道，一级流通通道中部分叉出二级流通通道，二级流通通道向一方向偏转60°分叉出三级流通通道。各次级流通通道一端连接上一级流通通道中部，另一端连接圆形检测孔。

上述圆形进样孔直径为8mm，上述各检测直径为6mm，上述一级流通通道从进样孔到检测孔之间的长度为5mm，各次流流通通道从分叉点到检测孔之间的长度为8mm，各流通通道的宽为3mm。

本实施例微流控纸芯片流通通道总数为三个，检测孔数目为三个。

2)在上述步骤1)得到的微流控纸芯片的三个检测区域内依次滴加3μL浓度为1mg/mL的壳聚糖，3μL 0.01mol/L的鲁米诺和3μL 1mmol/L的氯化钴溶液，室温干燥3min，制备得到化学发光功能化的微流控纸芯片。

3)将上述化学发光功能化的微流控纸芯片放入超微弱化学发光检测仪中的固定位置，使微流控纸芯片的进样孔正对检测仪进样管管口。用移液枪通过检测仪进样管向微流控纸芯片的进样孔加入100μL 0.01mol/L过氧化氢溶液(用0.1mol/L的NaOH水溶液稀释制得)，利用超微弱化学发光检测仪的光电倍增管进行化学发光检测。过氧化氢溶液通过毛细作用力向三个检测区域迁移，由于过氧化氢到达三个检测区域的时间不相等，可依次检测到三个检测区的化学发光发光信号，具体如图3所示。由图3可见，该微流控纸芯片可实现化学发光信号的时间分辨检测。

实施例3：

为了证明本发明的有益效果，发明人采用实施例2的纸芯片，制备用于葡萄糖、尿酸及胆固醇同时检测的化学发光微流控纸芯片，具体方法如下：

1)首先按照实施例2步骤1)所述制备微流控纸芯片。本实施例微流控纸芯片流通通道总数为三个，检测孔数目为三个。

2)将壳聚糖溶解于0.25％(v/v)的冰乙酸中，配制得到1mg/mL的壳聚糖溶液，分别将3.0μL上述1mg/mL的壳聚糖溶液滴加至纸芯片的三个检测孔中，室温干燥3分钟。

3)将3.0μL 50U/mL葡萄糖氧化酶和0.15mg/mL辣根过氧化酶混合液加入到纸芯片标号为1的葡萄糖检测区；将3.0μL 50U/mL的尿酸氧化酶和0.15mg/mL辣根过氧化酶混合液加入到纸芯片标号为2的尿酸检测区；将3.0μL 50U/mL的胆固醇氧化酶和0.15mg/mL辣根过氧化酶混合液加入到纸芯片标号为3的胆固醇检测区。得到用于葡萄糖、尿酸、胆固醇同时检测的微流控纸芯片，于4℃干燥保存。

4)将5.0μL样品溶液滴加至上述标号为1-3的三个检测区，于室温反应10min。之后，将上述用于葡萄糖、尿酸、胆固醇同时检测的微流控纸芯片放入超微弱化学发光检测仪中的固定位置。

5)用移液枪通过仪器进样管向微流控纸芯片的进样孔加入100μL 0.01mol/L的鲁米诺溶液(溶于0.1mol/L的NaOH溶液)，利用超微弱化学发光检测仪进行化学发光检测。鲁米诺溶液通过毛细作用迁移至三个检测孔，由于鲁米诺溶液到达三个检测孔的时间不等，化学发光检测仪可依次检测到三个化学发光发光信号。其中，1号检测孔的化学发光峰为葡萄糖的检测信号，2号检测孔的化学发光峰为尿酸的检测信号，3号检测孔的化学发光峰为胆固醇的检测信号。统计三个化学发光峰各自起峰位置的发光强度和各自最高化学发光强度，利用各个化学发光峰的最高化学发光峰强度减去各自起峰位置的发光强度计算三个化学发光峰的相对发光强度。利用origin软件处理实验数据，获取葡萄糖、尿酸以及胆固醇浓度与其各自检测孔相对发光强度信号之间的关系图，图4、图5、图6所示。因此，本发明的时间分辨化学发光检测微流控纸芯片可实现对葡萄糖、尿酸以及胆固醇的同时检测。

实施例4：

为了证明本发明的有益效果，发明人采用实施例3的纸芯片，检测实际血样葡萄糖、尿酸以及胆固醇的浓度，具体方法如下：

1)首先按照实施例3步骤1)、步骤2)和步骤3)制备用于葡萄糖、尿酸以及胆固醇同时检测的微流控纸芯片。本实施例微流控纸芯片流通通道总数为三个，检测孔数目为三个。

2)在微流控纸芯片的三个检测孔中滴加5.0μL经超滤后的血清样品，反应10min后，之后，将上述用于葡萄糖、尿酸以及胆固醇同时检测的微流控纸芯片放入超微弱化学发光检测仪中的固定位置。

3)用移液枪通过仪器进样管向微流控纸芯片的进样孔加入100μL 0.01mol/L的鲁米诺溶液(溶于0.1mol/L的NaOH溶液)，利用超微弱化学发光检测仪进行化学发光检测。根据化学发光检测仪检测到的化学发光信号数目和各化学发光峰的相对发光强度，依据实验得到的标准曲线的线性回归方程，判断和计算血清样品中葡萄糖、尿酸以及胆固醇的含量，其检测结果如表1所示。检测结果表明上述血清样品中含4.05mmol/L葡萄糖、0.37mmol/L尿酸以及0.21mmol/L游离胆固醇。上述检测结果与正常人血清样品中葡萄糖、尿酸以及游离胆固醇的含量相符。本实施例进一步利用加标回收实验对本实施例纸芯片的检测准确性进行考察，向上述血样中定量加入1mmol/L葡萄糖、0.2mmol/L尿酸以及0.2mmol/L胆固醇的标准溶液，检测加标血样中葡萄糖、尿酸以及胆固醇的含量，并计算其回收率和检测数据之间的标准偏差，其检测结果如表1所示。由表1可见，其回收率在84-105％之间，标准偏差小于5％，加标回收实验数据理想，上述数据表明利用本实施例纸芯片可实现实际血样中葡萄糖、尿酸、胆固醇以及胆碱的同时检测，检测结果准确。

表1本实施例微流控纸芯片检测血清中葡萄糖、尿酸以及胆固醇。

Claims (10)

1.一种化学发光时间分辨检测微流控纸芯片，其特征在于：所述化学发光时间分辨检测微流控纸芯片是以滤纸为基底，在所述基底上设置有进样孔、流通通道以及检测孔；

所述流通通道包括一个主流通通道和多个次级流通通道，所述多个次级流通通道按顺序依次称为二级流通通道、三级流通通道……，n级流通通道，n为≥2的整数；主流通通道的一端连接进样孔，另一端连接检测孔，从主流通通道的中部以一定角度发生偏转分流即为二级流通通道，二级流通通道的一端与主流通通道的中部相连，另一端连接检测孔，以此类推，下一级流通通道的一端与上一级流通通道的中部相连，另一端连接检测孔；下一级流通通道相对于上一级流通通道的偏转方向相同；

所述检测孔内依次置有壳聚糖、特异性氧化酶和化学发光催化剂。

2.根据权利要求1所述的化学发光时间分辨检测微流控纸芯片，其特征在于：

下一级流通通道相对于上一级流通通道的偏转角度相同，为60°。

3.根据权利要求1所述的化学发光时间分辨检测微流控纸芯片，其特征在于：

所述进样孔为圆形，直径为8mm；检测孔为圆形，直径为6mm。

4.根据权利要求1所述的化学发光时间分辨检测微流控纸芯片，其特征在于：

所述一级流通通道的长度设置为5mm，各次级流通通道的长度设置为8mm，各流通通道的宽度设置为3mm。

5.根据权利要求1所述的化学发光时间分辨检测微流控纸芯片，其特征在于：

所述进样孔、流通通道以及检测孔为亲水通道，通过滤纸直接构建；其余部分均为疏水材料。

6.根据权利要求1所述的化学发光时间分辨检测微流控纸芯片，其特征在于：

所述滤纸为Whatman 1号滤纸。

7.根据权利要求1所述的化学发光时间分辨检测微流控纸芯片，其特征在于：

所述特异性氧化酶包括葡萄糖氧化酶、尿酸氧化酶、胆固醇氧化酶、乳酸氧化酶、胆碱氧化酶、血红素氧化酶或甘油磷酸氧化酶；

所述化学发光催化剂为辣根过氧化物酶或含钴离子的金属盐。

8.一种权利要求1-7中任一种化学发光时间分辨检测微流控纸芯片的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

步骤1：首先在计算机上利用画图软件设计微流控纸芯片图案，制备纸芯片图案的丝网印刷模板，利用石蜡作为疏水材料，通过丝网印刷的方式在滤纸上印制纸芯片图案，随后放入恒温干燥箱，于120℃加热3分钟，使石蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成亲疏水的微通道网络，得到微流控纸芯片；

步骤2：将壳聚糖、特异性氧化酶、化学发光催化剂依次加入检测孔中，即得化学发光时间分辨检测微流控纸芯片，4℃下干燥保存。

9.一种权利要求1-7中任一种化学发光时间分辨检测微流控纸芯片的应用，其特征在于包括如下步骤：

步骤1：将5.0μL待测样品溶液分别滴加至微流控纸芯片的检测孔中，室温下反应10min；

步骤2：将微流控纸芯片放入超微弱化学发光检测仪中的固定位置，使微流控纸芯片的进样孔正对超微弱化学发光检测仪的进样管管口，将化学发光试剂通过进样管滴加至微流控纸芯片的进样孔中，开始检测；通过依次出现的化学发光峰的峰值大小判断目标物是否存在并对其含量进行测定。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：

所述化学发光试剂为鲁米诺、异鲁米诺或光泽精。