CN104624259A - 一种简易、高通量微流控化学发光纸芯片的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种简易、高通量微流控化学发光纸芯片的制备及应用。采用全打印模式，在一张B5大小的普通滤纸上，批量打印出多个微流控化学发光纸芯片。打印过程包括：批量打印疏水蜡图案；熔蜡成型；批量打印化学发光试剂墨图案；批量打印氧化酶墨图案；批量打印流速调节疏水蜡图案；微流控化学发光纸芯片的激光切割；将制备的微流控化学发光纸芯片进行塑封处理。一种微流控化学发光纸芯片的现场检测的方法，包括如下步骤：将塑封的微流控化学发光纸芯片放入掌上发光检测仪的暗盒中；将样品溶液滴加到进样区内；然后盖上暗盒盖，开始检测。通过依次出现的32个化学发光峰值的大小来依次判断检测的32种组分是否存在及含量。

Description

一种简易、高通量微流控化学发光纸芯片的制备及应用

技术领域

本发明涉及简易、廉价、高通量的现场即时分析检测技术领域，更具体地说是一种基于化学发光分析方法的微流控纸芯片实验室技术平台的构建。

背景技术

食品安全、人类重大疾病、养殖业重大畜禽疫病以及环境持久污染物、环境激素等直接影响人民的生活健康和生命安全。因此，加强食品质量安全控制、建立食品中农药残留等有害物质分析平台、开展恶性肿瘤等重大疾病的早期诊断与预防、加强畜禽疫病高效防治技术研究、开发简便易行、灵敏特异的诊断技术是目前亟待解决的难题，对社会的发展和进步将起到积极的作用。

免疫分析法是解决上述问题的有效手段。免疫分析法是利用抗原与抗体特异性结合而建立的高选择性生物化学方法。在标记免疫分析法中，最为成熟的方法是放射免疫分析法，但由于放射性物质对人体的危害，它的应用受到限制。非放射免疫分析法包括酶联免疫分析法（ELISA）、荧光免疫分析法（FIA）和电化学免疫分析法（EIA）等，具有很好的精密度，但目前大多只能进行一种抗原或抗体的检测，且需要复杂的仪器设备及专业操作人员，样品前处理繁琐费时、检测费用高，难以满足高通量、快速即时检测（point-of-care testing, POCT）的需要，限制了其在常规检测中的推广应用。近年来，化学发光法（CL）在免疫分析中的应用受到广泛关注。物质在化学反应过程中间相互作用会引发发光现象，这种发光现象被称为化学发光。化学发光分析法则是在化学发光的基础上，利用化学发光检测器记录体系的发光强度，然后分析被测物浓度与发光强度之间在一定条件下所呈现出来的线性定量关系，从而确定被测物含量。而一般的化学发光仪器只能进行单一样品或单一组分检测，不能解决“钩状相应”、交叉污染、嗜异性抗体等对检测结果的影响，难以满足高通量、快速及在线检测的需要。例如目前常用的单一肿瘤标记物的检测，对肿瘤疾病的诊断容易出现假阳性或假阴性。而将肿瘤的首选标记物和补充标记物组合为特异性高、可以互补的肿瘤标志物组进行联合检测，即可提高肿瘤的检出准确率。为此，发展高通量、多组分、快速、准确的免疫分析检测技术具有重要的意义。

近年来，由于微流控芯片已从分离检测发展为包括复杂试样前处理的多功能全分析系统，从分析工具发展到包括在线检测的微型化学反应与合成手段。因此在微流控芯片上进行免疫分析，将微流控芯片的分析能力和抗原-抗体的特异性相结合，可提高反应效率，简化操作步骤，缩短检验时间，降低试剂和能量的消耗。微流控芯片多种功能结合与集成化的特点也使微流控芯片上的免疫分析与常规免疫分析相比有很多潜在的优势，因此受到越来越多的关注。将纸芯片实验室与化学发光免疫分析方法结合后，具有成本低、操作简单、特异性强、灵敏度高、线性范围宽、检测快速，易实现自动化，所用的试剂无放射性危害，稳定性好等特点。因此，开展基于纸芯片实验室的化学发光免疫分析研究，将实现对食品安全、重大疾病、养殖业疫病以及环境持久污染物等的简便快速、灵敏特异的诊断与防制。

发明内容

本发明要解决的技术问题是在微流控纸芯片上建立高灵敏、高特异性的多组分化学发光分析检测方法；该微流控纸芯片还具有简易、快速、廉价等特点，并用于样品中葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、乳酸、单酚、多酚、黄嘌呤、胆固醇、血红素、抗坏血酸、细胞色素、D-氨基酸、L-氨基酸、单胺、二胺、NADH、NADPH、赖氨酰、丙酮酸、乙醇、乙醛、胆碱、谷胱甘肽、肌酐、3-α-类固醇、胆红素、白蛋白、球蛋白、丙胺酸、脂肪酸和尿酸的同时检测。

为了解决上述技术问题，本发明是通过构建一种新型的微流控化学发光纸芯片来实现的，该微流控化学发光纸芯片的制备方法为：

(1) 在计算机上设计化学发光微流控纸芯片的中空通道疏水蜡批量打印图案，样式如附图1所示。

(2) 在计算机上设计与中空通道疏水蜡批量打印图案匹配的化学发光试剂批量打印图案，样式如附图2所示。

(3) 在计算机上设计与中空通道疏水蜡批量打印图案匹配的三十二个氧化酶批量打印图案，样式如附图3、附图4、附图5和附图6所示。

(4) 在计算机上设计与中空通道疏水蜡批量打印图案镜像匹配的流速调节疏水蜡批量打印图案，样式如附图7所示。

(5) 将滤纸剪裁成B5尺寸。

(6) 将步骤(5)中裁好的滤纸放置到喷蜡打印机中，将步骤(1)中的中空通道疏水蜡批量打印图案打印到步骤(5)中的滤纸上。

(7) 将步骤(6)中带有蜡图案的滤纸放置到平板加热器或者烘箱中，在60-150摄氏度下加热0.5-2分钟。使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙，原理如附图8所示。

(8) 将步骤(7)中制备的滤纸放入喷墨打印机中。按照步骤(2)中的化学发光试剂批量打印图案，将化学发光试剂墨打印到化学发光检测区中，然后按照步骤(3)中的氧化酶批量打印图案，将氧化酶墨打印到酶识别催化微通道中。一种氧化酶批量打印图案用来打印一种氧化酶墨：附图3A用于打印葡萄糖氧化酶墨；附图3B用于打印果糖氧化酶墨；附图3C用于打印半乳糖氧化酶墨；附图3D用于打印乳糖氧化酶墨；附图3E用于打印乳酸氧化酶墨；附图3F用于打印单酚氧化酶墨；附图3G用于打印多酚氧化酶墨；附图3H用于打印黄嘌呤氧化酶墨；附图4A用于打印胆固醇氧化酶墨；附图4B用于打印血红素氧化酶墨；附图4C用于打印抗坏血酸氧化酶墨；附图4D用于打印细胞色素氧化酶墨；附图4E用于打印D-氨基酸氧化酶墨；附图4F用于打印L-氨基酸氧化酶墨；附图4G用于打印单胺氧化酶墨；附图4H用于打印二胺氧化酶墨；附图5A用于打印NADH氧化酶墨；附图5B用于打印NADPH氧化酶墨；附图5C用于打印赖氨酰氧化酶墨；附图5D用于打印丙酮酸氧化酶墨；附图5E用于打印乙醇氧化酶墨；附图5F用于打印乙醛氧化酶墨；附图5G用于打印胆碱氧化酶墨；附图5H用于打印谷胱甘肽氧化酶墨；附图6A用于打印肌酐氧化酶墨；附图6B用于打印3-α-类固醇氧化酶墨；附图6C用于打印胆红素氧化酶墨；附图6D用于打印白蛋白氧化酶墨；附图6E用于打印球蛋白氧化酶墨；附图6F用于打印丙胺酸氧化酶墨；附图6G用于打印脂肪酸氧化酶墨；附图6H用于打印尿酸氧化酶墨。打印不同氧化酶墨时，只需更换喷墨打印机中的墨盒。

(9) 将步骤(8)中制备的滤纸放入激光切割机中，先沿蜡图案外边缘进行激光切割，再激光切割掉螺旋形区域，即蜡图案上的网格区域，形成中空通道，从而得到微流控化学发光纸芯片A，样式如附图9所示。

(10) 将步骤(6)中带有蜡图案的滤纸放入喷墨打印机中。按照步骤(4)中的与中空通道疏水蜡批量打印图案镜像匹配的流速调节疏水蜡批量打印图案，将流速调节疏水蜡打印到步骤(6)中的滤纸反面。

(11) 将步骤(10)中带有蜡图案的滤纸放置到平板加热器或者烘箱中，在60-150摄氏度下加热0.5-2分钟。使蜡融化并浸透整个纸的厚度，形成疏水墙，原理如附图8所示，形成的滤纸正面如附图10所示。

(12) 将步骤(11)中制备的滤纸放入激光切割机中，沿蜡图案外边缘进行激光切割，得到微流控化学发光纸芯片B，样式如附图11所示。

(13) 将塑封膜放入激光切割机中，切割一圆形进样口，得到微流控化学发光纸芯片正面塑封膜，样式如附图12所示。

(14) 将步骤(9)中得到的微流控化学发光纸芯片A和步骤(12)中得到的微流控化学发光纸芯片B堆叠在一起夹在两片塑封膜中间，然后使用步骤(13)中得到的微流控化学发光纸芯片正面塑封膜和一片崭新的塑封膜进行塑封封装，制备得到封装的微流控化学发光纸芯片，塑封堆叠方式如附图13所示。

所设计的微流控化学发光纸芯片的疏水图案构成的亲水区域，如附图14中白色部分所示，包括一个螺旋形进样区，三十二个呈环绕分布的直径2.0~8.0 mm化学发光检测区和三十二个宽度均为1.0~4.0 mm，长度为4.0~15.0 mm的酶识别催化微通道。微流控化学发光纸芯片总尺寸为25.0~100.0 mm ×25.0~100.0 mm，形状为正方形。可根据不同的微流控化学发光纸芯片尺寸，调整一张B5纸上打印的微流控化学发光纸芯片个数，可为1-6个。

所设计的微流控化学发光纸芯片的化学发光试剂打印图案样式如附图15所示。

所设计的微流控化学发光纸芯片上的氧化酶打印图案样式如附图16所示。

所设计的微流控化学发光纸芯片上的中空通道流速调节疏水蜡打印图案样式如附图17所示。

所设计的微流控化学发光纸芯片A、B的制作过程如附图18所示。

所述附图12中塑封膜带有进样孔，其直径为10.0 mm，其位置与纸芯片进样区头部相对应。

所述附图16中每个酶识别催化微通道中的氧化酶打印图案的尺寸为2.0~4.0 mm ×1.0~3.0 mm的长方形。

所述附图16中每个酶识别催化微通道中的氧化酶打印图案距离化学发光检测区的距离为1.0~5.0 mm。

所采用的滤纸为常用的滤纸。

所采用的喷蜡打印机为常用的富士施乐喷蜡打印机。

所采用的激光切割机为常用的Epilog_Zing_16激光切割机。

步骤(8)中所述的化学发光试剂墨为化学发光试剂修饰的贵金属纳米粒子溶液。所采用的化学发光试剂为常用的化学发光试剂，可为鲁米诺。所采用的贵金属纳米粒子为常见的贵金属纳米粒子，可为金纳米粒子。

步骤(8)中所述的氧化酶打印墨为氧化酶修饰的贵金属纳米粒子溶液，所采用的氧化酶分别为葡萄糖氧化酶、果糖氧化酶、半乳糖氧化酶、乳糖氧化酶、乳酸氧化酶、单酚氧化酶、多酚氧化酶、黄嘌呤氧化酶、胆固醇氧化酶、血红素氧化酶、抗坏血酸氧化酶、细胞色素氧化酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶、单胺氧化酶、二胺氧化酶、NADH氧化酶、NADPH氧化酶、赖氨酰氧化酶、丙酮酸氧化酶、乙醇氧化酶、乙醛氧化酶、胆碱氧化酶、谷胱甘肽氧化酶、肌酐氧化酶、3-α-类固醇氧化酶、胆红素氧化酶、白蛋白氧化酶、球蛋白氧化酶、丙胺酸氧化酶、脂肪酸氧化酶和尿酸氧化酶。所采用的贵金属纳米粒子为常见的贵金属纳米粒子，可为金纳米粒子。

利用上述制备的微流控化学发光纸芯片实现多组分的现场即时检测的步骤为：

(1) 将微流控化学发光纸芯片放入掌上发光检测仪的暗盒中。

(2) 将样品溶液滴加到微流控化学发光纸芯片的进样区内。然后盖上暗盒盖，开始检测。通过依次出现的32个化学发光峰值的大小来依次判断葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、乳酸、单酚、多酚、黄嘌呤、胆固醇、血红素、抗坏血酸、细胞色素、D-氨基酸、L-氨基酸、单胺、二胺、NADH、NADPH、赖氨酰、丙酮酸、乙醇、乙醛、胆碱、谷胱甘肽、肌酐、3-α-类固醇、胆红素、白蛋白、球蛋白、丙胺酸、脂肪酸和尿酸是否存在及含量。

本发明中，样品溶液会在中空通道和纸的毛细作用力的驱动下，流经三十二个酶识别催化微通道。被测物经氧化酶的特异性识别催化后，产生的过氧化氢流入化学发光检测区并与化学发光试剂发生化学反应，产生光信号。由于样品溶液到达酶识别催化微通道的时间不同，导致所产生的过氧化氢到达化学发光检测区的时间亦不同，该设计可将不同被测物产生的发光信号从时间上区分开，进一步实现了一个发光检测窗口下的多组分同时检测。

本发明的有益效果：

1. 在微流控纸芯片实验室中引入了高灵敏度的化学发光检测方法，拓展了微流控纸芯片实验室的检测范围，提高了微流控纸芯片实验室的检测灵敏度与准确度。

2. 采用全打印的制备模式，简化了微流控化学发光纸芯片制备步骤，降低了制备成本，提高了微流控化学发光纸芯片的检测可重复性。

3. 所采用的打印图案可进行大规模集成打印，实现每个页面上打印多个图案用于同时制备多个微流控化学发光纸芯片。

4. 打印墨中含有贵金属纳米粒子，借助贵金属纳米粒子的催化作用，可提高酶识别催化能力与化学发光效率，进一步提高该微流控化学发光纸芯片的灵敏度。

5. 构建了高通量的微流控化学发光纸芯片，提高了微流控化学发光纸芯片的检测通量与检测能力。

6. 在微流控纸芯片实验室中引入了中空通道技术，极大地提高了溶液在纸通道内的流速，大大降低了检测时间，明显提高了检测效率。而且通过控制流速调节镜像疏水蜡颜色的深浅，可以控制溶液在纸通道内的流速，便于对多组分高通量化学发光检测过程进行控制。

7. 由于滤纸的多孔性质，因此酶识别催化微通道还具有纸层析分离的功能，将大颗粒杂质直接过滤掉。联合氧化酶分子的特异性识别催化能力，该微流控化学发光纸芯片可实现无前处理的直接样品加入检测，简化了检测步骤，节省了样品前处理成本。

8. 对微流控化学发光纸芯片进行塑封后的，可防止在运输、储存及使用过程中对微流控化学发光纸芯片造成污染，且该设计与中空通道结合后，将进一步提高溶液在纸通道内的流速，从而进一步降低检测时间，提高检测效率。此外，该设计使得微流控纸芯片实验室更加便于携带与使用。

附图说明

图1为微流控化学发光纸芯片的疏水蜡批量打印图案。

图2为微流控化学发光纸芯片的化学发光试剂批量打印图案。

图3A为微流控化学发光纸芯片的葡萄糖氧化酶批量打印图案。

图3B为微流控化学发光纸芯片的果糖氧化酶批量打印图案。

图3C为微流控化学发光纸芯片的半乳糖氧化酶批量打印图案。

图3D为微流控化学发光纸芯片的乳糖氧化酶批量打印图案。

图3E为微流控化学发光纸芯片的乳酸氧化酶批量打印图案。

图3F为微流控化学发光纸芯片的单酚氧化酶批量打印图案。

图3G为微流控化学发光纸芯片的多酚氧化酶批量打印图案。

图3H为微流控化学发光纸芯片的黄嘌呤氧化酶批量打印图案。

图4A为微流控化学发光纸芯片的胆固醇氧化酶批量打印图案。

图4B为微流控化学发光纸芯片的血红素氧化酶批量打印图案。

图4C为微流控化学发光纸芯片的抗坏血酸氧化酶批量打印图案。

图4D为微流控化学发光纸芯片的细胞色素氧化酶批量打印图案。

图4E为微流控化学发光纸芯片的D-氨基酸氧化酶批量打印图案。

图4F为微流控化学发光纸芯片的L-氨基酸氧化酶批量打印图案。

图4G为微流控化学发光纸芯片的单胺氧化酶批量打印图案。

图4H为微流控化学发光纸芯片的二胺氧化酶批量打印图案。

图5A为微流控化学发光纸芯片的NADH氧化酶批量打印图案。

图5B为微流控化学发光纸芯片的NADPH氧化酶批量打印图案。

图5C为微流控化学发光纸芯片的赖氨酰氧化酶批量打印图案。

图5D为微流控化学发光纸芯片的丙酮酸氧化酶批量打印图案。

图5E为微流控化学发光纸芯片的乙醇氧化酶批量打印图案。

图5F为微流控化学发光纸芯片的乙醛氧化酶批量打印图案。

图5G为微流控化学发光纸芯片的胆碱氧化酶批量打印图案。

图5H为微流控化学发光纸芯片的谷胱甘肽氧化酶批量打印图案。

图6A为微流控化学发光纸芯片的肌酐氧化酶批量打印图案。

图6B为微流控化学发光纸芯片的3-α-类固醇氧化酶批量打印图案。

图6C为微流控化学发光纸芯片的胆红素氧化酶批量打印图案。

图6D为微流控化学发光纸芯片的白蛋白氧化酶批量打印图案。

图6E为微流控化学发光纸芯片的球蛋白氧化酶批量打印图案。

图6F为微流控化学发光纸芯片的丙胺酸氧化酶批量打印图案。

图6G为微流控化学发光纸芯片的脂肪酸氧化酶批量打印图案。

图6H为微流控化学发光纸芯片的尿酸氧化酶批量打印图案。

图7为微流控化学发光纸芯片的流速调节镜像疏水蜡批量打印图案。

图8为喷蜡打印构建亲水通道原理示意图，A图是空白滤纸的示意图；B图是在滤纸上打印蜡图案的示意图，其中a是打印的蜡层；C图是在烘箱或平板加热设备中加热后，蜡图案融化并浸透整个滤纸的厚度，形成疏水墙。

图9为微流控化学发光纸芯片A的示意图，其中a是印有化学发光试剂墨的化学发光检测区，b是酶识别催化微通道中打印的氧化酶墨，c是进样区。

图10为流速调节微流控纸芯片的批量打印图案正面效果图。

图11为微流控化学发光纸芯片B的示意图，其中a是流速调节区域。

图12为微流控化学发光纸芯片正面塑封膜图案。

图13为微流控化学发光纸芯片的塑封封装示意图，A图是俯视图；B图是剖视图。其中a、d分别是正反面塑封膜，b、c分别是微流控化学发光纸芯片A、B。

图14为微流控化学发光纸芯片上的疏水图案示意图，其中，1是进样区；2是酶识别催化微通道；3是化学发光检测区。

图15为微流控化学发光纸芯片上的化学发光试剂打印图案示意图。

图16为微流控化学发光纸芯片上的氧化酶打印图案示意图，其中，1是葡萄糖氧化酶、2是果糖氧化酶、3是半乳糖氧化酶、4是乳糖氧化酶、5是乳酸氧化酶、6是单酚氧化酶、7是多酚氧化酶、8是黄嘌呤氧化酶、9是胆固醇氧化酶、10是血红素氧化酶、11是抗坏血酸氧化酶、12是细胞色素氧化酶、13是D-氨基酸氧化酶、14是L-氨基酸氧化酶、15是单胺氧化酶、16是二胺氧化酶、17是NADH氧化酶、18是NADPH氧化酶、19是赖氨酰氧化酶、20是丙酮酸氧化酶、21是乙醇氧化酶、22是乙醛氧化酶、23是胆碱氧化酶、24是谷胱甘肽氧化酶、25是肌酐氧化酶、26是3-α-类固醇氧化酶、27是胆红素氧化酶、28是白蛋白氧化酶、29是球蛋白氧化酶、30是丙胺酸氧化酶、31是脂肪酸氧化酶、32是尿酸氧化酶。

图17为微流控化学发光纸芯片上的流速调节镜像疏水图案示意图。

图18为微流控化学发光纸芯片A、B的制作过程示意图。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步说明。

实施例1人血液中葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、乳酸、单酚、多酚、黄嘌呤、胆固醇、血红素、抗坏血酸、细胞色素、D-氨基酸、L-氨基酸、单胺、二胺、NADH、NADPH、赖氨酰、丙酮酸、乙醇、乙醛、胆碱、谷胱甘肽、肌酐、3-α-类固醇、胆红素、白蛋白、球蛋白、丙胺酸、脂肪酸和尿酸的现场快速同时检测。

(1) 在计算机上利用Adobe Illustrator CS4软件设计微流控化学发光纸芯片的中空通道疏水蜡批量打印图案，样式如附图1所示。尺寸分别为：螺旋形进样区的宽度为1.0~20.0 mm，三十二个呈环绕分布的直径4.0 mm的化学发光检测区和三十二个宽度均为2.0 mm，长度为4.0~10.0 mm的酶识别催化微通道。微流控化学发光纸芯片总尺寸为50.0 mm ×50.0 mm，形状为正方形。此时，一张B5纸可打印6个微流控化学发光纸芯片。

(2) 在计算机上利用Adobe Illustrator CS4软件设计与中空通道疏水蜡批量打印图案匹配的化学发光试剂批量打印图案，样式如附图2所示。

(3) 在计算机上利用Adobe Illustrator CS4软件设计与中空通道疏水蜡批量打印图案匹配的三十二个氧化酶批量打印图案，样式如附图3、附图4、附图5和附图6所示。

(4) 在计算机上利用Adobe Illustrator CS4软件设计与中空通道疏水蜡批量打印图案匹配的流速调节疏水蜡批量打印图案，样式如附图7所示。

(5) 将普通定性滤纸剪裁成B5尺寸。

(6) 将步骤(5)中裁好的B5定性滤纸放置到喷蜡打印机中，将步骤(1)中的疏水蜡批量打印图案打印到步骤(5)中的B5定性滤纸上。

(7) 将步骤(6)中带有蜡图案的B5定性滤纸放置到平板加热器或者烘箱中，在130摄氏度下加热50秒。

(8) 制备化学发光试剂墨：取20.0毫升0.5摩尔每升的N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺水溶液，加入到20.0毫升直径为12.0 nm的金纳米粒子溶液中，室温下搅拌1小时，转速500转每分钟。然后用3500分子量的透析膜和超纯水将反应溶液透析两天，透析期间更换六次超纯水。最终得到异鲁米诺化学发光试剂墨。

(9) 制备氧化酶墨：取0.5毫升1.0毫克每毫升链霉亲和素溶液，加入到20.0毫升直径为12.0 nm的金纳米粒子溶液中，室温下搅拌0.5小时。然后加入0.5毫升质量分数为百分之五的牛血清白蛋白溶液，室温下搅拌5分钟。然后将上述反应溶液在12500转每分钟的转速下离心分离20分钟。将得到的沉淀分散到生物素化的氧化酶溶液中，在37摄氏度下搅拌1小时。将上述反应溶液在12500转每分钟的转速下离心分离10分钟。将得到的沉淀分散到pH=8.0，浓度为0.05摩尔每升的Tris-HCl缓冲溶液中，制备得到氧化酶墨。

(10) 将步骤(7)中制备的B5定性滤纸放入喷墨打印机中。首先，在喷墨打印机上安装化学发光试剂墨盒，按照步骤(2)中的化学发光试剂批量打印图案，将化学发光试剂墨打印到化学发光检测区中。然后将喷墨打印机中的墨盒更换为氧化酶墨盒，按照步骤(3)中的氧化酶批量打印图案，将氧化酶墨打印到酶识别催化微通道中。一种氧化酶批量打印图案仅用来打印一种氧化酶墨：附图3A用于打印葡萄糖氧化酶墨；附图3B用于打印果糖氧化酶墨；附图3C用于打印半乳糖氧化酶墨；附图3D用于打印乳糖氧化酶墨；附图3E用于打印乳酸氧化酶墨；附图3F用于打印单酚氧化酶墨；附图3G用于打印多酚氧化酶墨；附图3H用于打印黄嘌呤氧化酶墨；附图4A用于打印胆固醇氧化酶墨；附图4B用于打印血红素氧化酶墨；附图4C用于打印抗坏血酸氧化酶墨；附图4D用于打印细胞色素氧化酶墨；附图4E用于打印D-氨基酸氧化酶墨；附图4F用于打印L-氨基酸氧化酶墨；附图4G用于打印单胺氧化酶墨；附图4H用于打印二胺氧化酶墨；附图5A用于打印NADH氧化酶墨；附图5B用于打印NADPH氧化酶墨；附图5C用于打印赖氨酰氧化酶墨；附图5D用于打印丙酮酸氧化酶墨；附图5E用于打印乙醇氧化酶墨；附图5F用于打印乙醛氧化酶墨；附图5G用于打印胆碱氧化酶墨；附图5H用于打印谷胱甘肽氧化酶墨；附图6A用于打印肌酐氧化酶墨；附图6B用于打印3-α-类固醇氧化酶墨；附图6C用于打印胆红素氧化酶墨；附图6D用于打印白蛋白氧化酶墨；附图6E用于打印球蛋白氧化酶墨；附图6F用于打印丙胺酸氧化酶墨；附图6G用于打印脂肪酸氧化酶墨；附图6H用于打印尿酸氧化酶墨。

(11) 将步骤(10)中制备的滤纸放入激光切割机中，先沿蜡图案外边缘进行激光切割，再激光切割掉螺旋形区域，即蜡图案上的网格区域，形成中空通道，从而得到微流控化学发光纸芯片A，样式如附图9所示。

(12) 将步骤(6)中带有蜡图案的滤纸放入喷墨打印机中。按照步骤(4)中的与中空通道疏水蜡批量打印图案镜像匹配的流速调节疏水蜡批量打印图案，将流速调节疏水蜡打印到步骤(6)中的滤纸反面。

(13) 将步骤(12)中带有蜡图案的滤纸放置到平板加热器或者烘箱中，在130摄氏度下加热50秒。

(14) 将步骤(13)中制备的滤纸放入激光切割机中，沿蜡图案外边缘进行激光切割，得到微流控化学发光纸芯片B，样式如附图11所示。

(15) 将塑封膜放入激光切割机中，切割一圆形进样口，得到微流控化学发光纸芯片正面塑封膜，样式如附图12所示。

(16) 将步骤(11)中得到的微流控化学发光纸芯片A和步骤(14)中得到的微流控化学发光纸芯片B堆叠在一起夹在两片塑封膜中间，然后使用步骤(13)中得到的微流控化学发光纸芯片正面塑封膜和一片崭新的塑封膜进行塑封封装，制备得到封装的微流控化学发光纸芯片，塑封堆叠方式如附图13所示。

用三高病人的血样作为分析样品，血样中含有葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、乳酸、单酚、多酚、黄嘌呤、胆固醇、血红素、抗坏血酸、细胞色素、D-氨基酸、L-氨基酸、单胺、二胺、NADH、NADPH、赖氨酰、丙酮酸、乙醇、乙醛、胆碱、谷胱甘肽、肌酐、3-α-类固醇、胆红素、白蛋白、球蛋白、丙胺酸、脂肪酸和尿酸。利用上述制备的微流控化学发光纸芯片实现多组分的现场同时检测的步骤为：

(17) 将微流控化学发光纸芯片放入掌上发光检测仪的暗盒中。

(18) 取病人血样0.5毫升，加入到5毫升pH=8.0，浓度为0.05摩尔每升的Tris-HCl缓冲溶液中进行稀释。然后用滴管将稀释后的样品溶液滴加到微流控化学发光纸芯片的进样区内。然后盖上暗盒盖，开始检测。通过依次出现的32个化学发光峰值的大小来依次判断葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、乳酸、单酚、多酚、黄嘌呤、胆固醇、血红素、抗坏血酸、细胞色素、D-氨基酸、L-氨基酸、单胺、二胺、NADH、NADPH、赖氨酰、丙酮酸、乙醇、乙醛、胆碱、谷胱甘肽、肌酐、3-α-类固醇、胆红素、白蛋白、球蛋白、丙胺酸、脂肪酸和尿酸是否存在及含量。

实施例2人尿液中葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、乳酸、单酚、多酚、黄嘌呤、胆固醇、血红素、抗坏血酸、细胞色素、D-氨基酸、L-氨基酸、单胺、二胺、NADH、NADPH、赖氨酰、丙酮酸、乙醇、乙醛、胆碱、谷胱甘肽、肌酐、3-α-类固醇、胆红素、白蛋白、球蛋白、丙胺酸、脂肪酸和尿酸的现场快速同时检测。

将实施例1步骤(1) (2) (3) (4)中的“利用Adobe Illustrator CS4软件设计”改为“利用Photoshop CS6软件设计”；将实施例1中的“定性滤纸”改为“定量滤纸”；将实施例1步骤(1)改为：“在计算机上利用Photoshop CS4软件设计微流控化学发光纸芯片的疏水蜡批量打印图案，样式如附图1所示。尺寸分别为：螺旋形进样区的宽度为1.0~10.0 mm，三十二个呈环绕分布的直径2.0 mm的化学发光检测区和三十二个宽度均为1.0 mm，长度为2.0~5.0 mm的酶识别催化微通道。微流控化学发光纸芯片总尺寸为25.0 mm ×25.0 mm，形状为正方形。此时，一张B5纸可打印12个微流控化学发光纸芯片。”。将实施例1步骤(7) (13)中的“在130摄氏度下加热50秒”改为“在150摄氏度下加热40秒”；将实施例1步骤(8)改为“制备化学发光试剂墨：取20.0毫升0.5摩尔每升的异鲁米诺水溶液，加入到20.0毫升直径为13.0 nm的银纳米粒子溶液中，室温下搅拌1小时，转速500转每分钟。然后用3500分子量的透析膜和超纯水将反映溶液透析两天，透析期间更换六次超纯水。最终得到异鲁米诺化学发光试剂墨”；将实施例1步骤(8) (9)中的“直径为12.0 nm的金纳米粒子溶液中”改为“直径为15.0 nm的银纳米粒子溶液中”；将实施例1中的“三高病人血样”改为“三高病人尿样”；将实施例1步骤(18)改为“取病人尿样5毫升，然后用普通滴管将尿样滴加到微流控化学发光纸芯片的进样区内。然后盖上暗盒盖，开始检测。通过依次出现的32个化学发光峰值的大小来依次判断葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、乳酸、单酚、多酚、黄嘌呤、胆固醇、血红素、抗坏血酸、细胞色素、D-氨基酸、L-氨基酸、单胺、二胺、NADH、NADPH、赖氨酰、丙酮酸、乙醇、乙醛、胆碱、谷胱甘肽、肌酐、3-α-类固醇、胆红素、白蛋白、球蛋白、丙胺酸、脂肪酸和尿酸是否存在及含量”。

Claims (10)

1.一种简易、高通量微流控化学发光纸芯片的制备方法，其特征是包括以下步骤：

1.1.在计算机上设计化学发光微流控纸芯片的中空通道疏水蜡批量打印图案；

1.2.在计算机上设计与中空通道疏水蜡批量打印图案匹配的化学发光试剂批量打印图案；

1.3.在计算机上设计与中空通道疏水蜡批量打印图案匹配的三十二个氧化酶批量打印图案；

1.4.在计算机上设计与中空通道疏水蜡批量打印图案镜像匹配的流速调节疏水蜡批量打印图案；

1.5.将滤纸剪裁成B5尺寸；

1.6.将步骤1.5中裁好的滤纸放置到喷蜡打印机中，将步骤1.1中的中空通道疏水蜡批量打印图案打印到步骤1.5中的B5滤纸上；

1.7.将步骤1.6中带有蜡图案的B5滤纸放置到平板加热器或者烘箱中，在60-150摄氏度下加热0.5-2分钟；

1.8.将步骤1.7中制备的B5滤纸放入喷墨打印机中，按照步骤1.2中的化学发光试剂批量打印图案，将化学发光试剂墨打印到化学发光检测区中，然后按照步骤1.3中的氧化酶批量打印图案，将氧化酶墨打印到酶识别催化微通道中；一种氧化酶批量打印图案用来打印一种氧化酶墨，打印不同氧化酶墨时，只需更换喷墨打印机中的墨盒；

1.9.将步骤1.8中制备的滤纸放入激光切割机中，先沿蜡图案外边缘进行激光切割，再激光切割掉螺旋形区域，即蜡图案上的网格区域，形成中空通道，从而得到微流控化学发光纸芯片A；

1.10.将步骤1.6中带有蜡图案的B5滤纸放入喷墨打印机中；按照步骤1.4中的与中空通道疏水蜡批量打印图案镜像匹配的流速调节疏水蜡批量打印图案，将流速调节疏水蜡打印到步骤1.6中的滤纸反面；

1.11.将步骤1.10中带有蜡图案的滤纸放置到平板加热器或者烘箱中，在60-150摄氏度下加热0.5-2分钟；

1.12.将步骤1.11中制备的滤纸放入激光切割机中，沿蜡图案外边缘进行激光切割，得到微流控化学发光纸芯片B；

1.13.将塑封膜放入激光切割机中，切割一圆形进样口，得到微流控化学发光纸芯片正面塑封膜；

1.14.将步骤1.9中得到的微流控化学发光纸芯片A和步骤1.12中得到的微流控化学发光纸芯片B堆叠在一起夹在两片塑封膜中间，然后使用步骤1.13中得到的微流控化学发光纸芯片正面塑封膜和一片崭新的塑封膜进行塑封封装，制备得到封装的微流控化学发光纸芯片。

2.本发明所述微流控化学发光纸芯片的现场即时检测包括以下步骤：

2.1.将微流控化学发光纸芯片放入掌上发光检测仪的暗盒中；

2.2.将样品溶液滴加到微流控化学发光纸芯片的进样区内；然后盖上暗盒盖，开始检测；通过依次出现的32个化学发光峰值的大小来依次判断葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、乳酸、单酚、多酚、黄嘌呤、胆固醇、血红素、抗坏血酸、细胞色素、D-氨基酸、L-氨基酸、单胺、二胺、NADH、NADPH、赖氨酰、丙酮酸、乙醇、乙醛、胆碱、谷胱甘肽、肌酐、3-α-类固醇、胆红素、白蛋白、球蛋白、丙胺酸、脂肪酸和尿酸是否存在及含量。

3.根据权利要求1所述的中空通道疏水蜡打印图案，其特征是：所设计的微流控化学发光纸芯片的疏水图案构成的亲水区域包括一个螺旋形进样区，三十二个呈环绕分布的直径2.0~8.0 mm化学发光检测区和三十二个宽度均为1.0~4.0 mm，长度为4.0~15.0 mm的酶识别催化微通道；微流控化学发光纸芯片总尺寸为25.0~100.0 mm ×25.0~100.0 mm，形状为正方形；可根据不同的微流控化学发光纸芯片尺寸，调整一张B5纸上打印的微流控化学发光纸芯片个数，可为1-6个。

4.根据权利要求1所述的化学发光试剂打印图案，其特征是：每个化学发光检测区中的化学发光图案的直径为2.0~8.0 mm。

5.根据权利要求1所述的氧化酶打印图案，其特征是：每个酶识别催化微通道中的氧化酶图案的尺寸为1.0~4.0 mm ×1.0~4.0 mm的正方形。

6.根据权利要求1所述的流速调节疏水蜡打印图案，其特征是：流速调节疏水蜡打印图案与中空通道疏水蜡打印图案呈镜像匹配。

7.根据权利要求1所述的化学发光试剂打印墨，其特征是：所述的化学发光试剂墨为化学发光试剂修饰的贵金属纳米粒子溶液；所采用的化学发光试剂为常用的化学发光试剂；所采用的贵金属纳米粒子为常见的贵金属纳米粒子。

8.根据权利要求1所述的氧化酶打印墨，其特征是：所述的氧化酶墨为氧化酶修饰的贵金属纳米粒子溶液，所采用的氧化酶分别为葡萄糖氧化酶、果糖氧化酶、半乳糖氧化酶、乳糖氧化酶、乳酸氧化酶、单酚氧化酶、多酚氧化酶、黄嘌呤氧化酶、胆固醇氧化酶、血红素氧化酶、抗坏血酸氧化酶、细胞色素氧化酶、D-氨基酸氧化酶、L-氨基酸氧化酶、单胺氧化酶、二胺氧化酶、NADH氧化酶、NADPH氧化酶、赖氨酰氧化酶、丙酮酸氧化酶、乙醇氧化酶、乙醛氧化酶、胆碱氧化酶、谷胱甘肽氧化酶、肌酐氧化酶、3-α-类固醇氧化酶、胆红素氧化酶、白蛋白氧化酶、球蛋白氧化酶、丙胺酸氧化酶、脂肪酸氧化酶和尿酸氧化酶；所采用的贵金属纳米粒子为常见的贵金属纳米粒子。

9.根据权利要求1所述的滤纸和塑封膜，其特征是：所采用的滤纸为常用的滤纸；所采用的塑封膜带有进样孔，其直径为10.0 mm，其位置与纸芯片进样区头部相对应。

10.根据权利要求1所述的喷蜡打印机和激光切割机，其特征是：所采用的喷蜡打印机为常用的富士施乐喷蜡打印机；所采用的激光切割机为常用的Epilog_Zing_16激光切割机。