CN106442516A - 一种利用纸芯片比色分析装置检测核酸浓度的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利用纸芯片比色分析装置检测核酸浓度的方法，所述纸芯片比色分析装置包括纸芯片、模具基底以及光纤分析设备，所述检测核酸浓度的方法包括以下步骤：将纸芯片放置在模具基底上，在纸芯片上预先滴加TMB/H2O2显色底物溶液；滴加核酸铂纳米复合材料至纸芯片上，与显色底物溶液混合后反应3‑4分钟；观测并记录纸芯片的比色结果，显色颜色从无色变化至蓝色，颜色深度与核酸浓度成反比；将纸芯片放置于光纤分析设备中，进一步数值化精确读取纸芯片的颜色强度。与现有技术相比，本发明所述的核酸浓度定量检测方法具有很大的优势，其操作简单，便携性强，能够实现对0.0075uM目标核酸浓度的检测，且成本较低，具有十分优异的经济效益，具有良好的应用前景。

Description

一种利用纸芯片比色分析装置检测核酸浓度的方法
技术领域
本发明涉及纸芯片的分子检测领域，尤其涉及一种利用纸芯片比色分析装置检测核酸浓度的方法。
背景技术
最近，众多纳米材料如金属氧化物、金属纳米颗粒、碳基纳米材料(石墨烯、碳量子点、碳纳米管等)和这些材料相互结合形成的复合型纳米材料等已被证实具有优越的类过氧化物酶活性，并且被广泛用于各种生物传感策略中。同时，由于纳米人工酶具有纳米材料和天然酶的双重优越特性，在发展纳米酶来替代传统的蛋白酶生物分析研究中具有广阔的应用前景。此外，核酸和纳米材料之的自组装体系可以完美地将纳米材料自身光学、电磁学、以及催化性能与核酸有序组装特性和序列特异性识别能力相互融合，能够在分析检测中获得优越的信号识别和信号放大效果。
纸基分析设备(paper-based analytical device，PAD)简称纸芯片作为微流控芯片中的最新发展技术手段，为环境监测、食品安全控制和医疗快速诊断提供了新的研究方向和有力手段。纸芯片采用纸质材料作为基底，通过对纸材料进行各种精细设计和加工后，就会得到具备特定结构和功能的分析元件。另外，基于这些纸质材料元件具备化学稳定性强(不参与大多数生化反应)、生物相容性优越、无需外力驱动反应液就可纸质上顺利流通等良好特性，因而可在一块简单微型的纸芯片就可以快速地完成进样、反应以及检测等众多步骤。目前，大多数实验室关于核酸浓度定量的方法和技术主要是利用电泳手段和紫外分光光度法。在实际操作中，电泳过程繁琐耗时并且操作者还要小心各种剧毒物质。另外，紫外分析设备不具有便携性并且十分不经济。本发明基于纸芯片核酸浓度定量方法可以改进这些不足，有效实现核酸浓度的灵敏、快速、便捷定量。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种利用纸芯片比色分析装置检测核酸浓度的方法，其可实现快速、灵敏的核酸浓度的比色检测。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种利用纸芯片比色分析装置检测核酸浓度的方法，所述纸芯片比色分析装置包括纸芯片、放置纸芯片的模具基底以及光纤分析设备，其特征在于，所述检测核酸浓度的方法包括以下步骤：
步骤a、将纸芯片放置在模具基底上，在纸芯片上预先滴加TMB/H2O2显色底物溶液；
步骤b、滴加核酸铂纳米复合材料至纸芯片上，与显色底物溶液混合后反应3-4分钟；
步骤c、观测并记录纸芯片的比色结果，显色颜色从无色变化至蓝色，颜色深度与核酸浓度成反比；
步骤d、将步骤c中的纸芯片放置于光纤分析设备中，进一步数值化精确读取纸芯片的颜色强度。
优选的，所述光纤分析设备含有一个可发射红色激光的探针，该探针上还组装可对反射激光强度检测的探头元件，探针由导线接通于检测平台并以数值形式显示检测的结果。
优选的，所述纸芯片比色分析装置的制备步骤如下：制备椭圆柱形的塑料模具基底，所述塑料模具基底的上表面沿着椭圆形的长径方向上等距离设置至少2个圆形空心小孔以放置纸芯片；制备圆形的纸芯片，采用切刻机对亲水性聚偏氟乙烯膜进行切割以形成圆形的纸芯片；其中所述纸芯片的直径比所述圆形空心小孔的直径大至少3mm。
优选的，所述塑料模具基底长为45mm，宽为30mm，高为6mm，所述圆形空心小孔的底部离所述塑料模具基底上表面的距离为0.5～1.5mm，所述圆形空心小孔的数量为2个。
优选的，所述纸芯片的直径为11～12mm，所述圆形空心小孔的直径为7mm。
优选的，所述TMB/H2O2显色底物溶液组成如下：20mM MES-HAc(140mMNaAc，PH 4.0)溶液中含有2％v/v TMB(30mM)和2％v/v H2O2(30wt％)。
优选的，所述核酸铂纳米复合材料的制备步骤包括：配置反应液，置于离心 管中，同时向离心管中引入目标核酸，搅拌混匀5s；滴加铂前驱体物质到离心管中，离心振荡5s，并室温下培育2mi；快速滴加新鲜配制的硼氢化钠溶液到离心管中，离心振荡5s，并在室温下静置反应4-5min，获得核酸铂纳米复合材料。
优选的，所述目标核酸的核苷酸序列为TTACCGAACGAAAAATTCTAGGCTATGTACAACTACGCAAAGGCCCCAACGT(SEQ ID NO.1)，该目标核酸选取于阿兹海默疾病(Alzheimer’s disease(AD))相关联的致病基因部分序列片段。
优选的，所述反应液含有10mM Tris-HCl，150mM NaCl，25mM MgCl2，pH值为7.5。
优选的，所述铂前驱体物质为浓度为80uM的K2PtCl4。
优选的，所述光纤分析设备能够实现对0.0075uM目标核酸浓度的检测。
为达到上述目的，本发明采用如下机理：大多数与铂纳米相关的材料都具备优异类似过氧化氢酶活性，可以快速催化TMB/H2O2底物生成蓝色可见的沉淀物。大分子核酸可以通过非公价相互作用快速与铂前驱体分子(K2PtCl4)结合，当强还原剂硼氢化钠加入后会催化这些铂前驱体分子以核酸分子为模板快速生成核酸铂纳米复合材料(DNA-Pt hybridnaomaterials)。由于核酸大分子的空间位阻效应导致核酸铂纳米复合材料表面活性位点被大量包覆，使得核酸铂纳米复合材料的酶催化活性被有效抑制。失去酶活性的核酸铂纳米复合材料不能够有效地催化TMB/过氧化氢H2O2底物溶液产生颜色响应。
本发明所述的检测方法主要基于核酸与铂纳米材料自组装结合作用来调控铂纳米材料的类过氧化物酶活性，溶液中不同浓度的目标核酸含量直接导致最终核酸铂纳米复合材料具有不同的酶催化活性。同时采用一种纸芯片来作为微反应器进行核酸铂纳米复合材料催化3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)/过氧化氢(H2O2)底物显色反应，通过分析纸芯片的颜色响应来实现快速高效定性检测核酸浓度，根据肉眼观察就可判断纸芯片上的蓝色深度变化与核酸浓度之间的关系，也可使用光纤分析设备进一步实现便捷灵敏核酸浓度分析。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
纸芯片比色分析装置中模具基底可以用来固定和保存纸芯片，便于携带、适用于任意地方目标物质的快速检测；纸芯片具备类似微反应容器功能，可以在芯 片上进行核酸铂纳米复合材料催化TMB/H2O2的显色反应；简易的光纤分析设备可通过数值形式表征纸芯片上颜色的强度，从而便于精确分析纸芯片显色反应结果；
纸芯片比色分析装置中，采用椭球型的模具基底，减少了其占用空间，更利于携带，并同时设置多个可放置纸芯片的小孔，能较好的保证检测的同步性，并有效减少检测时间；
由于纸芯片具备微型化、集成化、便携化等优势，因而对于核酸浓度的检测具有很大的优势，本发明所述的检测方法操作简单，便携性强，成本较低，具有十分优异的经济效益，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为纸芯片比色分析装置的结构示意图，其中圆心纸质芯片安放在塑料模块基底上的圆形空心小孔中；
图2为利用纸芯片比色分析装置检测核酸浓度的方法流程图；
图3为核酸铂纳米复合材料透射电镜(Transmission electron microscope，TEM)的表征结果图；
图4为核酸铂纳米复合材料X射线电子能谱(X-ray photoelectronspectroscopy，XPS)的表征结果图。
图5a为溶液中目标核酸浓度与通过光纤分析设备的数值之间的线性关系图；
图5b为不同浓度目标核酸在纸芯片上的比色结果图。
附图标记为：1、模具基底；2、圆形空心小孔；3、纸芯片3。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。以下实施例中所用方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明所述的检测方法可进行任一核酸分子的浓度检测，本实施例仅以下述目标核酸的核酸序列举例说明。
检测的核酸序列如下：TTACCGAACGAAAAATTCTAGGCTATGTACAACTACGCAAAGGCCCCAACGT(SEQ ID NO.1)。该目标核酸选取于阿兹海默疾病(Alzheimer’s disease(AD))相关联的致病基因部分序列片段。
实施例1
制备纸芯片比色分析装置。
如图1所示，本发明所采用的纸芯片比色分析装置包括椭圆柱形的塑料模具基底1、圆形空心小孔2以及纸芯片3，其制备步骤为：设计一种椭圆柱形的塑料模具基底1，所述塑料模具基底1的上表面沿着椭圆形的长径方向上等距离设置至少2个直径均为7mm的圆形空心小孔2以放置纸芯片3；在工作电脑上用绘图软件绘制直径为11～12mm圆形纸芯片3的模板，然后通过连接于电脑的切刻机对亲水性聚偏氟乙烯膜(纸芯片3的原材料)进行切割，在几分钟内就会得到大量规格同等的纸芯片元件，随后将其摆放在塑料模块基底1上的圆形空心小孔2中，干燥常温下放置待用。
所述纸芯片比色分析装置还可包括光纤分析设备，所述光纤分析设备含有一个可发射红色激光的探针，该探针上还组装可对反射激光强度检测的探头元件，探针由导线接通于检测平台并以数值形式显示检测的结果。
实施例2
核酸铂纳米复合材料的制备，其制备的核酸浓度包括0.5uM、0.3uM、0.15uM、0.05uM、0.025uM、0.012uM、0.0075uM。
其制备步骤如下：
a.配置50ul反应溶液中(反应液含有10mM Tris-HCl，150mM NaCl，25mMMgCl2，pH7.5)分别置于500ul的离心管中，同时分别向各反应溶液中引入不同浓度的目标核酸，5s搅拌混匀。
b.随后滴加2.5ul的80uM铂前驱体物质(K2PtCl4)到含不同浓度的目标核酸的反应溶液中，涡旋离心振荡5s,并室温下培育2min左右。
c.紧接着快速滴加10ul新鲜配制的硼氢化钠溶液(25mM)到反应溶液中，涡旋离心振荡5s，并在室温下静置反应4-5min，获得核酸铂纳米复合材料，不需要任何离心清洗操作。
实施例3
采用实施例1制备的纸芯片比色分析装置检测核酸浓度以及确定检测限。
TMB/H2O2显色底物溶液组成如下：20mM MES-HAc(140mM NaAc PH 4.0)溶液中含有2％v/v TMB(30mM)和2％v/v H2O2(30wt％)。TMB由无水乙醇溶解，TMB和H2O2溶液均需保证现配现用。
采用纸芯片比色分析装置检测目标核酸浓度的示意图如图2所示。具体步骤如下：首先将纸芯片3放置在塑料模具基底1上的圆形空心小孔2中，在纸芯片3上滴加10ul TMB/H2O2显色底物溶液，随后滴加实施例2制备的10ul核酸铂纳米复合材料溶液进入纸芯片3中。纸芯片3上的微反应器在室温下静置3-4分钟确保反应完全，随后用数码相机或智能手机对纸芯片3进行拍照来记录比色结果，比色结果如图5b所示。
当制备核酸铂纳米复合材料的反应液中不含核酸分子时，最终纸芯片上可以看到蓝色很深沉淀物出现，这是由于铂纳米材料具有良好的类过氧化物酶催化活性，可以催化TMB/H2O2底物快速反应。同时可以发现当制备反应液中核酸分子浓度逐渐增加时，最终纸芯片蓝色沉淀物逐渐变淡，这表明了核酸浓度的提高有效地抑制了核酸铂纳米复合材料的类过氧化物酶活性，颜色的深度与核酸的浓度成反比。
同时将其放置到光纤分析设备的探头下进一步用数值方式精确地读取芯片上颜色强度，最终结果如图5a所示。光纤检测的数值与核酸的浓度对数值之间呈现较好的线性关系，从光纤分析设备的结果中可以证实本方法最低可实现对0.0075uM目标核酸的浓度检测。
同时对核酸铂纳米复合材料进行透射电镜表征和X射线电子能谱表征，其结果分别如图3、图4所示。
对比例1
采用专利CN105973879A所制备的纸芯片比色分析装置进行检测核酸含量的比色检测，其余步骤均与实施例3相同。
对比例1完成比色检测的时间需要将近1个小时，实施例3完成所有核酸浓度检测的时间仅为25分钟，其有效缩短了检测时间。
通过上述实施例可知，本发明所述的检测方法可以实现快速、灵敏的目标核酸的纸芯片比色检测，操作简单，便携性强，成本较低，具有十分优异的经济效 益，具有良好的应用前景。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
<110> 复旦大学；上海速创诊断产品有限公司
<120> 一种利用纸芯片比色分析装置检测核酸浓度的方法
<160> 1
<210> 1
<211> 52
<212> DNA
<213> 阿兹海默疾病（Alzheimer’s disease）相关联的致病基因部分序列片段
<220>
<223> 目标核酸
<400> 1
ttaccgaacg aaaaattcta ggctatgtac aactacgcaa aggccccaac gt 52

Claims (7)

1.一种利用纸芯片比色分析装置检测核酸浓度的方法，所述纸芯片比色分析装置包括纸芯片、放置纸芯片的模具基底以及光纤分析设备，其特征在于，所述检测核酸浓度的方法包括以下步骤：
步骤a、将纸芯片放置在模具基底上，在纸芯片上预先滴加TMB/H2O2显色底物溶液；
步骤b、滴加核酸铂纳米复合材料至纸芯片上，与显色底物溶液混合后反应3-4分钟；
步骤c、观测并记录纸芯片的比色结果，显色颜色从无色变化至蓝色，颜色深度与核酸浓度成反比；
步骤d、将步骤c中的纸芯片放置于光纤分析设备中，进一步数值化精确读取纸芯片的颜色强度。
2.根据权利要求1所述的一种利用纸芯片比色分析装置检测核酸浓度的方法，其特征在于，所述纸芯片比色分析装置的制备步骤包括：制备椭圆柱形的塑料模具基底，所述塑料模具基底的上表面沿着椭圆形的长径方向上等距离设置至少2个圆形空心小孔以放置纸芯片；制备圆形的纸芯片，采用切刻机对亲水性聚偏氟乙烯膜进行切割以形成圆形的纸芯片；其中，所述纸芯片的直径比所述圆形空心小孔的直径大至少3mm。
3.根据权利要求1所述的一种利用纸芯片比色分析装置检测核酸浓度的方法，其特征在于，所述TMB/H2O2显色底物溶液组成如下：20mM MES-HAc溶液中含有2％v/v TMB和2％v/vH2O2。
4.根据权利要求1所述的一种利用纸芯片比色分析装置检测核酸浓度的方法，其特征在于，所述核酸铂纳米复合材料的制备步骤包括：配置反应液，置于离心管中，同时向离心管中引入目标核酸，搅拌混匀5s；滴加铂前驱体物质到离心管中，离心振荡5s，并室温下培育2min；快速滴加新鲜配制的硼氢化钠溶液到离心管中，离心振荡5s，并在室温下静置反应4-5min，获得核酸铂纳米复合材料。
5.根据权利要求4所述的一种利用纸芯片比色分析装置检测核酸浓度的方法，其特征在于，所述反应液含有10mM Tris-HCl,150mM NaCl,25mM MgCl2，pH值为7.5。
6.根据权利要求4所述的一种利用纸芯片比色分析装置检测核酸浓度的方法，其特征在于，所述铂前驱体物质为浓度为80uM的K2PtCl4。
7.根据权利要求1所述的一种利用纸芯片比色分析装置检测核酸浓度的方法，其特征在于，所述光纤分析设备能够实现对0.0075uM目标核酸浓度的检测。
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