CN116218516A - 一种时间分辨荧光微球及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种时间分辨荧光微球及其制备方法和应用，所述制备方法包括如下步骤：(1)将苯乙烯和羧基功能单体利用无皂乳液聚合法，进行乳液聚合反应，得到羧基聚苯乙烯微球的种子乳液；(2)将铕配合物通过溶胀法包埋至羧基聚苯乙烯微球内部，得到所述时间分辨荧光微球。本发明所述的制备方法操作简单，得到的时间分辨荧光微球尺寸均一可控，表面规整，荧光强度较强而且性能稳定。所述的时间分辨荧光微球偶联抗体后，具有快速、简便、廉价、检查结果直观、稳定性好、检测标本种类多以及灵敏度低等特点，可达到对待测物进行定量分析的目的。

Description

一种时间分辨荧光微球及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及时间分辨荧光微球技术领域，尤其涉及一种时间分辨荧光微球及其制备方法和应用。
背景技术
聚合物荧光微球结合了荧光物质的特异性、发光效率高、寿命长以及微球表面基团可调和良好单分散性等特征，其中稀土有机配合物具有较长的荧光寿命、良好的光稳定性、窄而对称的发射谱，较大的Stokes位移，较为理想的生物相容性等性能，使其在荧光免疫层析技术中实现了通过荧光示踪对检测结果进行精准定量，获得可观的信噪比、灵敏度以及检测范围，在生物医学、临床化学分析、免疫检测等高新技术领域获得很好的应用。
荧光免疫层析技术是以荧光类物质作为生物活性物质的标记物，基于抗原抗体特异性免疫反应的新型膜检测技术。该技术以固定有检测线和质控线的条状纤维层析材料为固定相，测试液为流动相，荧光标记抗体或抗原固定于连接垫，通过毛细管作用使待分析物在层析条上移动。对于带有多个抗原决定簇的大分子抗原(蛋白、病毒、致病菌等)，通常采用“三明治”型双抗夹心免疫层析方法，即待测物在流动相作用下先与荧光标记抗体结合，这种化学偶联的方式区别于胶体金的物理性吸附，大大提高了检测效果的灵敏度以及稳定性，得到了人们的广泛研究和运用。
CN111218270A公开了一种改性时间分辨荧光微球的制备方法，其公开的改性时间分辨荧光微球的制备方法包括：(1)在反应釜中加入超纯水并通氮气，边加热边搅拌；加入经精馏的聚苯乙烯一起混合加热，接着再加入过硫酸钾，反应充分后获得白色乳胶球；(2)称取溶剂染料、2-噻吩甲酰三氟丙酮、邻菲罗啉盐酸盐、氯化铕及电子介体若干溶解在石油醚中生成混合物；将上述混合物缓慢加入到步骤(1)制备的白色乳胶球微球溶液中搅拌均匀获得染色时间分辨荧光微球，加热使石油醚全部挥发；将合成的微球重复离心洗涤，使溶液中多余的染料完全清洗干净，获得带有鲜艳颜色且不影响自身的时间分辨荧光的微球，用户使用时无需通过仪器读取数值，对于异常的测试条可直观地查找异常出现的原因。
CN114891030A公开了一种铕配合物的时间分辨荧光材料及其制备方法，，所述铕配合物的时间分辨荧光材料的分子式为Eu(L1)3(L2)n；其中，L1为β-二酮类配体，L2为协同配体；n为1或2；所述β-二酮类配体为4,4,4-三氟-1-(2-呋喃基)-1,3-丁二酮、4,4,4-三氟-1-(对甲苯基)-1,3-丁二酮、4,4,4-三氟-1-苯基-1,3-丁二酮、二苯甲酰甲烷和2-噻吩甲酰三氟丙酮中的一种或多种；所述协同配体为三苯基氧膦、1,10-菲罗啉和3,4,7,8-四甲基-1,10-菲罗啉中的一种或多种。其公开的铕配合物的时间分辨荧光材料在365nm紫外激光照射下具有较强的红色荧光和良好的时间分辨特性，可用作时间分辨荧光微球染色使用，也可作为时间分辨荧光材料使用，在医学临床检查，免疫层析等领域有广阔应用前景。
现有技术中，时间分辨荧光微球的制备方法复杂，得到的时间分辨荧光微球荧光强度较弱，稳定性差，不能很好地用于生物检测。
综上所述，开发一种能解决上述技术问题的时间分辨荧光微球是至关重要的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种时间分辨荧光微球及其制备方法和应用，所述的制备方法操作简单，得到的时间分辨荧光微球尺寸均一可控，表面规整，荧光强度较强而且性能稳定。所述的时间分辨荧光微球偶联抗体后，具有快速、简便、廉价、检查结果直观、稳定性好、检测标本种类多以及灵敏度低等特点，可达到对待测物进行定量分析的目的。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种时间分辨荧光微球的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将苯乙烯和羧基功能单体利用无皂乳液聚合法，进行乳液聚合反应，得到羧基聚苯乙烯微球的种子乳液；
(2)将铕配合物通过溶胀法包埋至羧基聚苯乙烯微球内部，得到所述时间分辨荧光微球。
本发明通过苯乙烯和羧基单体的无皂乳液聚合反应制备羧基聚苯乙烯微球种子乳液，溶胀法将铕稀土配合物荧光染料包埋在聚合物纳米粒子中，得到了具有核壳结构的聚苯乙烯荧光微球。
其中，无皂乳液聚合可以制备出单分散的亚微米级聚苯乙烯微球，疏水性单体苯乙烯等进行聚合时，单体的引发速率快于聚合物链的增长速率，导致齐聚物自由基大量生成，该自由基不断增长，当其聚合度达到一定的临界浓度时，就会凝聚形成初级粒子，初级粒子不断吸收齐聚物和单体而逐渐形成聚苯乙烯乳胶微球种子乳液。
溶胀包埋法主要是基于铕配合物作为荧光染料与微球内部碳氧结构的疏水相互作用，将铕配合物荧光染料包埋到微球内部。当将微球从溶胀剂中移出后，微球体积迅速缩小，微球表面的空隙也会随之缩小，从而将稀土配合物荧光染料禁锢在微球内部。利用溶胀包埋法制备出粒径更小的功能化纳米微球，其在生物体系的应用中表现出更高的反应灵活性和更快的反应动力学特征。
优选地，步骤(1)中，先将苯乙烯、羧基功能单体和水混合，再将引发剂加入反应体系中溶解，加热至反应的温度，进行乳液聚合反应，得到所述羧基聚苯乙烯微球的种子乳液。
优选地，步骤(1)在保护性气氛下进行。
优选地，所述溶解的时间为30-60min，例如35min、40min、45min、50min、55min等。
优选地，所述乳液聚合反应的温度为60-80℃，例如62℃、64℃、66℃、68℃、70℃、72℃、74℃、76℃、78℃等。
优选地，所述乳液聚合反应的时间为4-24h，例如6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h等。
优选地，步骤(1)中，以所述苯乙烯的总质量为100％计，所述引发剂的质量百分数为0.1％-0.5％，例如0.15％、0.2％、0.25％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％等。
优选地，所述苯乙烯和羧基功能单体的体积比为(0.1-0.4):1，其中，0.1-0.4可以为0.15、0.2、0.25、0.3、0.35等。
优选地，所述羧基功能单体包括丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸二甲氨基丙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基丙酯或丙烯酸二甲氨基丙酯中的任意一种或至少两种的组合，其中典型但非限制性的组合包括：丙烯酸和甲基丙烯酸的组合，甲基丙烯酸二甲氨基丙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯和甲基丙烯酸二乙氨基丙酯的组合，甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基丙酯和丙烯酸二甲氨基丙酯的组合等。
优选地，所述引发剂包括水相引发剂。
优选地，所述引发剂包括硫酸钾、过硫酸钾或硫代硫酸钠中的任意一种或至少两种的组合，其中典型但非限制性的组合包括：硫酸钾和过硫酸钾的组合，过硫酸钾和硫代硫酸钠的组合，硫酸钾、过硫酸钾和硫代硫酸钠的组合等。
作为优选的技术方案，步骤(1)具体包括如下步骤：
在保护性气氛下，先将苯乙烯和羧基功能单体依次加入水中分散，混合均匀，再将引发剂加入反应体系中溶解30-60min，加热至60-80℃，进行4-24h的乳液聚合反应，得到所述羧基聚苯乙烯微球的种子乳液。
优选地，步骤(2)中，所述铕配合物的制备方法包括如下步骤：
将含铕化合物溶液、配体溶液和溶剂混合，配位反应后处理，得到铕配合物。
优选地，所述混合包括：先将配体溶液滴加至含铕化合物溶液中，得到混合液，再与溶剂混合。
优选地，所述混合还包括调pH的操作。
优选地，所述调pH的方式包括：将配体溶液滴加至含铕化合物溶液后，采用滴加碱溶液方式，将体系中溶液pH调节为6-7，例如6.2、6.4、6.6、6.8等。
优选地，所述配位反应的温度为50-60℃，例如52℃、54℃、56℃、58℃等。
优选地，所述配位反应的时间为15-20h，例如16h、18h、20h等。
优选地，所述后处理包括除溶剂、萃取和提纯。
优选地，所述含铕化合物溶液和配体溶液的体积比为1：(1-2)，其中，1-2可以为1.2、1.4、1.6、1.8等。
优选地，所述含铕化合物溶液和溶剂的体积比为1：(1.5-2)，其中，1.5-2可以为1.6、1.7、1.8、1.9等。
优选地，所述含铕化合物溶液中，含铕化合物的浓度为12-67g/L，例如15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、65g/L等。
优选地，所述配体溶液中的配体包括二酮配体和/或菲罗啉配体，进一步优选二酮配体和菲罗啉配体的组合。
本发明中，优选二酮配体和菲罗啉配体的组合，与稀土铕离子(Eu3+)配位，制备了一种具有荧光特性的稀土铕配合物。其中，稀土铕离子具有极丰富的电子能级，经外界能量刺激，可以发生多种能级跃迁而发出荧光。但稀土离子本身不发光，Eu3+的水合离子吸收紫外光或可见光时能发出微弱的荧光，那么需将其与有机配体结合，制备成稀土配合物来提高其发光效率。二酮类配合物能与稀土铕离子形成稳定的六元环，可直接吸收激发光并将能量有效地传递给稀土离子，使得这类配合物在所有稀土配合物中发光效率最高。单纯由二酮类作为配体的配合物达不到饱和配位数，常常含有水分子参与配位，而水分子O-H键的振动能很大，会导致配合物的荧光淬灭，大大降低其发光效率。为了进一步提高稀土离子的发光效率，引入第二配体例菲罗啉，作为协同试剂参与能量转移过程，排挤水分子的参与配位，满足中心离子的配位数。
优选地，所述二酮配体和菲罗啉配体摩尔比为(2-3):1，其中，2-3可以为2.2、2.4、2.6、2.8等。
本发明中，所述配体和菲罗啉配体摩尔比优选(2-3):1，二者的摩尔比偏高，会导致有过多的配体没有参与反应造成配体的浪费；二者的摩尔比偏低，会导致反应不充分，从而降低反应效率；其余均与实施例1相同。
优选地，所述配体溶液中，所述二酮配体的浓度为50-67g/L，例如52g/L、54g/L、56g/L、58g/L、60g/L、62g/L、64g/L、66g/L等。
优选地，所述含铕化合物包括无水氯化铕、三氯化铕六水化合物、氧化铕或硝酸铕六水合物中的任意一种或至少两种的组合，其中典型但非限制性的组合包括：无水氯化铕和三氯化铕六水化合物，无水氯化铕和氧化铕的组合，氧化铕和硝酸铕六水合物的组合，无水氯化铕、三氯化铕六水化合物、氧化铕和硝酸铕六水合物的组合等。
优选地，所述二酮配体包括乙酰丙酮和/或1,3-二苯基-1,3-丙二酮。
优选地，所述菲罗啉配体包括4,7-二苯基-1,10-菲罗啉和/或2,9-二甲基-1,10-菲罗啉。
优选地，所述碱溶液中的溶质包括氢氧化钠、氨水、二乙胺或三乙胺中的任意一种或至少两种的组合，氢氧化钠和氨水的组合，氨水、二乙胺和三乙胺的组合，氢氧化钠、氨水、二乙胺和三乙胺的组合等。
作为优选的技术方案，所述铕配合物的制备方法具体包括如下步骤：先将配体溶液滴加至含铕化合物溶液中，得到混合液，再将混合液与碱溶液混合，在50-60℃下进行15-20h配位反应，最后除溶剂、萃取和提纯，得到所述铕配合物。
优选地，步骤(2)包括：将铕配合物溶液和羧基聚苯乙烯微球的种子乳液混合，进行溶胀反应，得到所述时间分辨荧光微球。
优选地，所述溶胀反应的温度为10-40℃，例如15℃、20℃、25℃、30℃、35℃等。
优选地，所述溶胀反应在避光和搅拌条件下进行。
优选地，所述搅拌的速率为200-600rpm，例如300rpm、400rpm、500rpm等。
优选地，所述搅拌的时间为3-24h，例如4h、6h、8h、12h、14h、16h、18h、20h、22h等。
优选地，所述溶胀反应后还包括蒸发和清洗。
优选地，所述铕配合物和羧基聚苯乙烯微球的体积比为1：(30-35)，其中，30-35可以为31、32、33、34等。
优选地，所述铕配合物溶液包括铕配合物和溶胀剂。
优选地，所述铕配合物溶液中，铕配合物的浓度为2-30g/L，例如5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L等。
优选地，所述羧基聚苯乙烯微球的种子乳液和溶胀剂的体积比为(0.5-1):1，其中，0.5-1可以为0.6、0.7、0.8、0.9等。
优选地，所述溶胀剂包括四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、己烯丙酮、甲苯、己二酸二辛酯、正辛烷或正己烷中的任意一种或至少两种的组合，其中典型但非限制性的组合包括：四氢呋喃、二氯甲烷和三氯甲烷的组合，三氯甲烷、己烯丙酮、甲苯、己二酸二辛酯、正辛烷和正己烷的组合等。
作为优选的技术方案，步骤(2)具体包括如下步骤：
将铕配合物溶液和羧基聚苯乙烯微球的种子乳液混合，避光条件下，在搅拌速率为200-600rpm和温度为10-40℃下进行3-24h溶胀反应，再进行蒸发和清洗，得到所述时间分辨荧光微球。
第二方面，本发明提供一种时间分辨荧光微球，所述时间分辨荧光微球由第一方面所述的制备方法得到。
第三方面，本发明提供一种第二方面所述的时间分辨荧光微球在生物检测中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所述的制备方法操作简单，得到的时间分辨荧光微球尺寸均一可控，表面规整，荧光强度较强而且性能稳定。
(2)本发明所述的时间分辨荧光微球偶联抗体后，具有快速、简便、廉价、检查结果直观、稳定性好、检测标本种类多以及灵敏度低等特点，可达到对待测物进行定量分析的目的。
(3)本发明所述的时间分辨荧光微球偶联PCT抗体后，在250pg/mL下的T/C比值的平均值在0.0174–0.308之间，10次测量结果的标准差SD在0.001-0.0018之间，变异系数CV在8.8％以内；
本发明所述的时间分辨荧光微球偶联PCT抗体后，在500pg/mL下的T/C比值的平均值在0.0313–0.0566之间，SD在0.0020–0.0023之间，CV在7.3％以内；
本发明所述的时间分辨荧光微球偶联PCT抗体后，在1ng/mL下的T/C比值的平均值在0.0466–0.1178之间，SD在0.004–0.0087之间，CV在9.1％以内；
本发明所述的时间分辨荧光微球偶联PCT抗体后，在5ng/mL下的T/C比值的平均值在0.2284–0.7385之间，SD在0.0117-0.0360之间，CV在6.6％以内。
附图说明
图1是实施例1所述的时间分辨荧光微球的扫描电镜图；
图2是实施例1所述的铕配合物的红外光谱图；
图3是实施例1所述的铕配合物的荧光光谱图；
图4是实施例1所述的时间分辨荧光微球偶联PCT抗体后试纸条重复性试验结果图。
具体实施方式
为便于理解本发明，本发明列举实施例如下。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供一种时间分辨荧光微球，所述时间分辨荧光微球由如下方法制备得到：
(1)羧基聚苯乙烯微球的种子乳液的制备
取分散水系于水浴槽中，在氮气气氛下，将体积比为0.3：1的苯乙烯和羧基功能单体丙烯酸依次加入水中分散，混合均匀，再将基于苯乙烯单体用量的0.3wt％的引发剂过硫酸钾加入反应体系中溶解45min，加热至70℃，进行10h的乳液聚合反应，得到所述羧基聚苯乙烯微球的种子乳液。
(2)铕配合物的制备
取0.73g含铕化合物三氯化铕六水化合物溶于30mL乙醇中，得到含铕化合物溶液；
取100mL无水乙醇溶入3.4mmol二酮配体1,3-二苯基-1,3-丙二酮和1.2m mol菲罗啉配体4,7-二苯基-1,10-菲罗啉形成配体溶液；
先将配体溶液分2min滴加至含铕化合物溶液中，得到混合液，采用滴加1mol/L氢氧化钠溶液方式，将体系中溶液pH调节为6-7。在55℃下进行18h配位反应，反应结束用减压蒸馏除去乙醇，在用100mL的去离子水和正己烷萃取，收集正己烷，用无水硫酸钠对收集的正己烷进行除水，然后减压蒸馏，得到铕配合物粉末。
(3)时间分辨荧光微球的制备
将铕配合物溶液和羧基聚苯乙烯微球的种子乳液溶于溶胀剂中，避光条件下，在搅拌速率为400rpm和室温下进行14h溶胀反应，反应结束后通过旋转蒸发仪去除溶胀剂，对剩余微球加入去离子水稀释，对微球表面进行超声清洗，通过高速离心去除上清液，反复操作3次，得到所述时间分辨荧光微球。
实施例2
本实施例提供一种时间分辨荧光微球，所述时间分辨荧光微球由如下方法制备得到：
(1)羧基聚苯乙烯微球的种子乳液的制备
取分散水系于水浴槽中，在氮气气氛下，将体积比为0.3：1的苯乙烯和羧基功能单体甲基丙烯酸依次加入水中分散，混合均匀，再将基于苯乙烯单体用量的0.25wt％的引发剂过硫酸钾加入反应体系中溶解30min，加热至80℃，进行4h的乳液聚合反应，得到所述羧基聚苯乙烯微球的种子乳液。
(2)铕配合物的制备
取0.73g含铕化合物三氯化铕六水化合物溶于30mL乙醇中，得到含铕化合物溶液；
取100mL无水乙醇溶入3.4mmol二酮配体1,3-二苯基-1,3-丙二酮和1.2m mol菲罗啉配体4,7-二苯基-1,10-菲罗啉形成配体溶液；
先将配体溶液分2min滴加至含铕化合物溶液中，得到混合液，采用滴加1mol/L氢氧化钠溶液方式，将体系中溶液pH调节为6-7。在55℃下进行15h配位反应，反应结束用减压蒸馏除去乙醇，在用100mL的去离子水和正己烷萃取，收集正己烷，用无水硫酸钠对收集的正己烷进行除水，然后减压蒸馏，得到铕配合物粉末。
(3)时间分辨荧光微球的制备
将铕配合物溶液和羧基聚苯乙烯微球的种子乳液溶于溶胀剂中，避光条件下，在搅拌速率为200rpm和室温下进行24h溶胀反应，反应结束后通过旋转蒸发仪去除溶胀剂，对剩余微球加入去离子水稀释，对微球表面进行超声清洗，通过高速离心去除上清液，反复操作3次，得到所述时间分辨荧光微球。
实施例3
本实施例提供一种时间分辨荧光微球，所述时间分辨荧光微球由如下方法制备得到：
(1)羧基聚苯乙烯微球的种子乳液的制备
取分散水系于水浴槽中，在氮气气氛下，将体积比为0.3：0.5：0.5的苯乙烯和羧基功能单体丙烯酸和甲基丙烯酸依次加入水中分散，混合均匀，再将基于苯乙烯单体用量的0.3wt％的引发剂过硫酸钾加入反应体系中溶解60min，加热至60℃，进行4h的乳液聚合反应，得到所述羧基聚苯乙烯微球的种子乳液。
(2)铕配合物的制备
取0.73g含铕化合物三氯化铕六水化合物溶于30mL乙醇中，得到含铕化合物溶液；
取100mL无水乙醇溶入3.4mmol二酮配体1,3-二苯基-1,3-丙二酮和1.2m mol菲罗啉配体4,7-二苯基-1,10-菲罗啉形成配体溶液；
先将配体溶液分2min滴加至含铕化合物溶液中，得到混合液，采用滴加1mol/L氢氧化钠溶液方式，将体系中溶液pH调节为6-7。在55℃下进行120h配位反应，反应结束用减压蒸馏除去乙醇，在用100mL的去离子水和正己烷萃取，收集正己烷，用无水硫酸钠对收集的正己烷进行除水，然后减压蒸馏，得到铕配合物粉末。
(3)时间分辨荧光微球的制备
将铕配合物溶液和羧基聚苯乙烯微球的种子乳液溶于溶胀剂中，避光条件下，在搅拌速率为600rpm和室温下进行3h溶胀反应，反应结束后通过旋转蒸发仪去除溶胀剂，对剩余微球加入去离子水稀释，对微球表面进行超声清洗，通过高速离心去除上清液，反复操作3次，得到所述时间分辨荧光微球。
实施例4
本实施例与实施例1的区别在于铕配合物的制备原料中不包括菲罗啉，其余均与实施例1相同。
实施例5-6
实施例5-6与实施例1的区别在于所述二酮配体和菲罗啉配体摩尔比分别为1.5:1(实施例5)和3.5:1(实施例6)，其余均与实施例1相同。
对比例1
本对比例与实施例1的区别在于将铕配合物替换为等质量的二酮类配合物，其余均与实施例1相同。
性能测试
1、将实施例1所述的时间分辨荧光微球进行扫描电镜测试，观察表观形貌，测试结果汇总于图1中。
图1显示，本发明所述的时间分辨荧光微球的粒径均一表面规整，粒径范围为100～400nm。
2、将实施例1所述的铕配合物进行红外光谱图测试，测试结果汇总于图2中。
图2显示，本发明所述的铕配合物在红外光谱图中，可以看出1600cm-1处是C＝O基的伸缩振动峰并以单峰的形式出现，在1510cm-1左右是C＝N的平面振动，在580cm-1处有一个弱的Eu-O峰。
3、将实施例1所述的铕配合物在稳态/瞬态荧光光谱仪进行荧光强度的测试，测试结果汇总于图3中。
图3显示，本发明所述的铕配合物用超纯水稀释成0.01％浓度，仪器参数设置激发波长364nm，发射波长612nm下进行测试，荧光强度为5.54×106。实施例4-6的铕配合物荧光强度分别为3.15×103、1.32×106、1.36×106，对比例1的铕配合物荧光强度为2.84×103。对比荧光强度实施例1所述的铕配合物制备方法最佳。
4、将实施例1-3所述的时间分辨荧光微球偶联抗体后进行测试；
(1)时间分辨荧光微球偶联抗体的制备方法
(a)活化：将时间分辨荧光微球混匀后，取100μL 1％固含量的乳胶微球悬浮液到EP管中，向EP管内加入1mL EDC/Sulfo-NHS的Buffer溶液(浓度为200mM，Sulfo-NHS溶液的浓度为200mM，MES为活化缓冲液50mM，pH5.5)，在30℃下振荡孵育30min，活化结束后在15000rpm条件下离心10min，移去上清液。
(b)偶联：向EP管内加入1mL偶联缓冲液(硼酸盐溶液)，旋涡重悬分散后加入PCT抗体(所述时间分辨荧光微球与抗体的质量比为1mg:0.1mg)，漩涡混合器充分混匀微球，在37℃下振荡偶联2h，完成标记。将上述EP管的微球悬浮液，4℃、15000rpm、离心10min，小心移去上清液。
(c)洗涤：向EP管内加入1mL洗涤液，超声分散混匀微球，其中，超声分散的功率为200W，超声总时间为1min(超5s停5s)，然后在4℃、15000rpm、离心10min，小心移去上清液。重复该步骤1次。
(d)封闭：向EP管内加入1mL封闭液(BSA和甘氨酸的HEPES缓冲液母液与偶联缓冲液体积比为1:9的混合溶液)，超声分散混匀微球，常温旋转封闭过夜，4℃、15000rpm、离心10min，小心移去上清液。
(e)保存：向EP管内加入250μL微球保存液(NaCl、BSA、Tween-20和海藻糖的磷酸盐缓冲液)，超声混匀微球，获得时间分辨荧光微球标记抗体的微球溶液。
(2)时间分辨荧光微球偶联PCT抗体后试纸条重复性试验
本发明中，试纸条是由四部分组成：样本垫、结合垫、NC膜以及吸水垫。将其按一定顺序以相互重叠的方式粘贴于PVC底板上，组装好后形成完整的试纸条体系。采用喷金划膜仪在NC膜上进行划线，包被有单克隆PCT抗体和羊抗鼠IgG抗体作为试纸条的检测线(T线)与质控线(C线)。
将制备的三种时间分辨荧光微球(实施例1-3制备微球标记为A、B、C)和ThermoFisher对照微球(标记为T)，将偶联PCT抗体的微球溶液进行铺垫干燥后，与NC膜、吸水垫、玻璃纤维膜一起组装得到层析试纸条，其中T线抗体划线浓度为1mg/mL，在PCT抗原浓度为250pg/mL、500pg/mL、1ng/mL、5ng/mL梯度参考品下进行精密度测试。
测试结果汇总于表1-5和图4中。
表1时间分辨荧光微球偶联后在250pg/mL下的T/C比值
编号 A B C T
1 0.0311 0.0196 0.0164 0.0149
2 0.0325 0.0185 0.0166 0.0182
3 0.0308 0.0231 0.0167 0.0214
4 0.0318 0.0208 0.0182 0.0172
5 0.0295 0.0221 0.0188 0.0152
6 0.0293 0.0196 0.0186 0.0148
7 0.0278 0.0229 0.017 0.0179
8 0.0308 0.0227 0.0172 0.0191
9 0.0325 0.0187 0.0182 0.0192
10 0.0315 0.0227 0.0159 0.0181
Mean 0.0308 0.0211 0.0174 0.0176
SD 0.0015 0.0018 0.0010 0.0020
CV 4.9％ 8.8％ 5.8％ 11.5％
表2时间分辨荧光微球偶联后在500pg/mL下的T/C比值
Figure BDA0003949386630000161
Figure BDA0003949386630000171
表3时间分辨荧光微球偶联后在1ng/mL下的T/C比值
Figure BDA0003949386630000172
Figure BDA0003949386630000181
表4时间分辨荧光微球偶联后在5ng/mL下的T/C比值
编号 A B C T
1 0.7751 0.2591 0.2222 0.2423
2 0.7003 0.2642 0.2227 0.2517
3 0.7472 0.3076 0.2546 0.2301
4 0.7403 0.3004 0.2141 0.2767
5 0.7029 0.2646 0.2287 0.2691
6 0.7266 0.2999 0.2341 0.2499
7 0.7137 0.2952 0.2321 0.2372
8 0.7047 0.2837 0.2316 0.2519
9 0.8080 0.3015 0.2295 0.2743
10 0.7660 0.2664 0.2139 0.2380
Mean 0.7385 0.2842 0.2284 0.2521
SD 0.0360 0.0189 0.0117 0.0163
CV 4.9％ 6.6％ 5.1％ 6.5％
分析表1-表4可知，本发明所述的时间分辨荧光微球偶联PCT抗体后，微球溶液喷垫制作成试纸条，在250pg/mL、500pg/mL、1ng/mL、5ng/mL梯度参考品下做重复性试验，批内精密度均小于15％，所述时间分辨荧光微球偶联PCT抗体性能稳定。
具体地，分析表1数据可知，本发明所述的时间分辨荧光微球偶联PCT抗体后，在250pg/mL下的T/C比值的平均值在0.0174–0.308之间，10次测量结果的标准差SD在0.001-0.0018之间，变异系数CV在8.8％以内，与对照微球T相比，本发明所述的时间分辨荧光微球信噪比(T/C)更高且CV更低，在一定程度表明试纸条的重复性和灵敏度更好。
分析表2数据可知，本发明所述的时间分辨荧光微球偶联PCT抗体后，在500pg/mL下的T/C比值的平均值在0.0313–0.0566之间，SD在0.0020–0.0023之间，CV在7.3％以内，与对照微球T相比，本发明实施例1所述的时间分辨荧光微球CV更低，表明试纸条的重复性更好。
分析表3数据可知，本发明所述的时间分辨荧光微球偶联PCT抗体后，在1ng/mL下的T/C比值的平均值在0.0466–0.1178之间，SD在0.004–0.0087之间，CV在9.1％以内，与对照微球T相比，本发明所述的时间分辨荧光微球T/C比值更高，表明微球使用性能更优。
分析表4数据可知，本发明所述的时间分辨荧光微球偶联PCT抗体后，在5ng/mL下的T/C比值的平均值在0.2284–0.7385之间，SD在0.0117-0.0360之间，CV在6.6％以内，与对照微球T相比，本发明所述的时间分辨荧光微球T/C比值更高，表明微球使用性能更优。
表5时间分辨荧光微球偶联后在梯度参考品下的T/C比值
Figure BDA0003949386630000191
Figure BDA0003949386630000201
表5中将所述时间分辨荧光微球制作得到层析试纸条，其中T线抗体划线浓度为2mg/mL，在PCT抗原浓度为0ng/mL、50pg/mL、100pg/mL、250pg/mL、500pg/mL、1ng/mL梯度参考品下进行最低检测限测试，在0.05ng/mL到1ng/mL梯度参考品下试纸条均呈现T线，且信噪比(T/C)呈一定比例升高，T/C比值越高在一定程度表明试纸条的灵敏度越好。数据对比发现各梯度参考品下微球A比对照微球T使用性能略优。
图4结果显示时间分辨荧光微球经偶联PCT抗体后的试纸条，在提取液空白对照下的图像为C线处有一条明亮的条带，T线处无肉眼可见荧光条带，试纸条显色正常无假阳。对比发现微球A比对照微球T的检测线更亮。
5、将实施例1、实施例4-6和对比例1进行如下测试：
将上所述的铕配合物分别用超纯水取样稀释成0.01％浓度的样品，在稳态/瞬态荧光光谱仪上设置相对应的激发波长/发射波长(Ex/Em)，进行荧光强度的测试。
将上所述的铕配合物分别用超纯水取样稀释成0.01％浓度的样品，在电感耦合等离子体发射光谱仪上对荧光染料中的铕元素进行测试。
上所述的铕配合物的荧光强度和纯度结果汇总于表6中。
表6铕配合物稀释成0.01％浓度下的荧光强度和纯度
Figure BDA0003949386630000202
Figure BDA0003949386630000211
结果表明：
对比例1荧光强度性能不如实施例1，证明以铕配合物制备的时间分辨荧光微球性能更佳。
实施例4荧光强度性能不如实施例1，证明二酮配体和菲罗啉配体物制备的时间分辨荧光微球性能更佳。
实施例5-6荧光强度和纯度性能不如实施例1，证明二酮配体和菲罗啉配体摩尔比在(2-3):1范围内制备的时间分辨荧光微球性能更佳。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种时间分辨荧光微球的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将苯乙烯和羧基功能单体利用无皂乳液聚合法，进行乳液聚合反应，得到羧基聚苯乙烯微球的种子乳液；
(2)将铕配合物通过溶胀法包埋至羧基聚苯乙烯微球内部，得到所述时间分辨荧光微球。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，先将苯乙烯、羧基功能单体和水混合，再将引发剂加入反应体系中溶解，加热至反应的温度，进行乳液聚合反应，得到所述羧基聚苯乙烯微球的种子乳液；
优选地，步骤(1)在保护性气氛下进行；
优选地，所述溶解的时间为30-60min；
优选地，所述乳液聚合反应的温度为60-80℃；
优选地，所述乳液聚合反应的时间为4-24h；
优选地，步骤(1)中，以所述苯乙烯的总质量为100％计，所述引发剂的质量百分数为0.1％-0.5％；
优选地，所述苯乙烯和羧基功能单体的体积比为(0.1-0.4):1；
优选地，所述羧基功能单体包括丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸二甲氨基丙酯、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸二乙氨基丙酯或丙烯酸二甲氨基丙酯中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述引发剂包括水相引发剂；
优选地，所述引发剂包括硫酸钾、过硫酸钾或硫代硫酸钠中的任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)具体包括如下步骤：
在保护性气氛下，先将苯乙烯和羧基功能单体依次加入水中分散，混合均匀，再将引发剂加入反应体系中溶解30-60min，加热至60-80℃，进行4-24h的乳液聚合反应，得到所述羧基聚苯乙烯微球的种子乳液。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述铕配合物的制备方法包括如下步骤：
将含铕化合物溶液、配体溶液和溶剂混合，配位反应，后处理，得到铕配合物；
优选地，所述混合包括：先将配体溶液滴加至含铕化合物溶液中，得到混合液，再与溶剂混合；
优选地，所述混合还包括调pH的操作；
优选地，所述调pH的方式包括：将配体溶液滴加至含铕化合物溶液后，采用滴加碱溶液方式，将体系中溶液pH调节为6-7；
优选地，所述配位反应的温度为50-60℃；
优选地，所述配位反应的时间为15-20h；
优选地，所述后处理包括除溶剂、萃取和提纯。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述含铕化合物溶液和配体溶液的体积比为1：(1-2)；
优选地，所述含铕化合物溶液和溶剂的体积比为1：(1.5-2)；
优选地，所述含铕化合物溶液中，含铕化合物的浓度为12-67g/L；
优选地，所述配体溶液中的配体包括二酮配体和/或菲罗啉配体；
优选地，所述二酮配体和菲罗啉配体摩尔比为(2-3):1；
优选地，所述配体溶液中，所述二酮配体的浓度为50-67g/L；
优选地，所述含铕化合物包括无水氯化铕、三氯化铕六水化合物、氧化铕或硝酸铕六水合物中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述二酮配体包括乙酰丙酮和/或1,3-二苯基-1,3-丙二酮；
优选地，所述菲罗啉配体包括4,7-二苯基-1,10-菲罗啉和/或2,9-二甲基-1,10-菲罗啉。
6.根据权利要求1-5任一项所述的制备方法，其特征在于，所述铕配合物的制备方法具体包括如下步骤：先将配体溶液滴加至含铕化合物溶液中，得到混合液，再将混合液与pH调节剂和溶剂混合，在50-60℃下进行15-20h配位反应，最后除溶剂、萃取和提纯，得到所述铕配合物。
7.根据权利要求1-6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)包括：将铕配合物溶液和羧基聚苯乙烯微球的种子乳液混合，进行溶胀反应，得到所述时间分辨荧光微球；
优选地，所述溶胀反应的温度为10-40℃；
优选地，所述溶胀反应在避光和搅拌条件下进行；
优选地，所述搅拌的速率为200-600rpm；
优选地，所述搅拌的时间为3-24h；
优选地，所述溶胀反应后还包括蒸发和清洗；
优选地，所述铕配合物和羧基聚苯乙烯微球的体积比为1：(30-35)；
优选地，所述铕配合物溶液包括铕配合物和溶胀剂；
优选地，所述铕配合物溶液中，铕配合物的浓度为2-30g/L；
优选地，所述羧基聚苯乙烯微球的种子乳液和溶胀剂的体积比为(0.5-1):1；
优选地，所述溶胀剂包括四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、己烯丙酮、甲苯、己二酸二辛酯、正辛烷或正己烷中的任意一种或至少两种的组合。
8.根据权利要求1-7任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)具体包括如下步骤：
将铕配合物溶液和羧基聚苯乙烯微球的种子乳液混合，避光条件下，在搅拌速率为200-600rpm和温度为10-40℃下进行3-24h溶胀反应，再进行蒸发和清洗，得到所述时间分辨荧光微球。
9.一种时间分辨荧光微球，其特征在于，所述时间分辨荧光微球由权利要求1-8任一项所述的制备方法得到。
10.一种权利要求9所述的时间分辨荧光微球在生物检测中的应用。
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