CN108414745A - 一种简单高效的可视化生物传感信号放大方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种简单高效的可视化生物传感信号放大方法。利用样品溶液中的目标分析物，通过特异性分子识别反应，将物理包埋催化性纳米材料的功能化复合物探针结合到固相平台表面；改变该固相平台表面的环境因素，将催化性纳米材料从功能化复合物探针释放到溶液中；往该混合溶液加入弱酸性2‑(N‑吗啉)乙磺酸溶液和氯金酸溶液，快速生成红色纳米金溶液。红色纳米金溶液形成时间反比于分析物浓度。使用电池驱动的廉价小型计时器进行信号读取，实现分析物的低成本便携式定量检测。本发明具有操作简单、成本低廉、不需使用专业分析仪器设备、适于现场分析和即时检测等优点；能直接推广应用于医学诊断、环境监测、食品安全等诸多领域。

Description

一种简单高效的可视化生物传感信号放大方法

技术领域

本发明属于纳米生物传感技术领域，具体涉及一种简单高效的可视化生物传感信号放大方法。

背景技术

生物传感技术是化学、生物学、物理学等多学科交叉融合而发展起来的一个新兴而活跃的研究领域。自1967年Updike和Hicks采用酶固化技术研制出第一支生物传感器以来，广大科学家对生物传感技术产生了极大的兴趣。生物传感技术是以生物活性单元（如蛋白质、核酸、酶、微生物、细胞、组织等）作为生物识别元件，结合物理或化学转换元件（如电化学电极、光学检测元件、微/纳米检测探针、压电石英晶体、纸微流控分析装置等），对目标物进行分析的一种先进的检测技术。其工作原理是：待测的目标物与生物识别元件（生物活性单元）特异性结合后，发生物理或化学反应，产生的生物学信息通过转换元件转换为可以输出的光信号或电信号，从而实现对目标物的分析和检测。生物传感技术已在医学诊断、食品分析和环境监测等领域获得广泛的应用。现有的生物传感技术主要包括电化学生物传感技术、荧光生物传感技术、化学发光生物传感技术、比色生物传感技术等。然而，这些技术不同程度地存在分析灵敏度不足、定量分析时必须依赖价格昂贵且体积庞大的分析仪器、不能用于现场分析与即时检测领域等问题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种简单高效的可视化生物传感信号放大方法。

本发明的思路：利用样品溶液中的目标分析物，通过特异性分子识别反应，将物理包埋催化性纳米材料的功能化复合物探针结合到固相平台表面；进而改变该固相平台表面的环境因素，将催化性纳米材料从功能化复合物探针中释放到溶液中；最后往该混合溶液中加入弱酸性2-(N-吗啉)乙磺酸溶液和氯金酸溶液，所释放的催化性纳米材料将高效催化这两种试剂的氧化还原反应，快速原位生成红色纳米金溶液。本发明协同利用功能化复合物探针对催化性纳米材料的高包埋量与催化性纳米材料对2-(N-吗啉)乙磺酸-氯金酸二者之间的氧化还原的高催化能力，实现分析灵敏度的显著提高。此外，红色纳米金溶液的形成时间反比于分析物浓度。通过使用电池驱动的廉价小型计时器代替电化学分析仪、荧光分光光度计、化学发光仪、紫外可见分光光度计等价格昂贵且缺乏便携性的分析仪器，进行信号（红色溶液的形成时间）读取，实现分析物的低成本便携式定量检测。

具体步骤为：

（1）利用样品溶液中的目标分析物，通过特异性分子识别反应，将物理包埋催化性纳米材料的功能化复合物探针结合到固相平台表面。

（2）改变步骤（1）中固相平台表面的环境因素，将催化性纳米材料从功能化复合物探针中释放到溶液中。

（3）往步骤（2）所得溶液中加入2-(N-吗啉)乙磺酸溶液和氯金酸溶液，所释放的催化性纳米材料将催化这两种试剂的氧化还原反应，原位生成纳米金颗粒。

（4）目视观察步骤（3）所得混合溶液的颜色变化，同时使用便携式计时器记录自氯金酸溶液加入起至混合溶液完全呈现红色所需的时间，该时间与样品中目标分析物的浓度呈反向关系。

所述目标分析物是指无机离子、有机离子、小分子、蛋白质、核酸、细胞、病毒和细菌中的一种。

所述特异性分子识别反应是指抗原-抗体之间的免疫反应、核酸之间的杂交反应、分析物与其核酸适配体之间的结合反应、酶与底物之间的反应、以及分析物与其分子印迹材料之间的结合反应中的一种。

所述可特异性结合目标分析物的材料是指抗原、抗体、生物素、亲和素、核酸、核酸适配体和分子印迹材料中的一种。

所述催化性纳米材料是指至少有一维尺寸在1~100纳米范围里的纳米金属颗粒、棒、管、片，纳米无机氧化物颗粒、棒、管、片，与纳米有机物颗粒、棒、管、片中的一种。

所述功能化复合物探针是指表面共价结合修饰了可特异性结合目标分析物材料且至少有一维尺寸在20 纳米~10微米范围里的可溶胀性有机聚合物颗粒、环境因素刺激响应性凝胶、脂质体、多孔性无机物薄膜与多孔性无机物颗粒中的一种。

所述固相平台是指采用异质固相反应模式的微孔板、有机试管、无机试管、疏水性材料填充图案化纸装置或纸芯片，或采用溶液均相反应模式的超顺磁性有机物颗粒与无机物颗粒、无磁性有机物颗粒与无机物颗粒中的一种。

所述环境因素是指有机溶剂、pH值、加热与光照因素中的一种。

所述的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液和氯金酸溶液的溶剂是指水或这两种试剂的任意有机溶剂中的一种。

与现有的生物传感技术相比，本发明的突出优点在于：

1）由于所使用功能化复合物探针具有很大的催化性纳米材料包埋量，且催化性纳米材料具有很高的催化2-(N-吗啉)乙磺酸-氯金酸二者之间的氧化还原的能力，可有效地放大单个特异性分子识别反应的响应信号，获得极高的分析灵敏度。

2）仅需肉眼观测混合反应溶液颜色的改变，并使用价格低廉的小型计时器即可进行便携式定量信号读取，从而在极大降低分析成本的同时还能实现分析物的现场分析和即时检测。

3）将本发明中的技术与抗原-抗体之间的免疫反应、核酸之间的杂交反应、分析物与其核酸适配体之间的结合反应、酶与底物之间的反应、或分析物与其分子印迹材料之间的反应相结合，可直接推广应用于医学诊断、环境监测、食品安全等诸多领域里各类型样本中无机离子、有机离子、小分子、蛋白质、核酸、细胞、病毒，或细菌目标分析物的简单、经济、快速、灵敏、特异的便携式定性与定量检测。

具体实施方式

以下实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1:

基于包埋纳米铜颗粒的聚苯乙烯微球探针的低成本高灵敏免疫分析法用于计时检测人癌基因蛋白质p190/bcr-abl（HOP）。

具体实施过程如下：

（1）往酶标板上的单个酶标孔加入60 μL 浓度为0.3 mg/mL 的HOP单克隆抗体（浓度为10 mmol/L的碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液配制，pH 9.5），4℃冰箱中静置过夜，将该抗体吸附固定于酶标孔底部，弃去液体且甩干后再将每个孔加满洗涤液（浓度为10 mmol/L磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液，pH 7），静置40 秒后弃去未固定的单克隆抗体分子，如此重复4次，将孔倒置在平铺的卷筒纸上拍干。

（2）在步骤（1）所得产物中加入60 μL浓度为15 mg/mL的牛血清白蛋白（浓度为10mmol/L的碳酸氢钠-碳酸钠缓冲溶液配制，pH 9.5），室温下静置6 小时封闭酶标孔底部的活性结合位点，弃去液体且甩干后加满洗涤液，静置40 秒后弃去，如此重复4次，将孔倒置在平铺的卷筒纸上拍干。

（3）在步骤（2）所得产物中依次加入60 μL待测HOP样品溶液、15 μL浓度为0.5 mg/mL 的生物素标记的HOP多克隆抗体（浓度为10 mmol/L的磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液配制，pH 7）以及60 μL 1.5 mg/mL 表面由链霉亲和素标记、内部包埋纳米铜颗粒（~20 nm粒径）的聚苯乙烯微球（~500 nm粒径）悬浊液（浓度为10 mmol/L的磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液配制，pH 7），轻微震荡混匀后置于37℃水浴箱中反应40 分钟，在酶标孔底部形成“单克隆抗体-HOP-生物素化多克隆抗体-亲和素标记聚苯乙烯微球”复合物，弃去含有未结合多克隆抗体和聚苯乙烯微球探针的液体，甩干，将每个孔加满洗涤液，静置40秒后弃去，如此重复6次，将孔倒置在平铺的卷筒纸上拍干。

（4）在步骤（3）所得产物中加入60 μL丙酮，室温下静置30分钟使聚苯乙烯微球发生溶胀以释放出纳米铜颗粒。

（5）37℃下往步骤（4）所得产物中加入500 μL 浓度为1.2 mmol/L的2-(N-吗啉)乙磺酸水溶液（预先使用浓度为1 mol/L的氢氧化钠水溶液将其pH值调节至5.8）和5 μL 浓度为20 mmol/L的氯金酸（HAuCl₄）水溶液，所释放的纳米铜颗粒将催化2-(N-吗啉)乙磺酸和氯金酸之间的生成纳米金颗粒的氧化还原反应。

（6）肉眼观测步骤（4）所得混合溶液的颜色变化，同时使用市售便携式电子计时器记录自氯金酸水溶液加入起至混合溶液完全呈现红色所需的时间（t）。根据如下标准曲线即可测定待测样品溶液中HOP浓度。

按上述1-6步骤对7个配制的HOP标准溶液（浓度从10^-9到10^-15 mol/L每隔一个数量级一个）进行检测，记录各标准溶液样品的t值，用t值对标准溶液中HOP浓度作图获得标准曲线。

实施例2:

基于包埋纳米铜颗粒的聚苯乙烯微球探针的低成本高灵敏核酸适配体生化分析法用于计时检测腺苷。

具体实施过程如下：

（1）在1.5 mL试管中混合50 μL短链DNA链（末端生物素化）和腺苷核酸适配体链共同修饰的超顺磁性Fe₃O₄@SiO₂微球（~4 μm粒径）悬浊液（浓度为10 mmol/L的磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液配制，pH 7）、50 μL待测腺苷样品溶液、50 μL 浓度为1.5 mg/mL 表面由链霉亲和素标记、内部包埋纳米铜颗粒（~20 nm粒径）的聚苯乙烯微球（~500 nm粒径）悬浊液（浓度为10 mmol/L的磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液配制，pH 7），轻微震荡混匀后于37℃下反应20 分钟，腺苷与其适配体结合后形成复合物脱离超顺磁性微球表面，使得短链DNA末端的生物素暴露出来，用于结合链霉亲和素标记的聚苯乙烯微球，得到“超顺磁性微球-生物素化短链DNA-亲和素标记聚苯乙烯微球”复合物，磁场下分离、弃去含有未结合的聚苯乙烯微球探针的液体，再将磁分离沉积物重新悬浮在200 μL洗涤缓冲溶液（浓度为10 mmol/L磷酸二氢钠-磷酸氢二钾缓冲溶液配制，pH 7），静置40 秒后磁场下分离弃去，如此重复6次。

（2）在步骤（1）所得产物中加入100 μL丙酮，室温下静置30 分钟使聚苯乙烯微球发生溶胀以释放出纳米铜颗粒。

（3）37℃下往步骤（2）所得产物中加入500 μL 浓度为1.2 mmol/L的2-(N-吗啉)乙磺酸水溶液（预先使用1mol/L氢氧化钠水溶液将其pH值调节至5.8）和5 μL浓度为 20mmol/L的氯金酸（HAuCl₄）水溶液，所释放的纳米铜颗粒将催化2-(N-吗啉)乙磺酸和氯金酸之间的生成纳米金颗粒的氧化还原反应。

（4）肉眼观测在步骤（3）所得产物中混合溶液的颜色变化，同时使用市售便携式电子计时器记录自氯金酸水溶液加入起至混合溶液完全呈现红色所需的时间（t）。根据如下标准曲线即可测定待测样品溶液中腺苷浓度。

按上述步骤对10个配制的腺苷标准溶液（浓度从10^-7到10^-16 mol/L每隔一个数量级一个）进行检测，记录各标准溶液样品的t值，用t值对标准溶液中腺苷浓度作图获得标准曲线。

Claims (1)

1.一种简单高效的可视化生物传感信号放大方法，其特征在于具体步骤为：

(1)利用样品溶液中的目标分析物，通过特异性分子识别反应，将表面修饰了可特异性结合目标分析物的材料且内部物理包埋了催化性纳米材料的功能化复合物探针结合到固相平台表面；

(2)改变步骤(1)中固相平台表面的环境因素，将催化性纳米颗粒从功能化复合物探针中释放到溶液中；

(3)往步骤(2)所得溶液中加入2-(N-吗啉)乙磺酸溶液和氯金酸溶液，所释放的催化性纳米材料将催化这两种试剂的氧化还原反应，原位生成纳米金颗粒；

(4)目视观察步骤(3)所得混合溶液的颜色变化，同时使用便携式计时器记录自氯金酸溶液加入起至混合溶液完全呈现红色所需的时间，该时间与样品中目标分析物的浓度呈反向关系；

所述目标分析物是指无机离子、有机离子、小分子、蛋白质、核酸、细胞、病毒和细菌中的一种；

所述特异性分子识别反应是指抗原-抗体之间的免疫反应、核酸之间的杂交反应、分析物与其核酸适配体之间的结合反应、酶与底物之间的反应、以及分析物与其分子印迹材料之间的结合反应中的一种；

所述可特异性结合目标分析物的材料是指抗原、抗体、生物素、亲和素、核酸、核酸适配体和分子印迹材料中的一种；

所述催化性纳米材料是指至少有一维尺寸在1~100纳米范围里的纳米金属颗粒、棒、管、片，纳米无机氧化物颗粒、棒、管、片，与纳米有机物颗粒、棒、管、片中的一种；

所述功能化复合物探针是指表面共价结合修饰了可特异性结合目标分析物材料且至少有一维尺寸在20 纳米~10微米范围里的可溶胀性有机聚合物颗粒、环境因素刺激响应性凝胶、脂质体、多孔性无机物薄膜与多孔性无机物颗粒中的一种；

所述固相平台是指采用异质固相反应模式的微孔板、有机试管、无机试管、疏水性材料填充图案化纸装置或纸芯片，或采用溶液均相反应模式的超顺磁性有机物颗粒与无机物颗粒、无磁性有机物颗粒与无机物颗粒中的一种；

所述环境因素是指有机溶剂、pH值、加热与光照因素中的一种；

所述的2-(N-吗啉)乙磺酸溶液和氯金酸溶液的溶剂是指水或这两种试剂的任意有机溶剂中的一种。