CN111929443A - 一种肝素结合蛋白测定试剂盒及其制备和测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒，包括亲和素标记的磁微粒、生物素标记的HBP抗体1、辣根过氧化物酶标记的HBP抗体2、HBP校准品、浓缩洗液和底物。本发明还公开了试剂盒的制备方法和测定方法。本发明新型免疫测定试剂盒用以体外定量测定人体液中的HBP，克服了传统酶免疫分析(EIA)法在操作方面的人为误差，并可通过定量客观反映HBP的存在，为临床诊断及疗效观察和预后判断提供更有力的实验诊断依据。本发明所提供的肝素结合蛋白测定方法特异性高，重复性好，检测灵敏度高，线性范围宽，自动化程度高，操作简便快速；与EIA法比较，具有快速、简便、准确、干扰小的优点。

Description

一种肝素结合蛋白测定试剂盒及其制备和测定方法
技术领域
本申请涉及免疫测定技术领域，尤其涉及一种应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒及肝素结合蛋白的测定方法。
背景技术
感染性疾病是一类严重威胁人类健康的疾病。脓毒症是病死率较高的感染性疾病之一，尽早诊断及治疗对提高脓毒症疗效及预后有重要的作用，所以现在临床面临的最大挑战是如何尽早对脓毒症患者明确诊断。近年来肝素结合蛋白(HBP)被证实可以作为脓毒症早期诊断标志物之一。
脓毒血症是指由感染引起的全身性炎症反应综合征(systemicinf1animatoryresponsesyndrome，SIRS)，临床上证实有感染或高度可疑感染。尽管脓毒血症是由感染引起的，但是一旦发生后，其发生及发展遵循自身的病理生理过程和规律，因此，从本质上来说脓毒血症是机体对感染性因素的反应。严重脓毒血症，是指脓毒血症并且伴有组织器官功能障碍及组织灌注不良或低血压。脓毒血症一旦发生，病情发展迅速，病死率高，给临床医疗活动带来巨大的挑战。近年来由于抗生素的不合理应用，耐药菌不断增加、糖皮质激素类药物及免疫抑制剂等广泛使用、人口老龄化等多种因素，脓毒血症发生率很高，流行病学调查研究结果显示，在过去的十年里，脓毒血症的发病率在不断攀升，全球每年有数百万人罹患脓毒血症，在美国严重脓毒血症发病率平均每年增长13.0％-13.3％，成为美国人口常见死亡原因之一。能够引起脓毒血症的病原微生物有很多，细菌、真菌、病毒及寄生虫均可以导致脓毒血症的发生，其根本的发病机制目前还不是很清楚，涉及到全身性炎症网络效应、组织损伤、凝血功能异常、免疫功能障碍以及机体对不同致病因素的异常反应等多个方面。近年来，尽管有效抗感染治疗措施和器官功能支持技术在临床广泛应用，使得脓毒血症的病死率有所下降，但总死亡率仍然在上升，超过肺癌及乳腺癌死亡率总和，在全世界人口死亡原因排行榜上处于前10的位置，每天全球有十几万人死于脓毒血症并发症，现如今脓毒血症已经成为重症监护室病房里非心血管病人的首要死亡原因。就概念上来讲，脓毒血症被定义为机体对感染性因素产生的全身性炎症反应，多种血浆标志物，例如内毒素、细胞因子、趋化因子、前列环素、氧自由基等，参与其病理生理过程，扮演着重要角色，调控疾病的进程，并可能对机体造成潜在的伤害，常常以体温、心率、呼吸频率等非特异性生理参数的改变为特征。血培养阳性是确诊脓毒血症的金标准，但其结果很容易受到其他因素干扰影响，耗时久，在临床诊疗活动中具有明显的延后性，并且阳性率低，仅约45％的脓毒血症性休克患者出现血培养阳性结果(脓毒血症性休克是严重脓毒血症的一种特殊形式，即严重脓毒血症给予足够液体复苏后排除其他可解释因素，仍有持续性低血压)，同时其医疗成本高，造成一定的资源浪费，这些因素共同限制了血培养在脓毒血症诊断中的应用。
HBP也被称为天青杀素或者阳离子抗菌蛋白37，是1984年被Shafer等首先分离提取的中性粒细胞衍生颗粒蛋白。HBP主要存在中性粒细胞的分泌颗粒和嗜天青颗粒中，相关研究显示其对炎症反应和血管渗漏的调节可能起到重要的作用。HBP是从251个氨基酸的前体中，在N末端去除26个氨基酸残基、C末端去除3个氨基酸残基而合成的一个单链糖蛋白。成熟的HBP由上述剩余的222个氨基酸残基构成，相对分子质量为24000。序列分析表明其与人的中性粒细胞弹性蛋白酶有45％的同源性，与蛋白酶3有42％的同源性，与人的嗜中性粒细胞中的组织蛋白酶G有32％的同源性。HBP上具有一个有催化作用的三联体，当其中的41号组氨酸和175号丝氨酸分别被丝氨酸和甘氨酸所替换，使其无法与二异丙基氟磷酸结合，并无法裂解人工或天然的蛋白水解酶底物，三联体中的89号天冬氨酸被保留。尽管HBP失去蛋白水解活性，但它仍然可以与胰蛋白酶抑制剂(BPTI)结合，使BPTI亲和色谱法成为提纯HBP的一种高效方法，而175号甘氨酸被大量谷氨酰胺残基所取代，能够消除天青杀素的BPTI亲和性，证实了HBP与BPTI亲和是作用于HBP活化中心三联体上的。从HBP的重组体中分离出三联体结构，发现三联体是由两个类似胰蛋白酶的蛋白酶类区域组成的，这两个区域是由6个反向平行的13氨基酸组成的13圆柱形，HBP的整体结构同源于中性粒细胞弹性蛋白酶，差别只是在某些位置存在环形区域及电荷分布不同，而在分子表面存在酸性及碱性氨基酸组成的独立板块。
HBP作为一种颗粒释放蛋白，其产生及释放机制尚需进一步研究；但它作为临床新的炎性标志物，具有早期、特异、敏感的特性，优于传统的炎性标志物，可在临床广泛应用。而且它具有对病情的早期评估，预后评价及疗效观察的价值；将它作为指导临床抗生素的应用，还可大大减少抗生素的滥用，减少耐药菌群的产生，有重要的临床和经济学意义。并且HBP有很强的导致血管渗漏的功能，在临床治疗尤其在循环衰竭或休克的治疗中很有必要将其作为一种治疗靶标，以减少病人死亡的几率。如何将HBP和传统炎症指标结合，寻求更加快速、特异、敏感的诊断感染的指征，尚需进一步研究和观察。
目前临床常用于判断感染的传统炎症指标如白细胞、中性粒细胞、乳酸、C反应蛋白及降钙素原等的影响因素较多，尤其是老年人常伴有免疫功能和机体反应低下，这些指标的升高水平不一定能准确反映病情的严重程度。Pdduzzi等发现，白细胞及中性粒细胞的升高不是感染的独立预测指标，且用于诊断感染的准确性很低，同时无法反映预后。而C反应蛋白是一种急性期反应蛋白，由肝脏合成并分泌，目前在临床上应用较广，但除细菌感染外，病毒感染、心血管系统疾病、哮喘、心搏骤停等均可引起C反应蛋白的升高，而且一般炎症反应需12h后才能检出，因而存在延迟反应，且对感染的诊断缺乏特异性。降钙素原作为一个早期诊断靶标，是严重细菌感染诊断与治疗监测指标，目前为实验室和临床应用；但其只在机体感染产生全身反应时才会产生，在局部感染和慢性感染时其血浆水平正常或轻微升高，且有Meta分析表明降钙素原并不能有效区分是细菌感染还是非细菌感染所引起的全身性炎症反应综合征，降钙素原在严重的感染性疾病中早期诊断的地位再次受到挑战。
近期有研究发现肝素结合蛋白(heparin-bindingprotein，HBP)可以作为新兴的诊断严重脓毒血症及脓毒血症性休克的早期生物标志物，可以对严重感染患者即将发生的休克进行预测。但未提及与PCT之间是否存在相关性，并且，其在脓毒血症诊断中的临床应用价值仍有待进一步研究。HBP具有较强的结合肝素的能力，因而被命名为肝素结合蛋白，其是中性粒细胞嗜天青颗粒中的可分泌多功能蛋白质，也被称为天青杀素，具有显著的杀菌活性、趋化作用以及调节炎症反应。释放入血液循环的HBP可以调节血管内皮细胞的功能，诱导血管内皮细症反应应答往往起始于细胞内的结构改变，尤其是细胞骨架和线粒体的改变。同时由此所致的凝血功能障碍在脓毒血症的发生发展中发挥重要作用，决定着疾病的预后。同时，细胞外液中的HBP还可进一步促进中性粒细胞渗出并脱颗粒。大量的HBP释放，可激活单核/巨噬细胞系统，诱导肿瘤坏死因子-a(Tumornecrosisfactoralpha，TNF-a)和干扰素-y(interferongamma，IFN-丫)及白细胞介素(Interleukin，IL)的释放，并且，炎症反应与凝血反应之间相互影响，两者的相互作用主要表现在以下两个方面:一方面炎症反应时内皮细胞及单核细胞等多种细胞均表达组织生长因子，激活凝血系统，凝血因子激活后引发生理性的抗凝途径下调，而另一方面有很多凝血因子其自身也是炎症介质，在炎症反应过程中可以激活其他炎症反应介质，也可以被其他炎症反应介质激活。
众所周知，在脓毒血症的生理病理过程中，大量的中性粒细胞和单核/巨噬细胞激活并释放一系列的细胞因子，各种细胞因子之间相互作用并形成网格系统，这在调控炎症反应的发生以及发展过程中具有至关重要的作用。其中TNF-a就扮演着促进炎症反应发生的重要角色。TNF-a可辅助白细胞黏附于血管内皮细胞，有助于白细胞在炎症部位聚集并激活中性粒细胞释放蛋白水解酶和氧自由基，放大炎症反应。更有研宄发现，对于手术后患者，血浆TNF-a水平可用于鉴别脓毒血症和非脓毒血症SIRS。IL-6也是促进炎症反应介质的核心成员，能激活T细胞，诱导B细胞分化。有文献报道，一般感染患儿血浆IL-6浓度轻度升高，脓毒血症患儿血浆IL-6浓度会显著升高，脓毒血症患者血浆IL-6水平与疾病严重程度评分及死亡率正相关，IL-6有望成为严重脓毒血症独立预警生物标志物。因此，我们有理由推测HBP在脓毒血症的发展进程中发挥重要作用。
综上所述，HBP与细菌感染有紧密的关系，对于细菌引起的感染有较高的灵敏度和特异度，是一项非常有应用价值的诊断感染状态的炎性指标，同时也可能是细菌感染新的治疗途径。但是有关HBP在体内作用的分子机制及临床应用方面的研究尚存在许多空白点，如何早期确诊脓毒血症并评估疾病的严重程度，以达到早期及时的干预治疗，提高患者的治愈率，改善患者预后，降低总死亡率，从而节约医疗资源，减轻患者及社会经济负担仍然是目前临床工作中面临的一大难题。脓毒血症的致病机制复杂多样，以此为背景的脓毒血症早期生物标志物研究为脓毒血症的早期诊断和治疗提供了新的思路。这都有待研究工作者的进一步探索和努力。
肝素结合蛋白在诊断感染病方面优于降钙素原和C反应蛋白，尤其是对于脓毒血症的诊断和预后观察，近些年体外诊断试剂行业生产厂家数量大幅度增加，但产品都以普通品种居多，并无高新技术，导致检测结果的灵敏性及特异性不够理想。
发明内容
有鉴于此，本申请的第一个目的在于提供一种以体外定量测定人体液(血液、尿液、脑脊液、胸腹水等)中的肝素结合蛋白为目的，基于磁微粒化学发光酶免疫分析法原理的肝素结合蛋白测定试剂盒。
本申请的第二个目的在于，针对现有技术中的不足，提供一种应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒的制备方法。
本申请的第三个目的在于，针对现有技术中的不足，提供一种应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白的测定方法。
为解决上诉技术问题，本申请的第一个目的采用以下技术方案予以实现：
一种应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒，所述试剂盒包括：磁微粒、HBP抗体1、酶标记的HBP抗体2、HBP校准品、浓缩洗液和底物。
可选的，所述磁微粒为亲和素标记的磁微粒。
可选的，所述磁微粒置于储存液中储存。
进一步的，所述亲和素标记的磁微粒置于储存液中储存。
可选的，所述储存液为含有Tween-20、BSA、EDTA、Procline300、PEG的磷酸盐缓冲液。
可选的，所述磷酸盐缓冲液浓度为0.02mol/L、pH7.4。
进一步的，所述储存液为质量分数为0.4％至0.8％Tween-20、0.5％至1.5％BSA、0.5％至1.5％EDTA、0.09％至0.11％Procline300、2.5％至6.5％PEG的pH7.4、0.02mol/L磷酸盐缓冲液。
进一步的，所述储存液为质量分数为0.5％Tween-20、1％BSA、1％EDTA、0.1％Procline300、4％PEG的pH7.4、0.02mol/L磷酸盐缓冲液。
可选的，所述储存液保存温度为2℃至8℃。
可选的，所述磁微粒粒径为0.9μm至1.1μm。
可选的，所述磁微粒为羧基磁性微球，所述羧基磁性微球为核壳结构，内核为介孔高分子微球，外壳为二氧化硅，磁性粒子分散在所述介孔高分子微球内部及表面，所述磁性粒子占所述羧基磁性微球总体积的1％至10％。
可选的，所述HBP抗体1为生物素标记的HBP抗体。
进一步的，所述HBP抗体1为生物素标记的鼠抗人HBP单克隆抗体1。
可选的，所述酶为辣根过氧化物酶。
进一步的，所述酶标记的HBP抗体2为辣根过氧化物酶标记的经修饰的鼠抗人HBP单克隆抗体2。
可选的，所述HBP校准品为重组人HBP。
可选的，所述浓缩洗液为含有Tween-20、Procline300的磷酸盐缓冲液。
进一步的，所述浓缩洗液为含有质量分数1.5％至2.5％Tween-20、0.9％至1.1％Procline300的2mol/L、pH7.5的磷酸盐缓冲液。
进一步的，所述浓缩洗液为含有质量分数2％Tween-20、1％Procline300的2mol/L、pH7.5的磷酸盐缓冲液。
可选的，所述底物为鲁米诺。
进一步的，所述鲁米诺浓度为为0.9mmol/L至1.1mmol/L。
进一步的，所述鲁米诺浓度为1mmol/L。
本申请的第二个目的通过以下技术方案予以实现：
一种应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，制备亲和素标记的磁微粒；步骤二，制备生物素标记的鼠抗人HBP单克隆抗体1；步骤三，制备酶标记的经修饰的鼠抗人HBP单克隆抗体2；步骤四，制备HBP校准品；步骤五，制备浓缩洗液；步骤六，制备底物。
可选的，步骤一，制备亲和素标记的磁微粒：
将磁微粒用EDC、NHS活化后与亲和素混匀，封闭液封闭，进行磁分离，所述封闭液移除后加入储存液进行储存。
进一步的，将磁微粒用EDC、NHS活化后与亲和素混匀，室温旋转2小时，用封闭液封闭1小时，所述封闭液为1mol/L甘氨酸，进行磁分离，所述封闭液移除后加入含有质量分数为0.4％至0.8％Tween-20、0.5％至1.5％BSA、0.5％至1.5％EDTA、0.09％至0.11％Procline300、2.5％至6.5％PEG的pH7.4、0.02mol/L磷酸盐缓冲液进行储存，2℃至8℃保存备用。
进一步的，将磁微粒用EDC、NHS活化后与亲和素混匀，室温旋转2小时，用封闭液封闭1小时，所述封闭液为1mol/L甘氨酸，进行磁分离，所述封闭液移除后加入含有质量分数为0.5％Tween-20、1％BSA、1％EDTA、0.1％Procline300、4％PEG的pH7.4、0.02mol/L磷酸盐缓冲液进行储存，2℃至8℃保存备用。
可选的，磁微粒用过量的EDC、NHS活化后与适量的亲和素混匀。
可选的，步骤二，制备生物素标记的鼠抗人HBP单克隆抗体1：
生物素用磷酸盐缓冲液溶解，与HBP抗体1混合，将混匀液通过层析柱，收集生物素标记的HBP抗体，测定抗体浓度，加入封闭液旋转。
进一步的，生物素用磷酸盐缓冲液溶解，所述磷酸盐缓冲液为0.02mol/L的无水磷酸氢二钠、磷酸二氢钠溶液，与HBP抗体1混合后室温旋转1小时；将混匀液通过层析柱，收集生物素标记的HBP抗体；紫外分光光度计测定抗体浓度；加入封闭液旋转15分钟，所述封闭液为质量分数1％BSA溶液。
进一步的，步骤二所述加入封闭液旋转速度为低速。
可选的，步骤三，制备酶标记的经修饰的鼠抗人HBP单克隆抗体2：
取HRP溶解于蒸馏水中，加入NaIO4水溶液，混匀，搅拌；装入透析袋中，醋酸钠缓冲液透析；加入含纯化抗体的水溶液，混匀，装入透析袋，加入碳酸盐缓冲液，搅拌透析，使之结合；加入NaBH4溶液，混匀；在以上溶液中加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，离心，去上清，沉淀以PBS溶液复溶，装入透析袋，以同样液体透析除盐12小时以上，取出离心，除去不溶物，即得酶-抗体结合物，以PBS溶液稀释后保存。
进一步的，步骤三，制备酶标记的经修饰的鼠抗人HBP单克隆抗体2：
取5mgHRP溶解于1mL蒸馏水中，加入0.1mol/LNaIO4水溶液0.2mL，混匀，室温下避光搅拌20分钟；装入透析袋中，浓度为1mmol/L、pH4.4的醋酸钠缓冲液4℃透析12小时以上；加入含5mg纯化抗体的水溶液1mL，混匀，装入透析袋，加入浓度为0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液，搅拌透析6小时，使之结合；加入浓度为5mg/mLNaBH4溶液0.2mL，混匀，置于4℃2小时；在以上溶液中加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃30分钟，离心，去上清，沉淀以浓度0.02mol/L、pH7.4的PBS溶液复溶，装入透析袋，以同样液体在4℃透析除盐12小时以上，取出离心，以除去不溶物，即得酶-抗体结合物，以浓度为0.02mol/L、pH7.4的PBS溶液稀释后低温保存。
可选的，步骤四，制备HBP校准品：
将重组人HBP用含有BSA的磷酸盐缓冲液稀释成校准品。
进一步的，步骤四，制备HBP校准品：
将重组人HBP用含有质量分数2％BSA的50mmol/L、pH7.6的磷酸盐缓冲液稀释成标号S0至S5的6个校准品，所述校准品浓度分别为0ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL，由图1可见，在0ng/mL至300ng/mL范围内，发光值强度随着校准品浓度的升高而增强。。
可选的，步骤五，制备浓缩洗液：
含有Tween-20、Procline300的磷酸盐缓冲液。
进一步的，步骤五，制备浓缩洗液：
含有质量分数2％Tween-20、1％Procline300的2mol/L、pH7.5的磷酸盐缓冲液。
可选的，步骤六，制备底物：
所述底物为鲁米诺。
进一步的，步骤六，制备底物：
所述底物为鲁米诺，浓度为1mmol/L。
本申请的第三个目的通过以下技术方案予以实现：
一种应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白的测定方法，包括以下步骤：
步骤一：将HBP校准品、磁微粒混悬液、生物素标记抗体、酶标记抗体、浓缩洗液和底物平衡至20℃至25℃；
步骤二：将所述浓缩洗液稀释成洗涤工作液；
步骤三：吸取所述HBP校准品、待测样本依次加入所述磁微粒混悬液中，同时加入所述生物素标记抗体和所述酶标记抗体，振荡孵育，用所述洗涤工作液洗涤；
步骤四：加入水，混匀；
步骤五：加入所述底物，混匀；
步骤六：检测并分析结果。
可选的，步骤二：将所述浓缩洗液用纯化水稀释10倍，成为洗涤工作液，备用。
可选的，步骤三：吸取50μL所述HBP校准品、50μL待测样本依次加入50μL所述磁微粒混悬液中，同时加入50μL所述生物素标记抗体、50μL所述酶标记抗体，20℃至25℃振荡孵育18分钟，用所述洗涤工作液洗涤5次。
进一步的，步骤三：所述磁微粒浓度为0.5mg/ml至1.5mg/ml，所述生物素标记抗体浓度为4.5ug/ml至5.5ug/ml，所述酶标记抗体浓度为4.5ug/ml至5.5ug/ml。
进一步的，步骤三：所述磁微粒浓度为1mg/ml，所述生物素标记抗体浓度为5ug/ml，所述酶标记抗体浓度为5ug/ml。
可选的，步骤四：加入50μL水，混匀。
可选的，步骤五：所述底物为鲁米诺。
进一步的，步骤五：所述底物鲁米诺体积为100μL。
进一步的，步骤五：所述底物鲁米诺浓度为0.9mmol/L至1.1mmol/L。
进一步的，步骤五：所述底物鲁米诺浓度为1mmol/L。
可选的，步骤六：于室温(20℃至25℃)下振荡混匀后检测，并分析结果。
进一步的，步骤六：于室温(20℃至25℃)下振荡混匀15秒后检测，并分析结果。
磁微粒化学发光酶免疫分析技术是将磁性分离技术、化学发光技术、免疫分析技术三者结合起来的一种均相免疫分析方法。生物素(Bio)标记的抗体1(Ab1)和辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体2(Ab2)能够分别特异性地识别HBP抗原(Ag)的不同位点，经免疫反应形成生物素标记抗体1-HBP抗原-辣根过氧化物酶标记抗体2的结合物(Bio-Ab1–Ag–HRP-Ab2)；采用磁微粒(Mag)为载体的亲和素(STV)专一性捕获生物素(Bio)，通过磁分离和洗涤，获得STV标记的Mag(Mag-STV)与免疫反应结合物(Bio-Ab1–Ag–HRP-Ab2)形成的复合物(Mag-STV)–(Bio-Ab1–Ag–HRP-Ab2)；当加入底物液时，化学发光物质在辣根过氧化物酶(HRP)的催化作用下发生水解，形成一个激发态的中间体，该中间体回到稳定的基态时，能够发射出一定量的光子，利用化学发光仪器测量发光值；样本中HBP的含量与相对发光值呈正相关。
用于储存磁微粒的储存液中含有BSA、Procline300、EDTA、磷酸盐缓冲液、Tween-20、聚乙二醇(PEG)。其中Procline300具有抗菌防腐作用且又能保持体系中酶的活性；EDTA能消除二价金属离子对反应检测的影响，并且可以用于消除血样本中补体对检测结果的影响；Tween-20是一种非离子型去污剂，不破坏蛋白的结构，可以降低免疫反应的阴性本底，提高灵敏度；PEG作为反应增强介质，能够促进抗原、抗体分子结合形成大分子复合物，可以提高抗原抗体反应的敏感性，快速达到反应平衡。所述磁微粒还可以为羧基磁性微球，所述羧基磁性微球为核壳结构，内核为介孔高分子微球，外壳为二氧化硅，磁性粒子分散在所述介孔高分子微球内部及表面，所述磁性粒子占所述羧基磁性微球总体积的1％至10％。所述羧基磁性微球采用物理吸附法对介孔高分子微球表面进行功能基团修饰，然后采用原位共沉淀合成的方法制备羧基磁性微球，再通过二氧化硅包覆、氨基修饰以及羧基再修饰的方式制备得到羧基多次修饰的磁性微球，所述羧基多次修饰的磁性微球为一种功能性复合微球，具有磁效应性、高稳定性、较好的生物兼容性、粒径均一、单分散性良好、磁含量可控，并且批次重复性好，适用于工业上大规模稳定制备，可以在细胞分离、免疫检测、蛋白纯化、固定化酶、环境保护等领域具有广泛的应用。
本申请的有益效果为：
本申请使用磁微粒化学发光酶免疫分析法体外定量测定人体液(血液、尿液、脑脊液、胸腹水等)中的肝素结合蛋白，是一种新型的免疫测定试剂盒，克服了传统酶免疫分析(EIA)法在操作人员技术(例如：手法、温度、时间及结果判断等)方面的人为误差，并可通过定量客观反映HBP的存在，为临床诊断及疗效观察和预后判断提供了更有力的实验诊断依据。本申请所提供的肝素结合蛋白的测定方法特异性高，重复性好，检测灵敏度高，线性范围宽，自动化程度高，操作简便快速；与EIA法比较，具有快速、简便、准确、干扰小的优点；解决了免疫检测实验中经常遇到的低灵敏度和非特异性反应等问题，能够更快地获得理想的数据而省去那些反复查找失败原因并尝试改进的麻烦。
附图说明
图1为校准品浓度与发光值强度对应图
具体实施方式
实施例1一种肝素结合蛋白测定试剂盒
一种肝素结合蛋白测定试剂盒，包括磁微粒、HBP抗体1、酶标记的HBP抗体2、HBP校准品、浓缩洗液和底物。
磁微粒：亲和素标记的磁微粒，粒径为0.9μm至1.1μm；
HBP抗体1：生物素标记的鼠抗人HBP单克隆抗体1；
酶标记的HBP抗体2：辣根过氧化物酶标记的经修饰的鼠抗人HBP单克隆抗体2；
HBP校准品：重组人HBP；
浓缩洗液：质量分数2％Tween-20、1％Procline300的2mol/L、pH7.5的磷酸盐缓冲液。
底物：浓度1mmol/L的鲁米诺。
实施例2肝素结合蛋白测定试剂盒制备方法
步骤一，制备亲和素标记的磁微粒：
将磁微粒用EDC、NHS活化后与亲和素混匀，室温旋转2小时，用封闭液封闭1小时，所述封闭液为1mol/L甘氨酸，进行磁分离，所述封闭液移除后加入含有质量分数为0.5％Tween-20、1％BSA、1％EDTA、0.1％Procline300、4％PEG的pH7.4、0.02mol/L磷酸盐缓冲液进行储存，2℃至8℃保存备用；
步骤二，制备生物素标记的鼠抗人HBP单克隆抗体1：
生物素用磷酸盐缓冲液溶解，所述磷酸盐缓冲液为0.02mol/L的无水磷酸氢二钠、磷酸二氢钠溶液，与HBP抗体1混合后室温旋转1小时；将混匀液通过层析柱，收集生物素标记的HBP抗体；紫外分光光度计测定抗体浓度；加入封闭液低速旋转15分钟，所述封闭液为质量分数1％BSA溶液；
步骤三，制备酶标记的经修饰的鼠抗人HBP单克隆抗体2：
取5mgHRP溶解于1mL蒸馏水中，加入0.1mol/LNaIO4水溶液0.2mL，混匀，室温下避光搅拌20分钟；装入透析袋中，1mmol/L、pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，温度4℃，透析12小时以上；加入含5mg纯化抗体的水溶液1mL，混匀，装入透析袋，加入0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液，搅拌透析6小时，使之结合；加入5mg/mLNaBH4溶液0.2mL，混匀，置于4℃2小时；在以上溶液中加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，4℃30分钟，离心，去上清，沉淀以0.02mol/L、pH7.4的PBS溶液复溶，装入透析袋，以同样液体在4℃透析除盐12小时以上，取出离心，以除去不溶物，即得酶-抗体结合物，以0.02mol/L、pH7.4的PBS溶液稀释后低温保存；
步骤四，制备HBP校准品：
将重组人HBP用含有质量分数2％BSA的50mmol/L、pH7.6的磷酸盐缓冲液稀释成标号S0至S5的6个校准品，所述校准品浓度分别为0ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL，由图1可见，在0ng/mL至300ng/mL范围内，发光值强度随着校准品浓度的升高而增强；
步骤五，制备浓缩洗液：
含有质量分数2％Tween-20、1％Procline300的2mol/L、pH7.5的磷酸盐缓冲液；
步骤六，制备底物：
所述底物为鲁米诺，浓度为1mmol/L。
实施例3肝素结合蛋白测定试剂盒测定方法
步骤一：将HBP校准品、磁微粒混悬液、生物素标记抗体、酶标记抗体、浓缩洗液和底物平衡至室温(20℃至25℃)；
步骤二：将所述浓缩洗液用纯化水稀释10倍，成为洗涤工作液，备用；
步骤三：吸取50μL所述HBP校准品、50μL待测样本依次加入50μL所述磁微粒混悬液中，同时加入50μL所述生物素标记抗体、50μL所述酶标记抗体，20℃至25℃振荡孵育18分钟，用所述洗涤工作液洗涤5次；所述磁微粒浓度为1mg/ml，所述生物素标记抗体浓度为5ug/ml，所述酶标记抗体浓度为5ug/ml；
步骤四：加入50μL水，混匀；
步骤五：加入所述底物100μL，所述底物为鲁米诺，浓度为1mmol/L；
步骤六：20℃至25℃振荡混匀15秒后检测，并分析检测结果。
实施例4
肝素结合蛋白测定试剂盒性能检测
1.实验目的
最低检出限：检测肝素结合蛋白试剂盒的灵敏度，测得HBP的最低检出量不高于5.90ng/mL。
2.实验方法
肝素结合蛋白测定试剂盒产品对磷酸盐缓冲液重复测定20次。
3.实验材料
肝素结合蛋白试测定剂盒
4.实验步骤
试剂准备：
(1)磷酸盐缓冲液和磁微粒及抗体：将试剂取出并平衡至室温(20℃至25℃)；
(2)洗涤液：将浓缩洗液使用纯化水在干净的容器中稀释10倍，作为工作洗涤液备用；
(3)底物：取出并平衡至室温。
试验操作：
(1)吸取50μL磷酸盐缓冲液加入50μL磁微粒混悬液中，同时加入50μL生物素标记抗体、50μL酶标记抗体；
(2)混合溶液在室温下，振荡孵育18分钟；
(3)孵育结束后，用洗涤工作液洗涤5次；
(4)向每个混合液中加入纯化水50μL；
(5)于室温下振荡混匀15秒后，加入100μL发光底物测试并进行分析结果。
5.实验结果
单位：ng/mL
Figure BDA0002618742100000141
6.实验结论
由以上实验结果可以看出，肝素结合蛋白测定试剂盒最低检出限不高于5.9ng/mL。
实施例5
肝素结合蛋白测定试剂盒性能检测
1.实验目的
确认肝素结合蛋白化学发光产品的线性范围。
2.实验方法
通过对一系列浓度梯度的样本进行测试，确认该产品的线性范围。
3.实验材料
HBP低浓度样本：6ng/mL；
HBP高浓度样本：302ng/mL。
4.实验步骤
试剂准备
(1)样本和磁微粒及抗体：将试剂取出并平衡至室温(20℃至25℃)；
(2)洗涤液：将浓缩洗液使用纯化水在干净的容器中稀释10倍，作为工作洗涤液备用；
(3)底物：取出并平衡至室温。
试验操作
(1)吸取50μLHBP样本、50μL待测样本依次加入50μL磁微粒混悬液中，同时加入50μL生物素标记抗体、50μL酶标记抗体；
(2)混合溶液在室温下，振荡孵育18分钟；
(3)孵育结束后，用洗涤工作液洗涤5次；
(4)向每个混合液中加入50μL水；
(5)于室温下振荡混匀15秒后，加入100μL发光底物测试并进行分析结果。
单位：ng/mL
样本号 1 2 3 4 5
低浓度样本(mL) 1.0 0.75 0.5 0.25 0.0
高浓度样本(mL) 0.0 0.25 0.5 0.75 1.0
理论浓度(ng/mL) 5.85 80.64 155.43 230.21 305
5.实验结果
单位：ng/mL
Figure BDA0002618742100000151
线性方程：
批号1：y＝1.0206x-0.0224
R2＝0.9992
批号2：y＝1.0462x-0.2184
R2＝0.9997
批号3：y＝1.033x-0.1891
R2＝0.9961
6.实验结论
HBP化学发光产品在5.90ng/mL～300.00ng/mL浓度之间具有良好的线性，相关系数r大于等于0.990。
实施例6
肝素结合蛋白测定试剂盒性能检测
1.实验目的
检测肝素结合蛋白化学发光产品的测定准确度。
2.实验方法
回收实验
将高浓度样本(A)分别加入到低浓度(B)的样本中，用量比例为1：9，各重复检测3次，取平均值，根据下述公式(1)计算出回收率：
Figure BDA0002618742100000161
公式(1)中：R—回收率；VS—A液体积；CS—A液浓度；V0—B液体积；C0—B液浓度的平均值；C—向B液中加入A液后的检测浓度的平均值。
3.实验步骤
试剂准备
(1)样本和磁微粒及抗体：将试剂取出并平衡至室温(20℃至25℃)；
(2)洗涤液：将浓缩洗液使用纯化水在干净的容器中稀释10倍，作为工作洗涤液备用；
(3)底物：取出并平衡至室温。
试验操作
(1)吸取50μLHBP样本、50μL待测样本依次加入50μL磁微粒混悬液中，同时加入50μL生物素标记抗体、50μL酶标记抗体；
(2)混合溶液在室温下，振荡孵育18分钟；
(3)孵育结束后，用洗涤工作液洗涤5次；
(4)向每个混合液中加入50μL水；
(5)于室温下振荡混匀15秒后，加入100μL发光底物测试并进行分析结果。
4.实验结果
单位：ng/mL
Figure BDA0002618742100000171
5.实验结论
在5.90ng/mL～300.00ng/mL浓度区间，肝素结合蛋白化学发光产品的回收率在85％～115％之间，产品测定准确度高。
实施例7
肝素结合蛋白测定试剂盒性能检测
1.实验目的
检测肝素结合蛋白化学发光产品的重复性。
2.实验方法
通过对高、低两个浓度的质控品进行多次(n＝10)检测，观察产品的重复性。
3.实验材料
低浓度质控品：10ng/mL～20ng/mL，优选15ng/mL；
高浓度质控品：150ng/mL～250ng/mL，优选200ng/mL。
4.实验步骤
试剂准备
(1)样本和磁微粒及抗体：将试剂取出并平衡至室温(20℃至25℃)；
(2)洗涤液：将浓缩洗液使用纯化水在干净的容器中稀释10倍，作为工作洗涤液备用；
(3)底物：取出并平衡至室温。
试验操作
(1)吸取50μLHBP样本、50μL待测样本依次加入50μL磁微粒混悬液中，同时加入50μL生物素标记抗体、50μL酶标记抗体；
(2)混合溶液在室温下，振荡孵育18分钟；
(3)孵育结束后，用洗涤工作液洗涤5次；
(4)向每个混合液中加入水50μL；
(5)于室温下振荡混匀15秒后，加入100μL发光底物测试并进行分析结果。
5.实验结果
单位：ng/mL
低浓度质控品 高浓度质控品
测定1 15.86 188.98
测定2 14.64 199.18
测定3 14.37 192.23
测定4 16.26 204.12
测定5 15.40 201.35
测定6 15.38 189.00
测定7 14.79 214.03
测定8 13.79 204.94
测定9 15.18 200.19
测定10 15.58 196.50
平均 15.13 199.05
SD 0.74 7.79
CV(％) 4.87％ 3.92％
6.实验结论
肝素结合蛋白化学发光产品批内差异小，CV不超过10％。
实施例8
肝素结合蛋白测定试剂盒性能检测
1.实验目的
观察HOOK效应状况。
2.实验方法
在样本中加入HBP抗原，配制成一系列梯度的高浓度样本，使用肝素结合蛋白化学发光产品进行测定，每个浓度测试3次。
3.判定标准
肝素结合蛋白化学发光产品的线性范围为5.9ng/mL～300ng/mL，试剂在检测直到最高检测水平1000ng/mL浓度样本时，若显示值能一直大于300ng/mL，不显示假阴结果，则判定该试剂在检测直到最高检测水平1000ng/mL浓度的肝素结合蛋白样本时，都不出现HOOK效应。
4.实验步骤
将HBP抗原加入到磷酸盐缓冲液中，配制成1000ng/mL左右的样本，再将该样本使用磷酸盐缓冲液进行梯度稀释至以下表格的浓度，使用肝素结合蛋白化学发光产品进行测定。
单位：ng/mL
序号 浓度[HBP]
1 1000±50
2 800±50
3 500±50
4 300±50
5 200±50
5.实验结果
单位：ng/mL
Figure BDA0002618742100000191
6.实验结论
肝素结合蛋白化学发光产品的线性范围为5.90ng/mL～300.00ng/mL，试剂在检测直到最高检测水平1000ng/mL浓度样本时，显示的值一直大于300.00ng/mL，不显示假阴结果，故判定该试剂在检测直到最高检测水平1000ng/mL浓度的肝素结合蛋白样本时，都不出现HOOK效应。
本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (10)

1.一种应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，包括磁微粒、HBP抗体1、酶标记的HBP抗体2、HBP校准品、浓缩洗液和底物；
所述磁微粒为亲和素标记的磁微粒；
所述HBP抗体1为生物素标记的HBP抗体；
所述酶为辣根过氧化物酶；
所述HBP校准品为重组人HBP；
所述浓缩洗液为含有Tween-20、Procline300的磷酸盐缓冲液；
所述底物为鲁米诺。
2.根据权利要求1所述的应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述磁微粒粒径为0.9μm至1.1μm，置于储存液中储存，所述储存液为含有Tween-20、BSA、EDTA、Procline300、PEG的磷酸盐缓冲液。
3.根据权利要求2所述的应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述储存液为含有质量分数为0.5％Tween-20、1％BSA、1％EDTA、0.1％Procline300、4％PEG的pH7.4、0.02mol/L的磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求1所述的应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述磁微粒为羧基磁性微球，所述羧基磁性微球为核壳结构，内核为介孔高分子微球，外壳为二氧化硅，磁性粒子分散在所述介孔高分子微球内部及表面，所述磁性粒子占所述羧基磁性微球总体积的1％至10％。
5.根据权利要求1所述的应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗液为含有质量分数2％Tween-20、1％Procline300的pH7.5、2mol/L的磷酸盐缓冲液。
6.根据权利要求1至5任意一项所述的应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒，其特征在于，经免疫反应形成生物素标记抗体1-HBP抗原-辣根过氧化物酶标记抗体2的免疫反应结合物，采用所述磁微粒为载体的所述亲和素专一性捕获所述生物素，通过磁分离和洗涤，获得所述亲和素标记的磁微粒与所述免疫反应结合物形成的复合物，当加入所述底物时，化学发光物质在所述辣根过氧化物酶的催化作用下形成发光反应，样本中HBP的含量与相对发光值呈正相关。
7.根据权利要求1至6任意一项所述的应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，制备亲和素标记的磁微粒：
将磁微粒用EDC、NHS活化后与亲和素混匀，封闭液封闭，进行磁分离，所述封闭液移除后加入储存液进行储存；
步骤二，制备生物素标记的鼠抗人HBP单克隆抗体1：
生物素用磷酸盐缓冲液溶解，与HBP抗体1混合，将混匀液通过层析柱，收集生物素标记的HBP抗体，测定抗体浓度，加入封闭液旋转；
步骤三，制备酶标记的经修饰的鼠抗人HBP单克隆抗体2：
取HRP溶解于蒸馏水中，加入NaIO4水溶液，混匀，搅拌；装入透析袋中，醋酸钠缓冲液透析；加入含纯化抗体的水溶液，混匀，装入透析袋，加入碳酸盐缓冲液，搅拌透析，使之结合；加入NaBH4溶液，混匀；在以上溶液中加入等体积的饱和硫酸铵溶液，混匀，离心，去上清，沉淀以PBS溶液复溶，装入透析袋，以同样液体透析除盐12小时以上，取出离心，除去不溶物，即得酶-抗体结合物，以PBS溶液稀释后保存；
步骤四，制备HBP校准品：
将重组人HBP用含有BSA的磷酸盐缓冲液稀释成校准品；
步骤五，制备浓缩洗液：
含有Tween-20、Procline300的磷酸盐缓冲液；
步骤六，制备底物：
所述底物为鲁米诺。
8.根据权利要求7所述的应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白测定试剂盒的制备方法，其特征在于，
步骤一中，所述EDC、NHS活化后的磁微粒与所述亲和素混匀后室温旋转2小时，所述封闭液为1mol/L甘氨酸，封闭时间为1小时，所述储存液为含有质量分数0.5％Tween-20、1％BSA、1％EDTA、0.1％Procline300、4％PEG的pH7.4、0.02mol/L磷酸盐缓冲液，2℃至8℃保存备用；
或步骤二中，所述磷酸盐缓冲液为0.02mol/L的无水磷酸氢二钠、磷酸二氢钠溶液，所述生物素与所述HBP抗体1混合后室温旋转1小时，所述抗体浓度采用紫外分光光度计测定，所述加入封闭液旋转时间为15分钟，所述封闭液为质量分数1％BSA溶液；
或步骤三中，所述HRP质量为5mg，所述蒸馏水体积为1mL，所述NaIO4水溶液浓度为0.1mol/L，体积为0.2mL，所述搅拌时间为20分钟，室温避光搅拌，所述醋酸钠缓冲液透析为浓度1mmol/L、pH4.4的醋酸钠缓冲液4℃透析12小时以上，所述含纯化抗体的水溶液体积为1mL，其中，所述纯化抗体质量为5mg，所述碳酸盐缓冲液浓度为0.05mol/L、pH9.5，所述搅拌透析时间为6小时，所述NaBH4溶液浓度为5mg/mL，体积为0.2mL，所述混匀后置于4℃2小时，所述加入等体积的饱和硫酸铵溶液混匀后置于4℃30分钟，所述复溶时PBS溶液浓度为0.02mol/L、pH7.4，所述透析除盐时间为12小时以上，温度为4℃，所述保存时PBS溶液浓度为0.02mol/L、pH7.4，低温保存；
或步骤四中，所述BSA质量分数为2％，所述磷酸盐缓冲液浓度为50mmol/L、pH7.6，所述校准品标号为S0至S5，浓度分别为0ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL；
或步骤五中，所述磷酸盐缓冲液浓度为2mol/L、pH7.5，所述Tween-20质量分数为2％，所述Procline300质量分数为1％；
或步骤六中，所述鲁米诺浓度为1mmol/L。
9.一种应用磁微粒化学发光酶免疫分析法的肝素结合蛋白的测定方法，其特征在于，所述测定方法应用权利要求1至6任意一项所述的肝素结合蛋白测定试剂盒，包括以下步骤：
步骤一：将HBP校准品、磁微粒混悬液、生物素标记抗体、酶标记抗体、浓缩洗液和底物平衡至20℃至25℃；
步骤二：将所述浓缩洗液稀释成洗涤工作液；
步骤三：吸取所述HBP校准品、待测样本依次加入所述磁微粒混悬液中，同时加入所述生物素标记抗体和所述酶标记抗体，振荡孵育，用所述洗涤工作液洗涤；
步骤四：加入水，混匀；
步骤五：加入所述底物，混匀；
步骤六：检测并分析结果。
10.根据权利要求9所述的测定方法，其特征在于，
步骤二中，所述浓缩洗液用纯化水稀释10倍，成为所述洗涤工作液；
或步骤三中，所述HBP校准品体积为50μL，所述待测样本体积为50μL，所述磁微粒混悬液体积为50μL，所述生物素标记抗体体积为50μL，所述酶标记抗体体积为50μL，所述振荡孵育时间为18分钟，所述洗涤次数为5次，所述磁微粒浓度为1mg/ml，所述生物素标记抗体浓度为5ug/ml，所述酶标记抗体浓度为5ug/ml；
或步骤四中，所述水体积为50μL；
或步骤五中，所述底物为鲁米诺，体积为100μL，浓度为1mmol/L；
或步骤六中，所述检测为20℃至25℃振荡混匀15秒后检测。
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