CN114133452A

CN114133452A - 一种肝素结合蛋白抗体及其试剂盒、应用

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Publication number: CN114133452A
Application number: CN202111333159.1A
Authority: CN
Inventors: 户元林; 孙兴宝; 王艳娥
Original assignee: Hangzhou Yibai New Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hangzhou Yibai New Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-11-11
Filing date: 2021-11-11
Publication date: 2022-03-04
Anticipated expiration: 2041-11-11
Also published as: CN114133452B

Abstract

本发明涉及一对配对使用的能够特异性结合人肝素结合蛋白的单克隆抗体，以及由该单克隆抗体制备的人肝素结合蛋白检测试剂盒，以及该单克隆抗体在检测人肝素结合蛋白中的应用。该单克隆抗体配对检测人肝素结合蛋白具有灵敏度高、线性范围宽、不同方法学检测平台抗体可以通用的优势。

Description

一种肝素结合蛋白抗体及其试剂盒、应用

技术领域

本发明涉及免疫检测领域，具体地说是涉及一对配对使用的能够特异性结合人肝素结合蛋白的单克隆抗体，以及由该单克隆抗体制备的人肝素结合蛋白检测试剂盒，以及该单克隆抗体在检测人肝素结合蛋白中的应用。

背景技术

肝素结合蛋白(Heparin-Binding Protein，简称HBP)，是一种由成熟中性粒细胞分泌的蛋白质，由Shafer等在1984年发现并分离成功。该蛋白具有杀菌活性，带有正电荷，由于当时测得相对分子质量为373000，因此将其命名为CAP37。后来不久，Gabay等后来学者又从嗜苯胺蓝颗粒中分离出具有杀菌活性的嗜苯胺蓝蛋白，命名为Azurocidin，即天青杀素。1991年Flodgaard等分别从人和猪的多形核白细胞颗粒中分离出具有极强肝素结合能力的蛋白，并将其命名为heparin-binding protein(HBP，肝素结合蛋白)。随着研究的进行，通过蛋白及相关基因测序证实，CAP37、Azurocidin、HBP是同一种蛋白；而且进一步的研究也证实了HBP是胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶家族的一员。

HBP是从251个氨基酸的前体中，在N末端切除26个氨基酸残基、C末端切除3个氨基酸残基而合成的一个单链糖蛋白。成熟的HBP由上述剩余的222个氨基酸残基构成，相对分子质量为24000。序列分析表明其与人的中性粒细胞弹性蛋白酶有45％的同源性，与蛋白酶3有42％的同源性，与人的嗜中性粒细胞中的组织蛋白酶G有32％的同源性。

HBP主要是由PMN受外界刺激所释放，所以正常人血中HBP含量很低，一般不超过10ng/ml，当有感染发生时，部分细菌侵入到血管内，菌体本身或者细菌释放的毒素等物质刺激中性粒细包释放HBP，从而导致血中HBP含量升高，HBP在一般感染时能达到20-30ng/ml，ICU中严重感染会更高，可能超过100ng/ml。出现细菌感染循环中最早升高的标志物之一，局部或轻微的细菌感染也会导致HBP迅速升高；细菌感染HBP水平升高，非细菌感染HBP水平不升高；半衰期短，可迅速反应患者病情好转或恶化以及抗生素治疗效果，并评估是否需要更换抗生素或停药。

目前，临床上将HBP≥15ng/mL作为严重败血症的标志，其敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别可以达到87.1％、95.1％、88.4％以及94.5％；在以上指标中，IL-6水平、乳铁蛋白水平、CRP水平、白细胞数量、降钙素原水平等指标可能在某一项表现突出，但其他项却很低，甚至低至30％左右。综合对比，HBP是比IL6、CRP、PCT更加优秀的感染标志物。

比较早期的HBP检测产品采用的是ELISA法，例如英国Axis-Shield公司的酶联免疫分析试剂，检测范围5.9-200ng/ml。由于其方法学落后、HBP抗体性能平庸，导致其存在耗时太长，高值样品容易产生Hook效应，检测灵敏度和线性范围有限等缺陷。免疫层析法可以实现即时快速检测，公开号为CN111562363的专利申请提到了一种层析法HBP检测，但是它不能起到定量检测的作用，灵敏度、准确性也很低；公开号为CN105572386的专利申请提到的免疫荧光层析法使用Abnova的HBP多克隆抗体和单克隆抗体，其线性范围达到了1-200ng/ml，但是上限仍然不够高；公开号为CN108267592的专利申请提到的免疫微球试纸，使用的是HBP多克隆抗体和单克隆抗体，但并没有提到其检测灵敏度和线性范围。公开号为CN110806487的专利申请提到的基于胶乳微球的免疫比浊法检测HBP，可以达到较好的灵敏度和线性范围，但是其主要技术特点是混合使用了大、小两种粒径和不同电荷的微球，拉宽了检测的线性范围，其技术进步并非因为HBP抗体原料的性能进步所致。

当前HBP检测试剂盒质量的最主要制约因素就是HBP配对抗体的性能，纵观现有的不同方法学HBP检测试剂盒，其或多或少都存在着配对抗体灵敏度低、线性范围窄、不同方法学检测平台通用性不佳等弊端。倘若能够开发出性能更佳的HBP配对抗体，基于不同方法学检测平台的HBP检测试剂盒质量就能有进一步提升。

本发明就是为了解决现有HBP配对抗体的灵敏度低、线性范围窄、不同方法学检测平台通用性不佳等弊端，从而提高HBP抗体原料、HBP抗原检测产品的性能。

发明内容

本发明要解决的就是为人肝素结合蛋白检测提供一对配对使用的灵敏度高、线性范围宽、不同方法学检测平台可以通用的HBP单克隆抗体。

本发明的第一目的是提供一种肝素结合蛋白抗体，包括一对配对使用的抗人肝素结合蛋白单克隆抗体HBP-McAb12和单克隆抗体HBP-McAb16，它们是配对使用的，使用它们配对检测人肝素结合蛋白有很好的性能。

作为优选，所述人肝素结合蛋白单克隆抗体HBP-McAb12的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.3所示，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示。

进一步地，所述人肝素结合蛋白单克隆抗体HBP-McAb16的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.5所示，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.6所示。

进一步地，所述人肝素结合蛋白单克隆抗体HBP-McAb12，其轻链可变区核苷酸序列为SEQ ID No.7所示，重链可变区核苷酸序列为SEQ ID No.8所示。

进一步地，所述人肝素结合蛋白单克隆抗体HBP-McAb16，其轻链可变区核苷酸序列为SEQ ID No.9所示，重链可变区核苷酸序列为SEQ ID No.10所示。

本发明另一个目的是一种利用抗人肝素结合蛋白单克隆抗体HBP-McAb12和单克隆抗体HBP-McAb16制备的人肝素结合蛋白检测试剂盒。

本发明的另一个目的是一种抗人肝素结合蛋白单克隆抗体HBP-McAb12和单克隆抗体HBP-McAb16在检测人肝素结合蛋白中的应用。

有益效果：本发明的单克隆抗体HBP-McAb12、HBP-McAb16分别用来包被和标记，检测标本中的人HBP含量，检测平台包括免疫层析法、免疫比浊法、化学发光法等都具有较好效果，尤其是灵敏度高、线性范围宽、不同方法学检测平台可以通用。

除非另外定义，发明涉及的所有技术和科学名词都是在本领域里熟练技术人员所理解的通常含义，在分子克隆、基因工程、生物化学、细胞生物学、免疫学广泛使用。

制备HBP重组抗原：

按照制备单克隆抗体的一般步骤，首先需要得到人HBP蛋白作为免疫原。从人体组织(例如血液、骨髓)提取RNA，反转录得到HBP的cDNA，再以cDNA为模板，用PCR法得到HBP基因片段，PCR酶在片段两个3’端加上碱基“A”，再将该片段连接到T载体上，挑选出阳性克隆进行DNA序列测定，由此即得到HBP基因，也可以在RT-PCR引物两端带上酶切位点，PCR产物直接酶切，连接到同样酶切之后的载体上，挑选阳性克隆进行测序。采用全基因合成的方法，将HBP基因交给商业化基因合成公司进行合成，也是可行的。获得的HBP基因，采用酶切或者非酶切的基因克隆方法，将其连接到表达载体上。表达载体和表达系统是对应的，本领域的技术人员所周知的表达系统，有原核表达系统，包括大肠杆菌表达系统；有真核表达系统，包括酵母表达系统、昆虫细胞表达系统、哺乳动物表达系统，都可以用来表达HBP蛋白。将连接了HBP基因的表达载体导入相应表达系统的宿主细胞中，其中原核表达系统对应的导入技术是转化，真核表达系统对应的导入技术是转染。转化或者转染需要加入相应的抗生素进行选择性筛选，选出携带有HBP基因的重组子细胞，进行表达鉴定，挑选HBP表达量大的细胞株，进行扩大培养。离心收集培养的细胞(胞内表达时)，或收集上清(分泌表达时)，经过纯化，得到重组HBP蛋白。

制备HBP单克隆抗体：

免疫动物、融合和筛选阳性杂交瘤细胞株技术都是本领域熟知的，简要概括如下，其详细方案和步骤可以参考：《抗体实验技术指导》，作者E.EdHarlow、D.DavidLane。用天然或者重组HBP蛋白免疫小鼠数次，ELISA测定小鼠血清效价，选择值高者取脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，筛选阳性单克隆细胞株，将其扩增培养之后注射到小鼠腹腔生产腹水，也可采用体外培养法生产培养物。收集富含抗体的腹水或者培养物，经过纯化，得到HBP单克隆抗体。将这些单克隆抗体进行亚型鉴定。

HBP抗体配对：

将HBP单克隆抗体标记HRP，与未标记的单克隆抗体ELISA配对来检测不同浓度的HBP，以考察其灵敏度、特异性、线性范围等性能指标，挑选性能较好的一批配对，在荧光层析、免疫比浊、化学发光等平台进行更进一步的性能验证。最终选定了一对单克隆抗体HBP-McAb12和HBP-McAb16分别用来包被和标记，这两株单克隆抗体配对使用时，在荧光层析、免疫比浊、化学发光检测都有最好的灵敏度、线性范围。

检测平台、试剂盒：

人HBP检测试剂盒，其采用免疫学检测方法，利用抗原-抗体特异性反应，用来检测标本中人HBP的含量，根据检测平台分为酶联免疫法、免疫层析法、化学发光法、免疫比浊法等。

鉴定单克隆抗体HBP-McAb12、HBP-McAb16氨基酸和核苷酸序列：

采用酶解-质谱法测定单克隆抗体HBP-McAb12、HBP-McAb16的氨基酸序列，其轻、重链可变区序列为SEQ ID No.3-6所示。通过对分泌单克隆抗体HBP-McAb12、HBP-McAb16的杂交瘤细胞株委托专业公司进行mRNA提取，RT-PCR，连接和cDNA测序，得到单克隆抗体HBP-McAb12、HBP-McAb16的轻、重链可变区核苷酸序列为SEQ ID No.7-10所示。

本领域的技术人员熟知，将单克隆抗体HBP-McAb12、HBP-McAb16抗体的轻、重链可变区氨基酸序列SEQ ID No.3-6经过适当氨基酸添加、减少、替换、突变、修饰，但是没有改变其免疫反应性，所产生的抗体，仍然属于本发明的范围，这里所指的术语“抗体”用来指任何具有抗原结合区的抗体样分子，包括抗体片段，如Fab′、Fab、F(ab′)2、单域抗体(DAB)、Fv、scFv(单链Fv)等。制备和使用各种基于抗体的构建体和片段的方法是本领域公知的。制备和表征抗体的方法也是本领域公知的(参见，例如，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988；通过参考并入本文)。

附图说明

图1为本发明制备的HBP抗原SDS-PAGE电泳图；

图2为本发明制备的抗体HBP-McAb12的SDS-PAGE电泳图；

图3为本发明制备的抗体HBP-McAb16的SDS-PAGE电泳图；

图4为本发明的配对抗体采用荧光层析法检测时与对照试剂盒的相关性图；

图5为本发明的配对抗体采用比浊法检测时与对照试剂盒的相关性图；

图6为本发明的配对抗体采用化学发光法检测时与对照试剂盒的相关性图。

具体实施方式

下述是本发明的具体实施方式，同时结合附图对本发明的技术方案做进一步的说明，但下述实施例不应限制本发明的应用。

实施例1、制备HBP重组抗原

构建质粒：根据UniProtKB编号P20160的HBP成熟蛋白序列SEQ ID No.1，按照人类基因偏好密码子进行序列优化，委托上海生工生物合成基因如SEQ ID No.2所示，基因5’端带有EcoRI酶切位点，3’端带有BamHI酶切位点，合成的基因包含在puck57质粒里。将puck57-HBP质粒用EcoRI、BamHI双酶切，切下的片段琼脂糖电泳胶回收之后连接到用EcoRI、BamHI双酶切之后的pcDNA3.1载体中，得到的阳性克隆pcDNA3.1-HBP经过测序鉴定无误后，大量接种LB培养基，收集菌体，用试剂盒Endo-Free Plasmid Maxi Kit(OMEGA公司，货号：D6926)抽提无内毒素质粒。

转染细胞：按照每1ug质粒对应5ul转染试剂ExpiFectamine 293Reagent(Thermofisher货号：A14524)的比例，转染传代培养3代之后的Thermo fisher Expi293细胞1000ml，转染时细胞密度2.5*106，在24h之后按照供应商提供的比例加入表达增强剂ExpiFectamine 293Transfection Enhancer 1(Thermo fisher货号：A14525)，ExpiFectamine 293Transfection Enhancer 2(Thermo fisher货号：A14526)，之后每天监测细胞活率，在第6天时细胞密度接近70％，收获细胞培养液，以6000rpm，10min的条件离心，收集细胞上清。

纯化抗原：细胞上清过0.22um滤膜之后，上样到平衡液：20mM磷酸盐，0.5M NaCl，pH7.4平衡5个柱床体积之后的20ml填料Ni Smart Beads 6FF(常州天地人和生物科技有限公司，货号：SA036500)，用平衡液：20mM磷酸盐，0.5M NaCl，pH7.4平衡5个柱床体积之后，用洗杂液：20mM磷酸盐，0.5M NaCl，5mM咪唑，pH7.4洗杂蛋白，用洗脱液：20mM磷酸盐，0.5MNaCl，250mM咪唑，pH7.4洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，在5L透析液：20mM磷酸盐，0.15M NaCl，pH7.4进行透析3遍，最终得到60mg重组HBP蛋白，纯度95％以上，分装保存于-20℃。

实施例2、制备HBP单克隆抗体

免疫动物：将实施例1制备的HBP重组抗原用20mM PBS pH7.4稀释到1mg/ml，与佐剂按照1：1比例混合，乳化。乳化后的HBP抗原免疫8周龄Balb/c小鼠，每只小鼠免疫100ug，初次免疫用弗氏完全佐剂，加强免疫用弗氏不完全佐剂。免疫三针后，采尾静脉血，测定效价，选择效价超过100万者进行细胞融合。融合前72小时冲击免疫，向尾静脉内注射30-50ugHBP抗原。

融合细胞：将待融合的小鼠处死，取脾，在200目筛网中碾磨，同时用RPMI1640培养基洗，将细胞悬液转移到50ml离心管中，用RPMI1640培养基洗4遍，每次15000rpm离心5min。将骨髓瘤细胞用RPMI1640培养基洗4遍，每次15000rpm离心5min，最后1遍和脾细胞一起洗。将混合后的脾细胞和骨髓瘤细胞1500rpm离心5min，弃去上清，轻弹管底，将细胞弹起；缓慢加入1ml提前预温至37度的PEG1450，边加边混匀，60s内加完；随即加入40ml提前预温至37度的RPMI 1640培养基终止融合反应，1500rpm离心5min；将细胞弹起，转移至RPMI 1640HAT细胞培养基中，混匀后铺板。铺板之后定时换液和检测上清，挑选高值阳性孔进行亚克隆，3次亚克隆之后，测定上清对Expi293表达的HBP有较高反应(OD值>1.5)，最终选定23株杂交瘤单克隆细胞。

纯化抗体：将23株杂交瘤细胞分别注射小鼠，收集产生的腹水，离心去掉沉淀物，上清用饱和硫酸铵初纯，Protein A柱亲和层析精纯，再透析到PBS缓冲液，最终得到了23株单抗，浓度都在5.0mg/ml以上，纯度都在95％以上。

实施例3、HBP抗体配对

将23株单抗采用过碘酸钠法进行标记(参考郭春祥,郭锡琼.介绍一种简单、快速、高效的辣根过氧化物酶标记抗体的过碘酸钠法，上海免疫学杂志.1983,3(02))具体来说：取5mg HRP溶于0.5ml水中，加入新鲜0.06M NaIO4水溶液0.5ml，混匀，4度放置30min。取出后加入0.16M乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30min后，加入含5mg纯化抗体的水溶液1毫升，混匀并装透析袋对0.05M，pH9.51的碳酸盐缓冲液透析过夜。取出后加入NaBH4溶液(5mg/ml)0.2ml，置冰箱2h。加入等体积饱和硫酸铵，冰箱放置30min后，离心，沉淀用2.5ml 20mMPBS重悬，加等体积甘油，混匀，保存。

将包被抗体用20mM PB7.4稀释至0.5-4ug/ml，每孔加100ul包被于96孔酶标板，37度包被2h。取出酶标板，弃去包被液，用PBST洗1遍，每孔加入200ul封闭液，37度封闭2h。取出酶标板，弃去封闭液，将稀释好的HBP样品加入板中，每孔100ul，37度反应30min。取出酶标板，弃去样品，用PBST洗5遍，每孔加入酶标抗体100ul，37度反应30min。取出酶标板，弃去酶标抗体，用PBST洗5遍，每孔加入四甲基联苯胺和过氧化氢各50ul，37度反应15min。取出酶标板，每孔加入2M硫酸终止反应，将酶标板放入酶标仪中读值。

将所有23株抗体两两配对作为包被和标记，选定一对灵敏度、特异性最佳的单抗，即单克隆抗体HBP-McAb12、HBP-McAb16。

实施例4、荧光层析法检测

(1)荧光微球标记：在25ml 20mM pH7.2 PBS缓冲液中加入25mg荧光微球(苏州纳微科技股份有限公司，300nm，1.0％w/v)，快速搅拌下加入1mg用20mM pH7.2 PBS缓冲液稀释为0.1mg/ml的实施例3的单抗HBP-McAb12，再缓慢加入10mg/ml的EDC 192ul，室温缓慢搅拌反应2h，再加入5ml 10％(m/v)BSA封闭30min，8000rpm离心10min，弃上清，并以20mMpH7.2 PBS清洗，相同条件离心，含有3％海藻糖、0.05％(w/v)Proclin 300的20mM pH7.2PBS重悬备用。

(2)荧光微球标记物结合垫：将上述微球-抗体标记复合物用喷涂仪4ul/cm均匀喷涂到玻璃纤维(Watman公司)，30度烘2小时，即制成标记物结合垫，干燥密封保存备用。

(3)抗体包被硝酸纤维素膜(NC)膜：用检测线稀释液(10mM PBS+2％蔗糖)稀释单抗HBP-McAb16至1mg/ml制成检测线工作液，用同一稀释液稀释羊抗鼠单抗至0.5mg/ml制成质控线工作液，用点膜仪将这两种工作液划到硝酸纤维素膜(Millipore公司，货号：HF135002)的相应位置上，37度干燥8小时。

(4)组装试剂盒：将上述标记物结合垫、包被好的硝酸纤维素膜以及吸水纸、聚酯板、样品垫等辅料组装成HBP荧光层析检测试剂盒。

(5)检测：加100ul待测样品(例如：血清)到样品垫处，室温放置5分钟之后，用荧光微球试纸条读数仪读取T/C值。

(6)对比检测：采用上述方法制备成HBP荧光层析试剂盒，检测115份中翰公司HBP检测检测试剂盒检测后的临床标本，结果表明，试纸条检测灵敏度可以达到0.5ng/ml，线性范围0.5-360ng/ml，与中翰检测结果相关性R²＝0.9721(图4为本发明的配对抗体采用荧光层析法检测时与对照试剂盒的相关性图)。

实施例5、比浊法检测

(1)聚苯乙烯微球的活化：选择微球粒径300nm，浓度100mg/ml(10％)，羧基密度59，用50mM pH6.0 MES-HCl将微球稀释20倍，加入NHS之后再加入EDC，其中EDC：COOH＝2:1，NHS：COOH＝3.4:1，活化20分钟。

(2)配制偶联用抗体：以每管75ug抗体/1mg微球的比例，用50mM pH6.0 MES稀释抗体HBP-McAb12、HBP-McAb16，两种抗体质量比是1：1。

(3)微球偶联抗体：活化完成后的微球16000rpm/min离心15分钟，弃上清，用稀释抗体的MES复溶微球(超声75s)；复溶之后，微球加入抗体中并超声(75s)，微球：抗体＝250:500。将每管偶联物置于翻转仪上，室温翻转2h。

(4)终止：加入5ul/ml乙醇胺终止30分钟。

(5)封闭：离心终止后的偶联物(16000rpm/min,15min)，弃上清，用R2(封闭液，20mM pH8.0 Gly-Tris，3％海藻糖，2％BSA，0.1％Tween-20，0.05％Proclin 300)复溶，37度烘箱一夜，第二天上机检测。

(6)检测结果：采用上述方法制备成HBP比浊法试剂盒，检测121份宁波艾科试剂盒测过的临床标本，灵敏度0.3ng/ml，线性范围0.3-1200ng/ml，与宁波艾科检测结果相关性R²＝0.9905(图5为本发明的配对抗体采用比浊法检测时与对照试剂盒的相关性图)。

实施例6、化学发光法检测

(1)磁珠包被抗体：取2mg PM3-008磁珠到1.5ml离心管中，用500ul MEST(10mMMES，pH6.0，0.05％Tween 20)洗涤2次，弃上清。加入200ul新配制的EDC(5mg/ml)和200ulNHS(5mg/ml)，混匀，37度活化30min，弃上清。加入500ul BST(5mM boric acid，0.05％Tween 20，pH9.0)，混匀，弃上清，再用500ul BST洗涤2次。加入100ug单抗HBP-McAb12到磁珠，翻滚混匀，弃上清，再用1ml BST洗涤2次，用5ml磁珠保存液重悬。

(2)吖啶酯标记抗体：取单克隆抗体HBP-McAb16，200ul加入600ul 0.1M PBS(pH8.0)中，加入150ul 0.5mM的AE(溶于甲基甲酰胺中)，混匀，室温避光反应20min。加赖氨酸溶液(8mg赖氨酸溶于200ul pH8.0的PBS)放置15min，对10mM pH6.5的PBS透析过夜，次日用葡聚糖凝胶G50纯化。

(3)化学发光法检测：向封闭好的微孔板中加入50ul磁珠标记的抗体、25ul抗原或待测标本、50ul分析缓冲液，室温孵育15min，洗涤液200ul每次小心洗涤3次，吸干。每孔加入用分析缓冲液按照1：100倍稀释的吖啶酯标记抗体50ul，室温反应10min，洗涤液200ul每次小心洗涤5次，吸干。每孔加入200ul洗涤液，用移液器吹匀，转移到2ml发光管中，磁力架上吸干上清。加入100ul预激发液A液，上机检测再加入100ul激发液B液，检测发光值。

(4)检测结果：采用上述方法制备成HBP化学发光法试剂盒，检测利德曼试剂盒检测过的127份临床标本，灵敏度为0.1ng/ml，线性范围为0.1-1100ng/ml，与利德曼检测结果相关性R²＝0.9943(图6为本发明的配对抗体采用化学发光法检测时与对照试剂盒的相关性图)。

实施例7、鉴定抗体氨基酸和核苷酸序列

对纯化的单克隆抗体HBP-McAb12、HBP-McAb16委托南京伯奥德泰生物工程有限公司采用蛋白酶解-肽质谱法进行抗体重链和轻链蛋白质序列测定。单克隆抗体HBP-McAb12的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.3所示，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示。单克隆抗体HBP-McAb16的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.5所示，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.6所示。

对分泌单克隆抗体HBP-McAb12、HBP-McAb16的杂交瘤细胞委托北京义翘神州科技股份有限公司采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)进行抗体重链和轻链的mRNA序列测定。详细方法如下：取单抗杂交瘤细胞株进行复苏，再用1640培养基37℃下培养10天至旺盛生长期,开始收集细胞。使用TRIzol法提取RNA：TRIzol裂解细胞，加入氯仿，震荡后离心15min，取上清并加入异丙醇，混匀后离心10min，弃上清，沉淀用75％乙醇清洗后，在空气中晾干，并用适量DEPC去离子水溶解。采用SMART RACE方法将RNA反转录合成cDNA：准备5’-RACE/3’-RACE的反应体系，并选择合适的扩增程序进行PCR扩增(延伸时间根据片段大小决定)，合成cDNA第一条链，然后根据已知的cDNA序列合成cDNA第二条链。加入用于PCR扩增的高保真DNA聚合酶与兼并引物等，对cDNA进行PCR扩增，获得重链/轻链可变区基因。抗体基因连接至T载体，挑选阳性克隆并测序。DNAStar软件分析测序结果，得到抗体序列如下：单克隆抗体HBP-McAb12，其轻链可变区核苷酸序列为SEQID No.7所示，重链可变区核苷酸序列为SEQ ID No.8所示。单克隆抗体HBP-McAb16，其轻链可变区核苷酸序列为SEQ ID No.9所示，重链可变区核苷酸序列为SEQ ID No.10所示。

实施例8、基因工程抗体HBP-McAb12rec、HBP-McAb16rec的制备及其应用

以单克隆抗体HBP-McAb12其轻链可变区核苷酸序列SEQ ID No.7为模板，再接上轻链恒定区，委托上海生工生物合成其基因HBP-McAb12-L，基因包含在质粒puck57中，其上游带有EcoRI酶切位点，下游带有BamHI酶切位点，质粒用限制性内切酶(NEB公司)切割之后电泳回收其对应的片段，割胶回收之后，连接到用同样的酶切割并割胶回收之后的pcDNA3.1载体，得到的阳性克隆pcDNA3.1-HBP-McAb12-L经过测序鉴定无误后，大量接种LB培养基，收集菌体，用试剂盒Endo-Free Plasmid Maxi Kit(OMEGA公司，货号：D6926)抽提无内毒素质粒。

以单克隆抗体HBP-McAb12其重链链可变区核苷酸序列SEQ ID No.7为模板，再接上重链恒定区，委托上海生工生物合成其基因HBP-McAb12-H，基因包含在质粒puck57中，其上游带有EcoRI酶切位点，下游带有BamHI酶切位点，质粒用限制性内切酶(NEB公司)切割之后电泳回收其对应的片段，割胶回收之后，连接到用同样的酶切割并割胶回收之后的pcDNA3.1载体，得到的阳性克隆pcDNA3.1-HBP-McAb12-H经过测序鉴定无误后，大量接种LB培养基，收集菌体，用试剂盒Endo-Free Plasmid Maxi Kit(OMEGA公司，货号：D6926)抽提无内毒素质粒。

于3.5cm组织培养皿中接种5×10<5>CHO-K1细胞，用DMEM培养基进行培养，将细胞培养至90％-95％融合时进行转染，具体步骤如下：取5μg质粒pcDNA3.1-HBP-McAb12-L，5μg质粒pcDNA3.1-HBP-McAb12-H及20μlLipofectamine200 0Reagent，按Lipofectamine2000Reagent试剂盒说明书进行转染。转染进行24h后，将细胞培养基换为含600μg/ml G418的DMEM培养基筛选抗性克隆。

将筛选得到的稳定表达抗体的CHO-K1细胞株用无血清培养基(EX-CELL302，购自SIGMA-ALDRICH公司)扩大培养，用rProtein A Sepharose 4Fast Flow按说明书亲和纯化，用PBS进行透析，最后用紫外吸收法测定抗体的含量。最终得到HBP-McAb12rec基因工程抗体。

以同样的方法得到HBP-McAb16rec基因工程抗体。

将HBP-McAb12rec和HBP-McAb16rec基因工程抗体分别作为包被和标记抗体，用实施例4、5、6的方法分别在荧光层析、免疫比浊、化学发光法检测平台上面使用，调配其最适用量，取得的效果与杂交瘤产生腹水生产的单克隆抗体HBP-McAb12和HBP-McAb16类似。

综上所述：通过实施例1、2、3得到特异性识别人HBP的单克隆抗体HBP-McAb12和HBP-McAb16，通过实施例4、5、6不同的检测平台检测标本中的人HBP含量，均具有灵敏度高，特异性好，线性范围宽，不同检测平台通用性好的优点，能够替代现有试剂盒中的HBP单克隆抗体。

本发明实施例多样，且各实施例实验数据较多，并不宜在本发明一一列出，对于本技术领域的技术人员在不偏离本发明原理的前提下做出的各种改动和改进，均应在本发明的权利要求内。

序列表

<110> 杭州伊佰新生物技术有限公司

<120> 一种肝素结合蛋白抗体及其试剂盒、应用

<141> 2021-11-08

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 222

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

Ile Val Gly Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Gln Phe Pro Phe Leu Ala

1 5 10 15

Ser Ile Gln Asn Gln Gly Arg His Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His

20 25 30

Ala Arg Phe Val Met Thr Ala Ala Ser Cys Phe Gln Ser Gln Asn Pro

35 40 45

Gly Val Ser Thr Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu

50 55 60

Arg Gln Ser Arg Gln Thr Phe Ser Ile Ser Ser Met Ser Glu Asn Gly

65 70 75 80

Tyr Asp Pro Gln Gln Asn Leu Asn Asp Leu Met Leu Leu Gln Leu Asp

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100 105 110

Gln Asn Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Arg Cys Gln Val Ala Gly Trp

115 120 125

Gly Ser Gln Arg Ser Gly Gly Arg Leu Ser Arg Phe Pro Arg Phe Val

130 135 140

Asn Val Thr Val Thr Pro Glu Asp Gln Cys Arg Pro Asn Asn Val Cys

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Thr Gly Val Leu Thr Arg Arg Gly Gly Ile Cys Asn Gly Asp Gly Gly

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Thr Pro Leu Val Cys Glu Gly Leu Ala His Gly Val Ala Ser Phe Ser

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Leu Gly Pro Cys Gly Arg Gly Pro Asp Phe Phe Thr Arg Val Ala Leu

195 200 205

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<211> 783

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

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Claims

1.一种肝素结合蛋白抗体，其特征在于，包括一对配对使用的抗人肝素结合蛋白单克隆抗体HBP-McAb12和单克隆抗体HBP-McAb16。

2.根据权利要求1所述的一种肝素结合蛋白抗体，其特征在于，所述人肝素结合蛋白单克隆抗体HBP-McAb12的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.3所示，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.4所示。

3.根据权利要求1所述的一种肝素结合蛋白抗体，其特征在于，所述人肝素结合蛋白单克隆抗体HBP-McAb16的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.5所示，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No.6所示。

4.根据权利要求1所述的一种肝素结合蛋白抗体，其特征在于，所述人肝素结合蛋白单克隆抗体HBP-McAb12的轻链可变区核苷酸序列为SEQ ID No.7所示，重链可变区核苷酸序列为SEQ ID No.8所示。

5.根据权利要求1的所述一种肝素结合蛋白抗体，其特征在于，所述人肝素结合蛋白单克隆抗体HBP-McAb16的轻链可变区核苷酸序列为SEQ ID No.9所示，重链可变区核苷酸序列为SEQ ID No.10所示。

6.一种利用抗人肝素结合蛋白单克隆抗体HBP-McAb12和单克隆抗体HBP-McAb16制备的人肝素结合蛋白检测试剂盒。

7.一种抗人肝素结合蛋白单克隆抗体HBP-McAb12和单克隆抗体HBP-McAb16在检测人肝素结合蛋白中的应用。