CN112730847A - 一种利用抗体做免疫印迹实验的试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用抗体做免疫印迹实验的试剂盒及其应用，属于分子生物领域。本发明为了解决免疫印迹反应操作困难、试剂查找和对比耗费大量时间的问题。本发明提供的利用抗体做免疫印迹实验的试剂盒，所述试剂盒包括：RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂、ECL发光检测液、预染蛋白Marker、Goat Anti‑Rabbit IgG‑HRP、10g脱脂奶粉、10×PBS缓冲液、5×SDS‑PAGE上样缓冲液、电泳缓冲液、转膜缓冲液、10×TBST缓冲液和PVDF膜。免疫印迹实验的试剂盒检测灵敏度高，可经过多次验证，实验结果客观准确。

Description

一种利用抗体做免疫印迹实验的试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种利用抗体做免疫印迹实验的试剂盒及其应用。
背景技术
Western是目前实验室用抗体检测蛋白的最常用方法。但目前存在Western(免疫印迹)整体实验操作困难的问题。究其原因是所需试剂耗材均需要单独购买，试剂查找、对比耗费大量时间；所需试剂均需单独配制、调整比例、验证可用性；很多试剂一次用不完，造成浪费；优化实验条件时，认为差异性大，极易造成结果不准确。
发明内容
本发明的目的是为了解决免疫印迹反应操作困难、试剂查找和对比耗费大量时间的问题，本发明提供了一种利用抗体做免疫印迹实验的试剂盒，所述试剂盒包括：5mL RIPA裂解液、50μL PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂、10mL ECL发光检测液、20uL预染蛋白Marker、15μL Goat Anti-Rabbit IgG-HRP、10g脱脂奶粉、80mL 10×PBS缓冲液、2mL 5×SDS-PAGE上样缓冲液、200mL电泳缓冲液、150mL转膜缓冲液、200mL 10×TBST缓冲液和3片PVDF膜。
进一步地限定，所述RIPA裂解液由以下成分组成：体积分数1％的Triton X-100、质量1％deoxycholate和质量分数0.1％的SDS。
进一步地限定，所述PMSF浓度为100mM。
进一步地限定，所述10×PBS缓冲液的制备方法为每一升溶液中含有2.4g KH2PO4、14.4g Na2HPO4、80g NaCl和2g KCl。
进一步地限定，所述5×SDS上样缓冲液由以下成分组成：质量分数4％的SDS、体积分数10％的β-巯基乙醇、体积分数为20％的甘油、质量分数为0.004％的溴酚蓝和0.125MTris-HCl，pH＝6.8。
进一步地限定，所述电泳缓冲液由以下成分组成：25mM Tris、190mM甘氨酸和0.1％SDS，pH＝8.3；所述转膜缓冲液由以下成分组成：25mM Tris、190mM甘氨酸和体积分数为20％的甲醇。
进一步地限定，所述PVDF膜的规格为8.5cm×6cm，PVDF膜孔径是0.45μm。
本发明还提供了上述利用抗体做免疫印迹实验的试剂盒在检测HSP70中的应用。
有益效果：免疫印迹试剂盒包含了从蛋白裂解提取到ECL底物曝光在内的所有试剂；各种试剂均已配制好，不需要单独调整配比；试剂盒内含有详细流程及实验条件，无需反复摸索；检测灵敏度高，可经过多次验证，实验结果客观准确；一个试剂盒可完成3块凝胶(约30个样)对应的Western Blot实验需求。
附图说明
图1为免疫印迹实验的结果图。
具体实施例
实施例1.
1.一种利用抗体做免疫印迹实验的试剂盒具体组分：5mL RIPA裂解液、50μLPMSF、30T BCA蛋白浓度测定试剂盒、10mL ECL发光检测液、20uL预染蛋白Marker、15μLGoat Anti-Rabbit IgG-HRP、10g脱脂奶粉、80mL 10×PBS缓冲液、2mL 5×SDS-PAGE上样缓冲液、200mL电泳缓冲液、150mL转膜缓冲液、200mL 10×TBST缓冲液和3片PVDF膜。
RIPA裂解液成分：1％Triton X-100，1％deoxycholate,0.1％SDS；PMSF成分：100mM PMSF；PBS缓冲液(10X)成分：每一升溶液中：2.4g KH2PO4，14.4g Na2HPO4，80gNaCl，2g KCl；5X SDS上样缓冲液成分：4％SDS，10％β-巯基乙醇，20％甘油，0.004％溴酚蓝，0.125M Tris-HCl，溶液pH 6.8；电泳缓冲液成分:25mM Tris，190mM甘氨酸，0.1％SDS，pH 8.3；转膜缓冲液成分:25mM Tris，190mM甘氨酸，20％甲醇；TBST缓冲液(10X)成分：0.05M TrisHCL Nacl 8g KCL 0.2g 20mL吐温0.5ml加蒸馏水定容至1L。PVDF膜(0.45μm，8.5cm×6cm)。
2.在样本为K562细胞，239T细胞，小鼠的脑细胞(M-brain)，大鼠的脑细胞(R-brain)，牛的肝细胞(B-liver)，牛的肺细胞(B-lung)，提取上述样本的蛋白质，利用步骤1所述的利用抗体做免疫印迹实验的试剂盒，一抗为HSP70抗体，用不同类型的细胞验证免疫印迹试剂盒的稳定性，步骤如下：
一、样本处理：从-80度取出组织和细胞，对于组织，将组织放入液氮中，将研钵用液氮预冷后，取出组织，放入预冷的研钵中，进行研磨，研磨后置于1.5mL离心管中，加入400ul RIPA裂解液，于冰上裂解30min；裂解后，再超声破碎(振幅90％；超5秒停5秒；超声20次)加入DNA酶；4℃离心机中12000rpm、离心15min，将上清转移到一个新的1.5mL离心管中置于冰上，利用BCA蛋白浓度测定试剂盒直接测蛋白浓度；将处理后的样品加入5×SDS-PAGE上样缓冲液(样品：5×SDS-PAGE的比例为4:1)，混匀后煮沸15min离心后待上样。
目的蛋白检测：配制12％丙烯酰胺的分离胶，5％浓缩胶
二、电泳
安装好玻璃板先灌制12％SDS-PAGE分离胶，待分离胶完全聚合后，灌注5％的SDS-PAGE浓缩胶，立即插入干净的梳子。待浓缩胶聚合完全后，小心移出梳子，按照组别上样。接通电源，在电泳缓冲液中电泳，浓缩胶电压为80V，当染料前沿进入分离胶后加电压到100V，继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部为止。
三、转膜
卸下胶块，裁好与胶块大小完全相同的6张3MM滤纸和1张硝酸纤维膜，以转膜缓冲液浸湿后，按下列次序安装电转膜装置：3MM滤纸3张、硝酸纤维膜、凝胶、3MM滤纸3张，精确对齐，赶走气泡。将三明治夹浸于转膜缓冲液，确认方向为胶负膜正，接通电源，电流为400mA转移2h。
四、杂交
将膜放入封闭液中，4℃封闭过夜，TBST洗膜3次、每次5分钟；将膜放入稀释过(脱脂奶粉稀释)的一抗中(一抗为HSP70 Polyclonal Antibody)，室温孵育3h；TBST洗膜3次，每次5分钟；1：5000稀释的二抗Anti-Rabbit IgG-HRP(脱脂奶粉稀释)，室温孵育1h，TBST洗膜3次，每次5分钟。加入2mL ECL显色底物，曝光显色。
具体参数：上样量：50μg；分离胶浓度：10％；PVDF膜孔径：0.45μM；转膜条件：15v，13min；封闭：5％脱脂奶，2h；一抗：1:1000，4℃过夜；二抗：1:5000，室温1h；显色：ECL曝光，30s。
结果如图1所示：免疫印迹试剂盒包含了从蛋白裂解提取到ECL底物曝光在内的所有试剂；各种试剂均已配制好，不需要单独调整配比；试剂盒内含有详细流程及实验条件，无需反复摸索；检测灵敏度高，可经过多次验证，实验结果客观准确；一个试剂盒可完成3块凝胶(约30个样)对应的Western Blot实验需求，不同类型的样本如组织，细胞等检测所得结果条带锐利，背景干净，说明本试剂盒可稳定适用于多种样本的检测。

Claims (8)

1.一种利用抗体做免疫印迹实验的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：5mL RIPA裂解液、50μL PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂、10mL ECL发光检测液、20uL预染蛋白Marker、15μLGoat Anti-Rabbit IgG-HRP、10g脱脂奶粉、80mL 10×PBS缓冲液、2mL 5×SDS-PAGE上样缓冲液、200mL电泳缓冲液、150mL转膜缓冲液、200mL 10×TBST缓冲液和3片PVDF膜。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RIPA裂解液由以下成分组成：体积分数1％的Triton X-100、质量分数1％deoxycholate和质量分数0.1％的SDS。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PMSF浓度为100mM。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述10×PBS缓冲液的制备方法为每一升溶液中含有2.4g KH2PO4、14.4g Na2HPO4、80g NaCl和2g KCl。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述5×SDS上样缓冲液由以下成分组成：质量分数4％的SDS、体积分数10％的β-巯基乙醇、体积分数为20％的甘油、质量分数为0.004％的溴酚蓝和0.125M Tris-HCl，pH＝6.8。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述电泳缓冲液由以下成分组成：25mMTris、190mM甘氨酸和质量分数0.1％的SDS，pH＝8.3；所述转膜缓冲液由以下成分组成：25mM Tris、190mM甘氨酸和体积分数为20％的甲醇。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PVDF膜的规格为8.5cm×6cm，PVDF膜孔径是0.45μm。
8.权利要求1-7任意一项所述的试剂盒在检测HSP70中的应用。
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