CN108241065A - 一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法,包括步骤：S1、样品制备及凝胶电泳，在磷酸化蛋白样品中以5:1比例加入6倍SDS上样缓冲液，均匀混合，电压80V进行电泳；S2、转膜，将凝胶面与负极相连，PVDF膜与正极相连，恒压130V，转印时间为1h；S3、封闭，将PVDF膜放入含有5％BSA的PBST中，室温摇床孵育20min；S4、加一抗，加入一抗，24℃摇床孵育2h，PBST漂洗4次，5min/次；S5、加二抗，加入用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔二抗，室温摇床孵育1h，PBST漂洗4次，5min/次；S6、显色，将显影试剂均匀滴到PVDF膜上，进行凝胶显影。本发明在磷酸化蛋白质的免疫印迹检测中采用湿转膜方式，蛋白信号连续且强度高；一抗抗体稀释比为1:5000时无非特异性条带，蛋白信号效果较好。

Description

一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体地说，本发明涉及一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法。

背景技术

目前恶性肿瘤的发病率越来越高，临床上主要依靠CT扫描进行病情筛查，这对于肿瘤组织较小的发病早期的筛查和诊断存在盲区。研究恶性肿瘤发生发展的分子机理，并进行分子层面的准确检测，对于及时预测和筛查早期病情意义非常重要。蛋白质的磷酸化修饰是生物体内最重要共价修饰方式之一，参与调节细胞的多种生命活动过程，包括细胞的增殖、发育和分化、细胞骨架条款、细胞凋亡、肿瘤发生等。如酪氨酸激酶和蛋白质酪氨酸磷酸化在肿瘤的发生和生长中起了重要作用。但由于生物体内磷酸化蛋白质的含量及磷酸化位点的化学计量值常常很低，大规模分析磷酸化蛋白质在技术上具有较大困难。目前关于磷酸化蛋白质组学的研究发展缓慢，相关的分析检测方法较少。如何从复杂的蛋白样晶中，或者其酶解产物中特异性地分离和富集磷酸化蛋白和磷酸化肽段，是磷酸化蛋白质组学研究中的一个巨大挑战和成功与否的关键所在。

Western Blot检测技术是将蛋白质样品经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移到固相载体上，利用抗原抗体的特异性结合反应来检测目标蛋白的表达。Westren Blot中有半干转和湿转两种不同转膜方法，另外一个关键点是特异性抗体对特定抗原的有效识别抗体识别蛋白特异性位点的过程是一个抗原抗体反应，只有当抗原和抗体比例适当时才出现最大反应，因此需要为特定抗原量(即蛋白量)选择合适的一抗稀释比例。Western blot检测到步骤繁杂、变异因素较多，不同的目标蛋白种类、不同的转膜方法、不同的抗体稀释比例对蛋白质检测效果差异很大，因此研究磷酸化蛋白的Western blot检测方法具有重要的价值。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，检测结果灵敏可靠，蛋白信号强。

为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，包括以下步骤：S1、样品制备及凝胶电泳：在磷酸化蛋白样品中以5:1比例加入6倍SDS上样缓冲液，均匀混合样品；电泳装置中加入1倍电泳缓冲液，将预染指示剂和磷酸化蛋白样品分别加入凝胶的点样孔中，电压80V进行电泳；S2、转膜：切取S1步骤中的磷酸化蛋白样品的电泳凝胶，并剪取两块和PAGE胶相同大小的厚滤纸和孔径为0.2μm的PVDF膜(硝酸纤维素膜)，转印夹负极放置海绵垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫，每层之间用玻璃棒去除气泡，组装好转印夹放入转印槽，加入预冷的转移缓冲液，将凝胶面与负极相连，PVDF膜与正极相连，恒压130V，转印时间为1h；S3、封闭：将S2步骤中的PVDF膜放入含有5％BSA的PBST中，室温摇床孵育20min，封闭膜上剩余的疏水结合位点；S4、加一抗：在S3步骤的溶液中加入合适比例的一抗，24℃摇床孵育2h，使目的蛋白与一抗特异性结合，PBST漂洗4次，5min/次，洗去未结合的一抗；S5、加二抗：在S4步骤的溶液中加入用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔二抗，室温摇床孵育1h，使HRP标记的二抗与一抗充分结合；PBST漂洗4次，5min/次，洗去未结合的二抗；S6、显色：使用1mL加样枪将显影试剂均匀滴到PVDF膜上，放入凝胶成像仪中进行凝胶显影。

优选的，步骤S1中蛋白样品加入SDS上样缓冲液中混合后，置于使用干式恒温器100℃煮沸5min，使蛋白质氨基酸侧链与SDS充分结合。100℃下可提高DTT和SDS蛋白变性效率。

优选的，步骤S1中开始电泳时设置恒压80V，待指示带跑入分离胶时，更换为130V恒定电压，直至指示带跑至凝胶底部，结束电泳。

优选的，S2步骤中的PVDF膜在进行转膜前先置于甲醇溶液中激活2min，然后于转移缓冲液中平衡约5min。

优选的，S2步骤中转印夹组装之前，先将PAGE胶、滤纸、海绵浸泡于转移缓冲液20min。

优选的，S4步骤加入的一抗采用含有5％BSA的PBST进行稀释，稀释比例为1:5000。

优选的，S5中的辣根过氧化物酶采用含有5％BSA的PBST提前稀释，抗兔二抗提前按照1:2000比例进行稀释。

优选的，步骤S6中显色的曝光时间为10min、60张。

优选的，步骤S6中显影剂为增强型化学发光(ECL)HRP底物。

本发明所取得的有益技术效果是：在磷酸化蛋白质的免疫印迹检测中，采用湿转膜方式，转膜的整个过程均在液体中，转印系统稳定性较好，对仪器要求较低，蛋白信号连续且强度为半干转的2倍以上；且转膜效率更高；对于磷酸化蛋白，半干转膜时磷酸化蛋白无信号，利用湿转条件可以检测到磷酸化蛋白出现连续信号；一抗抗体稀释比为1:5000时无非特异性条带，且蛋白信号效果较好，条带无弥散。

附图说明

从以下结合附图的描述可以进一步理解本发明。图中的部件不一定按比例绘制，而是将重点放在示出实施例的原理上。在图中，在不同的视图中，相同的附图标记指定对应的部分。

图1为实施例一的显色图像；

图2为实施例二的显色图像。

具体实施方式

为了使得本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及其实施例，对本发明进行进一步详细说明；应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。对于本领域技术人员而言，在查阅以下详细描述之后，本实施例的其它系统、方法和/或特征将变得显而易见。旨在所有此类附加的系统、方法、特征和优点都包括在本说明书内、包括在本发明的范围内，并且受所附权利要求书的保护。在以下详细描述描述了所公开的实施例的另外的特征，并且这些特征根据以下将详细描述将是显而易见的。

本方案中的主要试剂及材料均通过市场公开商业渠道购得，肌球蛋白轻链抗体(Myosin Light Chain)、肌球蛋白轻链磷酸化抗体(Phospho-Myosin Light Chain)、β-肌动蛋白(β-Actin)、抗兔IgG(Anti-rab-bit IgG,HRP-linked Antibody)购自美国赛信通(CST)公司；肌球蛋白轻链磷酸化抗体(Phospho-Myosin lightchain)购自英国艾博抗(Abcam)公司，显影试剂购自美国赛默飞世尔(Thermo fisher)公司；三羟甲基胺基甲烷、Tris购自美国Sigma公司，十二烷基磺酸钠(SDS)购自上海生工生物工程有限公司，过硫酸铵(APS)、四甲基二乙胺(TEMED)购自美国Bio-Rad公司，溴酚蓝、甘氨酸购自上海生工生物工程有限公司，焦碳酸二乙酯(DEPC)、DEPC、溴化乙锭(EB)、6×Loading Buffer、琼脂糖、硝酸纤维素膜及其他试剂购自水宝生物(大连)有限公司。

实施例一

拟采用分子量18kD的肌球蛋白轻链(myosin light chain，MLC)的磷酸化蛋白作为研究对象，比较不同转膜方法，不同抗体稀释比例对该蛋白及磷酸化表达检测效果的影响。

按照以下步骤进行操作：

S1、样品制备及凝胶电泳：在磷酸化蛋白样品中以5:1比例加入6倍SDS上样缓冲液，均匀混合样品，置于使用干式恒温器100℃煮沸5min，使蛋白质氨基酸侧链与SDS充分结合。100℃下可提高DTT和SDS蛋白变性效率；电泳装置中加入1倍电泳缓冲液，将预染指示剂和磷酸化蛋白样品分别加入凝胶的点样孔中，开始电泳时设置恒压80V，待所述指示带跑入分离胶时，更换为130V恒定电压，直至所述指示带跑至凝胶底部，结束电泳；

S2、转膜：切取S1步骤中的磷酸化蛋白样品的电泳凝胶，并剪取两块和PAGE胶相同大小的厚滤纸和孔径为0.2μm的PVDF膜(硝酸纤维素膜)，PVDF膜预先置于甲醇溶液中激活2min，然后于转移缓冲液中平衡约5min；转印夹负极放置预先浸泡于转移缓冲液20min的海绵垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫，每层之间用玻璃棒去除气泡，组装好转印夹放入转印槽，加入预冷的转移缓冲液，将凝胶面与负极相连，PVDF膜与正极相连，恒压130V，转印时间为1h；

S3、封闭：将S2步骤中的PVDF膜放入含有5％BSA的PBST中，室温摇床孵育20min，封闭膜上剩余的疏水结合位点；

S4、加一抗：在S3步骤的溶液中加入采用含有5％BSA的PBST进行稀释，稀释比例为1:3000比例的一抗，24℃摇床孵育2h，使目的蛋白与一抗特异性结合，PBST漂洗4次，5min/次，洗去未结合的一抗；

S5、加二抗：在S4步骤的溶液中加入含有5％BSA的PBST稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔二抗(1:2000比例进行稀释)，室温摇床孵育1h，使HRP标记的二抗与一抗充分结合；PBST漂洗4次，5min/次，洗去未结合的二抗；

S6、显色：取膜，滤纸吸去膜上过多的液体，并将其放入两层塑料保鲜膜中间，固定于暗盒的片央内，于暗室中曝光、显影和定影，使用1mL加样枪将增强型化学发光(ECL)HRP底物显影试剂均匀滴到PVDF膜上，放入凝胶成像仪中进行凝胶显影，曝光时间为10min、60张，观察荧光曝光效果。

为了研究不同转膜方式对Western blot检测蛋白结果的影响，设置半干性转膜的对比例1，在步骤S2转膜中，转膜装置从下至上依次按阳极碳板、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、PVDF，膜精确对齐，每一步用玻璃棒去除气泡，用滤纸将碳板上多余液体吸干，盖上电转装置盖子，设置恒压16V，转印30min；其余步骤与上述描述相同。

参见图1所示的半干转膜方式和湿转膜方式p-MLC蛋白检测结果对比图。可知，利用上述半干转膜方式和湿转膜方式检测p-MLC信号，结果发现：半干转膜方式MLC磷酸化无信号，β-actin信号正常，平均灰度值为68321(图1A)；而利用湿转膜方式，同样样品检测结果发现：β-actin平均灰度值基本持平的情况下，p-MLC磷酸化出现条带，且信号较强，平均灰度值达到64384(图1B)。湿转膜方式的蛋白信号连续且强度为半干转的2倍以上。这说明对于MLC磷酸化蛋白的检测，湿转膜方式优于半干转膜方式；电压和时间是影响转膜的关键因素，高电压短时间的湿法转膜较低电压、长时间效果更好。

实施例二

选用小鼠气管平滑肌细胞提取磷酸化肌球蛋白轻链，上样蛋白量为60μg，抗体选用p-MLC(ab2480)，一抗稀释比例分别为1:3000，1:5000，1:10000，采用湿转膜方式，按照实施例一描述的步骤进行操作。

参见图2所示的不同抗体稀释比例对p-MLC蛋白表达检测结果比较图，结果发现：抗体稀释比为1:3000时，出现非特异性条带，分子量为25kD(图2A)；降低抗体稀释比为1:5000时，无非特异性条带，且蛋白信号效果较好，平均灰度值为59563(图2B)；抗体稀释比为1:10000时同样无非特异性条带，但条带出现弥散且背景较高，平均灰度值为50387(图2C)。

本发明针对磷酸化蛋白的免疫印记检测中采用湿转膜方式，转印系统稳定性较好，对仪器要求较低，蛋白信号连续且强度为半干转的2倍以上；对于磷酸化蛋白，半干转膜时磷酸化蛋白无信号；而利用湿转条件，同样的样品检测结果发现磷酸化蛋白出现连续信号；当一抗抗体稀释比为1:5000时无非特异性条带，且蛋白信号效果较好。

虽然上面已经参考各种实施例描述了本发明，但是应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以进行许多改变和修改。因此，其旨在上述详细描述被认为是例示性的而非限制性的，并且应当理解，以下权利要求(包括所有等同物)旨在限定本发明的精神和范围。以上这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明的记载的内容之后，技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求所限定的范围。

Claims (9)

1.一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、样品制备及凝胶电泳：在磷酸化蛋白样品中以5:1比例加入6倍SDS上样缓冲液，均匀混合样品；电泳装置中加入1倍电泳缓冲液，将预染指示剂和磷酸化蛋白样品分别加入凝胶的点样孔中，电压80V进行电泳；

S2、转膜：切取S1步骤中的磷酸化蛋白样品的电泳凝胶，并剪取两块和PAGE胶相同大小的厚滤纸和孔径为0.2μm的PVDF膜，转印夹负极放置海绵垫、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵垫，组装好转印夹放入转印槽，加入预冷的转移缓冲液，将凝胶面与负极相连，PVDF膜与正极相连，恒压130V，转印时间为1h；

S3、封闭：将S2步骤中的PVDF膜放入含有5％BSA的PBST中，室温摇床孵育20min，封闭膜上剩余的疏水结合位点；

S4、加一抗：在S3步骤的溶液中加入合适比例的一抗，24℃摇床孵育2h，使目的蛋白与一抗特异性结合，PBST漂洗4次，5min/次，洗去未结合的一抗；

S5、加二抗：在S4步骤的溶液中加入用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗兔二抗，室温摇床孵育1h，使HRP标记的二抗与一抗充分结合；PBST漂洗4次，5min/次，洗去未结合的二抗；

S6、显色：使用1mL加样枪将显影试剂均匀滴到PVDF膜上，放入凝胶成像仪中进行凝胶显影。

2.根据权利要求1所述的一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，其特征在于，步骤S1中所述蛋白样品加入SDS上样缓冲液中混合后，100℃煮沸5min，使蛋白质氨基酸侧链与SDS充分结合。

3.根据权利要求2所述的一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，其特征在于，步骤S1中开始电泳时设置恒压80V，待所述指示带跑入分离胶时，更换为130V恒定电压，直至所述指示带跑至凝胶底部，结束电泳。

4.根据权利要求3所述的一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，其特征在于，S2步骤中的所述PVDF膜在进行转膜前先置于甲醇溶液中激活2min，然后于转移缓冲液中平衡约5min。

5.根据权利要求4所述的一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，其特征在于，S2步骤中转印夹组装之前，先将PAGE胶、滤纸、海绵浸泡于转移缓冲液20min。

6.根据权利要求5所述的一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，其特征在于，S4步骤加入的所述一抗采用含有5％BSA的PBST进行稀释，稀释比例为1:5000。

7.根据权利要求6所述的一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，其特征在于，S5中所述的辣根过氧化物酶采用含有5％BSA的PBST提前稀释，所述抗兔二抗提前按照1:2000比例进行稀释。

8.根据权利要求7所述的一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，其特征在于，步骤S6中显色的曝光时间为10min、60张。

9.根据权利要求7所述的一种磷酸化蛋白质的免疫印迹检测方法，其特征在于，步骤S6中所述显影剂为增强型化学发光(ECL)HRP底物。