CN103852364A - 一种生物聚合物自动染色法及染色装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物聚合物自动染色法及染色装置。该方法包括染料与待染色的生物聚合物结合、未结合的染料与已结合染料的生物聚合物的分离，整个染色过程在一容器中进行；其中未结合的染料与已结合染料的生物聚合物的分离是先将多余染料移除，加入脱色液，脱色液与残留染料以及已染生物聚合物置于施加电场的介质中，使未与生物聚合物结合的染料从介质中完全移出或部分移出而生物聚合物留在介质中。该方法不需要消耗一次性加厚滤纸，从而节约成本。本发明利用电场加速带电荷生物聚合物染料快速与生物聚合物结合，并能快速使未结合的染料与已结合染料的生物聚合物分离，缩短整个染色时间，节约成本，该方法操作简单，染色、脱色可在仪器中自动完成。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种生物聚合物自动染色法及染色装置。
背景技术
利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。在确定的条件下，带电粒子在单位电场强度作用下，单位时间内移动的距离（即迁移率）为常数。不同带电粒子因所带电荷不同，或虽所带电荷相同但荷质比不同，在同一电场中电泳，经一定时间后，由于移动距离不同而相互分离。分开的距离与外加电场的电压与电泳时间成正比。1937年瑞典学者A.W.K.蒂塞利乌斯设计制造了移动界面电泳仪，分离了马血清白蛋白的3种球蛋白，创建了电泳技术。本世纪40年代末到50年代初相继发展利用支持物进行的电泳，如滤纸电泳，醋酸纤维素膜电泳、琼脂电泳；50年代末又出现淀粉凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。目前，电泳技术已广泛应用于分析化学、生物化学、临床化学、药理学、免疫学、微生物学、遗传学等科学中。
生物聚合物如肽、蛋白质、核酸、寡糖、或者其混合物通过凝胶电泳分析，通常目的样品被装载在一个介质中，如聚丙烯酰胺凝胶，根据分子大小、电荷、和其他物理性质的差异，在电场中迁移得到不同的带，电泳后条带是通过生物聚合物与染色试剂结合后被检测。大量染色方法和试剂被开发出来用于染色出如凝胶这样的介质中的生物聚合物，这些试剂可以分为四种：第一种染色试剂包括结合到聚合物上的有机染料，如考马斯亮蓝染色试剂，使蛋白带变成蓝色从而可通过肉眼被观察到；第二种染色试剂包括结合到聚合物上的荧光染料，如EB结合DNA或RNA，当紫外线照射时，使DNA或RNA呈红色；第三种染色试剂包括银染试剂；第四种是染色背景的试剂，即被称为负染。第二种和第三种染色试剂的灵敏度已经达到或者超过第一种的传统染色试剂。但上述方法均存在着耗时较长的缺陷。
为了解决上述技术问题，申请人于2010年6月25日提交了申请号为201010220009.5，名称为生物聚合物快速染色法的中国发明专利申请，该方法包括染料与待染色的生物聚合物结合、未结合的染料与已结合染料的生物聚合物的分离、已结合染料的生物聚合物显像，该方法利用染料与生物聚合物在施加电场的介质中的迁移率不同，使染料快速与生物聚合物结合，并能快速使未结合的染料与已结合染料的生物聚合物分离，缩短整个染色时间，节约成本。但是该方法需要消耗载体，特别是一次性加厚滤纸，带来染色成本的增加。而且需要将电泳后的承载生物聚合体的介质与承载不同缓冲液的滤纸组成三明治结构，需要人为操作，不够简便，也需要接触介质、染料等，安全性较低。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种生物聚合物自动染色法。
本发明的另一目的是提供应用于本发明生物聚合物自动染色法的一种优选染色装置。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种生物聚合物自动染色法，包括如下步骤：
a、染料与待染色的生物聚合物结合：将染料与待染色的生物聚合物在施加电场的介质中保持接触，使染料与待染色的生物聚合物结合而进行染色；
b、未结合的染料与已结合染料的生物聚合物的分离是先将多余染料移除，加入脱色液，脱色液与残留染料以及已染生物聚合物置于施加电场的介质中，使未与生物聚合物结合的染料从介质中完全移出或部分移出而生物聚合物留在介质中；
c.已结合染料的生物聚合物显像：保留在介质中的已结合染料的生物聚合物采用可见光下显像或采用非可见光成像技术显像；
其中，步骤a与步骤b中的介质为同一介质。
所述的未结合的染料与已结合染料的生物聚合物的分离结束后将脱色液移除。
步骤a与步骤b在同一容器中进行。
所述的容器底部分别设有泵与染料和脱色液储藏容器相连接，染料的加入、移除、脱色液的加入及移除通过泵完成。
染料与生物聚合物上的染料在介质中的迁移方向相同或不相同。当迁移方向相同时，结合在生物聚合物上的染料与未结合在生物聚合物上的染料（即游离染料或残留染料）的迁移速率不同，未结合在生物聚合物上的染料迁移速度快，因此在迁移方向相同的情况下也可以实现染色。
当存在多个生物聚合物时，步骤b中施加的电场使生物聚合物在介质中迁移的方向与步骤a中施加的电场使生物聚合物在介质中迁移的方向不相反。
步骤b使脱色剂、未与生物聚合物结合的残留染料从介质中完全移出或部分移出而生物聚合物留在介质中的方法是通过控制迁移时间、与迁移方向平行的介质长度、迁移率、生物聚合物起始迁移位置、脱色剂的离子强度来实现。残留染料速度最快，结合在聚合物上的染料基本不迁移。脱色液是个混合物，主要成分是电解质，所起作用是使没有结合的染料即残留染料脱离介质继续迁移。
为得到较短的全程时间，相应的影响因素如何控制可以结合实际情形进行优选，比如：若生物聚合物与染料的电荷种类相同，二者在进行染色后可以以介质的同一端为起点进行分离，介质沿生物聚合物移动方向上保留足够的长度以满足生物聚合物不跑出介质而染料跑出介质；如果生物聚合物事先没有染色，则需保证生物聚合物位于染料移动路径上以保证二者能够接触并染色；另外，pH、电离强度、电压、介质种类等影响迁移率的因素也会影响时间和显色效果。
步骤b未与生物聚合物结合的染料从介质中部分移出的程度使留在介质中的未结合染料造成的背景色与结合染料的生物聚合物的显色能够区分出来。
所述的非可见光成像技术为荧光显像、红外显像、紫外显像、放射显像、数字成像技术。
所述的染料优选有机染料、无机染料、荧光染料、复合型染料中的一种或多种；所述的脱色液优选为25mM EDTA二钠和25mM NaH2PO4的水溶液；生物聚合物优选多肽、蛋白、RNA、DNA、低聚糖中的一种或多种；介质优选滤纸、醋酸纤维素膜、琼脂、凝胶中的一种。
所述的有机染料进一步优选考马斯亮蓝、氨基黑、丽春红、固绿FCF、锌试剂、铬黑中的一种或多种；所述的无机染料进一步优选铜离子、亚铁离子及其他重金属离子中的一种或多种；所述的荧光染料进一步优选溴化乙啶、丫啶类染料、花菁染料中的一种或多种；所述的复合型染料进一步优选无机染料与有机染料复合物、荧光染料和有机染料的复合物、荧光染料和无机染料的复合物等中的一种或多种；凝胶进一步优选琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种。
本发明染色方法步骤a中电场力驱动染料分子通过和介质以及生物聚合物的相互作用，从而使介质中的生物聚合物被染色。染色时的电压可以调整染料移动的速度。因此，染色时间可降低至不到10分钟。
电泳后的承载生物聚合体的介质置于电极之间，再施加一个电场，在保证生物聚合物的相对位置不会移动的前提下，施加电场的方向与电泳电场的方向可以成一定的角度。由于电场对生物聚合物还有染料分子都发生作用，不过生物聚合物移动的速度与染料分子移动的速度相比，速度慢很多倍，在比较短的时间内（10min之内），生物聚合物移动距离很短，相对于染料分子来说可以忽略不计。即使时间略长，生物聚合物移动一定距离，只要生物聚合物不跑出介质，而染料分子早已跑出介质，也能很好地将生物聚合物显现出来。
在本发明染色方法中，首先，把含有生物聚合物的介质如聚丙烯酰胺胶放置在染色容器中，泵自动泵入一定量的染料，仪器自动通电开始对在丙烯酰胺胶中的生物聚合物染色，2-5分钟后染色结束。泵自动泵出染料。然后，泵自动泵入一定量的脱色液，仪器自动通电开始对丙烯酰胺胶进行脱色，2-5分钟后脱色结束。泵自动泵出脱色液。从染色容器取出已染色的含有生物聚合物的介质，结束整个染色过程。需要指出的是，不同染料的混合物也能用来改进染色的灵敏度。
常用电极均可以适用于本发明染色方法，如Pt、石墨、钛、表面有惰性金属镀层电极、不锈钢电极等。
在本发明染色方法中脱色液是必须的，脱色液不含任何染料，脱色是为了让含有生物聚合物的介质如聚丙烯酰胺凝胶中的游离染料从介质中进入脱色液，从而除去背景。
一种用于本发明所述的生物聚合物自动染色法的染色装置，包含一个用于进行步骤a与步骤b的容器，两个泵；所述的容器开有染料进口和脱色剂进口，分别通过管道与泵与盛放染料和脱色剂储藏容器相连接，所述的容器底部开有废液出口。
所述的染色装置还包括电源、计时器。
虽然本发明染色方法优选上述染色装置，但是也可通过其他手段实现染料的加入、移除、脱色液的加入及移除。比如手动加入或移去各种溶液。这种情况下只需要一个可以施加电极的容器即可。
一种染色试剂盒，含有本发明所述的染色装置、染料及脱色液；所述的染料为有机染料、无机染料、荧光染料、复合型染料中的一种或多种；所述的有机染料为考马斯亮蓝、氨基黑、丽春红、固绿FCF、锌试剂、铬黑中的一种或多种；所述的无机染料为铜离子、亚铁离子及其他重金属离子中的一种或多种；所述的荧光染料为溴化乙啶、丫啶类染料、花菁染料中的一种或多种；所述的复合型染料为无机染料与有机染料复合物、荧光染料和有机染料的复合物、荧光染料和无机染料的复合物等中的一种或多种；所述的脱色液为由25mM EDTA二钠和25mMNaH2PO4组成的混合水溶液。
有益效果：
该技术是在已申请并授权专利（生物聚合物快速染色法，201010220009.5）的基础上，改进而成。生物聚合物快速染色法（201010220009.5）需要消耗载体，如一次性加厚滤纸，而本发明自动染色方法由于无需形成三明治结构，不需要消耗载体，从而节约成本。原理同样是利用电场加速带电荷生物聚合物染料快速与生物聚合物结合，并能快速使未结合的染料与已结合染料的生物聚合物分离，缩短整个染色时间，节约成本，该方法操作简单，染色、脱色可在仪器中自动完成，避免了手工操作以及实验人员接触染料和脱色液，增强了实验的安全性。
附图说明
图1实施例1按本发明方法染色的结果。
图2实施例2按本发明方法染色的结果。
图3是本发明染色装置的结构示意图。
其中1为脱色剂储藏器，2为脱色剂泵，3为容器，4为电极，5为染料泵，6为染料储藏器，7为废液泵，8为废液池，9为染料进口，10为脱色剂进口，11为含有生物聚合物的介质，12为废液出口。
具体实施方式
实施例1
在一4-20%聚丙烯酰胺胶（GenScript，MG420W12）中，把以下样品分别上样在12个样品孔中,10μl细胞裂解液（1泳道），5μl NEB蛋白质标样（2泳道），500ng鼠抗（3泳道），50ng鼠抗（4泳道），5000ng G蛋白（5泳道），500ng G蛋白（6泳道），50ng G蛋白（7泳道），5000ng BSA（8泳道），500ng BSA（9泳道），50ng BSA（10泳道），5μl NEB蛋白质标样（11泳道），10μl细胞裂解液（12泳道）。130伏电泳1小时后，按以下方法进行染色。
把含有已通过电泳分离的蛋白样品的聚丙烯酰胺胶放置在染色容器中，泵自动泵入20ml的染料，仪器自动通36v直流电开始对在丙烯酰胺胶中的蛋白质染色，5分钟后染色结束。泵自动泵出染料。然后，泵自动泵入20ml的脱色液，仪器自动通电开始对丙烯酰胺胶进行脱色，5分钟后脱色结束。泵自动泵出脱色液。从染色容器取出已对蛋白质样品染色的聚丙烯酰胺胶，结束整个染色过程。对已染色的聚丙烯酰胺胶拍照，结果见图1。其中使用的染料为考马斯亮蓝，具体为0.05%考马斯亮蓝R250溶液,溶剂为59%去离子水，28.5%乙醇和12.5wt%乳酸。使用的脱色液为25mM EDTA二钠和25mM NaH2PO4的混合物水溶液。
实施例2
在一4-20%聚丙烯酰胺胶（GenScript，MG420W10）中，把以下样品分别上样在9个样品孔中,5μl NEB蛋白质标样（1），1000ng BSA（2），500ng BSA（3），250ng BSA（4），125ngBSA（5），62.5ng BSA（6），31ng BSA（7），15ng BSA（8），8ng BSA（9）。130伏电泳1小时后，按上面描述方法进行染色。
把含有已通过电泳分离的蛋白样品的聚丙烯酰胺胶放置在染色容器中，泵自动泵入20ml的染料，仪器自动通36伏直流电开始对在丙烯酰胺胶中的蛋白质染色，5分钟后染色结束。泵自动泵出染料。然后，泵自动泵入20ml的脱色液，仪器自动通36伏直流电开始对丙烯酰胺胶进行脱色，5分钟后脱色结束。泵自动泵出脱色液。从染色容器取出已对蛋白质样品染色的聚丙烯酰胺胶，结束整个染色过程。对已染色的聚丙烯酰胺胶拍照，结果见图2。其中使用的染料为考马斯亮蓝，具体为0.05%考马斯亮蓝R250溶液,溶剂为59%去离子水，28.5%乙醇和12.5wt%乳酸。使用的脱色液为25mM EDTA二钠和25mM NaH2PO4的混合物水溶液。
实施例3
一种染色试剂盒，含有染色装置、染料溶液及脱色液。
图3所示的染色装置设有一插入电极4的容器3，含有生物聚合物的介质11置于容器3中进行染色；容器3上壁分别设有染料进口9和脱色剂进口10，染料进口9通过染料泵5与染料储藏器6相连，脱色剂进口10通过脱色剂泵2与脱色剂储藏器1相连；容器3底部设有废液出口12，通过废液泵7与废液池8相连。各储藏器与泵，泵与容器3之间通过管道连接。
染料溶液为0.05%考马斯亮蓝R250,溶剂为59%去离子水，28.5%乙醇和12.5wt%乳酸。
脱色液为25mM EDTA二钠和25mM NaH2PO4的混合物水溶液。
本发明的发明点不在于染料、脱色剂等的选择，而在于染色方法这一思路。以上实施例仅仅是对本发明的举例说明，并不因此限定本发明的保护范围。
Claims (14)
1.一种生物聚合物自动染色法，其特征在于如下步骤：
a、染料与待染色的生物聚合物结合：将染料与待染色的生物聚合物在施加电场的介质中保持接触，使染料与待染色的生物聚合物结合而进行染色；
b、未结合的染料与已结合染料的生物聚合物的分离是先将多余染料移除，加入脱色剂，脱色剂与残留染料以及已染生物聚合物置于施加电场的介质中，使未与生物聚合物结合的染料从介质中完全移出或部分移出而生物聚合物留在介质中；
c.已结合染料的生物聚合物显像：保留在介质中的已结合染料的生物聚合物采用可见光下显像或采用非可见光成像技术显像；
其中，步骤a与步骤b中的介质为同一介质。
2.根据权利要求1所述的生物聚合物自动染色法，其特征在于所述的未结合的染料与已结合染料的生物聚合物的分离结束后将脱色剂移除。
3.根据权利要求2所述的生物聚合物自动染色法，其特征在于步骤a与步骤b在同一容器中进行。
4.根据权利要求3所述的生物聚合物自动染色法，其特征在于所述的容器底部分别设有泵与染色剂和脱色剂储藏容器相连接，染料的加入、移除，脱色剂的加入及移除通过泵完成。
5.根据权利要求3所述的生物聚合物自动染色法，其特征在于染料、脱色剂与生物聚合物在介质中的迁移方向相同或不相同。
6.根据权利要求3所述的生物聚合物自动染色法，其特征在于当存在多个生物聚合物时，步骤b中施加的电场使生物聚合物在介质中迁移的方向与步骤a中施加的电场使生物聚合物在介质中迁移的方向不相反。
7.根据权利要求1所述的生物聚合物自动染色法，其特征在于步骤b使脱色剂、未与生物聚合物结合的残留染料从介质中完全移出或部分移出而生物聚合物留在介质中的方法是通过控制迁移时间、与迁移方向平行的介质长度、迁移率、生物聚合物起始迁移位置、脱色剂的离子强度来实现。
8.根据权利要求1所述的生物聚合物自动染色法，其特征在于步骤b未与生物聚合物结合的染料从介质中部分移出的程度使留在介质中的未结合染料造成的背景色与结合染料的生物聚合物的显色能够区分出来。
9.根据权利要求1所述的生物聚合物自动染色法，其特征在于非可见光成像技术为荧光显像、红外显像、紫外显像、放射显像、数字成像技术。
10.根据权利要求1所述的生物聚合物自动染色法，其特征在于所述的染料为有机染料、无机染料、荧光染料、复合型染料中的一种或多种；所述的脱色剂为电解质；生物聚合物为多肽、蛋白、RNA、DNA、低聚糖中的一种或多种；介质为滤纸、醋酸纤维素膜、琼脂、凝胶中的一种。
11.根据权利要求10所述的生物聚合物自动染色法，其特征在于所述的有机染料为考马斯亮蓝、氨基黑、丽春红、固绿FCF、锌试剂、铬黑中的一种或多种；所述的无机染料为铜离子、亚铁离子及其他重金属离子中的一种或多种；所述的荧光染料为溴化乙啶、丫啶类染料、花菁染料中的一种或多种；所述的复合型染料为无机染料与有机染料复合物、荧光染料和有机染料的复合物、荧光染料和无机染料的复合物等中的一种或多种；凝胶为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种。
12.一种用于权利要求1所述的生物聚合物自动染色法的染色装置，其特征在于包含一个用于进行步骤a与步骤b的容器，至少两个泵；所述的容器底部至少开有染色剂进出口和脱色剂进出口，分别通过管道与泵与盛放染色剂和脱色剂储藏容器相连接。
13.一种用于权利要求1所述的生物聚合物自动染色法的染色装置，其特征在于所述的染色装置还包括电源、计时器。
14.一种染色试剂盒，其特征在于该染色试剂盒含有权利要求12所述的染色装置、染色剂及脱色剂；所述的染料为有机染料、无机染料、荧光染料、复合型染料中的一种或多种；所述的有机染料为考马斯亮蓝、氨基黑、丽春红、固绿FCF、锌试剂、铬黑中的一种或多种；所述的无机染料为铜离子、亚铁离子及其他重金属离子中的一种或多种；所述的荧光染料为溴化乙啶、丫啶类染料、花菁染料中的一种或多种；所述的复合型染料为无机染料与有机染料复合物、荧光染料和有机染料的复合物、荧光染料和无机染料的复合物等中的一种或多种；所述的脱色剂为25mM EDTA二钠和25mM NaH2PO4的水溶液。
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