JP2015535609A - バイオポリマーの自動染色法及び染色装置 - Google Patents
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Abstract
バイオポリマーの自動染色法及び染色装置である。該方法は、染料と染色しようとするバイオポリマーの結合、結合されない染料と染料を結合したバイオポリマーの分離を含み、染色過程全体は容器で行う。結合されない染料と染料を結合したバイオポリマーの分離には、まず、余剰な染料を除去し、脱色液を添加し、脱色液と残留染料及び染色したバイオポリマーを電場を印加した媒体に置いて、バイオポリマーと結合されない染料を媒体から全部又は部分に移し出し、バイオポリマーを媒体に残留する。該方法には、使い捨て増厚濾紙を消耗する必要がないので、コストを節約する。該方法及び装置は電場で帯電バイオポリマー染料を加速して迅速にバイオポリマーと結合させ、迅速に結合されない染料と染料を結合したバイオポリマーを分離させ、染色時間全体を短縮し、コストを節約し、操作が簡単で、染色、脱色は機器で自動に完成されることができる。【選択図】図１
Description
本発明は生物技術分野に関し、バイオポリマーの自動染色法及び染色装置に関する。
荷電粒子が電場での移動速度の異なりを利用して分離を達成する技術は電気泳動技術と呼ばれる。確定した条件で、荷電粒子が単位電場強度の作用で、単位時間内に移動する距離（即ち移動度）が定数である。異なる荷電粒子は帯電した電荷が異なり、或いは帯電した電荷が同じであるが質量電荷比が異なるため、同一の電場で電気泳動し、一定の時間を経た後で、移動距離の異なりによって互いに分離する。分離した距離は印加電場の電圧と電気泳動時間に比例する。１９３７年にスウェーデンの学者A.W.K.Arne Wilhelm Kaurin seliusは移動インターフェイス電気泳動装置を設計して製造し、ウマの血清アルブミンの3種のグロブリンを分離し、電気泳動技術を確立した。本世紀４０年代末から５０年代初まで続いて支持物による電気泳動、例えば濾紙電気泳動、酢酸セルロース膜電気泳動、寒天電気泳動を発展しており、また、５０年代末にでんぷんゲル電気泳動とポリアクリルアミドゲル電気泳動などが現れる。従来、電気泳動技術が既に分析化学、生物化学、臨床化学、薬理学、免疫学、微生物学、遺伝学などの科学に幅広く適用した。
バイオポリマー、例えばペプチド、タンパク質、核酸、オリゴ糖、或いはその混合物はゲル電気泳動の分析によって、普通に標的サンプルが例えばポリアクリルアミドゲルのような媒体に載せられ、分子の大きさ、電荷、及びその他の物理性質の差異によって、電場で移動して異なるバンドを取得し、電気泳動した後バンドはバイオポリマーが染色試薬に結合した後に検出される。大量の染色方法と試薬は例えばゲルのような媒体でのバイオポリマーを染色するために開発されて、これらの試薬は４種類に分けられ、第１種の染色試薬はポリマーに結合される有機染料、例えばクマシーブリリアントブルー染色試薬を含み、タンパク質バンドを青色に変えさせて目によって観察されることができ、第２種の染色試薬はポリマーに結合される蛍光染料を含み、例えばＥＢがＤＮＡ又はＲＮＡに結合され、紫外線を照射する際に、ＤＮＡ又はＲＮＡに赤色を呈させ、第３種の染色試薬は銀染色試薬を含み、第４種は背景を染色する試薬であり、即ちネガティブ染色と呼ばれる。第２種と第３種の染色試薬の感度は、既に第１種の従来染色試薬に達するか或いは超えるようになる。しかしながら、上記の方法はいずれも時間がかかる欠陥が存在している。
上記の技術問題を解決するために、出願者は２０１０年６月２５日に出願番号が２０１０１０２２０００９．５、名称がバイオポリマー高速染色法である中国発明特許出願を提案し、該方法は染料と染色しようとするバイオポリマーの結合、結合されない染料と染料と結合したバイオポリマーの分離、染料と結合したバイオポリマー現像を含み、該方法は染料とバイオポリマーが電場を印加した媒体での移動度の異なりを利用して、染料を迅速にバイオポリマーに結合させ、且つ迅速に結合されない染料と染料と結合したバイオポリマーを分離させることができ、染色時間全体を短縮し、コストを節約する。しかしながら、該方法はキャリア、特に使い捨て増厚濾紙を消費する必要があり、染色コストを増加させる。且つ、電気泳動した後のバイオポリマーを担持する媒体と異なる緩衝溶液を担持する濾紙をサンドイッチ構造に構成する必要があり、手動操作を必要とし、複雑であり、媒体、染料などに接触する必要もあり、安全性が低い。
本発明は従来の技術における上記の欠陥に対して、バイオポリマーの自動染色法を提供することを目的とする。
本発明は本発明のバイオポリマーの自動染色法に使用される好ましい染色装置を提供することを他の目的とする。本発明の目的は以下のような技術的解決手段によって達成することができる。
バイオポリマーの自動染色法であって、
染料と染色しようとするバイオポリマーを含む媒体とを、電場を印加した容器で接触させ、染料と染色しようとするバイオポリマーを結合して染色する染料と染色しようとするバイオポリマーの結合ステップａと、
電場で媒体での余剰な染料を除去するステップｂと、
を含み、ステップａとステップｂでの媒体は同一の媒体である。
染料と染色しようとするバイオポリマーを含む媒体とを、電場を印加した容器で接触させ、染料と染色しようとするバイオポリマーを結合して染色する染料と染色しようとするバイオポリマーの結合ステップａと、
電場で媒体での余剰な染料を除去するステップｂと、
を含み、ステップａとステップｂでの媒体は同一の媒体である。
好ましくは、前記バイオポリマーの自動染色法は、容器に脱色剤を加え、電場を印加して、バイオポリマーと結合されない染料を媒体から全部又は一部に移り出させてバイオポリマーを媒体に残留するステップを更に含む。更に、染料と結合したバイオポリマーを現像し、現像技術は可視光での現像或いは非可視光イメージング技術の現像を採用するステップを更に含んでよい。
更に、前記の結合されない染料と染料と結合したバイオポリマーを分離して除去するステップを更に含んでよい。
上記の技術的解決手段では、前記の容器の少なくとも１つの端部は管路によってポンプに接続され、ポンプは着色剤と脱色剤の貯蔵容器に接続され、染料の添加及び除去と脱色剤の添加及び除去はポンプによって完成する。染料とバイオポリマーでの染料とは媒体での移動方向が同じ又は異なる。移動方向が同じである場合、バイオポリマーに結合される染料の移動速度はバイオポリマーに結合されない染料（即ち遊離染料又は残留染料）の移動速度と異なり、バイオポリマーに結合されない染料の移動速度が速いため、移動方向が同じである場合にも染色を実現することができる。バイオポリマーと染料の電荷の種類が異なる場合、染料が電場でバイオポリマーに結合されて染色し、余剰な結合されない染料が電場作用で媒体から移り出すことができる。
短い全過程時間を取得するために、対応な影響要素を如何に制御するかは実際の状況に応じて好適に選択でき、例えば、バイオポリマーと染料との電荷種類が同じであり、両者は染色した後媒体の同一の端を開始点として分離して、バイオポリマーと染料分子が媒体での異なる移動速度を制御でき、染料分子を媒体から移り出させ、バイオポリマーが依然として媒体に残留される。バイオポリマーは事先に染色されないと、両者が接触して染色することを確保するようにバイオポリマーが染料の移動経路にあることを確保する必要がある。また、ｐＨ、電離強度、電圧、媒体の種類などの移動度に影響を及ぼす要素も時間と着色効果にも影響を及ぼす。
前記バイオポリマーに結合されない染料が媒体から一部的に移り出す程度は媒体に残留された、結合されない染料による背景色と染料と結合したバイオポリマーの着色を区分することができる。
前記の非可視光イメージング技術は蛍光現像、赤外現像、紫外現像、放射現像、デジタルイメージング技術である。イメージング技術の選択は選ばれた染料によって決められる。
好ましくは、前記の染料は有機染料、無機染料、蛍光染料、複合型染料の中の１種又は多種であり、好ましくは、前記の脱色液は２５ｍＭのＥＤＴＡと２５ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４の水溶液であり、好ましくは、バイオポリマーはポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、オリゴ糖の中の１種又は多種であり、好ましくは、媒体は濾紙、酢酸セルロース膜、寒天、ゲル、或いは寒天とアクリルアミドを混合して調製したゲルの中の１種である。
本発明の前記脱色剤は電解質である。
好ましくは、前記脱色剤はリン酸又は可溶性リン酸塩を含み、更に好ましくは、前記リン酸又はリン酸塩のリン酸基の含有量が１５ｕＭ−１５０ｍＭ（モル比）である。好ましくは、前記脱色剤はＥＤＴＡを更に含む。具体的に、２５ｍＭのＥＤＴＡと２５ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４の水溶液を含むことが好ましい。
更に好ましくは、前記脱色剤は水溶性有機酸基を含み、前記水溶性有機酸基は蟻酸、乳酸、酢酸、クエン酸又は上記酸の可溶性塩の中の１種又は多種から選ばれる。好ましくは、前記水溶性有機酸基は乳酸基である場合、その含有量が０．１ｍＭ−１２Ｍ（モル比）であり、前記水溶性有機酸基は酢酸基である場合、その含有量が０．１ｍＭ−１２Ｍ（モル比）である。
前記の脱色液におけるＥＤＴＡはキレート化作用によって溶液での少量の金属不純物を除去することを主な作用とし、脱色を補助することを次の作用とし、その濃度は操作者により溶液の質量、反応時間、電圧の大きさに応じて調整して最適化することができ、ＲＤＴＡを含まなくてもよい。前記の脱色液はリン酸又はその他の可溶性リン酸塩又は可溶性有機酸又は可溶性有機酸塩の中の１種又は多種を含んでよく、その濃度は操作者により電圧の大きさ、反応時間に応じて調整することができる。前記の脱色液の組成は、操作者により電圧の大きさ、反応時間に応じて決められ、十分に高い電圧を選択する際に、水又はその他の導電液体を脱色液として使用することができる。前記脱色液の溶剤は水又はその他の電解質溶液を形成できる溶剤であってよい。
前記の有機染料はクマシーブリリアントブルー、アミドブラック、ポンソー、ファストグリーンＦＣＦ、亜鉛試薬、エリオクロムブラックの中の１種又は多種が更に好ましく、前記の無機染料は銅イオン、第一鉄イオン及びその他の重金属イオンの中の１種又は多種が更に好ましく、前記の蛍光染料はエチジウムブロマイド、アクリジン系染料、シアニン染料の中の１種又は多種が更に好ましく、前記の複合型染料は無機染料と有機染料の複合体、蛍光染料と有機染料の複合体、蛍光染料と無機染料の複合体などの中の１種又は多種が更に好ましく、ゲルはアガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、寒天とアクリルアミドの混合ゲルの中の１種が更に好ましい。
本発明の染色方法のステップａにおいて電場力で染料分子を駆動して、媒体及びバイオポリマーとの相互作用によって、媒体におけるバイオポリマーが染色される。染色する際の電圧は染料が移動する速度を調整することができる。このため、染色時間は１０分間未満に減少することができる。
電気泳動した後のバイオポリマーを担持する媒体が電極の間に置かれ、更に電場を印加し、バイオポリマーの相対位置が移動しないように確保する前提で、電場を印加する方向は電気泳動電場の方向と一定の角度となることができる。電場はバイオポリマーにも染料分子にも作用を奏するため、バイオポリマーが移動する速度は染料分子が移動する速度と比べて、速度が何倍遅く、短い時間内（ｌ０ｍｉｎ以内）で、バイオポリマーの移動距離が短く、染料分子に対して無視できる。時間がやや長くても、バイオポリマーが一定の距離で移動し、バイオポリマーが媒体から逃げ出しなく、染料分子が既に媒体から逃げ出した限り、バイオポリマーをよりよく表示することができる。
本発明の染色方法において、まず、バイオポリマーを含む媒体、例えばポリアクリルアミドゲルを染色容器に置いて、ポンプにより一定量の染料を自動にポンプ注入し、機器は自動に通電されてアクリルアミドゲルでのバイオポリマーを染色し始め、２−５分間後染色を終了する。ポンプにより染料を自動にポンプアウトする。そして、ポンプにより、一定量の脱色液を自動にポンプ注入し、機器は自動に通電されてアクリルアミドゲルを脱色し始め、２−５分間後、脱色を終了する。ポンプにより脱色液を自動にポンプアウトする。染色容器から染色された、バイオポリマーを含む媒体を取り出し、染色過程全体を終了する。なお、異なる染料の混合物が染色の感度を改良するためのものとすることもできる。
常用の電極はいずれも本発明の染色方法に適用することができ、例えば、消耗電極は、Ｃｕを含むが、それに限定されたものではない。不活性金属電極は、白金Ｐｔ、チタンＴｉ電極、グラファイト電極、表面に不活性金属（白金Ｐｔ、チタンＴｉを含むが、それに限定されたものではない）コーティングがある電極、ステンレス鋼電極等を含むが、それに限定されたものではない。
本発明に記載のバイオポリマーの自動染色法に用いる染色装置であって、ステップａとステップｂを行うための容器と、着色剤、脱色剤を搬送するための装置と、を含み、前記の容器の端部に少なくとも着色剤と脱色剤の注入と排出するための開口が設けられ、開口は、管路により、ポンプ、着色剤と脱色剤を収納した貯蔵容器、及び廃液溜めに接続される。
前記の染色装置は電源、コントローラを更に含む。
本発明は、染料は荷電染料である場合、バイオポリマーの自動染色法の染色過程は、染料と、染色しようとするバイオポリマーを含む媒体とを電場を印加した容器において接触させ、染料と染色しようとするバイオポリマーとを結合して染色し、結合されない染料は消耗されるか又は色をなくすまで継続的に移動するステップを含むことを更に開示する。
好ましくは、
電場で余剰な染料を除去するステップａ、又は
容器に脱色剤を添加し、電場を印加し、バイオポリマーと結合されない染料を媒体から全部又は部分に移し出すが、バイオポリマーを媒体に残留するステップｂ、
を更に含む。
電場で余剰な染料を除去するステップａ、又は
容器に脱色剤を添加し、電場を印加し、バイオポリマーと結合されない染料を媒体から全部又は部分に移し出すが、バイオポリマーを媒体に残留するステップｂ、
を更に含む。
好ましくは、前記荷電染料はクマシーブリリアントブルー、エチジウムブロマイド、シアニン染料の中の１種又は多種である。
上記バイオポリマーの自動染色法に用いる染色装置であって、染料と、染色しようとするバイオポリマーを含む媒体とを接触させるための容器と、着色剤、脱色剤を搬送するための装置と、を含み、前記の容器の端部に少なくとも着色剤と脱色剤を注入と排出するための開口が設けられ、開口は、管路により、ポンプ、着色剤と脱色剤を収納する貯蔵容器、及び廃液溜めに接続される。
好ましくは、前記の染色装置は電源、コントローラを更に含む。
染色キットであって、上記染色装置と着色剤を含み、前記の着色剤は荷電染料である。
好ましくは、前記着色剤はクマシーブリリアントブルー、臭化エチジウム、シアニン系染料の中の１種又は多種である。
本発明の染色方法には上記染色装置が好ましいが、他の手段により染料の添加及び除去と脱色液の添加及び除去を実現することもできる。例えば、手動で各種の溶液を添加するか又は除去する。この場合には、電極を印加可能な容器を必要すればよい。
染色キットであって、本発明に記載の染色装置、染料及び脱色液を含み、前記の染料は有機染料、無機染料、蛍光染料、複合型染料の中の１種又は多種であり、前記の有機染料はクマシーブリリアントブルー、アミドブラック、ポンソー、ファストグリーンＦＣＦ、亜鉛試薬、エリオクロムブラックの中の１種又は多種であり、前記の無機染料は銅イオン、第一鉄イオン及び他の重金属イオンの中の１種又は多種であり、前記の蛍光染料はエチジウムブロマイド、アクリジン系染料、シアニン染料の中の１種又は多種であり、前記の複合型染料は、無機染料と有機染料の複合体、蛍光染料と有機染料の複合体、蛍光染料と無機染料の複合体等の中の１種又は多種であり、前記の脱色液は２５ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムと２５ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４からなる混合水溶液である。
本発明の染色方法には脱色液が必ずしも必要なものではない。脱色液を使用する場合に、脱色液には任意の染料が含まず、脱色により、バイオポリマーを含む媒体、例えばポリアクリルアミドゲルにおける遊離染料は媒体から脱色液により速く進入し、それにより、背景を除去する。脱色液を利用する場合、電場の作用時間を延長することにより、遊離染料を媒体から移し出すことができる。
有益な効果
該技術は出願した授権特許（バイオポリマー高速染色法、２０１０１０２２０００９．５）のうえに、改良したものである。バイオポリマー高速染色法（２０１０１０２２０００９．５）にはキャリア、例えば使い捨て増厚濾紙を消耗する必要があり、本発明の自動染色方法はサンドイッチ構造を形成する必要がなくて、キャリアを消耗する必要がないので、コストを節約する。原理は、同様に、電場で帯電バイオポリマー染料とバイオポリマーとの高速結合を加速するとともに、結合されない染料と染料を結合したバイオポリマーとを迅速に分離させることができ、染色時間全体を短縮し、コストを節約することであり、該方法は、操作が簡単で、染色、脱色は機器で自動に完成されることができ、手動操作及び実験者と染料及び脱色液との接触を避けて、実験の安全性を強化する。
該技術は出願した授権特許（バイオポリマー高速染色法、２０１０１０２２０００９．５）のうえに、改良したものである。バイオポリマー高速染色法（２０１０１０２２０００９．５）にはキャリア、例えば使い捨て増厚濾紙を消耗する必要があり、本発明の自動染色方法はサンドイッチ構造を形成する必要がなくて、キャリアを消耗する必要がないので、コストを節約する。原理は、同様に、電場で帯電バイオポリマー染料とバイオポリマーとの高速結合を加速するとともに、結合されない染料と染料を結合したバイオポリマーとを迅速に分離させることができ、染色時間全体を短縮し、コストを節約することであり、該方法は、操作が簡単で、染色、脱色は機器で自動に完成されることができ、手動操作及び実験者と染料及び脱色液との接触を避けて、実験の安全性を強化する。
実施例１
４−２０％のポリアクリルアミドゲル（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＭＧ４２０Ｗ１２）において、１０μｌの細胞溶解液（１レーン）、５μ１のＮＥＢタンパク質標準サンプル（２レーン）、５００ｎｇのマウス抗体（３レーン）、５０ｎｇのマウス抗体（４レーン）、５０００ｎｇのＧタンパク質（５レーン）、５００ｎｇのＧタンパク質（６レーン）、５０ｎｇのＧタンパク質（７レーン）、５０００ｎｇのＢＳＡ（８レーン）、５００ｎｇのＢＳＡ（９レーン）、５０ｎｇのＢＳＡ（１０レーン）、５μ１のＮＥＢタンパク質標準サンプル（１１レーン）、１０μｌの細胞溶解液（１２レーン）というサンプルをそれぞれ１２個のサンプル穴にローディングする。１３０ボルトで１時間電気泳動した後、ゲルを取り出し、以下の方法で染色する。
電気泳動により分離されたタンパク質サンプルを含むポリアクリルアミドゲルを染色容器に置いて、コントローラの制御プロセスは以下のとおりである。ポンプにより２０ｍｌの染料を自動にポンプ注入し、機器には自動に３６ｖの直流電流を流れてアクリルアミドゲルでのタンパク質を染色し始め、５分間後、染色を終了する。ポンプにより染料を自動にポンプアウトする。そして、ポンプにより２０ｍｌの脱色液を自動にポンプ注入し、機器は自動に通電されてアクリルアミドゲルを脱色し始め、５分間後、脱色を終了する。ポンプにより脱色液を自動にポンプアウトする。染色容器からタンパク質サンプルに対して染色したポリアクリルアミドゲルを取り出し、染色過程全体を終了する。染色されたポリアクリルアミドゲルを撮影し、図１に結果を示す。使用した染料はクマシーブリリアントブルーであり、具体的に０．０５％のクマシーブリリアントブルーＲ２５０溶液であり、溶剤は５９％の脱イオン水、２８．５％のエタノール及び１２．５ｗｔ％乳酸である。使用した脱色液は２５ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムと２５ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４の混合物水溶液である。
４−２０％のポリアクリルアミドゲル（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＭＧ４２０Ｗ１２）において、１０μｌの細胞溶解液（１レーン）、５μ１のＮＥＢタンパク質標準サンプル（２レーン）、５００ｎｇのマウス抗体（３レーン）、５０ｎｇのマウス抗体（４レーン）、５０００ｎｇのＧタンパク質（５レーン）、５００ｎｇのＧタンパク質（６レーン）、５０ｎｇのＧタンパク質（７レーン）、５０００ｎｇのＢＳＡ（８レーン）、５００ｎｇのＢＳＡ（９レーン）、５０ｎｇのＢＳＡ（１０レーン）、５μ１のＮＥＢタンパク質標準サンプル（１１レーン）、１０μｌの細胞溶解液（１２レーン）というサンプルをそれぞれ１２個のサンプル穴にローディングする。１３０ボルトで１時間電気泳動した後、ゲルを取り出し、以下の方法で染色する。
電気泳動により分離されたタンパク質サンプルを含むポリアクリルアミドゲルを染色容器に置いて、コントローラの制御プロセスは以下のとおりである。ポンプにより２０ｍｌの染料を自動にポンプ注入し、機器には自動に３６ｖの直流電流を流れてアクリルアミドゲルでのタンパク質を染色し始め、５分間後、染色を終了する。ポンプにより染料を自動にポンプアウトする。そして、ポンプにより２０ｍｌの脱色液を自動にポンプ注入し、機器は自動に通電されてアクリルアミドゲルを脱色し始め、５分間後、脱色を終了する。ポンプにより脱色液を自動にポンプアウトする。染色容器からタンパク質サンプルに対して染色したポリアクリルアミドゲルを取り出し、染色過程全体を終了する。染色されたポリアクリルアミドゲルを撮影し、図１に結果を示す。使用した染料はクマシーブリリアントブルーであり、具体的に０．０５％のクマシーブリリアントブルーＲ２５０溶液であり、溶剤は５９％の脱イオン水、２８．５％のエタノール及び１２．５ｗｔ％乳酸である。使用した脱色液は２５ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムと２５ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４の混合物水溶液である。
実施例２
４−２０％のポリアクリルアミドゲル（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＭＧ４２０Ｗ１０）において、５μｌのＮＥΒタンパク質標準サンプル（１）、１０００ｎｇのＢＳＡ（２）、５００ｎｇのＢＳＡ（３）、２５０ｎｇのＢＳＡ（４）、１２５ｎｇのＢＳＡ（５）、６２．５ｎｇのＢＳＡ（６）、３１ｎｇのＢＳＡ（７）、１５ｎｇのＢＳＡ（８）、８ｎｇのＢＳＡ（９） というサンプルを９つのサンプル穴にそれぞれローディングする。１３０ボルトで１時間電気泳動した後、以上に記載の方法により染色する。
電気泳動により分離されたタンパク質サンプルを含むポリアクリルアミドゲルを染色容器に置いて、コントローラの制御プロセスは以下のとおりである。ポンプにより２０ｍｌの染料を自動にポンプ注入し、機器には自動に３６ボルトの直流電流を流れてアクリルアミドゲルでのタンパク質を染色し始め、５分間後、染色を終了する。ポンプにより染料を自動にポンプアウトする。そして、ポンプにより２０ｍｌの脱色液を自動にポンプ注入し、機器には自動に３６ボルトの直流電流を流れてアクリルアミドゲルを脱色し始め、５分間後、脱色を終了する。ポンプにより脱色液を自動にポンプアウトする。染色容器からタンパク質サンプルに対して染色したポリアクリルアミドゲルを取り出し、染色過程全体を終了する。染色されたポリアクリルアミドゲルを撮影し、結果を図２に示す。使用された染料がクマシーブリリアントブルーであり、具体的には０．０５％のクマシーブリリアントブルーＲ２５０溶液であり、溶剤は５９％の脱イオン水、２８．５％のエタノール及び１２．５ｗｔ％の乳酸である。使用した脱色液は２５ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムと２５ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４の混合物水溶液である。
４−２０％のポリアクリルアミドゲル（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、ＭＧ４２０Ｗ１０）において、５μｌのＮＥΒタンパク質標準サンプル（１）、１０００ｎｇのＢＳＡ（２）、５００ｎｇのＢＳＡ（３）、２５０ｎｇのＢＳＡ（４）、１２５ｎｇのＢＳＡ（５）、６２．５ｎｇのＢＳＡ（６）、３１ｎｇのＢＳＡ（７）、１５ｎｇのＢＳＡ（８）、８ｎｇのＢＳＡ（９） というサンプルを９つのサンプル穴にそれぞれローディングする。１３０ボルトで１時間電気泳動した後、以上に記載の方法により染色する。
電気泳動により分離されたタンパク質サンプルを含むポリアクリルアミドゲルを染色容器に置いて、コントローラの制御プロセスは以下のとおりである。ポンプにより２０ｍｌの染料を自動にポンプ注入し、機器には自動に３６ボルトの直流電流を流れてアクリルアミドゲルでのタンパク質を染色し始め、５分間後、染色を終了する。ポンプにより染料を自動にポンプアウトする。そして、ポンプにより２０ｍｌの脱色液を自動にポンプ注入し、機器には自動に３６ボルトの直流電流を流れてアクリルアミドゲルを脱色し始め、５分間後、脱色を終了する。ポンプにより脱色液を自動にポンプアウトする。染色容器からタンパク質サンプルに対して染色したポリアクリルアミドゲルを取り出し、染色過程全体を終了する。染色されたポリアクリルアミドゲルを撮影し、結果を図２に示す。使用された染料がクマシーブリリアントブルーであり、具体的には０．０５％のクマシーブリリアントブルーＲ２５０溶液であり、溶剤は５９％の脱イオン水、２８．５％のエタノール及び１２．５ｗｔ％の乳酸である。使用した脱色液は２５ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムと２５ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４の混合物水溶液である。
実施例３
染色キットであって、染色装置、染料溶液及び脱色液を含む。
図３に示す染色装置に電極４が挿し込まれた容器３が設けられ、バイオポリマーを含む媒体１１を容器３に置いて染色し、容器３の上壁にそれぞれ染料注入口９と脱色剤注入口１０が設けられ、染料注入口９は染料ポンプ５により染料貯蔵装置６と連通され、脱色剤注入口１０は脱色剤ポンプ２により脱色剤貯蔵装置１と連通され、容器３の底部に廃液排出口１２が設けられ、廃液ポンプ７により廃液溜め８と連通される。各貯蔵装置とポンプの間、ポンプと容器３の間は管路により接続される。
染料溶液は０．０５％のクマシーブリリアントブルーＲ２５０であり、溶剤が５９％の脱イオン水、２８．５％のエタノール及び１２．５ｗｔ％の乳酸である。
脱色液は２５ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムと２５ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４の混合物水溶液である。
染色キットであって、染色装置、染料溶液及び脱色液を含む。
図３に示す染色装置に電極４が挿し込まれた容器３が設けられ、バイオポリマーを含む媒体１１を容器３に置いて染色し、容器３の上壁にそれぞれ染料注入口９と脱色剤注入口１０が設けられ、染料注入口９は染料ポンプ５により染料貯蔵装置６と連通され、脱色剤注入口１０は脱色剤ポンプ２により脱色剤貯蔵装置１と連通され、容器３の底部に廃液排出口１２が設けられ、廃液ポンプ７により廃液溜め８と連通される。各貯蔵装置とポンプの間、ポンプと容器３の間は管路により接続される。
染料溶液は０．０５％のクマシーブリリアントブルーＲ２５０であり、溶剤が５９％の脱イオン水、２８．５％のエタノール及び１２．５ｗｔ％の乳酸である。
脱色液は２５ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムと２５ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４の混合物水溶液である。
実施例４
電気泳動サンプルは、タンパク質ｍａｒｋｅｒ（Ｇｅｎｓｃｉｐｔ、Ｍ００５１６）：５μＬ（１）、２．５μＬ（２）、１．２５μＬ（３）、０．６２５μＬ（４）、ＢＳＡ：５０ｎｇ（５）、２５ｎｇ（６）、１２．５ｎｇ（７）、６．２５ｎｇ（８）、３．１２５ｎｇ（９）である。実施例１又は２の操作により電気泳動及び染色を行い、脱色液はそれぞれ以下のとおりである。
２５ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムと１５ｕＭのＮａＨ２Ｐ０４の混合物水溶液、結果を図４に示す。
２５ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムと１５０ｕＭのＮａＨ２Ｐ０４の混合物水溶液、結果を図５に示す。
２５ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムと１．５ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４の混合物水溶液、結果を図６に示す。
２５ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムと１５ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４の混合物水溶液、結果を図７に示す。
２５ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムと１５０ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４の混合物水溶液、結果を図８に示す。
サンプルは、新たなタンパク質ｍａｒｋｅｒ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｍ００５１６）：５μＬ（１）、２．５μＬ（２）、１．２５μＬ（３）、０．６２５μＬ（４）、ＢＳＡ：５０ｎｇ（５）、２５ｎｇ（６）、１２．５ｎｇ（７）、６．２５ｎｇ（８）、３．１２５ｎｇ（９）である。実施例１又は２の操作に応じて電気泳動及び染色を行い、脱色液はそれぞれ以下のとおりである。
０．１ｍＭの酢酸水溶液、結果を図９に示す。
１ｍＭの酢酸水溶液、結果を図１０に示す。
１０ｍＭの酢酸水溶液、結果を図１１に示す。
０．５Ｍの酢酸水溶液、結果図１２に示す。
２．５Ｍの酢酸水溶液、結果を図１３に示す。
１Ｍの酢酸水溶液、結果を図１４に示す。
５Ｍの酢酸水溶液、結果を図１５に示す。
８Ｍの酢酸水溶液、結果を図１６に示す。
１２Ｍの酢酸水溶液、結果を図１７に示す。
電気泳動サンプルは、タンパク質ｍａｒｋｅｒ（Ｇｅｎｓｃｉｐｔ、Ｍ００５１６）：５μＬ（１）、２．５μＬ（２）、１．２５μＬ（３）、０．６２５μＬ（４）、ＢＳＡ：５０ｎｇ（５）、２５ｎｇ（６）、１２．５ｎｇ（７）、６．２５ｎｇ（８）、３．１２５ｎｇ（９）である。実施例１又は２の操作により電気泳動及び染色を行い、脱色液はそれぞれ以下のとおりである。
２５ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムと１５ｕＭのＮａＨ２Ｐ０４の混合物水溶液、結果を図４に示す。
２５ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムと１５０ｕＭのＮａＨ２Ｐ０４の混合物水溶液、結果を図５に示す。
２５ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムと１．５ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４の混合物水溶液、結果を図６に示す。
２５ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムと１５ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４の混合物水溶液、結果を図７に示す。
２５ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウムと１５０ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４の混合物水溶液、結果を図８に示す。
サンプルは、新たなタンパク質ｍａｒｋｅｒ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、Ｍ００５１６）：５μＬ（１）、２．５μＬ（２）、１．２５μＬ（３）、０．６２５μＬ（４）、ＢＳＡ：５０ｎｇ（５）、２５ｎｇ（６）、１２．５ｎｇ（７）、６．２５ｎｇ（８）、３．１２５ｎｇ（９）である。実施例１又は２の操作に応じて電気泳動及び染色を行い、脱色液はそれぞれ以下のとおりである。
０．１ｍＭの酢酸水溶液、結果を図９に示す。
１ｍＭの酢酸水溶液、結果を図１０に示す。
１０ｍＭの酢酸水溶液、結果を図１１に示す。
０．５Ｍの酢酸水溶液、結果図１２に示す。
２．５Ｍの酢酸水溶液、結果を図１３に示す。
１Ｍの酢酸水溶液、結果を図１４に示す。
５Ｍの酢酸水溶液、結果を図１５に示す。
８Ｍの酢酸水溶液、結果を図１６に示す。
１２Ｍの酢酸水溶液、結果を図１７に示す。
実施例５
１、細胞溶解液の取得
タンパク質サンプル１：大腸菌菌液を遠心させて菌体を収集し、超音波細胞粉砕機で菌体を粉砕し、遠心した後上澄みを収集し、タンパク質の濃度を測定した後０．５ｍＭのＴｉｒｓを用いて０．４ｍｇ／ｍｌに希釈し、そして、５Ｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒと４：１の割合で混合する。１０ｍｉｎの沸騰水浴又は１０ｍｉｎの１００°Ｃの金属浴を行う。
５Ｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ
２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ６．８）
１０％（Ｗ／Ｖ） ＳＤＳ
０．５％ （Ｗ／Ｖ）ＢＰＢ
５０％（Ｖ／Ｖ） グリセリン
５％（Ｗ／Ｖ） β−メルカプトエタノール
配合量：５ｍＬ
タンパク質サンプル２：電気泳動サンプルはタンパク質ｍａｒｋｅｒ（Ｇｅｎｓｃｉｐｔ、Ｍ００５１６）：５μＬ（ｌ）、２．５μＬ（２）、１．２５μＬ（３）、０．６２５μＬ（４）、ＢＳＡ：５０ｎｇ（５）、２５ｎｇ（６）、１２．５ｎｇ（７）、６．２５ｎｇ（８）、３．１２５ｎｇ（９）である。
２、電気泳動
１４０Ｖ 電気泳動 ４５ｍｉｎ
３染色
染色液（０．０５％のクマシーブリリアントブルーＲ２５０、溶剤が５９％の脱イオン水、２８．５％のエタノール及び１２．５ｗｔ％の乳酸である）を反応容器に添加し、２４Ｖでｌ０ｍｉｎ後、結果をそれぞれ図１８と１９に示す。
荷電染料、例えばクマシーブリリアントブルーに対して、染色時間を１０分間に延長し、結合されない染料は正極に移動した後電極の酸化により消耗されるので、このように、余剰な染料を除去する目的を実現することが見られる。
１、細胞溶解液の取得
タンパク質サンプル１：大腸菌菌液を遠心させて菌体を収集し、超音波細胞粉砕機で菌体を粉砕し、遠心した後上澄みを収集し、タンパク質の濃度を測定した後０．５ｍＭのＴｉｒｓを用いて０．４ｍｇ／ｍｌに希釈し、そして、５Ｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒと４：１の割合で混合する。１０ｍｉｎの沸騰水浴又は１０ｍｉｎの１００°Ｃの金属浴を行う。
５Ｘ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ
２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ６．８）
１０％（Ｗ／Ｖ） ＳＤＳ
０．５％ （Ｗ／Ｖ）ＢＰＢ
５０％（Ｖ／Ｖ） グリセリン
５％（Ｗ／Ｖ） β−メルカプトエタノール
配合量：５ｍＬ
タンパク質サンプル２：電気泳動サンプルはタンパク質ｍａｒｋｅｒ（Ｇｅｎｓｃｉｐｔ、Ｍ００５１６）：５μＬ（ｌ）、２．５μＬ（２）、１．２５μＬ（３）、０．６２５μＬ（４）、ＢＳＡ：５０ｎｇ（５）、２５ｎｇ（６）、１２．５ｎｇ（７）、６．２５ｎｇ（８）、３．１２５ｎｇ（９）である。
２、電気泳動
１４０Ｖ 電気泳動 ４５ｍｉｎ
３染色
染色液（０．０５％のクマシーブリリアントブルーＲ２５０、溶剤が５９％の脱イオン水、２８．５％のエタノール及び１２．５ｗｔ％の乳酸である）を反応容器に添加し、２４Ｖでｌ０ｍｉｎ後、結果をそれぞれ図１８と１９に示す。
荷電染料、例えばクマシーブリリアントブルーに対して、染色時間を１０分間に延長し、結合されない染料は正極に移動した後電極の酸化により消耗されるので、このように、余剰な染料を除去する目的を実現することが見られる。
本発明の発明点は染料、脱色剤等の選択に限定されないとともに、染色時間も具体的な場合によって５−１５分間内に調整されてもよい。以上の実施例はただ本発明の例示を説明するためのものだけで、本発明の保護範囲を限定しない。
Claims (28)
- 高速のバイオポリマーの自動染色法であって、
染料と、染色しようとするバイオポリマーを含む媒体とを電場を印加した容器において接触させ、染料と染色しようとするバイオポリマーを結合して染色する染料と染色しようとするバイオポリマーの結合ステップａと、
電場で余剰な染料を除去するステップｂと、
を含むことを特徴とする高速のバイオポリマーの自動染色法。 - 前記容器に脱色剤を添加し、電場を印加し、バイオポリマーと結合されない染料を媒体から全部又は部分に移し出し、バイオポリマーを媒体に残留するステップを更に含むことを特徴とする請求項１に記載のバイオポリマーの自動染色法。
- 染料を結合したバイオポリマーを現像し、現像技術は可視光での現像又は非可視光イメージング技術の現像を採用するステップを更に含むことを特徴とする請求項１に記載のバイオポリマーの自動染色法。
- 前記の結合されない染料を染料を結合したバイオポリマーから分離して除去することを特徴とする請求項１又は２に記載のバイオポリマーの自動染色法。
- 前記の容器の少なくとも１つの端部は管路によってポンプと接続され、ポンプは着色剤と脱色剤の貯蔵容器に接続され、染料の添加及び除去と脱色剤の添加及び除去はポンプにより完成されることを特徴とする請求項１又は２に記載のバイオポリマーの自動染色法。
- 染料、脱色剤及びバイオポリマーは媒体での移動方向と同じ又は異なることを特徴とする請求項２に記載のバイオポリマーの自動染色法。
- 前記バイオポリマーと結合されない染料が媒体から一部的に移り出す程度は媒体に残留された、結合されない染料による背景色と染料と結合したバイオポリマーの着色を区分することができることを特徴とする請求項２に記載のバイオポリマーの自動染色法。
- 非可視光イメージング技術は蛍光現像、赤外現像、紫外現像、放射現像、デジタルイメージング技術であることを特徴とする請求項３に記載のバイオポリマーの自動染色法。
- 前記の染料は有機染料、無機染料、蛍光染料、複合型染料の中の１種又は多種であり、前記の脱色剤は電解質であり、バイオポリマーはポリペプチド、タンパク質、ＲＮＡ、ＤＮＡ、オリゴ糖の中の１種又は多種であり、媒体は濾紙、酢酸セルロース膜、寒天、ゲルの中の１種であることを特徴とする請求項１に記載のバイオポリマーの自動染色法。
- 前記の有機染料はクマシーブリリアントブルー、アミドブラック、ポンソー、ファストグリーンＦＣＦ、亜鉛試薬、エリオクロムブラックの中の１種又は多種であり、前記の無機染料は銅イオン、第一鉄イオン及び他の重金属イオンの中の１種又は多種であり、前記の蛍光染料はエチジウムブロマイド、アクリジン系染料、シアニン染料の中の１種又は多種であり、前記の複合型染料は無機染料と有機染料の複合体、蛍光染料と有機染料の複合体、蛍光染料と無機染料の複合体等の中の１種又は多種であり、ゲルはアガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、又はアガロースとアクリルアミドの混合ゲルの中の１種であることを特徴とする請求項９に記載のバイオポリマーの自動染色法。
- ステップａとステップｂを行うための容器と、着色剤、脱色剤を搬送するための装置と、を含み、前記の容器の端部に少なくとも着色剤と脱色剤を注入と排出するための開口が設けられ、開口は、管路により、ポンプ、着色剤と脱色剤を収納する貯蔵容器及び廃液溜めに接続されることを特徴とする請求項１又は２に記載のバイオポリマーの自動染色法に用いる染色装置。
- 前記の染色装置は電源、コントローラを更に含むことを特徴とする請求項１０に記載のバイオポリマーの自動染色法の染色装置。
- 請求項１１に記載の染色装置、着色剤及び脱色剤を含み、前記の着色剤は有機染料、無機染料、蛍光染料、複合型染料の中の１種又は多種であり、前記の有機染料はクマシーブリリアントブルー、アミドブラック、ポンソー、ファストグリーンＦＣＦ、亜鉛試薬、エリオクロムブラックの中の１種又は多種であり、前記の無機染料は銅イオン、第一鉄イオン及び他の重金属イオンの中の１種又は多種であり、前記の蛍光染料はエチジウムブロマイド、アクリジン系染料、シアニン染料の中の１種又は多種であり、前記の複合型染料は無機染料と有機染料の複合体、蛍光染料と有機染料の複合体、蛍光染料と無機染料の複合体等の中の１種又は多種であり、前記の脱色剤は電解質であることを特徴とする染色キット。
- 前記脱色剤はリン酸又は可溶性リン酸塩を含むことを特徴とする請求項１３に記載の染色キット。
- 前記リン酸又はリン酸塩のリン酸基の含有量は１５ｕＭ−１５０ｍＭ（モル比）であることを特徴とする請求項１４に記載の染色キット。
- 前記脱色剤にはＥＤＴＡを更に含む請求項１４に記載の染色キット。
- 前記脱色剤は２５ｍＭのＥＤＴＡと２５ｍＭのＮａＨ２Ｐ０４を含む水溶液であることを特徴とする請求項１６に記載の染色キット。
- 前記脱色剤は水溶性有機酸基を含むことを特徴とする請求項１３に記載の染色キット。
- 前記水溶性有機酸基は蟻酸、乳酸、酢酸、クエン酸又は上記酸の可溶性塩の中の１種又は多種から選ばれることを特徴とする請求項１８に記載の染色キット。
- 前記水溶性有機酸基は乳酸基である場合、その含有量が０．１ｍＭ−１２Ｍ（モル比）であることを特徴とする請求項１９に記載の染色キット。
- 前記水溶性有機酸基は酢酸基である場合、その含有量は０．１ｍＭ−１２Ｍ（モル比）であることを特徴とする請求項１９に記載の染色キット。
- 染料が荷電染料である場合、染色過程は、
染料と、染色しようとするバイオポリマーを含む媒体とを電場を印加した容器に接触させ、染料と染色しようとするバイオポリマーを結合して染色し、結合されない染料は消耗されるか又は色をなくすまで継続的に移動するステップを含むことを特徴とするバイオポリマーの自動染色法。 - 電場で余剰な染料を除去するステップａ、又は
容器に脱色剤を添加し、電場を印加し、バイオポリマーと結合されない染料を媒体から全部又は部分に移し出すが、バイオポリマーを媒体に残留するステップｂ、を更に含むことを特徴とする請求項２２に記載の自動染色法。 - 前記染料はクマシーブリリアントブルー、エチジウムブロマイド、シアニン染料の中の１種又は多種であることを特徴とする請求項２２又は２３に記載の自動染色法。
- 染料と、染色しようとするバイオポリマーを含む媒体とを接触させるための容器と、着色剤、脱色剤を搬送するための装置と、を含み、前記の容器の端部に少なくとも着色剤と脱色剤を注入と排出するための開口が設けられ、開口は、管路により、ポンプ、着色剤と脱色剤を収納する貯蔵容器、及び廃液溜めに接続されることを特徴とする請求項２２又は２３に記載のバイオポリマーの自動染色法に用いる染色装置。
- 前記の染色装置は電源、コントローラを更に含むことを特徴とする請求項２５に記載のバイオポリマーの自動染色法に用いる染色装置。
- 該染色キットは請求項２５に記載の染色装置と着色剤を含み、前記の着色剤は荷電染料であることを特徴とする染色キット。
- 前記着色剤はクマシーブリリアントブルー、臭化エチジウム、シアニン染料の中の１種又は多種であることを特徴とする請求項２７に記載の染色キット。
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