CN106482999A - 一种基于活性染料的page胶分离蛋白快速染色脱色试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于活性染料的PAGE胶分离蛋白快速染色脱色试剂盒，可实现任一PAGE胶分离蛋白的快速染色及脱色，具体包括蛋白染色液和蛋白脱色液。为实现上述目的，本发明提供了一种基于活性染料的PAGE胶分离蛋白快速染色脱色方法，包括以下步骤：1) 根据不同活性染料与蛋白共价偶联特性配置最优蛋白染色液；2) 根据不同活性染料与PAGE胶结合特性配置最优蛋白脱色液；3) 常规PAGE胶电泳后，加入配置好的蛋白染色液与PAGE胶充分接触，摇床室温缓慢振荡染色2hrs；4) 回收上述染色液，采用去离子水冲洗凝PAGE胶至无活性染料液体流出；5) 加入配置好的蛋白脱色液与PAGE胶充分接触，摇床室温震荡脱色至少5hrs直至背景脱掉条带清晰为止。具有灵敏度高、特异性强、安全性高等特点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域一种基于活性染料的PAGE胶分离蛋白快速染色脱色试剂盒，具体包括蛋白染色液和蛋白脱色液。
背景技术
目前，大部分蛋白质的电泳分析研究方法是基于聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)电泳进行定性和相对定量分析。聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。为了使聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质更好地显示出来，通常使用一些化学染料标记物与蛋白质反应，由于蛋白质分子结构中含有大量的非共价结合位点，通过非共价键的作用固定在蛋白质分子上达到标记显示目的蛋白条带的效果。根据蛋白染色条带的有无可用于蛋白质定性，根据染色亮度可用于蛋白量粗略定量。目前，PAGE胶分离蛋白常采用传统的酸性染料考马斯亮蓝R250/G250等进行染色，可有效地以范德华力形式与蛋白质的碱性基团结合，通过脱色液将PAGE胶的背景色脱掉，最后使待检测蛋白样品以不同大小的分子量显示出来。然而，传统考马斯亮蓝法等染色法存在蛋白条带颜色固定、染色时间久、染色稳定性差、脱色时间较长等缺点。基于此，本发明旨在基于活性染料不同色素基团与蛋白质亲核试剂发生共价偶联特性，提供一种新的PAGE胶分离蛋白快速染色脱色试剂盒，通过该试剂盒的蛋白染色液可实现不同色素基团对PAGE胶分离蛋白样品的快速稳定偶联标记，进而通过蛋白脱色液实现快速脱色，最终使待测蛋白样品在PAGE胶上以不同颜色清晰显示出来，具有操作简单、成本低、染色脱色速度快、染色稳定、特异性高等特点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于活性染料的PAGE胶分离蛋白快速染色脱色试剂盒，可实现任何PAGE胶电泳分离蛋白实验的快速染色及脱色，具体包括蛋白染色液和蛋白脱色液。
为了实现上述目的，本发明提供了一种基于活性染料的PAGE胶分离蛋白快速染色脱色的方法，包括以下步骤：
1)根据不同活性染料与蛋白质共价偶联特性配置最优蛋白染色液；
2)根据不同活性染料与PAGE胶结合特性配置最优蛋白脱色液；
3)常规PAGE胶蛋白电泳后，加入配置好的蛋白染色液与PAEG胶充分接触，摇床室温缓慢震荡染色2hrs；
4)回收上述染色液，采用去离子水冲洗PAGE胶至无活性染料液体流出；
5)加入配置好的蛋白脱色液与PAGE胶充分接触，摇床室温震荡脱色至少5hrs直至背景脱掉条带清晰为止。
上述步骤1) 所述不同活性染料，可为一氯均三嗪型活性染料、乙烯砜型活性染料、双一氯均三嗪型活性染料、卤代嘧啶型活性染料等适用于蛋白质染色的活性染料，特别是卤代嘧啶型活性染料。
上述步骤1) 所述不同活性染料，可为红色、黄色、蓝色、紫色活性染料等基于不同色素基团的活性染料。
上述步骤1) 所述最优蛋白染色液，由2.5%活性染料、10%乙酸、45%无水乙醇和45%去离子水组成；
上述步骤2) 所述的PAGE胶，可为SDS-PAGE胶，二维PAGE胶和非变性PAGE胶等；
上述步骤2) 所述最优蛋白脱色液，由0.45%次氯酸钠组成；
上述步骤3) 所述蛋白染色时间，根据实际情况可调整为1-4hrs；
上述步骤4）所述蛋白脱色时间，根据实际情况可调整为2-12hrs。
本发明提供了一种基于活性染料PAGE胶分离蛋白快速染色脱色试剂盒，包括蛋白染色液和蛋白脱色液。基于测试的最优反应体系，可利用不同活性染料特性快速地将PAGE胶分离蛋白偶联标记色素基团，经脱色液处理后将待测蛋白显示出不同的颜色，不仅可实现快速染色和脱色，而且可实现蛋白的不同色彩展示，具有广泛的应用性。
附图说明
图1：SDS-PAGE胶分离蛋白的不同红色活性染料染色效果图；
图2：甲醇脱色液最佳脱色浓度摸索；
图3：乙醇脱色液最佳脱色浓度摸索；
图4：次氯酸钠脱色液最佳脱色浓度摸索。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明作进一步的阐述，但下述实施例仅是一个例子，并不作为本发明的限制，在不偏离本发明范围的情况下，本发明的主要特征可以用于各种实施方式。
实施例１
不同红色活性染料蛋白染色液最佳染色效果摸索
1.实验目的：研究不同种类的红色活性染料蛋白染色液对PAGE胶分离蛋白的染色脱色效果，摸索最优蛋白染色液；
2.实验分组：选择0.25%活性染料、10%乙酸、45%乙醇和45%去离子水作为蛋白染色液缓冲体系。采用不同的红色活性染料蛋白染色液对PAGE胶分离蛋白染色，包括：活性红M2B、活性红200和活性红XB。
实验步骤：
1)蛋白染色液配置：按照上述实验分组及缓冲液体系配方，依次配置活性红M2B染色液、活性红200染色液和活性红XB染色液；
2)BSA蛋白样品配置：选择牛血清白蛋白(Sigma,USA)作为待测蛋白样品，采用去离子水溶解，配置成终浓度1mg/ml的BSA蛋白待测样品，加入蛋白电泳上样缓冲液后，90℃煮沸10min；
3)SDS-PAGE胶配置及上样：按照分子克隆方法配置12.5%SDS-PAGE胶，按照每孔10μl蛋白样品体积上样，同时加入5μl蛋白marker作为对照；
4)SDS-PAGE电泳：100V、10min跑浓缩胶，200V、50min跑分离胶；
5)活性染料染色：待蛋白样品在PAGE胶中完全分离后，停止电泳，将PAGE胶转移至含上述配置的蛋白染色液的平皿，活性染料加样量以覆盖PAGE胶为宜，摇床室温缓慢震荡染色2hrs后进行拍照。
实验结果：
如图1所示， PAGE胶分离蛋白经不同红色活性染料染色2hrs后，PAGE胶和蛋白样品均被染成红色。其中活性红200的染色效果最好，BSA蛋白和蛋白marker条带清晰，后续选择活性红200作为最优蛋白染色液。
实施例2
PAGE胶分离蛋白染色后最优蛋白脱色液摸索_甲醇
1.实验目的：研究由不同浓度甲醇组成的蛋白脱色液对于PAGE胶分离蛋白的脱色效果，摸索甲醇作为蛋白脱色液缓冲液体系的可行性；
2.实验分组：采用0.25%活性红200、10%乙酸、45%乙醇和45%去离子水作为蛋白染色液。选择不同浓度的甲醇浓度作为蛋白脱色液，包括：0%、5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%。
实验步骤：
1)蛋白染色液配置：按照上述蛋白染色液配方，配置活性红200蛋白染色液；
2)蛋白脱色液配置：根据上述实验分组，依次配置不同浓度的甲醇蛋白脱色液；
3)BSA蛋白样品配置：选择牛血清白蛋白(Sigma,USA)作为待测蛋白样品，采用去离子水溶解，配置成终浓度1mg/ml BSA蛋白待测样品，加入蛋白电泳上样缓冲液后，90℃煮沸10min；
4)PAGE胶配置及上样：按照分子克隆方法配置12.5% SDS-PAGE胶，按照每孔10μl蛋白样品体积上样，同时加入5μl蛋白marker作为对照；
5)SDS-PAGE电泳：100V、10min跑浓缩胶，200V、50min跑分离胶；
6)PAGE分离蛋白染色及脱色：待蛋白样品在PAGE胶中完全分离后，停止电泳，将PAGE胶转移至含上述配置的蛋白染色液的平皿，活性染料加样量以覆盖过PAGE胶为宜，摇床室温缓慢震荡染色2hrs；回收活性染料，用去离子水冲洗PAGE胶直至无活性染料流出；加入上述不同浓度甲醇的活性染料脱色液，加样量以覆盖过PAGE胶为宜，摇床室温缓慢震荡染色5hrs后进行拍照。
实验结果：
如图2所示，随着甲醇浓度增加，PAGE胶脱色效果逐渐增加，但也伴随着PAGE胶的皱缩程度加剧，其中采用25%甲醇的活性染料脱色液效果最优，但胶的背景依然残存微量红色。
实施例3
PAGE胶分离蛋白染色后最优蛋白脱色液摸索_乙醇
1.实验目的：研究由不同浓度乙醇组成的蛋白脱色液对于PAGE胶分离蛋白的脱色效果，摸索乙醇作为蛋白脱色液缓冲液体系的可行性；
2.实验分组：采用0.25%活性红200、10%乙酸、45%乙醇和45%去离子水作为蛋白染色液。选择不同浓度的乙醇浓度作为蛋白脱色液，包括：0%、5%、10%、20%、25%、30%、35%组、40%。
实验步骤：
1)蛋白染色液配置：按照上述蛋白染色液配方配置活性红200蛋白染色液；
2)蛋白脱色液配置：根据上述实验分组，依次配置不同浓度的乙醇蛋白脱色液；
3)BSA蛋白样品配置：选择牛血清白蛋白(Sigma,USA)作为待测蛋白样品，采用去离子水溶解，配置成终浓度1mg/ml的BSA蛋白待测样品，加入蛋白电泳上样缓冲液后，90℃煮沸10min；
4)PAGE胶配置及上样：按照分子克隆方法配置12.5% SDS-PAGE胶，按照每孔10μl蛋白样品体积上样，同时加入5μl蛋白marker作为对照；
5)SDS-PAGE电泳：100V、10min跑浓缩胶，200V、50min跑分离胶；
6)PAGE胶分离蛋白染色及脱色：待蛋白样品在PAGE胶中完全分离后，停止电泳，将PAGE胶转移至含上述配置的蛋白染色液的平皿中，活性染料加样量以覆盖过PAGE胶为宜，摇床室温缓慢震荡染色2hrs；回收活性染料，用去离子水冲洗PAGE胶直至无活性染料流出；加入上述不同浓度乙醇的活性染料脱色液，加样量以覆盖过PAGE胶为宜，摇床室温缓慢震荡染色5hrs后进行拍照。
实验结果：
如图3所示，随着乙醇浓度增加，PAGE胶脱色效果逐渐增加，但也伴随着PAGE胶的皱缩程度加剧，其中采用20%乙醇的活性染料脱色液效果最优，但胶的背景依然残存微量红色。
实施例4
PAGE胶分离蛋白染色后最优蛋白脱色液摸索_次氯酸钠
1.实验目的：研究不同浓度次氯酸钠蛋白脱色液对PAGE胶分离蛋白的脱色效果，摸索次氯酸钠作为PAGE胶分离蛋白脱色液的可行性；
2.实验分组：采用0.25%活性红200、10%乙酸、45%乙醇和45%去离子水作为蛋白染色液。选择不同浓度的次氯酸钠浓度作为蛋白脱色液，包括： 0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%；根据初步实验结果进一步的缩小次氯酸钠浓度范围，依次分为0.4%、0.45%、0.5%、0.55%、0.6%、0.65%、0.7%、0.75%。
实验步骤：
1)蛋白染色液配置：按照上述蛋白染色液配方配置活性红200染色液；
2)蛋白脱色液配置：根据上述实验分组，依次配置不同浓度的次氯酸钠蛋白脱色液；
3)BSA蛋白样品配置：选择牛血清白蛋白(Sigma, USA)作为待测蛋白样品，采用去离子水溶解，配置成终浓度1mg/ml的BSA蛋白待测样品，加入蛋白电泳上样缓冲液后，90℃煮沸10min；
4)PAGE胶配置及上样：按照分子克隆方法配置12.5% SDS-PAGE胶，按照每孔10μl蛋白样品体积上样，同时加入5μl蛋白marker作为对照；
5)SDS-PAGE电泳：100V、10min跑浓缩胶，200V、50min跑分离胶；
6)PAGE胶分离蛋白的染色及脱色：待蛋白样品在PAGE胶中完全分离后，停止电泳，将PAGE胶转移至含上述配置的蛋白染色液的平皿，活性染料加样量以覆盖过PAGE胶为宜，摇床室温缓慢震荡染色2hrs；回收活性染料，用去离子水冲洗PAGE胶直至无活性染料流出；加入上述不同浓度次氯酸钠的活性染料脱色液，加样量以覆盖过PAGE胶为宜，摇床室温缓慢震荡染色5hrs后进行拍照。
实验结果：
如图4所示，随着次氯酸钠浓度增加，PAGE胶分离蛋白的脱色效果逐渐增加，但也伴随着蛋白样品和蛋白marker的脱色，其中采用0.45%次氯酸钠的活性染料脱色液效果最优，且胶的背景比较干净，故后续将选择0.45%的次氯酸钠缓冲液作为蛋白脱色液。
Claims (9)
1.一种基于活性染料的PAGE胶分离蛋白快速染色及脱色的方法，包括以下步骤：
1）根据不同活性染料与蛋白质共价偶联特性配置最优蛋白染色液；
2）根据不同活性染料与PAGE胶结合特性配置最优蛋白脱色液；
3）常规PAGE胶蛋白电泳后，加入配置好的蛋白染色液与PAEG胶充分接触，摇床室温缓慢震荡染色2hrs；
4）回收上述染色液，采用去离子水冲洗PAGE胶至无活性染料液体流出；
5）加入配置好的蛋白脱色液与PAGE胶充分接触，摇床室温震荡脱色至少5hrs直至背景脱掉条带清晰为止。
2.根据权利1所述不同活性染料，可为一氯均三嗪型活性染料、乙烯砜型活性染料、双一氯均三嗪型活性染料、卤代嘧啶型活性染料等适用于蛋白质染色的活性染料，特别是卤代嘧啶型活性染料。
3.根据权利1所述不同活性染料，可为红色、黄色、蓝色、紫色活性染料等基于不同色素基团的活性染料。
4.根据权利1所述最优蛋白染色液，由2.5%活性染料、10%乙酸、45%无水乙醇和45%去离子水组成。
5.根据权利1所述的PAGE胶，可为SDS-PAGE胶，二维PAGE胶和非变性PAGE胶等。
6.根据权利1所述的最优活性染料脱色液，由0.45%次氯酸钠组成。
7.根据权利1所述的蛋白染色时间，根据实际情况可调整为1-4hrs。
8.根据权利1所述蛋白脱色时间，根据实际情况可调整为2-12hrs。
9.根据权利1所述的方法组装的试剂盒，包括蛋白染色液和蛋白脱色液，可实现不同形式PAGE胶分离蛋白的染色及脱色。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116925563A (zh) * | 2023-06-30 | 2023-10-24 | 武汉赛维尔生物科技有限公司 | 一种高纯度活性染料及其制备方法和在制备预染蛋白Marker中的应用 |
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2016
- 2016-08-27 CN CN201610735795.XA patent/CN106482999A/zh active Pending
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