CN101936837A - 生物聚合物快速染色法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了生物聚合物快速染色法。该方法包括染料与待染色的生物聚合物结合、未结合的染料与已结合染料的生物聚合物的分离、已结合染料的生物聚合物显像，该方法利用染料与生物聚合物在施加电场的介质中的迁移率不同，使染料快速与生物聚合物结合，并能快速使未结合的染料与已结合染料的生物聚合物分离，缩短整个染色时间，节约成本，该方法操作简单，染色、脱色、显色可一步完成，也可将生物聚合物的分离与染色步骤结合在一起完成。

Description

生物聚合物快速染色法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种操作简便、耗时较少的生物聚合物快速染色法。

背景技术

利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。在确定的条件下，带电粒子在单位电场强度作用下，单位时间内移动的距离(即迁移率)为常数。不同带电粒子因所带电荷不同，或虽所带电荷相同但荷质比不同，在同一电场中电泳，经一定时间后，由于移动距离不同而相互分离。分开的距离与外加电场的电压与电泳时间成正比。1937年瑞典学者A.W.K.蒂塞利乌斯设计制造了移动界面电泳仪，分离了马血清白蛋白的3种球蛋白，创建了电泳技术。本世纪40年代末到50年代初相继发展利用支持物进行的电泳，如滤纸电泳，醋酸纤维素膜电泳、琼脂电泳；50年代末又出现淀粉凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳等。目前，电泳技术已广泛应用于分析化学、生物化学、临床化学、药理学、免疫学、微生物学、遗传学等科学中。

生物聚合物如肽、蛋白质、核酸、寡糖、或者其混合物通过凝胶电泳分析，通常目的样品被装载在一个介质中，如聚丙烯酰胺凝胶，根据分子大小、电荷、和其他物理性质的差异，在电场中迁移得到不同的带，电泳后条带是通过生物聚合物与染色试剂结合后被检测。大量染色方法和试剂被开发出来用于染色出如凝胶这样的介质中的生物聚合物，这些试剂可以分为四种：第一种染色试剂包括结合到聚合物上的有机染料，如考马斯亮蓝染色试剂，使蛋白带变成蓝色从而可通过肉眼被观察到；第二种染色试剂包括结合到聚合物上的荧光染料，如EB结合DNA或RNA，当紫外线照射时，使DNA或RNA呈红色；第三种染色试剂包括银染试剂；第四种是染色背景的试剂，即被称为负染。第二种和第三种染色试剂的灵敏度已经达到或者超过第一种的传统染色试剂。

Fazekas早在1960年发明的考马斯亮蓝染色蛋白的方法在当今仍然被广泛使用(Biochim.Biophys.Acta 71：377，1963年)。除考马斯亮蓝，其他有机染料，如氨基黑、丽春红、固绿FCF、锌试剂、铬黑等已被用于染色蛋白质。考马斯亮蓝染色的蛋白质相对便宜，比银染需要更少的时间，但仍然需要几个小时甚至过夜。

通常情况下，传统的考马斯亮蓝染色凝胶电泳结果包括以下步骤：(一)温柔振荡固定1小时；(二)将固定好的凝胶在温和振荡的条件下染色一小时；(三)将染色之后的凝胶在脱色液中脱色数次，直到胶没有背景并且条带清晰时为止，这通常需要2至3小时，甚至过夜。

常规考马斯亮蓝染色，如上所述，约需四小时或以上，其中至少有3个步骤。由于传统的考马斯亮蓝染色消耗宝贵的时间，需要有一个简单而快速的方法来解决这个问题。

自从Fazekas引入可视蛋白凝胶的方法，考马斯亮蓝染色成为最常用的一般蛋白质检测方法。

尽管考马斯亮蓝蛋白染色的方法有改善，包括采用新的染色试剂如胶体考马斯亮蓝，基本方法大致维持不变。染色方法由传统的演变为微波加热，从而减少了染色时间，这三个基本步骤仍必须完成才能获得令人满意的结果。

目前，尚未有利用电泳技术使未结合的染料与生物材料分离而使已结合染料的生物材料显色从而节省时间的方法报导。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种操作简便、无需使用脱色液脱色、耗时较少的生物材料快速染色法。

本发明还提供了用于上述染色方法的试剂盒。

本发明主要是利用生物聚合物与染料在施加电场的介质中的迁移率不同，使染料从介质中移出而生物聚合物保留在介质中，从而使结合染料的生物聚合物显色。由于生物聚合物分子较大，在电场中移动缓慢，在限定的时间内不会从介质中移出，有机染料分子相对生物聚合物分子来的小得多，未与生物聚合物分子结合的染料分子可迅速从介质中移出，从而在短时间内得到高分辨率、背景影响小甚至无背景的生物聚合物的分析图像。对介质中已分离未染色的生物聚合物，染料在电场的作用下快速定向移动，能在较短的时间下与生物聚合物分子结合进行染色。

染料与生物聚合物的电荷性质可以相同或相反，在电场作用下，染料迁移方向与生物聚合物的迁移方向可以相同或相反，只要保证染料能与生物聚合物相遇则可进行染色。对已染色的生物聚合物与未结合的染料的分离则无需保障二者的接触时间。

由于染料需要迁移出介质而生物聚合物需保留在介质中，故染料的迁移率应大于生物聚合物的迁移率。介质应保障迁移速度最快的生物聚合物沿迁移方向保留足够的长度不至于在适当的电压和时间作用下跑出介质。

本发明的目的可以通过下列技术方案来实现：

一种生物聚合物染色法，包括染料与待染色的生物聚合物结合、未结合的染料与已结合染料的生物聚合物的分离、已结合染料的生物聚合物显像，具体地说：

a.染料与生物聚合物结合：将染料与待染色的生物聚合物直接混合进行染色，或者将待染色的生物聚合物与含有染料的载体接触，或者将染料与待染色的生物聚合物在施加或不施加电场的介质中保持接触，使染料与待染色的生物聚合物结合而进行染色；

b.未结合的染料与已结合染料的生物聚合物的分离：将染料与待染或已染生物聚合物置于施加电场的介质中，使未与生物聚合物结合的染料从介质中完全移出或部分移出而生物聚合物留在介质中；

c.已结合染料的生物聚合物显像：保留在介质中的已结合染料的生物聚合物采用可见光下显像或采用非可见光成像技术显像；

其中，在施加电场的介质中，结合或未结合染料的生物聚合物的迁移率小于染料的迁移率。

所述的染色法，其中染料与生物聚合物在介质中的迁移方向相同或不相同。

所述的染色法，其中步骤a与b中的介质为同一介质或不同介质(如进行转印处理)；当存在多个生物聚合物时，当存在多个生物聚合物时，步骤b中施加的电场使生物聚合物在介质中迁移的方向与步骤a中施加的电场使生物聚合物在介质中迁移的方向不相反，以防止经步骤a已电泳分离的生物聚合物又经过步骤b中电场作用使其发生反向迁移，造成混淆，影响分离效果。

所述的染色法，其中步骤b使未与生物聚合物结合的染料从介质中完全移出或部分移出而生物聚合物留在介质中的方法可以通过控制迁移时间、与迁移方向平行的介质长度、迁移率(特别是染料与生物聚合物迁移率的比例关系)、生物聚合物起始迁移位置等因素来实现。

为得到较短的全程时间，相应的影响因素如何控制可以结合实际情形进行优选，比如：若生物聚合物与染料的电荷种类相同，二者在进行染色后可以以介质的同一端为起点进行分离，介质沿生物聚合物移动方向上保留足够的长度以满足生物聚合物不跑出介质而染料跑出介质；如果生物聚合物事先没有染色，则需保证生物聚合物位于染料移动路径上以保证二者能够接触并染色；另外，pH、电离强度、电压、介质种类等影响迁移率的因素也会影响时间和显色效果。

举例说明如下：

迁移率：未结合的生物材料的迁移率为m1，未结合的染料的迁移率为m2，结合染料后的生物材料的迁移率为m3。(迁移率可在特定条件固定的情况下通过仪器测出，或者根据电压、分子量、电荷性质与大小、介质pH等因素推算出染料与生物材料迁移率的比例范围，如果这个倍数很大，某些影响因素可以忽略不计)

介质长度为L，未结合的染料的起始位置距介质边缘短距离为X，未结合生物材料的起始位置距介质边缘短距离为Y，当它们均从介质边缘开始迁移时X，Y为0。

未结合前的电泳时间t1，结合后染料移出介质的电泳时间t2。

同时的时间内，结合后生物材料不能跑出介质外，未结合的染料应跑出介质外。

结合时染料迁移距离d2＝m2*t1，结合时未结合的生物材料迁移距离d1＝m1*t1。

则如下面几种类型：

1、电泳分离前未结合，染料与生物材料迁移方向相反(图6)：

m3*t2＜d2+x，m2*t2＞d1+y(即结合后同样时间内染料移出而结合的生物材料不移出)

L＝x+d2+d1+y＝x+m2*t1+m1*t1+y

2、电泳分离前未结合，染料与生物材料迁移方向相同(图7)：

m3*t2＜L-(d1+y)或m3*t2＜L-(d2+x)

m2*t2＞L-(d1+y)或m2*t2＞L-(d2+x)

L＝x+m2*t1+m2*t2＝y+m1*t1+m2*t2

3、对电泳前已结合的生物材料与染料分离：

t为染料移出介质的电泳时间

m3*t＜m2*t(相同方向)，或m3*t＜(L-m2*t)(相反方向)

其他一些类型也可以通过上述分析确定相关影响因素，选择介质、染料种类，调节影响迁移率的因素以满足较短的时间内得到较好的分离效果。

所述的染色法，其中步骤b未与生物聚合物结合的染料从介质中部分移出的程度使留在介质中的未结合染料造成的背景色与结合染料的生物聚合物的显色能够区分出来。

所述的染色法，其中非可见光成像技术为荧光显像、红外显像、紫外显像、放射显像、数字成像技术。

所述的染色法，其中染料为有机染料、无机染料、荧光染料、复合型染料中的一种或多种，包括染料标记试剂，如放射性标记试剂等；生物聚合物为多肽、蛋白、RNA、DNA、低聚糖中的一种或多种；介质为滤纸、醋酸纤维素膜、琼脂、凝胶中的一种。

所述的染色法，其中有机染料为考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue)、氨基黑(Amido black)，丽春红(PonceauS)，固绿FCF(Fast green FCF)，锌试剂(zincon)，铬黑(chrome black)中的一种或多种；无机染料为铜离子、亚铁离子以及其他重金属离子中的一种或多种；荧光染料为溴化乙啶、丫啶类染料、花菁染料中的一种或多种；复合型染料为无机染料与有机染料复合物、荧光染料和有机染料的复合物、荧光染料和无机染料的复合物等中的一种或多种；凝胶为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种。

所述的染色法，其中包括下列步骤：在正极板上放置浸湿溶液C的载体，将介质放在浸湿溶液C的载体之上，将浸湿溶液B的载体放在介质之上，将浸湿溶液A的载体在浸湿溶液B的载体之上，负极在这个三明治结构的最上方；两电极板之间施加适当的电压；

其中，溶液A为含异丙醇、乙醇、EDTA中一种或多种的水溶液，溶液B为含考马斯亮蓝(考马斯亮蓝R-250或G-250)、异丙醇、Tris、EDTA(乙二胺四乙酸)、乙酸中一种或多种的水溶液，溶液C为pH 2.0～11的磷酸缓冲液或者类似的缓冲液，介质为滤纸、醋酸纤维素膜、琼脂、凝胶，载体为普通滤纸、转印滤纸或海绵。

进一步，溶液A为含10～50％异丙醇、5～35％乙醇、1～30mmol/L EDTA的水溶液，溶液B为0.05～0.5％考马斯亮蓝，20～60％乙醇，1～30mmol/L EDTA，2～30％乙酸的水溶液，溶液C为pH 6.8的磷酸盐缓冲液。

一种染色试剂盒，该试剂盒含有正负电极、试剂A、试剂B、试剂C；或者还含有介质和/或用于浸渍试剂的载体。试剂盒中的材料可以分开包装。试剂A为异丙醇、乙醇、EDTA中一种或多种，试剂B含考马斯亮蓝(考马斯亮蓝R-250或G-250)、异丙醇、Tris、EDTA(乙二胺四乙酸)、乙酸中一种或多种，试剂C为配制磷酸缓冲液或者类似的缓冲液的试剂。

所述的染色试剂盒，该试剂盒的结构为在正电极与负电极之间依次浸渍试剂C的载体、介质、浸渍试剂B的载体、浸渍试剂A的载体；其中介质可以是已含有待染色的生物聚合物的介质。溶液B是含有负电荷的染料，溶液C是含有正负电荷的染料。两电极板之间的电压可以调节，电压范围在不大于500伏特。

本发明提供了用于包括蛋白质染色分析的一种或者多种组成部分的试剂盒，在另一个方面，该试剂盒包含了一个可以承载染料的部件以及一个或者多个用于蛋白质染色分析的部件，更进一步的说，这个试剂盒包含了可以实现蛋白质染色脱色的整个过程。

进一步，本发明是提供一种改进的快速检测蛋白的考马斯亮蓝染色方法，将传统的蛋白质结合考马斯亮蓝的蛋白染色步骤(一)至(三)合并为一步。因此，这一方法将3步减少为1步，所有的染色过程在正负两电极板之间完成。电场力驱动染料分子通过凝胶和蛋白质相互作用，从而使凝胶中的蛋白质被染色。染色时的电压可以调整染料移动的速度。因此，染色时间可降低至不到10分钟。

电泳后的承载生物聚合体的介质与承载不同缓冲液的滤纸组成的如图5所示的三明治结构置于电极之间，再施加一个电场，在保证生物聚合物的相对位置不会移动的前提下，施加电场的方向与电泳电场的方向可以成一定的角度。由于电场对生物聚合物还有染料分子都发生作用，不过生物聚合物移动的速度与染料分子移动的速度相比，速度慢很多倍，在比较短的时间内(10min之内)，生物聚合物移动距离很短，相对于染料分子来说可以忽略不计。即使时间略长，生物聚合物移动一定距离，只要生物聚合物不跑出介质，而染料分子早已跑出介质，也能很好地将生物聚合物显现出来。

除非特别的申明，这里涉及到的所有技术上和学术上的术语和属于这个发明的技术的文章中的术语通常被理解为相同的意思。

正如本文中所使用的“染色试剂”和“生物聚合物”应属于最广泛的范围。一个“染色试剂”可以是任何颜色或无色的物质。举例来说，染色试剂，包括但不限于：有机染料，无机染料，荧光染料，金属复合染料，放射性或放射性标记分子，或无色物质，改变颜色或成为荧光结合后的生物聚合物。“生物聚合物”包括但不限于多肽，蛋白质，RNA，DNA，低聚糖，一种RNA的聚合物，或者一种DNA多肽聚合物等，或者这些物质中二种或多种的混合物。

染色试剂可以是一个单一的形式，或者也可以存在于混合物或溶液中。染色试剂可以以修改形式(例如，化学改性)或不加修改的形式。

本发明提供了蛋白染色必须的成分。其中一个成分是本文提及作为染色的溶液。染色液包括考马斯亮蓝，异丙醇，Tris，EDTA和乙酸。所有这些因素可能会被文献报道中相类似的试剂取代，但是其功能实质上是一样的。例如异丙醇可以被甲醇或乙醇或者其他文献报道中比较类似的试剂代替。考马斯亮蓝可由其他蛋白染色的染料取代，如氨基黑，丽春红，固绿FCF，锌试剂，铬黑等。染色液包括约0.1克到5克每公升的考马斯亮蓝(R-250或G-250)，但通常是约1克。染色液包括约10克至500克每升的异丙醇，但通常是大约200克。乙酸量为：一公升染色液由大约10克到300克，一般约150克。EDTA在每升染色液中包含约0.1克到10克左右，通常约1克。Tris在一公升染色液包含约0.1克到10克左右，通常约1克。对于染色的溶液，可在pH值的范围约2.0-11.0左右，但通常是在5.0。

在以上的描述中，除了文章中提到的染料，其他的染色液可以被用于这个发明。一个或一个以上的染色液成分可以省略，同样一个或一个以上的试剂可以添加到染料之中。变更染料的目的是提高染色效率，从而使固定，染色和脱色合并成一个步骤。可以设想，其他的染料提供类似的功能，正如染料能够得到发展。

在以上的描述中，文章中指出，其他染色试剂也可以用来染色的蛋白质，除了在这个发明中提到的染色试剂(考马斯亮蓝，R-250或G-250)，这些染色试剂包括，但不仅限于，氨基黑，  丽春红S，固绿FCF，锌试剂，铬黑等等。

在以上的描述中，文章中指出，荧光染色试剂也可以用来染色的蛋白质，除了在这个发明中提到的染色试剂(考马斯亮蓝R-250或G-250)，这些染色试剂包括但不仅限于罗丹明(rhodamine)，Sypro系列(如Sypro Ruby，Sypro Rose)，深紫染料等。应当指出的是，一些结合蛋白后变成的荧光染料。

在以上的描述中，文章中指出，金属离子或金属络合物(也称为金属螯合物)也可用于染色的蛋白质，除了在这个发明中提到的染色试剂(考马斯亮蓝，R-250或G-250)，这些染色试剂包括，但不仅限于亚铁，铟或钼邻苯三酚红复合物，或其他金属配合物与邻苯二酚紫形成的复合物，溴邻苯三酚红，二甲酚橙，邻苯三酚酞等。

应当指出的是，一些在结合蛋白后的荧光染料或者将要变成的荧光染料。

发明的染色液可以瓶装和用作于一般在研究和诊断实验室中。它也可以预染(介质为转印滤纸)。发明包括的染料通常被用于蛋白染色或者类似的实验。

该发明提供了一种快速蛋白染色的方法类似常规蛋白染色(但减少了步骤和时间)。一般常规蛋白染色，通常包括三个步骤，例如，在图1。这些步骤包括一个固定步骤，染色步骤和脱色步骤。常规蛋白染色的这些步骤的每一步都是必要的，以获得可以接受的结果。

在以上的描述中，这些文章中提到的技术将会被有目的的修改，以进一步改善染色的灵敏度。这些修改包括但不仅限于，增加一个或多个步骤。其中一个例子是增加了脱色步骤，以进一步减少的背景。

在以上的描述中，这些文章中所提到的技术，将有很多方法在两个电极之间组装快速染色的分析。如图5所示，发明中的染色液被一片转印滤纸吸收然后放在胶上进行染色。如果染色液带正电，用一片转印滤纸浸润染色液后放在胶下面进行染色。当电极转换后，带正电的染色液将会向上移动到胶介质中对蛋白进行染色。需要指出的是，不同染色液的混合物也能用来改进染色的灵敏度。虽然正负极染色液在染色之前被胶介质分离，但是同时用负极染色液或者混合物和正极染色液或者混合物进行染色是可行的。

在以上的描述中，这些文章中提到的技术中有很多种方法定位两个电极。如图5所示，正极在底部，而负极在顶部。正极和负极的位置可以转换。而且染色液的位置也可以改变，将会对介质胶中的蛋白进行染色。给这个染色装置提供的电压可以是不高于500V。

本发明的有益效果：

这个发明提供了为在介质中的生物聚合物快速染色的方法和有用的组分。一方面，这个发明提供了传统生物聚合物(如蛋白)染色技术的一个显著的改进。这个发明提供的方法使传统方法的蛋白染色的多个步骤合并成了一步。另一方面，这个发明提供了一种用阳极和阴极提供的电场力使带电的染色液在介质中移动的方法。阳极和阴极提供的电压使染色液移动速度比传统染色方法中处于主导地位的扩散作用的速度更快。因此电场力不仅能使染色液快速移动进入凝胶介质中与生物聚合物结合，使生物聚合物染色，而且能使未与生物聚合物结合的染料从胶介质中快速移出使胶介质脱色。这个发明大大减少了生物聚合物的染色(检测鉴定)的时间和成本。

1、本发明提供的染色方法染色全过程耗时短，染料和介质选择余地大，应用范围广。

2、本发明提供的染色法使用的染料的量很少，同时避免使用脱色液，可节约成本。

3、本发明提供的方法操作简单，染色、脱色、显色可一步完成，也可将生物材料分离与染色步骤结合在一起完成。

4.本发明提供的方法占用实验室的空间非常小，最大程度的减少污染的面积。

5.本发明提供的方法实验结果的灵敏度较高。

6.本发明使用的试剂避免使用传统的有毒性试剂，安全。

附图说明

图1：常规考马斯亮蓝染色程序示意图。

凝胶固定1小时，1小时染色和3小时脱色共5个小时。

图2：实施例1按本发明方法进行考马斯亮蓝快速染色牛血清白蛋白的结果，时间为6分钟。M是蛋白质标记(GenScript，MM0900)。

图3：实施例1按传统方法进行考马斯亮蓝染色牛血清白蛋白的结果，时间为5小时。M是蛋白质标记(GenScript，MM0900)。

图4：本发明考马斯亮蓝快速染色三明治结构的安装示意图。

图5：实施例2采用带正电的染料(溴化乙啶)在电场的驱动下与DNA结合后，在紫外灯下成像。介质为琼脂糖凝胶，浓度为2％。样品是一种核酸标记。500ng/泳道，核酸被分别上样到预制核酸凝胶(金思特公司，GenScript，货号L00335)中的1、2、3、4、5、6、7泳道中。染色时间为3分钟。

图6：电泳分离前未结合，染料与生物材料迁移方向相反的示意图。

图7：电泳分离前未结合，染料与生物材料迁移方向相同的示意图。

图6、图7中，●代表染料，■代表未结合染料的生物聚合物，

代表结合了染料的生物聚合物。

图8：实施例3按本发明方法染色的结果。

图9：实施例4按本发明方法染色的结果。

图10：实施例5按本发明方法染色的结果，左图为肉眼直接观察，右图为在紫外灯下成像。

图11：实施例6按本发明方法染色的结果。

图12：实施例7按本发明方法染色的结果。

图13：实施例8按本发明方法染色的结果。

具体实施方式

下列针对性的实验更进一步的说明这个发明，必须指出的是，这个发明不仅限于此。

一般性说明：由于实施例中采用的生物聚合物分子量与所用染料相比有显著的差别，在同样的电泳条件下，结合或未结合染料的生物聚合物的迁移率明显小于染料的迁移率，故实施例中不再对它们的迁移率一一测定。

实施例1  先电泳分离蛋白质再染色。

牛血清白蛋白染色。1500ng、750ng、300ng、150ng、75ng、30ng的牛血清白蛋白被分别上样两块PAGE胶(Genscript，MG008W10)的1到6号泳道，电泳后，一块胶被用于快速染色，具体地说，电泳后，把胶取出，将胶放在如图4所示的三明治结构之中。溶液A为含10～50％(v/v)异丙醇、5～35％(v/v)乙醇、1～30mmol/L乙二胺四乙酸的水溶液，溶液B为含0.05～0.5％(质量体积比)的考马斯亮蓝，20～60％(v/v)乙醇，1～30mmol/L的乙二胺四乙酸，2～30％(v/v)乙酸的水溶液，C为pH 4.0～10的磷酸或者类似的缓冲液(优选：A为含25％异丙醇、10％乙醇、5mmol/L乙二胺四乙酸的水溶液，B为含0.3％的考马斯亮蓝、46％乙醇、5mmol/L乙二胺四乙酸、8％乙酸的水溶液，C为pH 6.8％的磷酸缓冲液)。用电源给三明治结构通电18V，6分钟。整个过程持续大概6分钟，结果见图2。

第二块胶被用于传统的方法染色，具体地说电泳之后，把胶取出，用固定液(含10％(v/v)乙酸和20％(v/v)甲醇的水溶液)固定1小时，固定之后，将固定液吸出，加100mL染色液(含0.1％(质量体积比)考马斯亮蓝，25％(v/v)甲醇以及10％(v/v)乙酸的水溶液)，染色1小时。将溶液吸出，加100mL脱色液(含25％(v/v)甲醇及10％(v/v)乙酸的水溶液)，震荡1小时，脱色步骤重复三次，直到蛋白条带被看见，没有背景。整个过程持续大概5小时，结果见图3。

经比较，图2与图3基本一致，说明采用本发明方法仅需6分钟就能达到传统考马斯亮蓝染色5小时的染色效果。

实施例2：

分别取DNA Marker(Genscript，100bp ladder)，上样于浓度为2％的琼脂糖凝胶，500ng/泳道，核酸被分别上样到预制核酸凝胶中的1、2、3、4、5、6、7泳道中，在TBE(含445 mmol/L Tris碱，445mmol/L硼酸盐，10mmol/L EDTA的水溶液)缓冲液中，恒流300mA，20分钟。电泳结束后，将浸湿带正电染料(溴化乙啶稀释10000倍)的滤纸平铺于正极板上，电泳后的琼脂糖凝胶位于其上，琼脂糖上方再平铺上两层浸湿TBE的滤纸，上方加上负电极组成三明治结构，在两电极上施加50V的电压，3分钟。在电场的驱动下与DNA结合后，在紫外灯下成像。染色时间为3分钟，结果见图5。

实施例3：多种生物聚合物的电泳分离与染色合二为一。

分别取分子量为67KD的蛋白质(牛血清白蛋白)500μg和分量为6KD的多肽500μg，加入1ml水中，配成多种生物聚合物混合的水溶液，加入1ml溶液B(含0.3％考马斯亮蓝，46％乙醇，5mmol/L乙二胺四乙酸，8％乙酸的水溶液)，使染料与生物聚合物保持接触1分钟，对生物聚合物进行染色，然后取该溶液上样于醋酸纤维素膜介质一端(长度为10cm，浸渍于pH8.6的浓度为0.07mol/L巴比妥缓冲液中)，介质施加电压200v，分离时间20分钟，即可见到多肽和蛋白质能够被分离并清晰显色，结果见图8。

实施例4：核酸中含有蛋白

取核酸片段大小为500bp的DNA片段浓度为1μg/μl 5μl与分子量为56KD的蛋白(牛血清白蛋白)浓度为1μg/μl 5μl均匀混合后取5μl上样与8％的PAGE预置胶中(Genscript，MG008W10)的一个泳道中，电泳条件140V，40分钟。电泳后，把胶取出，将胶放在如图4所示的三明治结构之中。溶液A为含25％异丙醇，10％乙醇，5mmol/L乙二胺四乙酸的水溶液，溶液B为含0.3％考马斯亮蓝，46％乙醇，5mmol/L乙二胺四乙酸，8％乙酸的水溶液，C为pH 6.8％的磷酸缓冲液。用电源给三明治结构通电18V，6分钟。结果见图9。

实施例5：

取核酸片段大小为500bp的DNA片段浓度为1μg/μl 5μl与分子量为56KD的蛋白(牛血清白蛋白)浓度为1μg/μl 5μl均匀混合后取5μl上样与8％的PAGE预置胶中(Genscript，MG008W10)的一个泳道中，电泳条件140V，40分钟。电泳后，把胶取出，将胶放在类似图4所示的三明治结构之中，与其不同的是在在介质与含C的转印滤纸之间添加了一层浸湿带正电的染料(溴化乙啶稀释10000倍)的滤纸。溶液A为含25％异丙醇，10％乙醇，5mmol/L乙二胺四乙酸的水溶液，B为含0.3％考马斯亮蓝，46％乙醇，5mmol/L乙二胺四乙酸，8％乙酸的水溶液，C为pH 6.8％的磷酸缓冲液。用电源给三明治结构通电18V，6分钟。用肉眼观察和在紫外灯下成像，结果见图10：左图为肉眼直接观察，右图为在紫外灯下成像。

实施例6：金属离子染料(锌染)

牛血清白蛋白染色。1500ng、750ng、300ng、150ng、75ng、30ng的牛血清白蛋白被PAGE胶(Genscript，MG008W10)的1到6号泳道，电泳后，胶被用于金属离子快速染色，具体地说，电泳后，把胶取出，将胶放在如图4所示的三明治结构之中。溶液A为含1～50％(w/v)碳酸钠、5～35％(v/v)乙醇，C为pH 2.0～7.0的硫酸锌溶液(1～10％(w/v))。用电源给三明治结构通电18V，6分钟。整个过程持续大概6分钟(本实施例将三明治结构中的B去掉)，结果见图11。

实施例7：金属离子染色后再经考马斯亮蓝染色(锌染后考染)

牛血清白蛋白染色。1500ng、750ng、300ng、150ng、75ng、30ng的牛血清白蛋白被PAGE胶(Genscript，MG008W10)的1到6号泳道，电泳后，胶被用于金属离子快速染色，具体地说，电泳后，把胶取出，将胶放在如图4所示的三明治结构之中。溶液A为含1～50％(w/v)碳酸钠、5～35％(v/v)乙醇，B为pH 2.0～7.0的硫酸锌溶液(1～10％(w/v))。用电源给三明治结构通电18V，6分钟。整个过程持续大概6分钟，之后将锌染后的胶浸于双蒸水中10秒后，将胶放在如图4所示的三明治结构之中。溶液A为含10～50％(v/v)异丙醇、5～35％(v/v)乙醇、1～30mmol/L乙二胺四乙酸的水溶液，溶液B为含0.05～0.5％(质量体积比)的考马斯亮蓝，20～60％(v/v)乙醇，1～30mmol/L的乙二胺四乙酸，2～30％(v/v)乙酸的水溶液，C为pH 4.0～10的磷酸或者类似的缓冲液(优选：A为含25％异丙醇、10％乙醇、5mmol/L乙二胺四乙酸的水溶液，B为含0.3％的考马斯亮蓝、46％乙醇、5mmol/L乙二胺四乙酸、8％乙酸的水溶液，C为pH 6.8％的磷酸缓冲液)。用电源给三明治结构通电18V，6分钟，效果见图12(本实施例锌染步骤将三明治结构中的B去掉，考马斯亮蓝染色将三明治结构B加上)。

实施例8：先常规方法染色，待胶染上色之后用此原理脱色

蛋白marker染色。1μl、2μl、3μl、4μl、5μl蛋白marker被上样于PAGE胶(Genscript，MG008W10)的1、10，2、9，3、8，4、7，5、6泳道，电泳后，胶被用于常规方法染色，具体的做法是电泳之后，把胶取出，用固定液(含10％(v/v)乙酸和20％(v/v)甲醇的水溶液)固定1小时，固定之后，将固定液吸出，加100mL染色液(含0.1％(质量体积比)考马斯亮蓝，25％(v/v)甲醇以及10％(v/v)乙酸的水溶液)，染色1小时。染色之后，将胶取出，放在如图4所示的三明治结构之中。溶液A为含10～50％(v/v)异丙醇、5～35％(v/v)乙醇、1～30mmol/L乙二胺四乙酸的水溶液，溶液B为含0.05～0.5％(质量体积比)的考马斯亮蓝，20～60％(v/v)乙醇，1～30mmol/L的乙二胺四乙酸，2～30％(v/v)乙酸的水溶液，C为pH 4.0～10的磷酸或者类似的缓冲液(优选：A为含25％异丙醇、10％乙醇、5mmol/L乙二胺四乙酸的水溶液，B为含0.3％的考马斯亮蓝、46％乙醇、5mmol/L乙二胺四乙酸、8％乙酸的水溶液，C为pH 6.8％的磷酸缓冲液)。用电源给三明治结构通电18V，6分钟。效果如图13。

Claims (12)

1.一种生物聚合物染色法，包括染料与待染色的生物聚合物结合、未结合的染料与已结合染料的生物聚合物的分离、已结合染料的生物聚合物显像，其特征在于：

a.染料与生物聚合物结合：将染料与待染色的生物聚合物直接混合进行染色，或者将待染色的生物聚合物与含有染料的载体接触，或者将染料与待染色的生物聚合物在施加或不施加电场的介质中保持接触，使染料与待染色的生物聚合物结合而进行染色；

b.未结合的染料与已结合染料的生物聚合物的分离：将染料与待染或已染生物聚合物置于施加电场的介质中，使未与生物聚合物结合的染料从介质中完全移出或部分移出而生物聚合物留在介质中；

c.已结合染料的生物聚合物显像：保留在介质中的已结合染料的生物聚合物采用可见光下显像或采用非可见光成像技术显像；

其中，在施加电场的介质中，结合或未结合染料的生物聚合物的迁移率小于染料的迁移率。

2.根据权利要求1所述的染色法，其特征在于染料与生物聚合物在介质中的迁移方向相同或不相同。

3.根据权利要求1所述的染色法，其特征在于步骤a与b中的介质为同一介质或不同介质；当存在多个生物聚合物时，步骤b中施加的电场使生物聚合物在介质中迁移的方向与步骤a中施加的电场使生物聚合物在介质中迁移的方向不相反。

4.根据权利要求1所述的染色法，其特征在于步骤b使未与生物聚合物结合的染料从介质中完全移出或部分移出而生物聚合物留在介质中的方法是通过控制迁移时间、与迁移方向平行的介质长度、迁移率、生物聚合物起始迁移位置来实现。

5.根据权利要求1所述的染色法，其特征在于步骤b未与生物聚合物结合的染料从介质中部分移出的程度使留在介质中的未结合染料造成的背景色与结合染料的生物聚合物的显色能够区分出来。

6.根据权利要求1所述的染色法，其特征在于非可见光成像技术为荧光显像、红外显像、紫外显像、放射显像、数字成像技术。

7.根据权利要求1所述的染色法，其特征在于染料为有机染料、无机染料、荧光染料、复合型染料中的一种或多种；生物聚合物为多肽、蛋白、RNA、DNA、低聚糖中的一种或多种；介质为滤纸、醋酸纤维素膜、琼脂、凝胶中的一种；载体为普通滤纸、转印滤纸或海绵。

8.根据权利要求7所述的染色法，其特征在于有机染料为考马斯亮蓝、氨基黑、丽春红、固绿FCF、锌试剂、铬黑中的一种或多种；无机染料为铜离子、亚铁离子及其他重金属离子中的一种或多种；荧光染料为溴化乙啶、丫啶类染料、花菁染料中的一种或多种；复合型染料为无机染料与有机染料复合物、荧光染料和有机染料的复合物、荧光染料和无机染料的复合物等中的一种或多种；凝胶为琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种。

9.根据权利要求1所述的染色法，其特征在于包括下列步骤：在正极板上放置浸湿溶液C的载体，将介质放在浸湿溶液C的载体之上，将浸湿溶液B的载体放在介质之上，将一个浸湿溶液A的载体在浸湿溶液B的载体之上，负极在这个三明治结构的最上方；

其中，溶液A为含异丙醇、乙醇、EDTA中一种或多种的水溶液，溶液B为含考马斯亮蓝、异丙醇、Tris、EDTA、乙酸中一种或多种的水溶液，溶液C为pH 2.0～11的磷酸缓冲液或者类似的缓冲液，介质为滤纸、醋酸纤维素膜、琼脂、凝胶，载体为普通滤纸、转印滤纸或海绵。

10.根据权利要求9所述的染色法，其特征在于溶液A为含10～50％异丙醇、5～35％乙醇、1～30mmol/L EDTA的水溶液，溶液B为0.05～0.5％考马斯亮蓝，20～60％乙醇，1～30mmol/L EDTA，2～30％乙酸的水溶液，溶液C为pH 6.8的磷酸缓冲液。

11.一种染色试剂盒，其特征在于该试剂盒含有正负电极、试剂A、试剂B、试剂C；或者还含有介质和/或用于浸渍试剂的载体。

12.根据权利要求11所述的染色试剂盒，其特征在于该试剂盒的结构为在正电极与负电极之间依次浸渍试剂C的载体、介质、浸渍试剂B的载体、浸渍试剂A的载体；其中介质可以是已含有待染色的生物聚合物的介质。

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