CN101034043A - 一种电泳凝胶上蛋白质的双重染色方法 - Google Patents

一种电泳凝胶上蛋白质的双重染色方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种电泳凝胶上蛋白质的双重染色方法，包括如下步骤：1)将蛋白质样品电泳后的凝胶置于固定液中，染色液染色；2)洗脱，敏化液敏化；3)去离子水水洗，硝酸银溶液银染；4)去离子水水洗，显影剂显色，EDTA溶液终止。本发明所述的双重染色方法灵敏度高，较现有染色法所需时间更短，质谱兼容性好，安全价廉。

Description

一种电泳凝胶上蛋白质的双重染色方法
技术领域
本发明涉及蛋白质染色领域，具体的说，涉及一种电泳凝胶上蛋白质的双重染色方法。
背景技术
在蛋白质组学研究中，凝胶蛋白质染色技术是衔接二维电泳和下游质谱分析的关键技术。当前先进的质谱仪已能够分析pg级的痕量蛋白。常规的考马斯亮蓝染色法和银染法由于灵敏度低等因素严重的制约了蛋白质组学的发展。近三四十年开发出了不少新的染色技术，但是还是存在着如下一个或几个缺点：灵敏度低、重现性差、毒性大、质谱兼容性差、价格昂贵等。寻找新的染色方法以适应当前先进的质谱分析技术已成为后基因组时代推动蛋白质组学发展的当务之急。对常规的染料进行筛选、组合或染色条件的优化已难以有实质性的突破，必须以新的化学理论为指导方可突破当前在利用质谱分析对蛋白质定性的技术瓶颈。
发明内容
本发明的目的是提供一种高灵敏度的电泳凝胶上蛋白质的双重染色方法。
为了实现本发明的目的，本发明提供了一种电泳凝胶上蛋白质的双重染色方法，包括如下步骤：
1)将蛋白质样本电泳后的凝胶置于固定液中固定10～60min，染色液染色10～60min；
2)固定液洗脱10～60min，敏化液敏化5～60min；
3)去离子水水洗1～3次，每次1～10min，硝酸银溶液银染5～60min；
4)去离子水水洗1～3次，每次10～60s，显影剂显色4～8min，EDTA溶液终止。
所述步骤1)中凝胶置于固定液中固定30min，然后在染色液溶液染色30min；所述固定液为体积百分含量30～50％的乙醇和5～20％乙酸水溶液；所述染色液为0.002～0.006％巯氧吡啶锌溶液、0.001～0.005％乙基紫、20～30％乙醇和5～10％乙酸溶液；固定液优选体积百分含量40％的乙醇和10％乙酸水溶液；所述染色液为0.004％巯氧吡啶锌、0.003％乙基紫、24％乙醇和7％乙酸溶液
所述步骤2)中，用固定液洗脱20min，然后用敏化液敏化10min；所述敏化液为0.01～0.05％硫代硫酸钠的乙醇和乙酸溶液；敏化液优选为0.02％硫代硫酸钠的乙醇和乙酸溶液。
所述步骤3)中，去离子水水洗3次，每次5min，硝酸银溶液银染10min；所述硝酸银溶液为0.25％硝酸银的0.03％甲醛溶液。
所述步骤4)中，去离子水水洗2次，每次20s；显影剂溶液为1～3％碳酸钾、0.01～0.03％甲醛和0.0001～0.0005％硫代硫酸钠溶液。
所述步骤4)中，在显影剂溶液为3％碳酸钾、0.022％甲醛和0.0004％硫代硫酸钠溶液。
所述步骤4)中，1.5％EDTA溶液终止10min。
本发明所述方法依据了离子对和银离子的敏化作用的理论，在染料染色过程中同时使用两种带相反电荷的染料，通过调整溶液的组成、浓度和极性，从而改变染料分子的部分理化性质，使染色溶液处于一种特殊离子配对的临界点，这种状态能够增加染料离子对蛋白质的选择性和吸附性，达到减少染色时间，同时增加蛋白质检测灵敏度和减少背景染色的效果；在银染过程中染料分子可以做为高效的银离子敏化剂，染料分子结构本身具有偶氮键，在显色的特定条件下，偶氮键发生断裂产生还原性(产生氮气)，从而改善银离子的还原，从而增加银染的重现性和灵敏度。该技术能可控性进行两次相对独立染色，能够从染料染色过度到银染。
前期研究表明该技术：
1)灵敏度高：灵敏度高于常规的考马斯亮蓝染色法10倍以上，高于常规的银染法3倍以上；
2)较现有染色法所需时间更短；
3)质谱兼容性好：蛋白质在双重染色后，经质谱分析都获得了较高的复盖率；
4)安全价廉：使用的染料和试剂的毒性较低；染色的成本比美国GE公司研发的Sypro ruby染料低100倍以上。该技术的多项指标已达到国际领先水平，较适合高通量的蛋白质组学研究，据此推测该研究成果将打破国外大公司在蛋白质染色领域对高技术试剂盒的垄断地位。
附图说明
图1在SDS-PAGE凝胶上，本发明所述双重染色法和戊二醛银染法灵敏度的比较。
图中：A双重染色法中染料染色，B双重染色法中银染，C传统的戊二醛银染法；1、样品量25ng/mm2；2、样品量12.5ng/mm2；3、样品量6.2ng/mm2；4、样品量3.1ng/mm2；5、样品量1.6ng/mm2；6、样品量0.8ng/mm2；7、样品量0.4ng/mm2；8、样品量0.2ng/mm2；9、样品量0.1ng/mm2；10、样品量0.05ng/mm2。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
用购自Sigma公司的标准蛋白SDS-6H为样品，在相同的条件下进行电泳。将蛋白质样本电泳后的凝胶置于体积百分含量为40％的乙醇水溶液中固定30min，染色液0.004％巯氧吡啶锌和0.003％乙基紫染色30min。用体积百分含量为40％的乙醇水溶液或体积百分含量为10％的醋酸水溶液洗脱20min，敏化液0.02％硫代硫酸钠溶液敏化10min。去离子水水洗3次，每次5min，硝酸银溶液银染10min。去离子水水洗2次，每次20s。显影剂3％的碳酸钾溶液显色4～8min。1.5％EDTA溶液终止10min。
用常规的戊二醛银染法染色法分别对上述蛋白质样本进行染色，比较结果见图1。戊二醛银染法操作方法参见文献：Heukeshoven，J.，and Dernick，R.(1985)Simplified method for silver staining of proteins inpolyacrylamide gels and the mechanism of silver staining.Electrophoresis 6，103-12.
由图1可见，A为双重染色法中染料染色；B为双重染色法中银染；C为传统的戊二醛银染法。随着样本量的逐渐降低(2倍递减)，三种染色法所显现的颜色逐渐变弱，其中，本发明所述的双重染色方法(银染法)的灵敏度最高。

Claims (9)

1、一种电泳凝胶上蛋白质的双重染色方法，包括如下步骤：
1)将蛋白质样本电泳后的凝胶置于固定液中固定10～60min，染色液染色10～60min；
2)固定液洗脱10～60min，敏化液敏化5～60min；
3)去离子水水洗1～3次，每次1～10min，硝酸银溶液银染5～60min；
4)去离子水水洗1～3次，每次10～60s，显影剂显色4～8min，EDTA溶液终止。
2、如权利要求1所述的双重染色方法，其特征在于，所述步骤1)中凝胶置于固定液中固定30min，然后在染色液溶液染色30min；所述固定液为体积百分含量30～50％的乙醇和5～20％乙酸水溶液；所述染色液为0.002～0.006％巯氧吡啶锌溶液、0.001～0.005％乙基紫、20～30％乙醇和5～10％乙酸溶液。
3、如权利要2所述的双重染色方法，其特征在于，所述步骤1)中固定液为体积百分含量40％的乙醇和10％乙酸水溶液；所述染色液为0.004％巯氧吡啶锌、0.003％乙基紫、24％乙醇和7％乙酸溶液。
4、如权利要求1所述的双重染色方法，其特征在于，所述步骤2)中，用固定液洗脱20min，然后用敏化液敏化10min；所述敏化液为0.01～0.05％硫代硫酸钠的乙醇和乙酸溶液。
5、如权利要求4所述的双重染色方法，其特征在于，所述步骤2)中，敏化液为0.02％硫代硫酸钠的乙醇和乙酸溶液。
6、如权利要求1所述的双重染色方法，其特征在于，所述步骤3)中，去离子水水洗3次，每次5min，硝酸银溶液银染10min；所述硝酸银溶液为0.25％硝酸银的0.03％甲醛溶液。
7、如权利要求1所述的双重染色方法，其特征在于，所述步骤4)中，去离子水水洗2次，每次20s；显影剂溶液为1～3％碳酸钾、0.01～0.03％甲醛和0.0001～0.0005％硫代硫酸钠溶液。
8、如权利要求7所述的双重染色方法，其特征在于，所述步骤4)中，在显影剂溶液为3％碳酸钾、0.022％甲醛和0.0004％硫代硫酸钠溶液。
9、如权利要求1所述的双重染色方法，其特征在于，所述步骤4)中，1.5％EDTA溶液终止10min。
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