CN101539496A

CN101539496A - 用于蛋白质电泳分离后选择性染色的方法

Info

Publication number: CN101539496A
Application number: CN200910082037A
Authority: CN
Inventors: 徐秉玖; 周丽丽; 唐静成; 孙正圆
Original assignee: Capital Medical University
Current assignee: Capital Medical University
Priority date: 2009-04-17
Filing date: 2009-04-17
Publication date: 2009-09-23
Anticipated expiration: 2029-04-17
Also published as: CN101539496B

Abstract

本发明提供一种用于蛋白质电泳分离后选择性染色的方法，其主要步骤包括：采用金属离子对蛋白质电泳分离得到的斑点进行选择性染色；然后采用电迁移方法将选择性染色的蛋白质斑点以外的其他位置所结合的金属离子除去；接着，采用能与用来染色的金属离子结合的染料对蛋白质进行显色，在电泳胶片上将蛋白质斑点取下后，采用络合剂将结合在蛋白质斑点上的金属离子除去，以便进行后续的质谱分析。本发明方法检测的灵敏度高、所需费用少、操作简便、省时省力、且与后续的质谱分析完全兼容。

Description

用于蛋白质电泳分离后选择性染色的方法

技术领域

本发明涉及一种用于蛋白质电泳分离后选择性染色的方法，特别涉及一种通过控制染色的金属离子的电迁移时间，选择性地检测蛋白质经过电泳分离后聚丙烯酰胺凝胶上的目标蛋白斑点的方法。

背景技术

在诸多的蛋白质电泳分离方法中，聚丙烯酰胺凝胶电泳是应用最为广泛的一种分离技术。之后又由传统的一维电泳逐渐发展成了双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，并广泛的应用于蛋白质组学的研究中，成为了蛋白质组学研究领域中的核心技术之一。它是目前分辨率最高、重复性最好的蛋白质分离技术。但双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术只对蛋白质实现分离，随后还须采用染色技术将分离后的蛋白质斑点显示出来以便进行随后的分析。染色方法应不干扰蛋白质点随后进行的质谱分析以便作蛋白质测序或者鉴定的目的。至今为止，凝胶上微量蛋白质的显色以及定量分析仍然是聚丙烯酰胺凝胶电泳面临的主要问题。

在众多的凝胶染色方法中，现在比较常用的是考马斯亮蓝(CBB)染色法及其改进，如胶体考马斯蓝染色法。但是这种方法受到其检测灵敏度的限制，无法检测到低丰度蛋白，并且染色脱色的过程比较费时，其他的有机染料对凝胶进行染色也存在类似的问题。

银染是另外一种传统的染色方法，它的检测灵敏度虽然可达1ng以下，然而它的缺点是染色过程十分复杂、对操作人员的要求也比较高、容易受到诸多因素的干扰、背景颜色较深，并且由于固定试剂甲醛或者戊二醛的使用造成其常常很难与后续的质谱分析相兼容。

近年来也出现了一些利用人工合成的荧光试剂或是具有荧光的天然产物来进行凝胶上蛋白质染色的方法。这些荧光染色方法的灵敏度较高并且也可以与质谱分析兼容，然而现有的荧光染色方法的局限在于其费用昂贵、操作技术复杂、染色时背景容易产生荧光干扰，并且荧光漂白作用会使染色后的凝胶不易长期保存结果。

放射性标记的方法一般是在蛋白质中加入放射性同位素，通过同位素示踪的方法以达到检测的目的。由于不受空白背景的干扰，这种方法也能够达到很低的检测限，但同时也存在同位素元素放射性衰减的问题，并且放射性物质的操作和处理都需要很好的保护措施以保证安全，这也大大提高了实验的费用。

利用金属离子对凝胶进行负染色(Reverse staining)也是一种常用的染色方法。这种方法主要基于金属离子会选择性的在不含蛋白质的空白凝胶处产生沉淀，而在含有蛋白的凝胶处则是相对透明的。利用咪唑-锌盐对蛋白质进行检测最先报道于1990年，其后又利用这种染色方法对凝胶电泳后的生物分子进行分析和微量制备；铜离子染色最初报道于1987年，整个染色过程只需5min，是一种方便快捷的染色方法，蛋白与金属的结合是可逆的，同一块凝胶也可以用其他方法进行复染，并且金属离子可以通过络合剂除去从而不影响后续的质谱分析，所得凝胶能够长期保存后蛋白质点不发生扩散不影响成像质量，但其检测限大约为80ng，这在很大程度上限制了该方法在蛋白质研究领域中的应用。其它的金属离子如铁、金、钌等均可用于凝胶染色。

蛋白质组学发展到今天，一种理想的蛋白染色方法应该是既可以非特异性地与蛋白质有较高的亲和力、不受其他生物分子和常用试剂的干扰；在需要时又可以选择性的标记出所需的同一类蛋白，这样可以免去对凝胶上的所有蛋白质点逐个进行分析，大大节省实验时间。同时染色过程还应该方便快捷以便于不同的操作人员进行操作，更重要的要具有较高的灵敏度以及在需要的时候能够方便的除去染色试剂以达到与后续的各种蛋白分析手段相兼容的目的。由前所述可见，目前还没有一种理想的方法可以大体满足上述的要求，特别是不能对特定类型的蛋白质斑点加以标记，这使得例如含硒蛋白的分析中，缺少一种手段从成千上万的蛋白质斑点中挑出所需研究的对象进行分析，从而增加了分析的成本和干扰的可能性。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于蛋白质电泳分离后选择性染色的方法及装置。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种用于蛋白质电泳分离后选择性染色的方法，其步骤包括：

(1)采用金属离子对蛋白质电泳分离得到的斑点进行选择性染色；

(2)采用一电迁移方法，将与进行选择性染色的蛋白质以外的位置上结合的金属离子除去；

(3)采用能与用来染色的金属离子结合的染料对蛋白质进行显色，在电泳胶片上将蛋白质斑点取下后，采用络合剂将结合在蛋白质斑点上的金属离子除去，以便进行后续的质谱分析。

所述步骤(1)是将分离的蛋白质电泳凝胶从电泳池中取出后，用水反复清洗，再用金属离子的盐溶液浸泡凝胶，取出后用水清洗；所述金属离子的盐溶液其浓度范围为0.1至1.0mol/L，浸泡时间为0.5至3小时。

其中，所述电泳可以是一维电泳，也可以是双向电泳。

优选的，所述凝胶为聚丙烯酰胺凝胶；所述金属离子为具有高检测灵敏度的，并且容易在阴极上析出从而除去的过渡金属离子，例如铜离子、锌离子、铁离子、钴离子等，更优选为铜离子；所述金属离子的盐中的酸根可以为任何无机酸根或有机酸根，无机酸根可以为氯离子、硫酸根或磷酸根，有机酸根可以为甲酸根、乙酸根、丙酸根、丁酸根、草酸根、酒石酸根、苹果酸根、枸椽酸根、抗坏血酸根、苯甲酸根或水杨酸根。

当所述步骤(1)中的选择性染色是指选择对所有的蛋白质斑点染色时，所述步骤(2)可以通过调整迁移时间，使得凝胶上无蛋白质斑点的基底上的金属离子全部迁移掉，留下与蛋白质斑点结合的金属离子以便随后对其检测。所述迁移时间的调整，是在平行实验中，该迁移时间导致用金属离子检测染料显色时，凝胶上没有蛋白质斑点处和蛋白质斑点上所结合的金属离子显色结果对比度达到最大。优选的，迁移的恒定直流电压为2V至50V，迁移时间为1h至3h。

当所述步骤(1)中的选择性染色是指选择对目标蛋白质斑点染色时，所述步骤(2)包括：首先采用电迁移方法除去与凝胶基质结合的金属离子，留下与蛋白质斑点结合的金属离子，提高对蛋白质斑点进行检测时的信噪比，提高检测的灵敏度；进一步采用电迁移方法除去与非目标蛋白质结合的金属离子。由于与非目标蛋白结合的金属离子在电场的作用下可以较快迁移到溶液中，并继续迁移到阴极上还原为金属单质而被除去，而与目标蛋白结合的金属离子由于其与蛋白结合得较牢固，不易解离，所以通过延长迁移时间可以使只与目标蛋白结合的金属离子保留在凝胶上，再对其进行显色，即可以选择性的使目标蛋白质显色。所述迁移时间的延长是在平行实验中，该迁移时间导致非目标蛋白质斑点处的金属离子在采用检测染料显色时观察不到。

在本发明的较佳实施例中，优选的，所述的目标蛋白质为含硒蛋白质或硒蛋白，所述金属离子为铜离子。当选择对含硒蛋白质斑点染色时，由于与非含硒蛋白结合的铜离子在电场的作用下可以较快迁移到溶液中，并继续迁移到阴极上还原为铜而被除去，而与含硒蛋白结合的铜离子由于其与蛋白结合得较牢固，不易解离，所以通过延长迁移时间可以使只与含硒蛋白结合的铜离子保留在凝胶上，再对其进行显色，即可以选择性的使含硒蛋白质显色。所述迁移时间的延长是在平行实验中，该迁移时间导致非含硒蛋白质斑点处的铜离子在采用检测染料显色时观察不到。优选的，电迁移的恒定直流电压为2V至50V，迁移时间为4h。

优选的，所述电迁移的过程中用冰浴冷却，以免产生的电热效应使蛋白质发生变化。所述电迁移方法是在包括电极和缓冲液的电迁移池中进行，且包括随时更换电极缓冲液及清洗电极的过程。

所述步骤(3)是在电迁移已经除去进行选择性染色的目标蛋白质以外的其它位置的金属离子后，采用能与金属离子结合的染料(如三羟基水杨基荧光酮、双缩脲、铁氰化钾、亚铁氰化钾及二甲酚橙等)使蛋白质斑点显色，在电泳胶片上将蛋白质斑点取下后，采用络合剂(常用络合剂，例如EDTA、柠檬酸钠、枸橼酸钠、Tris、NH₃等)将结合在蛋白质斑点上的金属离子除去，以便进行后续的质谱分析。当所述金属离子为铜离子时，所述染料例如可以为三羟基水杨基荧光酮、双缩脲、亚铁氰化钾等。

本发明还提供一种用于蛋白质电泳分离后选择性染色的装置，其包括电泳池和电迁移装置。所述电迁移装置为玻璃板和玻璃胶构制成的电迁移池，所述电迁移池有两块中间镂空的玻璃板，一块采用玻璃胶封固在电迁移池中间，另一块可以移动，需要电迁移的电泳凝胶夹紧在两决中间镂空的玻璃板中间，在电迁移池的两边中充入盐类溶液构成的缓冲液。所述电迁移池的两边缓冲液中分别放置了一块铂电极，铂电极上施加的直流电压范围为2至50V之间。

优选的，所述的缓冲液中的盐类浓度为0.01至0.5mol/L范围内。所述盐类可以为无机酸铵盐，有机酸铵盐，有机碱的无机酸盐或有机碱的有机酸盐。所述无机酸根可以为氯离子、硫酸根或磷酸根；所述有机酸根可以为甲酸根、乙酸根、丙酸根、丁酸根、草酸根、酒石酸根、苹果酸根、枸椽酸根、抗坏血酸根、苯甲酸根或水杨酸根；所述有机碱可以为RNH₂、RR’NH、RR’R”N或三羟甲基氨基甲烷，其中的R，R’，R”可以选自CH₃-、C₂H₅-、C₃H₇-、C₄H₉-中的任一种。所述缓冲液的pH值用无机酸调节至2～11范围内；所述无机酸可以为盐酸、硫酸、磷酸。

在本发明的实施例中，优选的，所述电迁移池在迁移过程中用冰浴冷却。

本发明采用了双向电泳技术将蛋白质分离后，对这些蛋白质点进行选择性染色的方法，并以电场力作为动力，利用金属离子与凝胶基质、非含硒蛋白、含硒蛋白结合能力有很大的差别，使得凝胶基质上结合的金属离子最容易在电场力的作用下迁移出凝胶并且镀在阴极上，从而被彻底除去；而非含硒蛋白质斑点上的金属离子需要长得多的时间才能除去，含硒蛋白斑点上的金属离子在更长的时间内也还保留在其上，这样，在其后用金属离子检测染料对留下的金属离子显色时，就可以通过选择电迁移的时间达到可以按需要检测出双向电泳后分离的所有蛋白质斑点，或者仅检测含硒蛋白质的斑点。另外，本发明方法也适用于一维电泳后非含硒蛋白质的染色，可以作为一种常规的聚丙烯酰胺凝胶分离后蛋白质染色的方法。

本发明方法大大简化了硒蛋白的分离分析过程，为硒蛋白的研究提供了一种有力的工具。并且由于本发明提高了蛋白质斑点所显色的深度与背景相比的对比度，因此提高了检测的灵敏度。与其他染色技术相比，本发明具有需要的费用很少，操作简便，费时相对较少，与后续的质谱分析完全兼容等优点。

附图说明

图1为本发明设计的电迁移结构简图；

图2为本发明用于牛血清白蛋白经SDS-PAGE后，凝胶上蛋白质点的检测结果图；

图3a-3d分别为利用本发明方法分别对等量的BSA和富硒酵母蛋白进行凝胶上染色比较的扫描结果图；

图4a为利用本发明方法对富硒酵母蛋白双向电泳分离后的凝胶进行染色所得到的扫描结果图；

图4b为经传统的考马斯亮蓝染色法对富硒酵母蛋白双向电泳分离后的凝胶进行染色的扫描结果图；

图5a-5b分别为本发明用于富硒酵母蛋白质双向电泳分离凝胶上含硒蛋白点进行选择性染色后对任选一蛋白点进行序列测定的质谱图。

附图标记说明：1-电源；2-金属铂电极；3-玻璃板；4-聚丙烯酰胺凝胶；4601-PDQuest分析软件对蛋白点进行的编号。

具体实施方式

以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。

实施例1

图1所示为本发明用于蛋白质电泳分离后选择性染色的电迁移池的示意图，整个迁移池由1.5mm厚的玻璃板组成，其包括：检测池本体，其是由玻璃板和玻璃胶构成，其中，在所述的检测池本体中间有两决中间镂空的玻璃板3，一块采用玻璃胶封固在电迁移池中间，另一块不固定以便随时移动。池体与中间镂空的玻璃板的尺寸须适应所处理的聚丙烯酰胺胶片4的尺寸，聚丙烯酰胺凝胶的厚度为1mm；在进行电迁移过程时，将所处理的胶片紧夹在两片镂空玻璃板之间，池的两边充入缓冲液，使得通过电迁移池的电流全都是由于胶片和溶液中离子的迁移实现。其中玻璃板镂空的面积稍小于凝胶面积，以便将凝胶固定于两块玻璃板中间，类似于一个三明治的结构，以使迁移池的左右两边不相连通，可以防止离子自由移动。

还包括，在池的两边插入的铂电极2，该两电极分别与电源的正负极相连，且铂电极面积略小于凝胶面积，两铂电极通过直流电源1施加恒定的离子迁移电压。

以下给出一具体的实施过程，在电迁移池的实施过程中，首先用玻璃胶将合适尺寸的玻璃板粘成一个封闭的长方体池子，另将两块玻璃板中间镂空，镂空的面积根据实验中用到的凝胶大小而定，镂空面积稍小于凝胶面积，以两块板恰好可以夹住凝胶片以使两边能够不相连通为宜，其中一块玻璃板用玻璃胶封固在迁移池的中间位置，另一块与之尺寸相同但不固定以便移动。两个铂金电极的尺寸相同，分别固定于迁移池两侧壁的内侧，并通过两根与之一体的铂金引线分别与电源的正负极相连。

应用时，将电泳后的凝胶夹在两块镂空玻璃板中间，用夹子将其固定，保证两边液体不相流通，连通电源后即可在电场力的作用下迫使凝胶中的金属离子迁移到溶液中，最终在阴极板上以金属单质的形式析出。

实施例2

图2所示是应用实施例1中的电迁移池，利用本发明方法对不同量的牛血清白蛋白(BSA)电泳后的凝胶进行染色。图中一系列条带为一维电泳后利用本发明方法对其进行电迁移后再染色所标记出的蛋白质条带。各个条带的上样量不同，均标记于各带的正上方，所使用的单位为ng，由图可知本发明方法对BSA的检测限可达到39ng。可见本发明方法可以作为一种检测灵敏度很高的一维聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后蛋白质染色的方法。

具体操作过程：将电泳后的凝胶取出，用水反复清洗三次除去表面大量的电泳缓冲液，再用0.3M CuCl₂溶液浸泡凝胶1h，取出后用水清洗两次，以除去表面大量的Cu²⁺，再将凝胶置于电迁移池中进行迁移。迁移电压为40V，时间为2h，所用的电极缓冲液为0.05M NH₄Ac，用1M H₂SO₄调其pH为3.5。电迁移完成后，用水冲洗凝胶两次，将其浸泡于0.05％的三羟基水杨基荧光酮(以50％甲醇溶解)中进行显色，显色时间约为3-4h，再以20％的甲醇作为脱色剂进行脱色1h，以脱去凝胶基质上的有色物质。

经过试验发现，迁移开始10min后，阴极板上镀有大量金属Cu，溶液中也黑色的铜屑悬浮，所以此时需更换溶液并清洗阴极铂金板，具体方法是：拆下阴极端电极，用稀酸除去表面镀上的大量金属铜，用水冲洗干净后继续迁移，以后每半小时清洗一次阴极电极。在迁移过程中，由于Cu²⁺不断地镀到阴极上，溶液中电流便不断减小，所以每隔1h需更换电极缓冲液一次。迁移过程中整个池子需置于冰浴中后再连通电源，以免产生的电热效应使蛋白质发生变化。

实施例3

图3a-3d所示分别为利用本发明方法分别对等量的BSA和富硒酵母蛋白进行凝胶上染色的比较图。每张图的左侧两个点均为不含硒的BSA点，右侧两点均为富硒酵母蛋白质点，所有点的蛋白量均相同。图a、b、c、d的电迁移时间分别为1h，2h，3h，4h。

上样方法：配浓度为1mg/ml的BSA和富硒酵母蛋白溶液，灌制1mm厚、浓度为12％的聚丙烯酰胺凝胶，先使其干燥，再用加样枪分别加上述两种蛋白溶液，点样量均为2μl，待蛋白溶液被吸收进凝胶基质后，用水浸泡凝胶使其充分溶胀。电泳后将凝胶取出，其余操作步骤参照实施例2。

随着迁移时间的延长，可以发现BSA点逐渐减淡，到4h时已经完全没有颜色，而硒酵母蛋白点则能够一直保持比较深的颜色，直到4h时才稍有减弱，4h后与BSA结合的Cu²⁺全部迁移到了阴极上，经染色后不再显示蛋白点，而与硒蛋白结合的Cu²⁺仍大量保留，所以仍显示出较深的颜色，这就证明了在相同电场力作用下含硒蛋白与不含硒蛋白对Cu²⁺的保留是有很大差异的，含硒蛋白与Cu²⁺的相互作用力要大得多，这就可以通过控制迁移时间实现选择性检测。

实施例4

图4a所示为本发明用于富硒酵母蛋白双向电泳分离后凝胶进行染色的结果图。

双向电泳的条件和参数如下：取100μl 1.71mg/ml富硒酵母蛋白质样品溶液，加入40μl水化上样缓冲液(8M尿素，4％CHAPS，65mM DTT，0.2％两性电解质，0.001％溴酚蓝)，涡旋混匀，上样至7cm、pH 3-10的IPG胶条上，进行等电聚焦，聚焦程序如表1所示。

表1等电聚焦程序

聚焦完成后将胶条取出进行平衡使蛋白质发生还原和甲基化，分别用缓冲液I(8M尿素，2％SDS，0.375M Tris-HCl(pH 8.8)，20％甘油，2％DTT)和缓冲液II(8M尿素，2％SDS，0.375M Tris-HCl(pH 8.8)，20％甘油，2.5％IAA)平衡胶条各15min。继续用SDS-PAGE进行第二向的分离，采用12％的聚丙烯酰胺分离凝胶(厚度为1mm)。所用的溶液均为新鲜配制。初始电压为80V，待样品在分离胶部分浓缩成一条线时，将电压增大到120V直到电泳完成。电泳后将凝胶取出，其余操作步骤参照实施例2，电迁移的迁移时间为3h。

根据PDQuest软件分析结果，共得到了48个蛋白质点，并一一对其进行了编号，例如4601就是PDQuest分析软件对蛋白点进行的编号。为了证实本方法对含硒蛋白的选择性，可以将染色后凝胶上的所有蛋白质点切下，在浓HNO₃/H₂O₂(1∶1)的作用下将凝胶消解成溶液状态，利用原子吸收光谱法测定其中硒的含量，在测定过程中加入了Ni(NO₃)₂作为基改剂，得到了比较好的线性，测得的数据如表2所示。

表2扣除空白后各个点的硒含量值^b

a：PDQuest软件对各个蛋白质点的编号

b：面积为1.5mm²的空白处(是指两块玻璃板除镂空部分外周围所夹的凝胶部分)凝胶点的硒含量：3.88ng

根据数据可知，所检测到的点全部为含硒蛋白点，但是其硒含量有比较大的差异。这跟酵母在富硒过程中其生物合成硒蛋白的方式有关，不可能所有的蛋白中都含有较大量的硒。这就有力的证明了本发明方法可以对含硒蛋白进行选择性检测。

作为比较，还利用传统的考马斯亮蓝法对同样条件下电泳得到的凝胶进行了染色，所得结果图如图4b所示，根据PDQuest软件分析结果，共得到了103个蛋白质点。经比较，a图左上方部分所出现的蛋白质点明显多于b图，这就可以证明本发明方法对蛋白质染色的灵敏度要高于传统方法。

实施例5

为了进一步证实在实施例4中标记出的蛋白点的确为含硒蛋白，选取其中一个含有蛋白质的凝胶点(4601)，切下以后利用胶内酶切的方法进行酶解，再利用ESI-QTOF对其进行测序。

酶解方法：切下凝胶点置于1.5ml离心管中，首先用500μl水洗2次，每次10分钟，再加0.25M EDTA/0.25M Tris-HCl(pH 9.0)溶液对胶片进行脱色，37℃温育20分钟，重复上述步骤，直到凝胶的颜色褪去。加CH₃CN 50μl脱水至胶粒变自，真空抽干10min。加10mM DTT/25mM NH₄HCO₃混合溶液20μl(其中NH₄HCO₃的作用是给蛋白质酶解提供一个偏碱性环境，又不会使蛋白质结构受到破坏)，56℃水浴1h。冷至室温，吸干，快速加50mM IAA/25mM NH₄HCO₃混合溶液20μl，置于暗室45min。依次用下列溶液进行超声清洗：25mM NH₄HCO₃(2次)、25mM NH₄HCO₃+50％CH₃CN(2次)、CH₃CN(1次)，每次10min。CH₃CN脱水至胶粒变白，真空抽干10min。将0.1μg/μl胰蛋白酶液用25mMNH₄HCO₃稀释10-20倍，每管加4μl，稍微离心一下，让酶液与胶粒充分接触，4℃放置30min。待酶液被胶粒完全吸收，加25mM NH₄HCO₃至总体积15μl，37℃过夜。加入50％CH₃CN(含0.5％甲酸)停止反应，冰浴超声提取肽段。再将全部样品进行微量凝胶透析，以除去其中的杂质和盐类，便于进行质谱分析。

将处理好的样品用50％CH₃CN(含0.5％甲酸)稀释10倍，进行Q-TOF分析。图5a为4601蛋白点酶解后样品的质谱图，插图为质荷比(m/z)为896.4985的峰附近出现的一系列同位素峰；图5b为m/z 896.4985峰的二级质谱碎片峰，标记出的为b和y系列离子以及由此推算出的该蛋白中的一段氨基酸序列。所得的m/z 896.4985峰的二级质谱数据如表3所示。

表3 ESI-MS/MS所得m/z 896.4985峰的二级质谱数据

从所得到的质谱峰数据中可以推断出一段含硒的氨基酸序列，这就更好的证明了利用本发明方法所标记出的蛋白质点均为含硒蛋白点。

本发明所设计的电迁移池在应用过程中，可以随时更换电极缓冲液，防止由于金属还原造成的溶液导电能力下降，并且方便随时清洗电极。整个池子以玻璃为材料制成，既可以防水又耐腐蚀，不易发生各种化学变化。电迁移完成后，由于其中的一块镂空玻璃板可以随时移动，就可以很方便地将迁移完成的凝胶取出，进行清洗以及下一步的染色。迁移过程采用金属铂作为电极，可避免电极本身发生腐蚀，也避免了电极腐蚀溶解后对凝胶和其中的蛋白质造成污染。本发明方法采用铜离子作为迁移离子，由于其比较廉价易得，电极电位又比较合适，可以很容易地镀到阴极上。利用本发明方法，可以对二维凝胶上的含硒蛋白质点进行选择性检测，并且已经经过了实验的证实。另外，本方法也适用于一维电泳后非含硒蛋白质的染色，可以作为一种常规的聚丙烯酰胺凝胶分离后蛋白质染色的方法。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims

1、一种用于蛋白质电泳分离后选择性染色的方法，其特征在于，其步骤包括：

2、根据权利要求1所述的用于蛋白质电泳分离后选择性染色的方法，其特征在于，所述步骤(1)是将分离的蛋白质电泳凝胶从电泳池中取出后，用水反复清洗，再用金属离子的盐溶液浸泡凝胶，取出后用水清洗；所述金属离子的盐溶液其浓度范围为0.1至1.0mol/L，浸泡时间为0.5至3小时；所述电泳是一维电泳或双向电泳。

3、根据权利要求2所述的用于蛋白质电泳分离后选择性染色的方法，其特征在于，所述凝胶为聚丙烯酰胺凝胶；所述金属离子是具有高检测灵敏度的，并且容易在阴极上析出从而除去的过渡金属离子，包括铜、锌、铁或钴；所述金属离子的盐中其酸根为氯离子、硫酸根、磷酸根、甲酸根、乙酸根、丙酸根、丁酸根、草酸根、酒石酸根、苹果酸根、枸椽酸根、抗坏血酸根、苯甲酸根或水杨酸根。

4、根据权利要求1所述的用于蛋白质电泳分离后选择性染色的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的选择性染色是指选择对所有的蛋白质斑点染色时，所述步骤(2)可以通过调整迁移时间，使得电泳凝胶上无蛋白质斑点的基底上的金属离子全部迁移掉，留下与蛋白质斑点结合的金属离子以便随后对其检测；其中所述迁移时间的调整，是在平行实验中，该迁移时间导致用金属离子检测染料显色时，凝胶上没有蛋白质斑点处和蛋白质斑点上所结合的金属离子显色结果对比度达到最大。

5、根据权利要求1所述的用于蛋白质双向电泳分离后选择性染色的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的选择性染色是指选择对目标蛋白质斑点染色时，所述步骤(2)包括：首先采用电迁移方法除去与凝胶基质结合的金属离子，留下与蛋白质斑点结合的金属离子；进一步采用电迁移方法，通过延长迁移时间使只与目标蛋白结合的金属离子保留在凝胶上，再对其进行显色；其中所述迁移时间的延长是在平行实验中，该迁移时间导致非目标蛋白质斑点处的金属离子在采用检测染料显色时观察不到。

6、根据权利要求5所述的用于蛋白质电泳分离后选择性染色的方法，其特征在于，所述的目标蛋白质为含硒蛋白质和/或硒蛋白，所述金属离子为铜离子，所述电迁移的恒定直流电压为2V至50V，迁移时间为4h。

7、根据权利要求1所述的用于蛋白质电泳分离后选择性染色的方法，其特征在于，所述电迁移方法是在包括电极和缓冲液的电迁移池中进行，且包括随时更换电极缓冲液及清洗电极的过程，以及电迁移的过程中用冰浴冷却。

8、根据权利要求1所述的用于蛋白质电泳分离后选择性染色的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述染料为三羟基水杨基荧光酮、双缩脲、铁氰化钾、亚铁氰化钾或二甲酚橙；所述络合剂为EDTA、柠檬酸钠、枸橼酸钠、Tris或NH₃。

9、一种用于蛋白质电泳分离后选择性染色的装置，其特征在于，其包括电泳池和电迁移装置，所述电迁移装置为玻璃板和玻璃胶构制成的电迁移池，所述电迁移池有两块中间镂空的玻璃板，一块采用玻璃胶封固在电迁移池中间，另一块可以移动，需要电迁移的电泳凝胶夹紧在两块中间镂空的玻璃板中间，在电迁移池的两边中充入盐类溶液构成的缓冲液，所述电迁移池的两边中分别放置了一块铂电极，铂电极上施加的直流电压范围为2至50V之间。

10、根据权利要求9所述的用于蛋白质电泳分离后选择性染色的装置，其特征在于所述缓冲液是pH值在2～11、浓度为0.01至0.5mol/L的盐类溶液，所述盐类为铵盐和有机碱类盐的溶液，其中盐的酸根为氯离子、硫酸根、磷酸根、甲酸、乙酸根、丙酸根、丁酸根、草酸根、酒石酸根、苹果酸根、枸椽酸根、抗坏血酸根、苯甲酸根或水杨酸根，其中的有机碱为RNH₂、RR’NH、RR’R”N或三羟甲基氨基甲烷，所述R，R’，R”分别选自CH₃-、C₂H₅-、C₃H₇-、C₄H₉-中的一种。