JPH06502885A - タンパク質染色用組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質染色用組成物及び方法 産業上の利用分野 本発明は合成染料を使用するタンパク質の検出に係る。

より特定的には本発明は新規染料及び、特に電気泳動による分離中に前記染料を 使用してタンパク質を検出及び定量するための新規改良方法に係る。

発明の背景 タンパク質の分析に最も広く使用されている最も強力な方法は、不活性担体に電 界を印加してサンプル中のタンノ（り質を予測可能且つ再現可能な方法で移動さ せることにより担体中のタンパク質を分離する方法である。例えばＧｅＩ　Ｅｌ ｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃ ａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ。

Ｈａ　ｍ　ｅ　ｓ　、Ｂ　、及びＲｉ　ｃｋｗｏｏｄ、Ｄ、＠。

ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｄ、Ｃ。

（１９８９）を参照されたい、一般に、担体はポリアクリルアミド（アクリルア ミドとビスアクリルアミドの重合体）又はアガロース（グルコース単位の重合体 ）のような重合体から製造される。一般にタンパク質サンプルを分離する際には 、個々の成分を分画に従って可視化することができず、分離後、成分は着色染料 を使用して成分を染色することにより検出される。このような染料としては、ア ミドブラックや、クーマシーブリリアントブルー　Ｇ−２５０（登録商標）染料 （カラーインデックス番号４２６５５）（以下の文中ではクーマシープルー　Ｇ −２５０と呼称する）又はクーマシーブリリアントブルー　Ｒ−２５０（登録商 Ｉｆ）染料（カラーインデックス番号４２６６０）（以下の文中ではクーマシー プルー　Ｒ−２５０と呼称する）のようなＣｏｏｍａｓｓｉｅ　（登録商標）染 料を挙げることができる。はとんどすべてのタンパク質は溶液、ポリアクリルア ミドもしくはアガロースゲル又は他の不活性担体中で透明であり、従って視覚的 に検出することができないので、タンパク質を検出するためにはこのような染色 剤が必要である。タンパク質の染色は一般に、分離した成分を含有する担体を完 全に含浸するように染料溶液中に浸漬させた後、受動的拡散又は電気泳動のよう な手段によりタンパク質を含有しない担体の領域から染料を除去することにより 実施される。タンパク質の最大検出感度は、タンパク質に対する染料の親和性及 び染料−タンパク質複合体の消光係数に依存する。一方、ポリアクリルアミド又 はアガロースゲルのような不活性担体中のタンパク質の検出可能な最低レベルは 通常、タンパク質を含有しない担体の領域における染料のレベルをできるだけ低 いレベルに低げ、染色したタンパク質と担体との間に最大の視覚的な相違をもた らした後に決定される。

従来、上記電気泳動分画方法の最も広く使用され且つ許容されている手法は、ド デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）でコートしたタンパク質をポリアクリルアミド 又はアガロース担体中で分離する方法である。このような方法は特にタンパク質 サンプルの純度を決定し、タンパク質と種々の物質との反応を監視し、その後の 免疫学的・、放射線学的・又はタンパク質配列・解析のためにタンパク質サンプ ル又は単一タンパク質のセグメントを分離し、種々の分析方法によりタンパク質 の近縁度を比較するために広く使用されている。ポリアクリルアミドゲル電気泳 動を使用する場合には通常５ＤＳ−ＰＡＧＥと略称されるこの分離方法は、診断 又は治療用のような穐々の最終用途のために少量の純粋タンパク質を単離するた めにも使用されている。５ＤＳ−ＰＡＧＥ又は５ＤＳ−アガロースゲル上で分離 されたタンパク質を検出するには、一般にゲルに放射線を照射し、上述したよう なり−マシーブルー染料などの染料でタンパク質バンドを付随的に染色する。実 際に、５ｅｒｖａ　Ｂｌｕｅ、Ｂｒ１ｌｌｉａｎｔ　Ｂｌｕｅ、Ｃｙａｎｉｎ、 　Ｉｎｄｏｃｙａｎｉｎ及びＥｒ１ｏｓｉｎ　Ｂｒ１１１ｉａｎｔ　Ｃｙａｎｉ ｎ等のような他の名称でも知られているクーマシーブルー染料は、使用し易く且 つ非常に少量のタンパク質を高感度で検出するので、最も一般的に使用されてい る。Ｗｉｌｓｏｎ、Ｃ，、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、９１．　２３６−２４７ 　（１９８３）参照。

当業者は、強力な分画方法を提供するために、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び５ＤＳ−ア ガロースゲル電気泳動の分解能を種々の不活性担体中のタンパ、り質の等電集束 のような他の技術と組み合わせている。これらの技術は通常二次元ゲル電気泳動 （２−Ｄゲル電気泳動）法と呼称され、タンパク質上の固有電荷によりポリアク リルアミド又はアガロース担体上でまず最初にサンプルを分画し、次にタンパク 質サンプルをＳＤＳで被覆後に、分離したポリペプチド鎖を最初の分画の方向に 対して垂直な方向に分画することにより実施される。Ｈａｍｅｓ、Ｂ、及びＲｉ ｃｋｗｏｏｄ、Ｄ。

前出、このような方法は５０００〜１００００のタンパク質成分を同時に分離す ることができ、利用可能な最も強力な分離方法であると主張されている。この場 合も、分画したサンプル中のタンパク質の検出は、分画後の担体をクーマシーブ ルー染料のような染料により染色することにより実施される。

特定の手順では、ＰＡＧＥ又はアガロースゲル電気泳動を実施しながらサンプル 中のタンパク質成分の固有の酵素及び構造特性を維持するように注意が必要であ る。ネイティブゲルとして知られるこのようなゲルは分離したタンパク質のいく つかをその活性（例えば酵素活性）により検出することができる。

５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分画したサンプル中に存在する個々のタンパク質成分 の量は、デンシトメトリー又は結合した染料の溶離後に直接吸収法によりタンパ ク質バンドに結合した染料の量を測定することにより決定することができる。

しかしながら、上述の方法は強力ではあるが、その使用を制限するいくつかの固 有の欠点がある。

Ｓ　Ｄ　Ｓ−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ及びネイティブＰＡＧＥゲル中のタンパク質を染色 するためにクーマシーブルーのような種々の染色剤を使用することができるが、 染色方法は膨大な時間を必要とし、サンプルを望ましくない条件（例えば酸性の ｐＨ又は有機溶媒の存在）に暴露しなければならず、担体中にタンパク質を取り 込み、「固定」すると報告されている。Ｚｅｈｒ、Ｂ、ら、　”Ａ　０ｎｅ−ｓ ｔｅｐ、Ｌｏｗ　Ｂａｃｋｇｒｏｕｄ　クーマシーＳｔａｉｎｉｎｇＰｒｏｃｅ ｄｕｒｅ　ｆｏｒ　Ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　Ｇｅ１ｓ、”　Ａｎａｌｙ ｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

１８２：　１５７−１５９　（１９８９）；　Ｗｉｌｓｏｎ、Ｃ，、”Ｓｔａｉ ｎｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｎ　Ｇｅ１ｓ：　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｓ　ｏｆＤｙｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、”　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ 　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、前出０分離前に分離マトリックスに染料を添加するこ とによりこれらの問題を回避しようと試みた研究者もあったが、このような方法 では担体マトリックス中に存在する染料レベルが低下し、担体に与える色により 低レベルのタン−バク質を検出することができなくなる。Ｓｃｈｒａｇｇｅｒら 、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｍ、１７３．　２０１−２０５　（１９８８）、他の科 学者はゲル担体中のりボタンバク質を検出することが可能な試薬などのような他 の化学的試薬を使用した。しかしながら、これらの方法ではタンパク質の大半を 検出することができず、従って用途が非常に制限される。

従って、担体を濃く染色することなく担体中のタンパク質の全体又はほぼ全体を 検出できるようにするために使用可能な一般的染料が必要とされている。

ある種のタンパク質成分はネイティブゲル中で同定することができるが、担体マ トリックス中のタンパク質の存在はタンパク質の構造的、酵素的又は他の属性に より検出を複雑にするか又は妨げるので、多くのタンパク質はこの方法で容易に 検出することができない、そこで、このような方法を改善するためには、検出を 可能にするタンパク質固有の構造的もしくは酵素的特性又は他の固有特徴に依存 することなく、このようなマトリックス中でタンパク質を検出できるようにする ために使用可能な染料が必要とされている。

デンシトメトリー及び関連方法を使用することによりゲル中でタンパク質を高感 度で定量することができるが、これらの手順ではタンパク質を含有しないゲルの 領域がらゲルマトリックス中の染料を実質的に完全に除去できなければならない 、このためには状況によっては非常に長時間が必要であり、あるいはこの目的に 作成された高価な電気的脱色装置を使用しなければならない、そこで、ゲル担体 中のタンパク質を迅速且つ高感度で検出するために使用することができ、迅速に 除去でき、又はタンパク質を含有しない担体の領域から全く除去する必要のない 染料が要請されている。

最後に、未修飾クーマシーブルー染料を含むある種の染料には、溶液中のタンパ ク質を定量するために染料を使用する場合に非常に酸性の条件を必要とするとい う欠点がある。Ｇｒｏｓｓｂｅｒｇら、　米国特許第４２１９３３７号ＨＢｒａ ｄｆｏｒｄら、米国特許第４０２３９３３号。

このような条件下では不溶性のタンパク質もあるので、このような方法により正 確に測定することができない、従って、よりマイルドなｐＨ条件下でタンパク質 を定量するために使用可能な染料を入手できるならば有利である。

クーマシーブルー染料及びその誘導体については、Ｌｉ１１ｉｅ、Ｃｏｎｎ’ｓ 　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　５ｔａｉｎｓ、第９版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉ ｌｋｉｎｓ　Ｃｏ、、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡ　（１９ ７７＞及びＦｌｅｍｉｎｇ、米国特許第４９６６８５４号も参照されたい。

ダンシルクロリド、フルオレセインインチオシアネート又はフルオレサミン（例 えばＨａｍｅｓ、Ｂ、、Ｇｅ１Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｒｏ ｔｅｉｎｓ第１章：　ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、前出参照） のような蛍光染料（タッグ）を添加することによりタンパク質をゲルに加える前 に修飾するならば、非常に高感度でゲル中のタンパク質を検出することができる 。しかしながら、これらの方法はタンパク質を共有結合的に修飾するので、タン パク質配列解析、又は天然状態の酵素の場合にはタンパク質を酵素として使用す るといったような多数の用途でタンパク質をゲル分離後に使用することができな い、更に、このような共有結合染料はリジンのυアミノ基又はアミノ末端アミノ 酸のαアミノ基のようなアミノ酸の官能基を介してタンパク質に結合するので、 染料は全タンパク質をほぼ同一感度で同様に検出するのでなく、むしろ着目タン パク質のアミノ酸組成に基づいて示差的に染色し、従って検出感度はサンプル中 のタンパク質毎に大幅に変化し得る。従って、染料とタンパク質との共有結合を 介する方法はタンパク質単離にも分析にも広くは使用されていない、タンパク質 に共有結合する染料の代わりを形成し、従って、典型的には異なるタンパク質を ほぼ同一程度まで染色するが、共有結合により得られる感度と同様のタンパク質 検出感度を提供する誘導体を入手できるならば有利である。

免胛座１刀 特に不活性担体を介するタンパク質の電気泳動又は他の分離を伴う用途において 非共有結合複合体を形成することによりタンパク質を染色するための改良染料が 当該技術分野で必要とされているが、本発明はこのような要請に対処するもので ある０本発明は更に、タンパク質を検出するための新規で改善された方法を提供 する。

本発明は、ドデシル硫酸ナトリウムのような洗浄剤の存在下又は不在下で水溶液 中及びポリアクリルアミド又はアガロースゲルのような不活性担体材料中のタン パク質と非共有的に高い親和力で結合し、複合染料の色（即ち（人間の目により ）視覚的に又はスペクトロフォトメトリーにより検出可能な可視範囲の波長の光 吸収）又は蛍光（即ち可視範囲における波長の光の蛍光発光）に基づいて高感度 で検出可能な非共有複合体を形成する新規染料を提供する。

本発明の染料は従来技術で既知のタンパク質染色用染料の誘導体である０本発明 の染料は２つの機能的領域即ち（１）典型的には疎水性の脂肪族又は芳香族炭化 水素セグメントであり且つ染料をタンパク質に高親和性で非共有結合的に結合さ せる結合領域と、（２）色又は蛍光を介して高感度で検出可能なシグナリング領 域とを有する。

本発明の染料は、シグナリング領域を維持しながら疎水性結合領域を付加するか 又は該領域の疎水性を増加させるように従来技術で既知のタンパク質染色用染料 を適切な試薬と反応させることにより製造され得る。従来技術の染料が官能基を 有しており、染料がタンパク質と共有結合する場合、従来記述の染料に対応する 本発明の染料の製造方法は、本発明の染料がタンパク質に非共有結合的にのみ結 合するように官能基を修飾又は脱離する。

本発明者らは驚くべきことに、例えばＣｉ−＋ｓ脂肪族鎖を加え、必要に応じて タンパク質に共有結合する従来技術染料の能力を排除することなどにより、単に 従来技術のタンパク質染色用染料の疎水性を増加させれば、タンパク質を検出す るための本発明の改善方法で使用可能な染料（「疎水性強化染料」）を提供でき ることを知見した。多くの疎水性強化染料は新規であり、これらの染料は本発明 の一部を構成する。

タンパク質を検出するための本発明の１改良方法は、タンパク質と疎水性強化染 料との複合体を形成する段階と、次に、染料−タンパク質複合体が着色される場 合には複合体の色を視覚的もしくはスペクトロフォトメトリーにより検出し、染 料−タンパク質複合体が蛍光性である場合には複合体の蛍光を検出する段階とを 含む、当業者に周知のトランスイルミネーター装置を使用することにより、蛍光 の視覚的検出を容易にすることができる。

サンプル中のタンパク質を検出するための本発明の別の改良方法は、ドデシル硫 酸ナトリウムのような変性剤を含み得るポリアクリルアミド又はアガロースゲル のような不活性担体にタンパク質を含有するサンプル溶液を加える段階と、電気 泳動を使用してサンプルをタンパク質フラクションに分離する段階と、担体上の タンパク質を疎水性強化染料で染色する段階と、染色したタンパク質の染料が着 色される場合には染色したタンパク質を視覚的又はスペクトロフォトメトリーに より検出し、染色したタンパク質が蛍光性である場合には染色したタンパク質の 蛍光を検出する段階とを含む、当然のことながら、蛍光染料を着色し、本発明の このような染料で染色したタンパク質をその色と蛍光との両方により検出するこ とも可能である。

本発明の検出方法は更に、タンパク質サンプル中の１種以上のタンパク質の定量 を含み得る。

本発明の１ｇ様は式Ｘ■： く式中、置換アルキル、未置換アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換 アリールアルキル及び未置換アリールアルキル基から構成される群から選択され た疎水性基Ｈ１１は、−Ｒ，Ｎ　（Ｃ＝Ｏ）−基のカルボニルに結合しており、 Ｒ１，Ｒ２及びＲ３は独立して水素、置換アルキル、未置換アルキル、置換アリ ール及未置換アリール基から構成される群から選択され、Ｒ４及びＲ５は独立し て置換アルキル、未置換アルキル、置換アリール及び未置換アリール基から構成 される群から選択され、Ｒ６は水素、置換アルキル、未置換アルキル、置換アリ ール、未置換アリール、置換アリールアルキル及び未置換アリールアルキル基か ら構成される群から選択される）のクーマシー染料誘導体に係る。疎水性基Ｈ” が活性化−（Ｃ＝Ｏ）−基（例えば活性化エステル又は−（Ｃ＝Ｏ）Ｃ１基）を 含む場合、活性化−（Ｃ＝Ｏ）−基は、単一の疎水性基が式ＸＩの２部分（同一 でも異なってもよい）を結合するように、そのＲ“ＮＨ−基において第２の来訪 導体化り−マシー分子と反応し得る１本発明は更に、誘導体化クーマシー染料の 塩、例えばナトリウム塩にも係る。

式ＸＩ中、典型的な未誘導体化（「未修飾」とも呼称する）クーマシー染料又は その塩（例えばナトリウム塩）において、Ｒ１及びＲ２は独立して水素又はメチ ルであり、Ｒ１は水素であり、Ｒ４及びＲ５はエチルであり、Ｒ６はフェニル又 はエトキシフェニルであり、Ｒ６基に結合した窒素にはアシル基の代わりに水素 が結合している。当該技術分野で最も広く使用されている未修飾クーマシー染料 は、式Ｘ■中、Ｒ２及びＲ１がメチルであり、Ｒ６がエトキシフェニルであるク ーマシーブリリアントブルー　Ｇ−２５０（クーマシーブルー　〇に同じ）、及 び式ＸＩ中、Ｒ２及びＲ３が水素であり、Ｒ６がエトキシフェニルであるクーマ シーブリリアントブルー　Ｒ−２５０（クーマシープルー　Ｒに同じ）である、 未修飾クーマシー染料の最も一般的に使用されている塩はナトリウム塩である。

本発明の別の態様は弐ＸＩＩ： （式中、Ｒ１”４ＪＲ”’、Ｒ’°、Ｒ１２コ及びＲ”’から独立しており、− ＜　ｃ　＝　ｏ　）　ＨＩ　２４又は水素、置換アルキル、未置換アルキル、置 換アリール及び未置換アリール基から構成される群から選択される基であり、Ｒ ”’はＲＩ２’、　Ｒ＋１Ｊ＋２３及びＲ′２４から独立しており、−（Ｃ＝Ｏ ）Ｈ’２ｓ又は水素、置換アルキル及び、未置換アルキルから構成される群から 選択される基であり、）（＋２４及び）ｉｌｍｓはＲ”４及びＲ１２５の各々に ついて独立しており、Ｒ目４が−（Ｃ＝　Ｏ）　Ｈ”’Ｔ：且ツＲ”’が−（Ｃ ＝Ｏ）Ｈ””ｅある場合には、置換アルキル、未置換アルキル、置換アリール、 未置換アリール、置換アリールアルキル及び未置換アリールアルキル基から構成 される群から選択される疎水性基であり、Ｒ１２４が−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ１２’もし く４１Ｒ′２’が−（Ｃ＝Ｑ　）　）（１２％テあるか又はＲ′２４が−（Ｃ＝ ０）Ｈ”’且ツＲＩ２５が−（Ｃ＝Ｏ）Ｈ１２’のいずれか一方であり、Ｒ′２ ’、　Ｒ１２２、）ｊ１２ｆｆは独立して水素、置換アルキル、未置換アルキル 、置換アリール及び未置換アリール基から構成される群から選択される）のアシ ッドブルー　２５誘導体に係る。

Ｒ１２４又はＨ目５基が活性化−（Ｃ＝Ｏ）−基（例えば活性化エステル又は− （Ｃ＝Ｏ）Ｃｌ基）を含む場合、活性化−（Ｃ＝Ｏ）−基は、単一の疎水性基が 式ＸＩＩの２部分（同一でも異なってもよい）を結合するようにそのアミノ又は 置換アミノ基において第２の未誘導体化アシッドブルー　２５分子と反応し得る 。あるいはＨ１′４又はＨ′２’基が活性化−（Ｃ＝Ｏ）−基を含む場合、活性 化−（Ｃ＝Ｏ）−基は、単一の疎水性基が式ＸＩＩの１部分の２つのアミド基を 結合するように同一分子のアミノ又は置換アミノ基と反応し得る０本発明は更に 、誘導体化アシッドブルー２５染料の塩、例えばナトリウム又はアンモニウム塩 にも係る。

式ＸＩＩ中、典型的な未誘導体化もしくは未修飾アシッドブルー　２５染料又は その塩（例えばナトリウム塩）においてＲ”’、　ＲＩ２２．　Ｒ”コ、Ｒ”” 及びＲ１２５はすべて水素である。これはアシッドブルー　２５それ自体の場合 である。

更に別のＲａ！において本発明は式ＸＩ　Ｉ　ＩＡ：ＸエエエＡ （式中、　Ｌ１２−は−ＣＯ，Ｈ部分を担持するフェニル基に疎水性基−Ｈ１− を結きする結合部分である）のフルオレセイン誘導体に係る　Ｌ　ｌ　３　）（ １ｆｆ部分は−ＣＯ，Ｈ部分に対してパラ位（タイプＩＩ異性体）又は−ＣＯ２ ８部分に対してメタ位（より好適なタイプＩ異性体）に位置する。

置換アルキル、未置換アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換アリール アルキル及び未置換アリールアルキル基から構成される群から選択される疎水性 基Ｈ１’に好適に結合する適切な結合基Ｌ′′を提供するために、多数のフルオ レセイン誘導体が当該技術分野で利用可能である。これらのフルオレセイン誘導 体としては、式Ｈ２ＮＨ”の化合物と反応してＬＩｆｆが式−（Ｃ＝Ｏ）（ＮＨ ）−で表されるような弐ＸＩ　ｔ　ＩＡの本発明の染料を提供し得る５−（即ち タイブエ）又は６−（即ちタイプＩＩ）カルボキシフルオレセイン、スクシンイ ミジルエステル：　式ＨＳ　Ｈ１３の化合物と反応して結合基が式−ＣＨ２Ｓ− で表されるような本発明の染料を提供し得る５−（ブロモエチル）フルオレセイ ン；　式Ｈ３Ｈ１′の化合物と反応して結合基が−Ｓ−であるような本発明の染 料を提供し得るフルオレセイン−５−マレイミド；　式ＨＳ　Ｈ”の化合物と反 応して結合基が式−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２Ｓ−で表されるような本発明の染料を 提供し得る５−ヨードアセトアミドフルオレセイン；　式８２Ｎ　Ｈ”の化合物 と反応してし＋３が式−（ＳＯ□）ＮＨ−で表されるような本発明の染料を提供 し得る５−フルオレセインスルホニルクロリド又は６−スルホニルスルホニルク ロリド；　及び以下に記載するように反応して結合基が式−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ −で表されるような本発明の染料を提供し得る５−イソチオシアナトフルオレセ イン又は６−イソチオシアナトフルオレセインを挙げることができる。５−イソ チオシアナトフルオレセインがち製造された染料が最適である。

従って１本発明は［フルオレセインインチオシアネート」誘導体ともみなすこと ができ且つ式ＸＩ　Ｉ　Ｉ　：（式中、上記に定義したような疎水性基−Ｈ”は 「チオ尿素」部分−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−に結合している）で表される［フルオ レセインチオ尿素」誘導体に係る。　−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ一部分は、−ＣＯ２ ８部分に対してバラ又はメタ位（夫々異性体ＩＩ又は異性体Ｉ）に配置される。

式ＸＩＩＩ及び多数の互変異性体を有する化合物に関して本明細書中に記載する 他の構造式において、特に指定しない限り、式は特定の形しか示さない場合であ っても分子の種々の互変異性形のすべてを包含することが当業者には理解されよ う、チオ尿素部分に結合した疎水性基が第１アミノ基を含む場合、第１１ミノ基 は、単一の疎水性基が２つのフルオレセインチオ尿素部分（同一でも異なっても よい）を結合するように、イソチオシアナト基において第２の未誘導体化フルオ レセインインチオシアネート分子と反応し得る。

式ＸＩ　Ｉ　ＩＡ及び式ＸＩ　Ｉ　Ｉ（７）両方においてＲ１３１は（式中、Ｒ ｌ　５５及びＲ１３４は独立してアルキル基から選択される）から構成される群 から選択され、Ｒ１３２はＲ”’が一〇Ｈである場合には酸素であり、Ｒ１″１ がである場合には である１本発明は更にフルオレセイン誘導体である染料の塩にも係り、例えばＲ ”’が−○Ｈ（塩中に０−）である場合には二ナトリウム塩であり、Ｒｌ　ｊ　 ＋がである場合には塩化物塩である。

式ＸｌＴｌ中、典型的な未誘導体化又は未修飾フルオレセインインチオシアネー ト染料又はその塩（例えば二ナトリウム塩又は塩化物塩）において、チオ尿素部 分はインチオシアナト部分で置換され、Ｒ１３１は一０Ｈ１−Ｎ（Ｃ，Ｈｌ）２ （ローダミンＢイソチオシアネート）、又は−Ｎ（ＣＨｚ）ｚ（テトラメチルロ ーダミンイソチオシアネート）である。未誘導体化フルオレセインインチオシア ネート染料はタンパク質と反応して遊離アミノ基にチオ尿素共有結合を形成する 。

別の態様によると本発明は式ＸＩＶ： （式中、スルホンアミド基の窒素には、置換アルキル、未置換アルキル、置換ア リール、未置換アリール、置換アリールアルキル及び未置換アリールアルキル基 から構成される群から選択される疎水性基）（＋４が結合している）の「ダンシ ルクロリドに係る。ＨＩ３基が第１アミ７基を含む場合、第１アミノ基は、単一 の疎水性基が２つのダンシル部分（同一でも異なってもよい）を結合するように 、スルホンアミド基の窒素において第２の未誘導体化ダンシル分子と反応し得る 　Ｒ＋　４１及びＲ１４２は独立して置換アルキル、未置換アルキル、置換アリ ール及び未置換アリール基から構成される群から選択される０本発明は更に、塩 酸塩酸付加塩のようなダンシル誘導体の塩にも係る。

式ＸＩＶ中、典型的な未誘導体化もしくは未修飾ダンシル染料又はその塩（例え ば塩酸塩酸付加塩）において、Ｒ１４１及びＲ１２は同一であり典型的には未置 換のＣ，−、アルキル、最適にはメチルであり、スルホンアミド基はスルホニル ハロゲン化物、通常は塩化物である０周知のダンシルクロリドは、５−（ジメチ ルアミノ）−１−ナフタレンスルホニルクロリドである。未誘導体化染料はタン パク質と反応して遊離アミノ基との間にスルホンアミド共有結合を形成する。

更に別の態様において本発明は式Ｘ■：（式中、−Ｎ−には置換アルキル、未置 換アルキル、置換アリール、未置換アリール、置換アリールアルキル及び未置換 アリールアルキル基から構成される群から選択される疎水性基Ｈ１ｓが結合して いる）のＭＤＰＦ誘導体に係る。

ＭＤＰＦは２−メトキシ−２，４−ジフェニル−３（２Ｈ）−フラノンを意味す る。＝Ｎ−に結合したＨ”基が第１アミノ基を含む場合、第１アミノ基は、単一 の疎水性基が式ｘ■の２部分く同一でも異なってもよい）を結合するようにフラ ン環中の３位のケト基の炭素において第２の来訪導体化合ＭＤＰＦ分子と反応し 得る　Ｒｌ　％　＋は置換アルキル、未置換アルキル、置換アリール及び未置換 アリール基から構成される群から選択される。Ｒ””及びＲ”３は独立して水素 、置換アルキル、未置換アルキル、置換アリール及び未置換アリール基から構成 される群がら選択される。置換アミノ基の存在により塩（例えば酸付加塩）を形 成することが可能なＭＤＰＦの場合、本発明はこのような塩にも係る。

式ＸＶ中、典型的な未誘導体化又は未修飾ＭＤＰＦ染料においてＲ１５１は未置 換アルキル、最適にはメチルであり、Ｒ１５２及びＲ１ｓ’は両方とも水素であ り、＝Ｎ−はフラン環の３位で＝Ｏに置換される０式ＸＶ中、ＭＤＰＦそれ自体 ではＲＩＳＩはメチルであり、ＲＩｓ２及びＲ１５３は両方とも水素である。未 誘導体化ＭＤＰＦ染料はタンパク質と反応して遊離アミノ基との間のシッフ塩基 共有結合を形成する。

免艷立且鳳１１」 本発明は新規染料並びに、タンパク質の検出、分析及び定量におけるこのような 染料の新規使用方法に係る。

本発明は、疎水性の高い修飾又は「誘導体化」染料を得るように場合により修飾 された第１７ミノ基、第２７ミノ基、カルボキシル基、スルホニル基又はインチ オシアナト基のような１個以上の極性官能基を有するタンパク質染色用染料に係 る。これらの（未誘導体化）染料のいくつかは、このような極性官能基を介して タンパク質と共有結合し得る。従って、本発明の新規染料及び本発明の方法で使 用される染料は「疎水性強化」染料である。これらの疎水性強化染料は、タンパ ク質との非共有結合的相互作用によってのみ（即ちタンパク質との間に非共有結 合複合体のみを形成することにより）タンパク質を染色する。

驚くべきことに、疎水性強化染料とタンパク質との相互作用を、対応する未修飾 染料とタンパク質との相互作用に対して改変させると有利であることが知見され た。これらの有利な改変は、ドデシル硫酸ナトリウムのようなタンパク賀変性用 洗剤の存在下でポリアクリルアミド又はアガロースゲルのような不活性担体中の タンパク質を電気泳動により分離することによりタンパク質検出、分析及び定量 を行うために染料を使用する場合に明白である。

本発明の新規方法で使用される疎水性強化染料は、本発明の新規染料を含み、従 来技術の染料と同様に好ましくはトリフェニルメタン染料く及びより具体的には ローザニリン染料）、アシッドブルー２５染料、ダンシル染料、フルオレセイン 染料又は２−メトキシ−２，４−ジフェニル−３（２Ｈ）−フラノン（ＭＤＰＦ ）染料として知られる類の染料の１種から製造される。好ましくは、本発明のト リフェニルメタン染料は修飾（即ち誘導体化）クーマシー染料である。

クーマシー染料及びアシッドブルー２５染料のような本発明で使用されるか又は 本発明の一部である疎水性強化染料の票は、タンパク質を可視的に染色し、即ち 着色された染料−タンパク質複合体を形成し、こうして（直接人間の目で）視覚 的に又は（スペクトロフォトメトリー装置を使用して）スペクトロフォトメトリ ーにより検出することができる。

ダンシル染料、フルオレセイン染料及びＭＤＰＦ染料のような本発明で使用され るか又は本発明の一部を構成する疎水性強化染料の類は蛍光性である。これらの 蛍光染料の多くは更に着色され、例えば当業者に理解されるように「トランスイ ルミネーター」を使用することによりその蛍光を介してより高感度で検出するこ とができる。

本発明の新規な修飾染料及び本発明の方法で使用される他の疎水性強化染料は、 タンパク質の染色゛において対応する極性官能基含有染料にまさる多数の予想外 の利点を有しており、高い疎水性により、タンパク質、特に溶液中のタンパク質 又は電気泳動のような方法でタンパク質サンプルから分離もしくは分画されたタ ンパク質を検出、分析及び定量するための多数の新規で改良された方法を提供す る。

従って、疎水性強化染料はほぼ無色の状態に保たれる担体と架台してタンパク質 に対して改善された親和性を有しており、はぼ透明な背景上に染色されたタンパ ク質のバンドを示すので、例えば蛍光の可視化又は観察により著しく改善された 感度でタンパク質を電気泳動中に検出することができる。

更に、本発明の修飾ローザニリン染料は、例えば他のタンパク質分析（例えば配 列解析）又は定量方法のためにタンパク質サンプルを短時間に調製するために使 用され得る迅速色強化及び脱色法によりタンパク質を高感度で検出及び定量する ことができ、更に未修飾クーマシー染料を使用する場合にこのような目的で必要 であった非常に低いＰ、Ｈに比較して著しくマイルドな約３．５〜約８．５のｐ Ｈで溶液中のタンパク質を高感度で定量できるという、未修飾クーマシー染料に まさる多数の付加的な予想外の利点を有する。

本発明は式■： （Ｘ、）−（ＤＩ）、−（Ｘ２）。　■［式中、Ｄｌは、 （ｉ）式Ｘ： （式中、Ｒｌ　ｌ　、　Ｒ＋　２及びＲ”は独立して水素及びＣ、−、アルキル から構成される群から選択され、Ｒ′４及びＲ＋　５は独立してＣ１−Ｓアルキ ルから構成される群から選択され、Ｒ１６はＣトｚｏアルキル、フェニル、アル キル基が１〜１０個の炭素原子を有するアルコキシフェニル、及びアルキル基が １〜１０個の炭素原子を有するアルキルフェニルから構成される群から選択され る）の部分、 （式中、Ｒ２１及びＲ２２は独立して水素及び−（Ｃ＝Ｏ）−から構成される群 がら選択され、但しＲ２１及びＲ”の少なくとも一方は−（Ｃ−０）−である） の部分、（ｉｉｉ）式ＸＸＸＡ： （式中、−Ｌコ０一部分は＝（ＮＨ）（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−１−８○２ＮＨ−（式中 、スルホニル基の硫黄は−ＣＯ２Ｈ部分を担持するフェニルに直接結合している ）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−（式中、−（Ｃ＝Ｏ）−基の炭素は−ＣＯ，Ｈ部分を担 持するフェニルに直接結合している）　、−ＣＨ２Ｓ−（式中、　Ｃ＋（２−基 の炭素は−ＣＯ，Ｈ部分を担持するフェニルに直接結合している）、−３−１及 び−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２Ｓ　（式中、−（ＮＨ）の窒素は−Ｃｏ、Ｈ部分を担 持するフェニルに直接結合している）から構成される群から選択され且つ−ＣＯ ２Ｈ部分に対してパラ又はメタ位に配置され、Ｒ′３１は一〇）■及び （式中、Ｒ”及びＲ”は独立してＣ３−６アルキルから選択される）から構成さ れる群から選択され、Ｒコ２はＲ３１が−ＯＨである場合には酸素であり、Ｒ” がである場合には である）の部分、 （式中、Ｒ”は水素及びＣＩ−Ｓアルキルから構成される群から選択される）の 部分、及び （Ｖ）式ＬＸＸ： ＬＸＸ （式中、Ｒ１１及びＲ”は独立してＣＩ−１゜アルキルから選択される）の部分 から構成される群から選択され、ｍは各染料分子中の部分Ｄ＋の数であり、１又 は２であり、ｎは各染料分子中の部分ｘ２の数であり、０又は１であり、Ｄｌが 式Ｘで表される場合には、ｍは１であり、ｎはＯであり、Ｘ＋はＣｌ−１゜アル キル、フェニル、ベンジル、任意の１つの位置でＣ１−１゜アルキル、り四口、 ブロモ、ニトロ又はシアンで置換されたフェニル、及びフェニル環上の任！の１ つの位置でＣ＋−ｔＯアルキル、クロロ、ブロモ、ニトロ又はシアノで置換され たベンジルから構成される群から選択され、 Ｄ、が式ＸＸで表される場合には、ｍは１であり、ｎは０（Ｒ２１及びＲ”のい ずれか一方がＨである場合）又は１であり、ｘｌ及びＸ、は独立してＣ５−８゜ アルキル、フェニル、ベンジル、任意の１つの位置でＣ＋−＋。アルキル、クロ ロ、ブロモ、ニトロ又はシアノで置換されたフェニル、及びフェニル環上の任意 の１つの位置でＣ＋−＋。アルキル、クロロ、ブロモ、ニトロ又はシアノで置換 されたベンジルから構成される群から選択され、 Ｄｌが式ＸＸＸＡで表される場合には、ｍは１又は２であり、ｎはＯであり、Ｘ 、は （ｉ　）−Ｘ３−Ｒ”（式中、−Ｘ、−はＣＩ−２゜アルキレニルであり、Ｒ” はＸ、の任意の１つの位置に配置され、水素、ブロモ、クロロ、ヒドロキシル、 −（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ１４、又はｍが２である場合には式ｘｘＸＡの第２の部分との 単結合であり、Ｒ”及びＲＩ４は独立して水素及びＣ＋−ｔＯアルキルから選択 される）、（式中、Ｒ”はブロモ、クロロ、シアノ、ニトロ、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ ”、又はｍが２である場合には式ＸＸＸＡの第２の部分との単結合である） から構成される群から選択され、 Ｄｌが式ＬＸＸで表される場合には、ｍは１又は２であり、ｎは０であり、Ｘ、 は （式中、Ｒ”はブロモ、クロロ、シアノ、ニトロ、−（Ｃ＝０）ＯＲ”、又はｍ が２である場合には式ＬＸＸの第２の部分との単結合である）から構成される群 から選択され、 Ｄ、が式ＸＬで表される場合には、ｍは１又は２であり、ｎは０であり、ｘｌは （ｉ）　Ｘｓ　Ｒ”（式中、Ｒ１はＸ、中の任意の１つの位置に配置され、水素 、ブロモ、クロロ、ヒドロキシル、−（Ｃ＝０）ＯＲ”、又はｍが２である場合 には式ＸＬの第２の部分との単結合である）、 （式中、Ｒ＠７はブロモ、クロロ、シアノ、ニトロ、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ’ｊ、又 はｍが２である場合には式ＸＬの第２の部分との単結合である） から構成される群から選択される〕 の染料又は式■の染料の塩に係る。

本発明は更に、 （Ａ１式■■： （Ｘ＋＋）　（Ｄ＋）−（Ｘｚ）。　ＩＩ［式中、Ｄ、は、 （ｉ）式Ｘ： （式中、Ｒ”、ＲＩ２及びＲ′′は独立して水素及びＣＩ−Ｓアルキルから構成 される群から選択され、Ｒ”及びＲ”は独立してＣ１−、アルキルから構成され る群から選択され、Ｒ１６はＣｌ−２０アルキル、フェニル、アルキル基が１〜 １０個の炭素原子と有するアルコキシフェニル、及びアルキル基が１〜１０個の 炭素原子を有するアルキルフェニルがら構成される群がら選択される）の部分、 （ｉｉ）式ｘＸ： （式中、Ｒ２１及びＲ２２は独立して水素及び−（Ｃ＝０）−から構成される群 から選択され、但しＲ２１及びＲ２２の少なくとも一方は−（Ｃ＝Ｏ）−である ）の部分、（ｉｉｉ）式ＸＸＸＡ： （式中、−Ｌ３０一部分は−（ＮＨ）（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−、−３Ｏ，ＮＨ−（式中 、スルホニル基の硫黄は−ＣＯ２Ｈ部分を担持するフェニルに直接結合している ＞、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−（式中、−（Ｃ＝Ｏ）−基の炭素は−Ｃ０２８部分を担 持するフェニルに直接結合している）　、−ＣＨ，Ｓ−（式中、　ＣＨ２−基の 炭素は−ＣＯ２Ｈ部分を担持するフェニルに直接結合している）、−５−１及び −ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＩ（２Ｓ−（式中、−（ＮＨ）の窒素は−ＣＯ２Ｈ部分を担 持するフェニルに直接結合している）から構成される群から選択され且つ−ＣＯ ２Ｈ部分に対してバラ又はメタ位に配置され、Ｒ”は−ＯＨ及び （式中、Ｒ”及びＲｆｆ４は独立してＣ＋−ｓアルキルから選択される）から構 成される群から選択され、Ｒ”はＲコ１が−ＯＨである場合には酸素であり、Ｒ ”がである場合には である）の部分、 （ｉｖ）式ＸＬ： （式中、ＲＳ　ｌは水素及びＣ１−６アルキルから構成される群から選択される ）の部分、及び （Ｖ）式ＬＸＸ： （式中、Ｒ”及びＲ７２は独立してＣ１−１゜アルキルから選択される）の部分 から構成される群から選択され、ｍは各染料分子中の部分Ｄ１の数であり、１又 は２であり、ｎは各染料分子中の部分Ｘ２の数であり、０又は１であり、Ｄｌが 式Ｘで表される場合には、ｍは１であり、ｎは０であり、ＸｌｌはＣｌ−２゜ア ルキル、フェニル、ベンジル、任意の１つの位置でＣＩ−１゜アルキル、クロロ 、ブロモ、ニトロ又はシアノで置換されたフェニル、及びフェニル環上の任意の １つの位置でＣ、−、。アルキル、クロロ、ブロモ、ニトロ又はシアノで置換さ れたベンジルから構成される群から選択され、 Ｄｌが式ｘＸで表される場合には、ｍは１であり、ｎは０（Ｒ２１及びＲ”のい ずれか一方がＨである場合）又は１であり、Ｘ、及びＸ２は独立してＣＩ−２゜ アルキル、フェニル、ベンジル、任意の１つの位置でＣＩ−１゜アルキル、クロ ロ、ブロモ、ニトロ又はシアノで置換されたフェニル、及びフェニル環上の任意 の１つの位置でＣ１−１゜アルキル、クロロ、ブロモ、ニトロ又はシアノで置換 されたベンジルから構成される群から選択され、 Ｄ、が式ＸＸＸＡ又はＬＸＸで表される場合には、ｍは１又は２であり、ｎはＯ であり、Ｘ、は （ｉ）　ＸｓＲ藝２（式中、　Ｘｓ−はＣＩ−２゜アルキレニルであり、Ｒｏは Ｘ、の任意の１つの位置に配置され、水素、ブロモ、クロロ、ヒドロキシル、 −（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ’コ、又はｍが２である場合には、式ＸＸＸＡの第２の部分（ Ｄ　Ｉが式ＸＸＸＡで表される場合）又は式ＬＸＸの第２の部分（Ｄｌが式ＬＸ Ｘで表される場合）との単結合であり、Ｒ”及びＲ４４は独立して水素及びＣ１ −１０アルキルから選択される）、 （式中、Ｒ”はブロモ、クロロ、シアノ、ニトロ、−（Ｃ＝０）ＯＲ”、又はｍ が２である場合には式ＸＸＸＡの第２の部分（Ｄ、が式ＸＸＸＡで表される場合 ）又は式ＬＸＸの第２の部分（Ｄ、が式ＬＸＸで表される場合）との単結合であ る） から構成される群から選択され、 Ｄ、が式ＸＬで表される場合には、ｍは１又は２であり、ｎはＯであり、Ｘｌ＋ は （ｉ　）　Ｘ３　Ｒ”　（式中、Ｒ藝６はＸ、中の任意の１つの位１に配置され 、水素、ブロモ、クロロ、ヒドロキシル、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ’コ、又はｍが２で ある場合には式ＸＬの第２の部分との単結合である）、 （式中、Ｒ”はブロモ、クロロ、シアノ、ニトロ、−（Ｃ−０）ＯＲ”、又はｍ が２である場合には式ＸＬの第２の部分との単結合である） から構成される群から選択される］ の染料とタンパク質との複合体を形成する段階と、（Ｂ）（ｉ）染料中のＤｌが 式Ｘ又はＸＸで表される場合には複合体中の式ＩＩの染料の存在により複合体の 色を観察することにより、又は（ｉｔ）染料中のり、が式ＸＸＸＡ、ＸＬ又はＬ ＸＸで表される場合には複合体中の式ＩＩの染料の存在により複合体の色又は蛍 光を観察することにより、複合体を検出する段階とを含む、タンパク質の検出方 法に係る。

更に本発明は、 （ａ）タンパク質を含有するサンプル溶液をポリアクリルアミド又はアガロース ゲルに加える段階と、（ｂ）電気泳動を使用してサンプルをタンパク質フラクシ ョンに分離する段階と、 （ｃ）担体上のタンパク質を弐■Ｉ： （ｘｚ）−（ＤＩ）、−（Ｘ２）。　ＩＩ［式中、Ｄｌは、 （ｉ）式Ｘ： （式中、Ｒ”、Ｒ”及びＲ”は独立して水素及びＣ５−、アルキルから構成され る群から選択され、Ｒ１４及びＲＩＳＧよ独立してＣｌ−６アルキルから構成さ れる群から選択され、Ｒ１６はＣ１−２゜アルキル、フェニル、アルキル基が１ 〜１０個の炭素原子を有するアルコキシフェニル、及びアルキル基が１〜１０個 の炭素原子を有するアルキルフェニルから構成される群から選択される）の部分 、 （ｉ　ｉ）式Ｘｘ： （式中、Ｒ２′及びＲ”は独立して水素及び−（Ｃ＝Ｏ）−から構成される群か ら選択され、但しＲ”及びＲ”の少なくとも一方は−（Ｃ＝Ｏ）−である）の部 分、（ｉ　ｉ　ｉ）式ＸＸＸＡ： （式中、−Ｒ３０一部分は−（ＮＨ）（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−５−３Ｏ２ＮＨ−（式中 、スルホニル基の硫黄は−ＣＯ，Ｈ部分を担持するフェニルに直接結合している ）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−（式中、−（Ｃ＝Ｏ）−基の炭素は−ＣＯ２８部分を担 持するフェニルに直接結合している）、−ＣＨ２Ｓ−（式中、−ＣＨ，−基の炭 素は−ＣＯ２Ｈ部分を担持するフェニルに直接結合している）、−５−１及び− ＮＨ（Ｃ＝０）ＣＨｚＳ　（式中、−（ＮＨ）の窒素は一〇〇、Ｈ部分を担持す るフェニルに直接結合している）から構成される群から選択され且つ−ＣＯ２Ｈ 部分に対してパラ又はメタ位に配置され、Ｒ”は−ＯＨ及び （式中、Ｒ”及びＲ３４は独立してＣ＋−Ｓアルキルから選択される）から構成 される群から選択され、Ｒ”はＲ”が−〇Ｈである場合には酸素であり、Ｒ″′ がである場合には である）の部分、 （ｉｖ）式ＸＬ。

（式中、Ｒ”は水素及びＣ１−、アルキルから構成される群から選択される）の 部分、及び （Ｖ）式ＬＸＸ： （式中、Ｒ”及びＲ”は独立してＣ１−１゜アルキルから選択される）から構成 される群から選択され、ｍは各染料分子中の部分Ｄ１の数であり、１又は２であ り、ｎは各染料分子中の部分Ｘ２の数であり、０又は１であり、Ｄｌが式Ｘで表 される場合には、ｍは１であり、ｎは０であり、ｘ３．はＣ、−、。アルキル、 フェニル、ベンジル、任意の１つの位置で０１−１゜アルキル、クロロ、ブロモ 、ニトロ又はシアンで置換されたフェニル、及びフェニル環上の任意の１つの位 置でＣｌ−１０アルキル、クロロ、ブロモ、ニトロ又はシアノで置換されたベン ジルから構成される群から選択され、 Ｄｌが式ＸＸで表される場合には、ｍは１であり、ｎは０（Ｒ２１及びＲ２２の いずれか一方がＨである場合）又は１であり、Ｘｌ＋及びＸ２は独立してＣ３− ２゜アルキル、フェニル、ベンジル、任意の１つの位置で０１−１゜アルキル、 クロロ、ブロモ、ニトロ又はシアノで置換されたフェニル、及びフェニル環上の 任意の１つの位置で０１−１゜アルキル、クロロ、ブロモ、ニトロ又はシアノで 置換されたベンジルから構成される群から選択され、 ＤＩが式ＸＸＸＡ又はＬＸＸで表される場合には、ｍは１又は２であり、ｎは０ であり、Ｘｌ＋は（ｉ）Ｘ３　Ｒ藝２（式中、−Ｘ３−はＣ１−２゜アルキレニ ルであり、Ｒ”はＸ、の任意の１つの位置に配置され、水素、ブロモ、クロロ、 ヒドロキシル、 −（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ”、又はｍが２である場合には、式ｘｘＸＡの第２の部分（Ｄ Ｉが式ＸＸＸＡで表される場合）又は式ＬＸＸの第２の部分（Ｄｌが式ＬＸＸで 表される場合）との単結合であり、Ｒ”及びＲ”は独立して水素及びＣ１−５゜ アルキルから選択される）、 （式中、Ｒ１はブロモ、クロロ、シアノ、ニトロ、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ”、又はｍ が２である場合には式ＸＸＸＡの第２の部分（ＤＩが式ＸＸＸＡで表される場合 ）又は式ＬχＸの第２の部分（Ｄ　＋が式ＬＸＸで表される場合）との単結合で ある） から構成される群から選択され、 Ｄｌが式ＸＬで表される場合には、ｍは１又は２であり、ｎは０であり、Ｘ、は （ｉ）　Ｘｓ　Ｒ”（式中、ＲＯはＸ、中の任意の１つの位置に配置され、水素 、ブロモ、クロロ、ヒドロキシル、−（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ”、又はｍが２である場合 には式ＸＬの第２の部分との単結合である）、 （式中、Ｒ”はブロモ、クロロ、シアノ、ニトロ、−（Ｃ，＝Ｏ）ＯＲ’コ、又 はｍが２である場合Ｇ：番よ式ＸＬの第２の部分との単結合である） から構成される群から選択される］ の染料で染色する段階と、 （ｄ）（ｉ）染料中のＤｌが式Ｘ又はＸｘで表される場合には複合体中の式ＩＩ の染料の存在により複合体の色を観察することにより、又は（ｉｉ）染料中のＤ １力く式ＸＸＸＡ、ＸＬ又はＬＸＸで表される場合には複合体中の式ＩＩの染料 の存在により複合体の色又は蛍光を観察すること（こより、染色されたタンパク 質を検出する段階とを含む、サンプル中のタンパク質の検出方法にも係る。

本発明は更に、タンパク質を電気泳動させたポリアクリルアミド又はアガロース 担体中のタンパク質の検出方法にも係り、該方法は、 （Ａ）担体中のタンパク質を式ＩＩＩ：（式中、Ｒ”、Ｒ”及びＲ”は独立して 水素及びＣ５−、アルキルから構成される群から選択され、Ｒ１及びＲ”は独立 してＣ，−Ｇアルキルから構成される群から選択され、Ｒ１６はＣ１−２゜アル キル、フェニル、アルキル基が１〜１０個の炭素原子を有するアルコキシフェニ ル及びアルキル基が１〜１０個の炭素原子を有するアルキルフェニルであり、Ｘ Ｉ２はＣ，−、。アルキル、フェニル、ベンジル、任意の１つの位置でＣ１−３ ゜アルキル、クロロ、ブロモ、ニトロ又はシアノに置換されたフェニル、及びフ ェニル環上の任意の１つの位置でＣ＋−＋。アルキル、クロロ、ブロモ、ニトロ 又はシアノに置換されたベンジルから構成される群から選択される）の部分であ る］ の染料で染色する段階と、 ＣＢ）約３未満のｐＨを有する水溶液に担体を浸漬する段階と、 （Ｃ）染色したタンパク質を可視化する段階とを含む。

式ＩＩの染料は疎水性強化染料の例である０式Ｉの疎水性強化染料は本発明の新 規染料の例である。

Ｄｌが式Ｘで表される染料はクーマシー染料である。Ｄｌが式ｘｘで表される染 料はアシッドブルー　２５染料である。ＤＩが式ＸＸＸＡで表される染料はフル オレセイン染料である。ＤＩが式ＸＬで表される染料はＭＤＰＦ染料である。Ｄ 、が式ＬＸＸで表される染料はダンシル染料である。

本発明のより好適なり−マシー染料において、Ｒ１１，Ｒ目及びＲＩ　２は独立 して水素及びＣＩ−１アルキルから構成される群から選択され、Ｒ”及びＲ１５ は独立してＣＩ−１アルキルから構成される群から選択され、Ｒ１はＣ＋−ｚ。

アルキル、フェニル、アルキル基が１〜１０個の炭素原子を有するアルコキシフ ェニル及びアルキル基が１〜１ｏの炭素原子を有するアルキルフェニルがら構成 される群がら選択され、ＸＩはＣト、。アルキル、フェニル、ベンジル、任意の １つの位置でＣ、、。アルキル、クロロ、ブロモ、ニトロ又はシアノに置換され たフェニル、及びフェニル環上の任意の位置でをＣ＋−＋。アルキル、クロロ、 ブロモ、ニトロ又はシアノに置換されたベンジルから構成される群から選択され る。

本発明の別のより好適なり−マシー染料において、ＲＩｌ及びＲ”は両方とも水 素であるが又は両方ともメチルであり、Ｒ”は水素であり、Ｒ”及びＲＩｓは両 方ともエチルであり、Ｒ”はエチル又はエトキシフェニルであり、ｘｌはＣ６− ２゜アルキル及びフェニルがら構成される群から選択される。別のより好適な染 料においてＲ”及びＲ”は両方とも水素であるか又は両方ともメチルであり、Ｒ ”は水素であり、Ｒ”及びＲ”は両方ともエチルであり、Ｒ”はエトキシフェニ ルであり、ｘＩはＣト、。アルキル及びフェニルから構成される群から選択され る。

Ｒ１、Ｒ”及びＲ”がいずれも水素であり、Ｒ目及びＲ１５が両方ともエチルで あり、Ｒ目がエトキシフェニルであり、Ｘｌがｎ−へブチルであるクーマシー染 料はＰｒｏｍｅｇａ　Ｇｒｅｅｎｌと呼称される。ＲＩｌ、ＲＩ２及びＲ”がい ずれも水素であり、Ｒ口及びＲ”が両方ともエチルであり、Ｒ”がエトキシフェ ニルであり、ＸＩがメチルであるクーマシー染料はＰｒｏｍｅｇａ　Ｇｒｅｅｎ ２と呼称される。Ｒ１１、Ｒ”及びＲ”がいずれも水素であり、Ｒ”及びＲＩ５ が両方ともエチルであり、Ｒ目がエトキシフェニルであり、Ｘｌがｎ−ウンデシ ルであるクーマシー染料はＰｒｏｍｅｇａ　Ｇｒｅｅｎ３と呼称される。

本明細書中で使用される「アルキル」基なる用語は炭素数に関して以外は制限な く、場合によりアルキル基で置換された直鎖、枝分かれ鎖又は環状アルキル基を 意味する。

本発明のアシッドブルー　２５染料のうちで本発明の方法で使用するのに好適な 染料は、ｎが０又は１であり、Ｘ口及びＸ２が独立してＣ＋−Ｂｎ−アルキルか ら選択されるような式ＩＩの染料である。より好適なアシッドブルー２５染料に おいてｎは１であり、Ｘｌ＋及びＸ２はへブチルである。

本発明のフルオレセイン染料のうちでは、Ｄ、が式ＸＸＸ　： ＸχＸ （式中、−（ＮＨ）（Ｃ＝Ｓ）Ｎｌ（一部分は−ＣＯ２Ｈ部分に対してメタ位に 配置される）の部分であるような式ＩＩのフルオレセインチオ尿素又はフルオレ セインイソチオシアネーｌ−誘導体が好適である。より好適なフルオレセインチ オ尿素染料において、Ｒ”は−ＯＨであり、Ｘｌ、はＣ１−２゜アルキル及び から構成される群から選択される。フルオレセインチオ尿素染料のうちでは、Ｘ 、がＣ１−１□ｎ−アルキル、式ＸｘＸの２つの部分を結合する単結合、−（Ｃ ＝Ｏ）ＯＲ”（式中、Ｒ”は水素又はＣ１−、アルキルである）、及び式ＸＸＸ の２部分を結合する から構成される群から選択されるような染料が好適である。

更にフルオレセインチオ尿素染料のうちでは、Ｘ、がｎ−オクチル、ｎ−ドデシ ル、 及び式ＸＸＸの２部分を結合する から構成される群から選択されるような染料が好適である。

本発明のＭＤＰＦ染料のうちでは、−Ｘ３−Ｒ”がＣ５−２゜アルキル、フェニ ル及びベンジルから構成される群から選択される式ＩＩの染料が好適である。よ り好適なＭＤＰＦ染料は、Ｒｓｌがエチルであり、　Ｘ３　Ｒ”がＣ＋−Ｂｎ− アルキルであるような染料である。

本発明の方法で使用するのに好適な本発明のダンシル染料は、Ｒ”及びＲ７２が 両方ともメチルであり、Ｘｌｌが０１−７゜アルキル及び から構成される群から選択される式ＩＩの染料である。ダンシル染料のうちでは 、ＸｌｌがＣ、−、□アルキル、−＜Ｃ＝０）ＯＲ”（式中、Ｒ”は水素又はｃ ｌ−、アルキルである）及び２部分を結合する から構成される群がら選択されるような染料がより好適である。ダンシル染料で 使用するには更に、Ｘ、がＣ，−，２ｎ−アルキル、 及び２部分を結合する から構成される群がら選択されるような染料がより好適である。ダンシル染料で はＸｌｌがＣ，−，２ｎ−アルキルがら構成される群から選択される類が最適で ある。

式■（又は式ＩＩ又はＩＩＩ）のクーマシー染料は、製造しようとするクーマシ ー染料と同一の置換基Ｒ”、　Ｒ１２゜Ｒ”、Ｒ’４．Ｒ１’及びＲ”を有する が、製造しようとする染料中の置換基−（Ｃ＝Ｏ）ｘ＋　（又は−（Ｃ＝Ｏ）Ｘ 、。

又は−（ｃ＝ｏ）Ｘ＋ｚ）の代わりに水素を有する対応する化合物を出発物質と することにより、当業者により容易に合成される。これらの出発物質はトリフェ ニルメタン染料又はその単なる誘導体であり、その製造方法は周知であるので、 当業者により容易に製造され、実際にそのうちの多く（例えばクーマシープルー 　Ｒ及びクーマシープルー〇）は市販されている。

式■（又はＩＩ又はＩＩＩ）のクーマシー染料を製造するためには、有機化学業 者に周知の方法を使用して対応する化合物を対応するシルクロリド又は酸無水物 のような対応するアシル化剤で処理する。アシル化反応に好適な溶媒はピリジン であり、反応は該溶媒を大気圧で還流させると首尾よく行われる。

式Ｉ（又は式ＩＩ）のアシッドブルー　２５染料は、Ｘｌ及びＸ２以外は所望の 化合物と同一の置換基を有する対応するアシッドブルー　２５化合物を出発物質 として開始することにより、式■のクーマシー染料と同様に当業者により容易に 合成される。対応するアシッドブルー２５化合物は公知であり（例えばアシッド ブルー２５それ自体）、あるいは常法を使用して当業者により容易に製造される ６本発明の所望のアシッドブルー２５染料を得るためには、クーマシー染料と共 に使用されている方法と近似する方法により対応するアシッドブルー２５化合物 を対応するアシル化剤でアシル化する。Ｘ、がＸ２と異なる場合には、Ｘ、を提 供するためのアシル化剤とＸ２を提供するためのアシル化剤との２種類のアシル 化剤を使用する。

アシル化反応によりクーマシー又はアシッドブルー２５誘導体を製造後、過剰の アシル化剤を（例えばメタノール又は水の添加により）破壊する段階と、（例え ば回転蒸発により）溶媒を除去する段階を実施する。蒸発後、メタノール又はメ タノール濃度的２５％（Ｖ　／　Ｖ−）以上のメタノール水溶液のような適切な 溶媒に残渣をとり、形成された溶液を後述する実施例に記載するように典型的に はく電気泳動で使用される緩衝溶液を含む）アルコール又は水溶液で更に希釈後 、タンパク質染色に使用することができる。

あるいは、過剰のアシル化剤の除去及び（ピリジンの場合には、回転蒸発後、ト ルエンで１回又は２か共沸蒸留することにより）溶媒の除去後、常法（例えばシ リカゲル上の薄層クロマトグラフィー、シリカゲルカラムクロマトグラフィー） により誘導体を単離することができる。単離した誘導体を次に適切な溶媒（例え ば１：１メタノール：水）にとり、形成された溶液を実施例に記載するように典 型的には（電気泳動で使用される緩衝溶液を含む）アルコール又は水溶液で更に 希釈後、タンパク質染色に使用することができる。

式■（又は式ＩＩ）のフルオレセインチオ尿素染料、弐Ｉ（又は式ＩＩ）のＭＤ ＰＦ染料、又は式ｌ（又は式ＩＩ）のダンシル染料は、対応するフルオレセイン インチオシアネート（即ち−ＮＨ（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ一部分をインチオシアナト部分 に置換した以外は式ｘｘＸと同様の化合物）、ＭＤＰＦ　（即ち＝Ｎ−を＝０に 置換した以外は式ＸＬと同様の化合物）又はダンシル染料ド（即ち−（ＳＯｚ） ＮＨ−をスルホニルクロリド又はスルホニルプロミドに置換した以外は式ＬＸＸ と同様の化合物）から夫々容易に合成され、これらの化合物はフルオレセインチ オチ尿素又はダンシル染料の場合は式（ＨＮＲ”）Ｘ、Ｒ”（式中、ＲｌＩは水 素又はＣ１−１゜アルキル（好ましくは水素）である）のアミンであり、ＭＤＰ Ｆ染料の場合は式（Ｎ　Ｈ２）　ｘ　ｓ　Ｒ６６のアミンである６反応は極性有 機溶媒又はこのような溶媒（例えばアセトン、ジメチルホルムアミド（即ちＮ、 Ｎ−ジメチルホルムアミド））の混合物又は水とこのような溶媒との混合物中で 塩基性条件下で室温で適切に実施される１反応条件の例は後述する実施例に示す 、その後、必要に応じて常法（例えばシリカゲルカラムクロマトグラフィー、薄 層クロマトグラフィー）を使用して所望のフルオレセインチオ尿素誘導体、ＭＤ ＰＦ誘導体又はダンシル誘導体を単離することができる。単離した誘導体を次に 後述する実施例に詳細に記載するように染色で使用するために適切な溶媒、典型 的にはエタノール、メタノール又はその水溶液にとる。

あるいは同様に後述する実施例に記載するように、誘導体を合成した反応混合物 を単にこのような溶媒（例えば１０％メタノール水溶液）で約１０倍〜約１００ ０倍に希釈し、誘導体を形成した反応混合物から誘導体を精製する必要なくタン パク質染色に使用することができる。

上記記載から当業者に容易に理解されるように、本発明は更に本発明の新規染料 の塩及び本発明の方法における疎水性強化染料の塩の使用にも係る。「塩」なる 用語は、当該技術分野で理解されるように、本発明の中性（即ち無帯電）化合物 （複数の帯電基が全体としてＯの正味電荷を有する場合であっても）と別の中性 塩形成化合物、典型的にはａｌｌ（例えばＨＣＩ）又は塩基（例えばＮａ０Ｈ） とを結合した化合物を意味する１例えば、Ｘ、中にアミノ基を含まないクーマシ ー染料、ＸＩ中にアミノ基を含まないフルオレセインチオ尿素染料（Ｒ３＋が一 ０Ｈ）及び両方の窒素がアシル化され且つＸ１中にもＸ２中にもアミノ基を含ま ないアシッドブルー２５染料の塩としては、ナトリウム、カリウム、マグネシウ ム、カルシウム、アンモニウム、モノ、ジ５トリ又はテトラアルキル置換アンモ ニウム等との塩を挙げることができる。ナトリウムが好適である。例えば、更に ダンシル染料、フルオレセインチオ尿素染料（Ｒ３１はジアルキルアミノである ）、両方の窒素がアシル化され且つ２個のアミノ基を含むアシッドブルー２５、 及びｘｌがアミノ基を含むＭＤＰＦ染料の塩としては、ＨＣ１＝ＨＢｒ、Ｗｌ＃ 、メチルスルホン酸、硝酸、リン酸、酢酸、クエン酸、乳酸等との酸付加塩を挙 げることができる。ＨＣＩが好適である。塩は好ましくは「電気泳動的に許容可 能な塩」であり、この用語は、（帯電染料分子以外の）塩のイオンが染料と非共 有結合的にしか反応せず且つタンパク質を分離するために使用される電気泳動用 固体担体を介して電界中でタンパク質よりも著しく迅速に移動することを意味す る１本発明の染料の塩の製造は熟練した化学者には容易であり、中性染料の溶液 を塩基、酸と単に又は、カチオンもしくはアニオンが染料との塩のために意図さ れる夫々カチオンもしくはアニオンであるような塩と単に結合すればよい、形成 された塩の溶液は、場合により（タンパク質電気泳動に使用される標準緩衝溶液 を含み得る）アルコール又は水溶液で更に希釈後、中性染料溶液と同様にタンパ ク質染色に使用することができる。あるいは、中性染料溶液と酸、塩基又は塩と を結合することにより形成された溶液を、染料の所望の塩の溶液から沈殿を生じ るような条件下においてもよい。その後、必要に応じて沈殿した塩を単離及び精 製するために当業者に周知の工程を実施する。タンパク質染色に使用するために は、対応する中性誘導体を固体形態で得る場合とほぼ同様に、沈殿した塩を適切 なアルコール又は水溶液にとることにより処理し、その後、実際に染色に使用す る前に（タンパク質電気泳動用Ｍ衝溶液を含む）アルコール又は水溶液で更に希 釈してもよい。

本明細書中には各酸又は塩基基について１つの陽子化又は未陽子化状態のみを各 々示す特定構造式で種々の染料を示すが、実際の水性系では種々の染料形態は系 の他の成分と動力学的に平衡しており、個々の染料分子上の基は染料の構造式中 に示すものと異なる陽子化状態もとり得ることが当業者に理解されよう、染料の 構造式は染料を全体として示すものであり、特定の分子を示す意図はない。

Ｘｌｌ　Ｘ２．　Ｘｌｌ及びＸ１□基（以下、集合的に「Ｘ基」と呼称する）は 対応する未誘導体化染料と比較して疎水性強化染料の疎水性を増加する。以下の 説明から明らかなように、Ｘ基はタンパク質を含有するゲル又は固体担体を優先 的に染色するようにタンパク質を染色する本発明の染料の能力を（対応する未誘 導体化化合物に比較して）強化するように機能する。Ｘ基は、ゲル又は固体担体 に対する染料の親和性に影響することも、恐らく（対応する未誘導体化化合物に 比較して）この親和性を低下しさえすることもなく、タンパク質に対する疎水性 強化染料の親和性を（同様に対応する未誘導体化化合物に比較して）強化するも のと予想される。

本発明の方法は、タンパク質を検出するための上記疎水性強化染料の使用も包含 し、このような使用では、染料とタンパク質との複合体を着色又は蛍光性に（又 は両方）し、従って、可視化又はスペクトロフォトメトリー又は蛍光検出装置に よりタンパク質を検出することができる。より特定的には、本発明は溶液中のタ ンパク質を検出するため又は当業者に周知の日常的な電気泳動法を使用するため に上記染料を使用する。Ｈａｍｅｓ、Ｂ、及びＲｉｃｋｗｏ。

ｄ、Ｄ、、前出。

「タンパク質」なる用語は、本発明の疎水性強化染料の少なくとも１分子が錯生 成することが可能なポリペプチド、ぺ１チド、放射性及び非放射性標識タンパク 質、糖タンパク質、リポタンパク質、タンパク質成分もしくはサブユニット、タ ンパク質もしくはその混合物の部分的タンパク分解により得られるフラグメント 等を含む任意のタンパク質様物質を意味する。を気泳動用途において、「タンパ ク質」なる用語は典型的且つ好ましくは少なくとも約１０００ダルトンの分子量 を有する。

広義には、本発明によると、流体（例えば生物源に由来する血液もしくは血清、 リンパ液、腹水、尿、微生物もしくは組織培地、細胞抽出物等）、化学的に合成 されたタンパク質を含有すると考えられる溶液、又はこのような生物源からの流 体もしくは化学的に合成されたタンパク質を含有すると考えられる溶液から調製 される抽出物もしくは溶液のサンプルであり得るサンプル中のタンパク質を固体 担体に加える。好ましくは、固体担体はゲルであり、最適にはポリアクリルアミ ド又はアガロースから形成される。固体担体上のタンパク質サンプルをその後、 電気泳動によりタンパク質フラクションに分離する。を気泳動前に疎水性強化染 料を含有するような固体担体を作成してもよいし、あるいはタンパク質フラクシ ョンを担持する担体を、電気泳動後にこのような溶液で染色してもよい。いずれ の場合もタンパク質フラクションのみが染料により実質的に色又は蛍光（又は両 方）を保持するように固体担体を脱色し、タンパク質と錯生成する染料によりタ ンパク質に与えられる色又は蛍光に基づいて、染色されたタンパク質を定性的及 び／又は定量的に検出する。定性的検出では固体担体を直接可視化してもよいし 、蛍光染料の場合にはトランスルミネーターを使用し、又は（蛍光染料の場合は トランスルミネーターを介して）固体担体の写真を使用してもよい。

蛍光強度測定又はタンパク質電気泳動分野で当業者に既知の他の任意の方法を用 いて実施することができる。本発明の好適電気泳動方法ではポリアクリルアミド 担体中でドデシル硫酸ナトリウムを使用する（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、このような 方法は本発明の技術分野で当業者によく知られている。Ｈａｍｅｓ、Ｂ、及びＲ ｉｃｋｗｏｏｄ、Ｄ、前出並びにＷｉｌｓｏｎ、Ｃ，前出。もっとも、本発明は 、三次元構造及び酵素活性のようなタンパク質の固有特性が維持されるネイティ ブゲル（ポリアクリルアミドゲルを含む）を使用して実施することもできる。

本発明の方法の１態様によると、例えば後述する実施例５．７．９．２２及び２ ４に記載するように電気泳動工程中にタンパク質フラクションを可視化できると いう利点がある。本発明のこの特徴は、ゲルがほぼ無色のままに維持され且つ本 発明の染料が分離しているタンパク質フラクションを染色するという事実に起因 する。

本発明の方法の別の態様は、迅速にタンパク質を検出できるという利点を有する １例えば、（実施例５．７及び９に記載するように）ゲルの走査中に可視化可能 な量よりも少量のタンパク質を実施例６．８及び１０に記載するように僅か１〜 ２分で可視化することができる。実施例１２に記載するようにプロトコルをほん の僅か延長するだけで、更に少量のタンパク質を可視化することができる。

本発明の方法の更に別の態様によると、本発明の染料を使用して高感度でタンパ ク質を検出できるという利点がある１例えば、実施例１４及び１５に記載するプ ロトコルによると、夫々溶液及び５ＤＳ−ＰＡＧＥ中のタンパク質を高感度で定 量することができる。

本発明の方法の別の態様によると、ゲルマトリックス内でタンパク質を電気泳動 後に高感度で染色できる１例えば、実施例２７．３０．３１．３４．３７及び３ ９に記載するように少量のタンパク質を蛍光的に観察することができる。

別の！ｇ様によると、本発明は例えば実施９１３２及び３５に記載するようにタ ンパク質種のゲル内染色の適用により、ゲルマトリックス内のタンパク質を蛍光 により更に迅速に検出することができる。Ｎえば本発明の蛍光染料の蛍光を励起 することが可能な光を、電気泳動により分画しているタンパク質種の場所に透過 させるように電気泳動用ゲルを配置した装置を使用することにより、サンプル中 のタンパク質を電気泳動による分離中に蛍光バンドとして観察することができる 。これは、例えば実施例５．７．９．２２及び２４に記載するように本発明の可 視染料を使用すれば可能である。

本発明の疎水性強化染料はタンパク質と共有結合的に相互作用する染料と同程度 までの結合程度でタンパク質稲を区別することはできないが、本発明の染料のう ちで特に帯電基を有するものはタンパク質毎に異なる結合程度を示し、従って、 特定のタンパク質を著しく高感度で検出するために使用することができる。この 点は例えば実施例３７を参照されたい、この示差結合能（及び関連する異なるタ ンパク質の検出感度の差）により、状況によってはタンパク質混合物中から特定 のタンパク質を検出することができる。

本発明のこの態様によると、混合物のタンパク質が相互に完全に分離されない場 合であってもタンパク質混合物中の特定のタンパク質を検出することができる。

本発明の方法は更に、その後の解析に備えて固体担体から染色したタンパク質を 回収する操作も含み得る。一般に、回収はタンパク質の染色バンドを含むゲルを ゲルの残部から切り出し、切り出した部分を当業者に周知の別の処理工程にかけ ることにより実施される０本発明の染料を使用すると、固体担体中のタンパク質 バンドの位置を確認するために当業者に一般に使用されている時間のかかる検出 プロトコルを使用する必要がなくなる。更に、当業者に一般に使用されているプ ロトコルは、担体から回収しようとする所望のタンパク質の望ましくない又は許 容し難い化学的改変を避けるように固体担体を非常に注意しながら取り扱わなけ ればならない１例えばＬｕｊａｎら、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、９１．　２２ ７−２３６（１９８３）参照。

本発明の染料により可能になった方法は、固体担体からタンパク質の回収中に所 望のタンパク質を損傷する危険を著しく少なくする。更に、実施例１９に記載す るようなプロトコルを使用すると、本発明の染料はその後の分析を容易にするよ うに所望のタンパク質を迅速に検出する方法を提供する。こうしてこのような方 法に通常必要な時間のかかる手Ｉｌｌ（Ｈａｍｅｓ、　Ｃｈａｐｔｅｒ　６．　 ｉｎ　Ｈａｍｅｓ及びＲｉｃｋｗｏｏｄ、前出）が不要になる。

本発明の方法で使用される疎水性強化染料は電気泳動中に染色フラクションを可 視化することができるので、ゲル上のタンパク質の位置を観察し、タンパク質バ ンドに隣接して液溜を形成し、タンパク質バンドがこの液溜に捕捉されるように 電気泳動を実施することにより、着目タンパク質バンドを取り出すことが可能で ある。この有利な手順の詳細については実施例１８を参照されたい。

固体担体中で本発明の特定の染料で染色されたタンパク質を電気泳動により分離 した処、驚くべきことに酸性水溶液（例えば５％酢酸）中の担体の懸濁液は染色 したタンパク質と担体とのコントラストを迅速且つ顕著に増加することが知見さ れた。担体を酸性溶液（即ちｐＨ約３未満）に懸濁又は！に露することによりタ ンパク質バンドの可視性を強化するこの方法によると、担体中のタンパク質バン ドの同定及びこのようなバンド中のタンパク質の定量を著しく容易にすることが できる。これについては実施例６．８．１０及び１２を参照されたい。

本発明は更に、溶液中のタンパク質を高感度で定量するための方法を提供し、該 方法は、約３．５〜約８．５のｐＩ（を有する溶液中で本発明のクーマシー染料 をタンパク質と錯生成させる段階と、形成された溶液の光学密度を測定する段階 と、光学密度を既知濃度のタンパク質標準溶液から得られる光学密度と比較する 段階とを含む、当該技術分野で入手可能なり−マシー染料を使用した場合、溶液 中のタンパク質のこのような分析には、被分析タンパク質を損傷する危険の大き い非常に低い溶液ｐＨが必要であった。

溶液中のタンパク質を定量する本発明の方法は例えば、体液中の特定タンパク質 濃度が重要であるような種々の診断（医療診断を含む）用途で有用であり得る０ 本発明の方法は、例えばタンパク質サンプル（例えば体液サンプル）の電気泳動 に用いた担体上で本発明の染料で同定されたバンドから溶液中に溶出している可 能性のある特定の予め選択されたタンパク質に適用することができる。実施例１ ３及び１４参照。

以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するも のではない。

実施例１ プロメガグリーン（Ｐｒｏ＋＊ｅｇａ　Ｇｒｅｅｎ　）　１の合成りマシープル −（Ｃｏｏｓａｓｓｉｅ　Ｂｌｕｅ）Ｒ（Ａｌｄｒｉｃｈ　ＣｈｅｓｉｃａｌＣ ｏ、、ＭｉｌｗａｕｋｅｅＪｉｓｃｏｎｓｉｎ、ＵＳ＾、カタログＮｏ、２０， １ｌ４０−５）（１０，０，０１２モル）をピリジン（１００ｍｌ）と共に同時 蒸発させて水分を除去した。残渣をピリジン（１００ｍ１　）に溶解し、得られ た溶液を還流まで加熱した。還流下で５分後に、塩化オクタノイル（１０ｅ＋Ｉ 、０．０５９モル）を加え、加熱を更に１５分間続けた。３：１クロロホルムご メタノールを溶離液として用いる薄層クロマトグラフィー（Ｔ　Ｌ　Ｃ）により 反応生成物を分析した。このＴＬＣでは、移動速度のより速い生成物への変換が 明らかにされた０反応物質を室温に冷却し、水（１ｍｌ）を加え、得られた溶液 を蒸発乾固させた。

残渣を３：１メタノール：水（４００ｍｌ）に溶解し、ヘキサンで２回抽出した （ＺＸ２００ｍｌ）、　１回目のヘキサン抽出物を３＝１メタノール：水（５０ ｍｌ）で逆抽出した（　ｂａｃｋ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ）、メタノール：水溶液 をプールしてプロメガグリーン１の（ストック）溶液を得た。

実Ｍ例２ プロメガグリーン２の合成 りマシーブル−Ｒ（Ａｌｄｒｉｃｈ、２０，１ｌ４０−５）（Ｌｏ、０．０１２ モル）をピリジンと共に同時蒸発させて水分を除去した。残渣をピリジン（５０ ｍｌ）に溶解し、得られた溶液を還流まで加熱した。無水酢酸（５ｍｌ、０．０ ５３モル）を加え、還流を更に１５分間続けた。

３：１クロロホルム：メタノールを溶離液として用いるＴＬＣにより反応生成物 を分析した。このＴＬＣでは、移動速度のやや遠い生成物への変換が明らかにさ れた１反応物質を室温に冷却し、溶液を蒸発乾固させた。残渣を１＝１メタノー ル：水（１００ｍ１　）に再溶解し、再蒸発させた。

残渣を１：１メタノール：水（６００Ｉｌｌ）に再溶解し、ヘキサンで２回抽出 した（　ｚｘ　３００ｍ１）。最初のヘキサン抽出物を１：１メタノール：水（ １００ｍ１　）で逆抽出した。メタノール：水溶液をプールしてプロメガグリー ン２の（ストック）溶液を得た。

実施例３ プロメガグリーン３の合成 りマシーブルーＲ（Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｅｉａｌ　Ｃｏ、、Ｈｉｌｗａｕ ｋｅｅ、Ｍｉｓｃｏｎｓｉｎ、ｔｌｓ＾、カタログＮｏ、２０，１４０−５）　 （１ｏｇ、０．０１２モル）をピリジン（５０ｅ＋ｌ）に溶解し、得られた混合 物を還流まで加熱した。塩化ラウロイルを２時間の間に数回に分けて合計２７ｍ １　（０，１１７モル）加えた。

３：１クロロホルム：メタノールを溶離液とする薄層クロマトグラフィー（ＴＬ Ｃ）で反応生成物を分析しな、このＴＬＣでは、移動度は殆ど変化せずに青色出 発材料が緑色誘導体に変換されていることが明らかにされた。反応物質を室温に 冷却し、溶液を蒸発乾固させた。

残渣を２：１メタノール：水（７００ａ＋Ｉ　）に溶解し、ヘキサンで２回抽出 した（２Ｘ３００ｍｌ）、最初のヘキサン抽出物を１００鴫１の２：１メタノー ル：水で逆抽出した。メタノール：水溶液をプールしてプロメガグリーン３の（ ストック）溶液を得た。

実施例４ クマシーブルーＲ及びプロメガグリーン１．２．３の分光分析 実施例１．２及び３でそれぞれ形成したプロメガグリーンｌ、２及び３の３種類 の溶液をメタノール：水の１：１溶液中に約５００倍で希釈した。得られた溶液 及びクマシーブルーＲの１２ｇｇ／輸１溶液（１：１メタノール：水中）のスペ クトルを７００〜３４０ｎ−で１＝１メタノール：水に対して記録した。この分 析の結果、クマシーブルーＲ溶液は前記スペクトル範囲に主要吸光ピークを１つ 有し、最大吸光度は５９０ｎ＋＊の近傍にあった。誘導体は総て本質的に同じス ペクトルを示した。

しかしながら、希釈したプロメガグリーン１の最大吸光度はその他の誘導体につ いて観察された吸光度の約２倍であった。誘導体は走査スペクトル領域に２つの ピーク吸光を有していた。主ピークは約６３０ｎｍ、第２のピークは約４４０ｎ ＋＊に見られた。これら３種類のプロメガグリーン染料溶液（１：１メタノール ：水中に１＋５００で希釈したもの）について、６３０ｎ−の近傍のピークで記 録された吸光度は下記の通りである染料　吸光度 プロメガグリーン１　１．６６ プロメガグリーン２１．３フ プロメガグリーン３　０．８３ ここに示したスペクトル（及びクロマトグラフィーの）差は、元のクマシーブル ーＲ染料が確実に誘導体化されたことを立証している。吸光度の差が、誘導体の モル吸光係数の差ではなく誘導体溶液の最終濃度の変化を反映していることは可 能である。

実施例５ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動中のタンパク質の検出におけるプロメガグリーン１の 使用 先行技術の報告で示唆されているように（前出のＳｅｈａｇｇｅｒ、ｔｌ、らの 論文）、５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で使用するゲル成分のＳＯ５濃度が低いと関 連染料による染色が改善されると思われるため、この分析の実施に使用するポリ アクリルアミドゲル及び緩衝液ではＳＯＳ濃度を低下させた。

タンパク質の形成及び電気泳動に使用するための溶液は、（ａｅｎｅ　Ｆｕｓｉ ｏｎｓ、５ｉｌｈａｖｙ、Ｂｅｒ＠ａｎ、Ｅｎｑｕｉｓｔ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　Ｂａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　ｆｌ＠ｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋに記載の実験で示されている指示に下 記の修正を加えて調製した： ａ）上方及び下方ゲル緩衝液成分のＳＯＳ濃度は、ゲル中の最終ＳＯ５濃度が０ ．０５％となるように低下させた。即ち、４×上方ゲル緩衝液の組成は、０．５ Ｍ）リス−ＨＣｌ、ｐＨ６，８，０，２％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム＜ ５ＯＳ）とし、４×下方ゲル鞭衝液の組成は、１．５Ｍ）リス−１１ＣＩ、ｐｌ ！８．８．０．２％（ｗ／ｖ）ＳＯＳとした。

ｂ）電気泳動（電極）ＩＩ衝液のＳＯＳ濃度は最終濃度が０．０４％となるよう に低下させた。即ち、４×電極（アノード又はカソード＞Ｗ衝液は、６０ｇのト リスペースと２８８ｇのグリシンと８ｇのＳＯＳとを水に溶解し、次いで水で５ リツトルまで希釈することによって調製した。「電極」緩衝液は「ランニング（ ｒｕｎｎｉｎｇ）Ｊ　［衝液と称されることもある。

ｃ）２×試料緩衝液のＳＯＳ濃度は、最終ＳＯＳ濃度が１％となるように低下さ せた。即ち、２×試料緩衝液は、０，５１の６−メルカプトエタノールと、　０ ．２５ｍ１の０１％（Ｗ／Ｖ）プロモフェノールブｌレーと、１曽１の１０％（ ｗ／ｖ）ＳＯＳと、３１の水と、５．３曽１の２×グリセロールＷｌｉ液とを混 合することによって調製した。２×グリセロール緩衝液は、１２．５１の４×上 方ゲル緩衝液と２０−１のグリセロールとを混合し、得られた溶液を水で８０１ ＋　Ｉまで希釈することにより調製した。「試料」緩衝液は「充填（ｌｏａｄｉ ｎｇ）　Ｊ　１１衝液と称されることもある。

ｄ　）　ＢＩＯ−ＲＡＤミニプロティンＩｌｔ気泳動装置を用いて電気泳動を実 施し、充填ウェルの底と分離ゲルとの間に１ｃ−の間隙が存在するようにゲルを 注入した。

本明細書に記載の別の電気泳動実験で使用した緩衝液は、該実施例の前述の緩衝 液と同じある。該実施例のように、カソード（又は電極）Ｍ衝液１５０ｍ１中の 染料溶液の調製が指示されている場合には、最初に適量の染料ストック溶液を１ ５０ｍ１のカソード緩衝液に加え、次いで得られた溶液１２５−１を用いて電気 泳動装置のカソード緩衝液チャンバ（容積１２５■１）を充たした。カソード緩 衝液の量を特定せずに、又はカソード緩衝液の量を１２５■Ｉと特定して、カソ ード緩衝液への染料ストック溶液の添加が指示されている場合には、既にカソー ド緩衝液チャンバ内に存在する１２５ｍ１のカソード緩衝液にストック溶液を直 接加えた。

使用した試料は、試料緩衝液に希釈したＰｒｏｍｅｇａ　Ｍｉｄ−Ｒａｎｇｅ　 Ｍｏ１ｅｅｕｌａｒ　Ｗｅｉｇｈｔ　Ｍａｒｋｅｒｓ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃ ｏｒｐ、、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｎ１５ｅｏｎｓｉｎ、ＵＳＡ、カタログＮｏ、Ｖ５ ２３１）　（以後、Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｈｉｄ−Ｒａｎｇｅ　［Ｍｏ１ｅｅｕｌａ ｒ　Ｈｅｉｇｈｔ　］Ｍａｒｋｅｒｓ又は５ｔａｎｄａｒｄｓと称する）を用い て調製した。　Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｍｉｄ−Ｒａｎｇｅ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＷｅ ｉｇｈｔ　Ｍａｒｋｅｒｓは、分子量標準として下記の各タンパク質を約０．５ ｅ＋ｇ／ｍｌ含む溶液である：ホスホリラーゼＢ（見掛は分子量：　９７，４０ ０ダルトン（ｄ））、ウシ血清アルブミン（見掛は分子量：　６６．２００ｄ） 　、グルタメートデヒドロゲナーゼ（見掛は分子量：　５５，０００ｄ）　、オ ボアルブミン（見掛は分子量：　４２，７００ｄ）、アルドラーゼ（見掛は分子 量：　４０，０ＯＯｄ）５カルボニツクアンヒドラーゼ（見掛は分子量：　３１ ，０００ｄ）、大豆トリプシン阻害剤（見掛は分子量：　２１，５００ｄ）及び リゾチーム（見掛は分子量：　１４，４００ｄ）　、希釈の結果、試料溶液２０ μｍ当たり４．２．１．５．１．０及び０．５μｍのマーカー溶液を含む溶液が 得られ、従って各マーカーバンドのタンパク質濃度は試料溶液２０μｍ当たり２ ．１．０．７５．０．５及び０．２５μｇとなった。試料を、１．５１のＥｐｐ ｅｎｄｏｒｆ遠心管内で時々撹拌しながら１０分間９５℃に加熱し、次いでＥｐ ｐｅｎｄｏｒｆ遠心管で２０秒遠心分離して、試料中のタンパク質を確実に変性 させると共に十分に混合した。

前述の別の溶液を用いて前出の参考文献に記載のように３つの１０％５ＯＳ−Ｐ ＡＧＥゲルを注入した。

積層ゲル（ｓｔｉｃｋｉｎｇ　ｇｅｌ　）の重合後に、ゲル中の試料ウェルの形 成に使用したゲルコーム（ｇｅｌ　ｃｏｍｂ）を除去し、ウェル内の非重合溶液 を蒸留水で充填ウェルがら洗い出した。

ゲルを逆さにしてウェルを空にし、前述の試料２０μｍを各ゲル中の５つの連続 的乾燥試料ウェルに充填した。前述のプロメガグリーン１のストックを、電極（ カソード）緩衝ｉ１５０ｍｌ当、？：’）０．２．０　、４　及ヒ０　、６　ｍ 　ｌ＜７）染料ストックノ割合で電極（カソード）Ｍ漬液（ＳＯＳ最終濃度：　 ０．０４％ｗ／ｖ）に希釈した。これらの溶液のうちの１つを用いて、１つのゲ ル中の試料ウェルの充填を完成し、次いで残りの溶液を用いて、対応ゲルの操作 （ｒｕｎ）に使用されるカソード緩衝液チャンバを満たした。このようにして充 填処理したゲルを電気泳動装置に挿入した。カソードチャンバに前述の適当な溶 液を充填した。アノードチャンバには、染料を含まない電極緩衝液を充填し、分 離中に形成されてアノード方向に移動した暗色染料バンドがゲルの底から現れる まで１６０ｖで電気泳動を実施した。この操作の所要時間は約１時間であった。

ゲルの背後に白色プラスチックカードを配置して、ゲルがカソードチャンバ内の 色に妨害されずに見えるようにした。電気泳動中に、バンド当たり２．０及び１ ．０μｇのタンパク質を含むレーンのタンパク質バンドが分離時に可視化され、 操作が終了するまでに、バンド当たり０．７５及び０．５μｇのタンパク質を含 むレーンのバンドの大部分が本質的に透明な背景に対して可視化された。染料濃 度の高いゲルではバンドの検出がやや容易に行われたが、これに伴ってゲル背景 の色が濃くなった。

実施例６ プロメガグリーン１で染色した５Ｏ５−ＰＡにＥゲルにおけるタンパク質染色の 増進 電気泳動分離の終了後に、前述のゲルを５％酢酸中に配置した。１又は２分以内 に、ゲルは明るい緑色の背景を形成したが、タンパク質バンドは急激に黒ずんで 緑色になった。この時点で、試料を有する総てのレーンの総てのタンパク質バン ドが総てのゲル中で可視化された。この場合も、染料濃度を高くすると背景の色 が更に暗くなった。

ゲルを５％酢酸中で一晩インキユベートさせると、ゲルからなる背景中の染料が 溶液中に放出された。タンパク質バンドの色の明度はやや暗くなったように見え た。

実施例７ ＳＤＳ−ＰＡｆ；Ｅ電気泳動中のタンパク質の検出におけるプロメガグリーン２ の使用 プロメガグリーン２が電気泳動中のタンパク質を染色する能力を前述のように（ 実施例５）調べた。但し、プロメガグリーン２溶液は１０．２，０及び３．０ｎ ｌを別個に個々のカソードＭＩＸ液溶液に加えたく各溶液光たり１５０ｍ　ｌの 電極緩衝液）、ゲルは前述のように操作した。電気泳動中にゲルの背後に白色プ ラスチックカードを配置すると、ゲルの操作中にバンド当たり２．０及び１．０ μｇのタンパク質を含むレーンが可視化された。

実施例８ プロメガグリーン２で染色した５ＯＳ−ＰＡＧＥゲルにおけるタンパク質の染色 の増進 電気泳動分離の終了後に、前述のゲル（実施例７）を５％酢酸中に配置した。１ 又は２分以内に、総てのゲルが明るい緑色に変化し、染色されたバンドの色が濃 くなって、０．２５μｇタンパク質／バンドを含むレーンも含めて、総てのタン パク質が可視化された。

一晩インキユベートすると、ゲル中の染料は酢酸溶液中に拡散したが、タンパク 質バンドはやや褪色したように見えた。

実施例９ ＳＯ５−ＰＡＧＥ電気泳動中のタンパク質の検出におけるプロメガグリーン３の 使用 プロメガグリーン３が電気泳動中のタンパク質を染色する能力を前述のように（ 実施例５）調べた。但し、プロメガグリーン３の染料溶液は、０．２．０．３及 び０．５０ｍ１を別個に個々のカソード緩衝液溶液に加えた（各溶液当たり１５ ０１の電極緩衝液）、ゲルは前述のように操作した。を気泳動中にゲルの背後に 白色プラスチックカードを配置すると、ゲルの操作中にバンド当たり２．０及び １．０μｇのタンパク質を含むレーンが可視化された。

実施例１０ プロメガグリーン３で染色した５ＯＳ−ＰＡＧＥゲルにおけるタンパク質の染色 の増進 電気泳動分離の終了後に、前述のゲル（実施例９）を５％酢酸中に配置した。１ 又は２分以内に、総てのゲルが明るい緑色に変化し、染色されたバンドの色が濃 くなって、０．２５μｇタンパク質／バンドを含むレーンも含めて、総てのタン パク質が可視化された。

一晩インキユベートすると、ゲル中の染料の大部分が酢酸溶液中に拡散したが、 プロメガグリーン１の場合よりも多い染料がゲル中に残留していたため、プロメ ガグリーン３の場合の方が背景の色が暗かった。

これらの検査（実施例５〜１０）から明らかなように、プロメガグリーン１は試 験した化合物の中で最も望ましい性質を有していたが、増進方法（実施例６．８ 及び１０）では総ての誘導体が優れた性能を示した。前記増進方法はクマシー染 料も含めて他のいずれのタンパク質染料についても報告されていない。

実施例１１ ＳＯＳ無含有ポリアクリルアミドゲルにおけるプロメガグリーン１の使用 ポリアクリルアミドゲルは、１０％の分離ゲルと３％の積層ゲルとを含み且つ５ ０＋ｍＮ　）リス−）ＩＣＩ％ｐＨ８，０をＩＩ液として含むように調製した。

試料充填溶液は、５０ｍＭ　）リス−〇ＣＩ、ｐＨ８，０に溶解したプロメガグ リーン１と２０％グリセロールとを含むように調製した。ウシ血清アルブミン（ ＢＳ＾）試料とカルボニックアンヒドラーゼ試料とを試料緩衝液に加えた。前記 試料をゲル上に充填し、該ゲルをＢｉｏＲａｄ　Ｍｉｎｉｐｒｏｔｅａｎ　ＩＩ ゲルシステム中に導入した。５０ｍＭ）リス、ｐＨ８，０の電極緩衝溶液を用い て緩衝液チャンバを充たし、装置に１５０ボルトの電圧を印加した。　ＢＳ＾及 びカルボニックアンヒドラーゼ試料は、充填Ｍｗ液液中染料の一部分と結合した 染色バンドとしてゲル中を移動するのが見えた。従って、前記染色はＳＯＳ含有 システムだけで使用すべきものとは限らない。

実施例１２ ゲル中に染料を少ししか残留させずに、プロメガグリーン１でのタンパク質染色 を高速で増進する方法の開発前述のように、タンパク質は、密度測定のような方 法によるタンパク質の定量が正確に且つ短時間で実施されるように、迅速に、そ してゲル背景中に残る染料が殆ど無くなるように可視化できることが望ましい。

このような方法を開発するために、実施例５の方法で１０％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲ ルを幾つか調製し、実施例５と同様の方法で調製した試料を充填した。但し、試 料充填量は５μｍに減少し、溶液は、５μ＋の試料にＰｒｏｍｅｇａ　Ｍｉｄ− ＲａｎＦｉｅ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＨｅｉｇｈｔ　Ｍａｒｋｅｒｓの各タンパク 質バンドが１．０．０．５０．０．２５及び０１２５μｇ含まれるように調製し た。各ゲルの充填は、種々の濃度のタンパク質を含む試料の２つ組パネルが４つ の連続レーンを有するように行った。ゲルを前述のように操作し、２つ組試料パ ネルの間でゲルを切断した。１つのパネルを含むゲルセグメントを下記の各液体 中に配置した・３０−１の２％氷酢酸（Ａ）・３０−１の１０％メタノール中２ ％氷酢酸（Ｂ）；２０％メタノール中２％氷酢酸（Ｃ）；３０％メタノール中２ ％氷酢＊（Ｄ）；３０ｍ１の水（Ｅ）；３０ｍ１の１０％メタノール（Ｆ）；３ ０ｍ１の２０％メタノール（Ｇ）及び３０ｍ１の３０％メタノール（Ｈ）、前記 溶液をゲルセグメントとメントの沈澱を防止すべ（４０ｒｐｎで静かに回転させ た。その後、元の溶液を除去し、下記の液体をゲルセグメントに適用した：液体 Ａ及びＥで処理したセグメントには３０ｍ　ｌの２％酢酸を適用し、液体Ｂ及び Ｆで処理したセグメントには３０１の１０％メタノール中２％酢酸を適用し、液 体Ｃ及びＧで処理したセグメントには３０１の２０％メタノール中２％酢酸を適 用し、液体り及びＨで処理したセグメントには３０鴫１の３０％メタノール中２ ％酢酸を適用した。次いで、前記セグメントを静かに回転させながら（４０ｒｐ ＋ｉ　）室温で６０分間インキュベートした。

その結果、最初に液体Ｅ、Ｆ、Ｇ及びＨで処理したセグメントはいずれも、液体 Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤで処理した対応するセグメントと比べて低い背景染色度を示し た。また、総てのゲルセグメントで総てのタンパク質バンドが可視化された。こ れは、これらの方法を用いれば、バンド中の１２５ｎｇ以下のタンパク質を検出 できることを意味する。また、ゲルの大きさは少し縮小したが、メタノールの濃 度を上げて処理したものは、そのゲルセグメントを最初に酢酸含有溶液で処理し たかどうかには関係なく背景の染色度が低がった。特に、液体セットＨで処理し たセグメントは背景中の残留染料が極めて少なく、存在するタンパク質バンドの 定量に使用し得るものであった。

高感度のタンパク質検出のために開発された別の染料を用いるプロトコルは、染 料を含む溶液中でゲルをインキュベートし、次いで染料を含まない溶液中でゲル をインキュベートする方法を用いることがある。このようなプロトコルが、プロ メガグリーン１を用いる更に低い濃度のタンパク質の検出に使用できるかどうか を決定するために、下記の検査を行った。

実施例５にならって３つの５ＯＳ−ＰＡＧＥゲルを調製した。Ｐｒｏｓｅｇａ　 Ｍｉｄ−ＲａｒＢｉｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｈｅｉｇｈｔ　Ｍａｒｋｅｒｓの 試料を形成し、実施例５と同様に処理した。但し、ゲルに適用する試料の量は５ μｍとし、個々の試料は５μｍの試料中に各タンパク質バンドが１．０．０．５ ．０．２５．０．１２５．０．０８２５．０．０３１２及び０．０１５６μｇ含 まれるように調製した。実施例５と同様に試料をゲル中に充填し、電気泳動にが けた。電気泳動後に、３０．４０又は５０％のメタノールとプロメガグリーン１ ストツク溶液の１　：５０００希釈液とを含む溶液５０翰１中で静かに撹拌しな がらゲルを１０分間インキュベートした。その後、液体を除去し、下記の溶液を ゲルに適用した：前述の３０％メタノール溶液で処理したゲルは、プロメガグリ ーン１ストツクの１：１０，０００希釈液を含む５０端１の３０％メタノール、 ２％酢酸で処理し、４０％メタノール溶液で処理したゲルは、プロメガグリーン １ストツクの１：１０，０００希釈液を含む５０１の４０％メタノール、２％酢 酸で処理し、５０％メタノール溶液で処理したゲルは、プロメガグリーン１スト ツクの１＋１０，０００希釈液を含む５０−１の５０％メタノール、２％酢酸で 処理した。

次いで、ゲルを室温で１０分間、４０ｒｐ翰で静かに回転させた。

その後溶液を除去し、除去した溶液に対応する、但し染料を含まない溶液を５ｋ ｌ適用し、ゲルを室温で１０分間、４０ｒｐ＋＊で静かに回転させた。６０分後 、いずれのゲルも極めて低い背景染色度を示し、バンド当たり６２．５ｎｇのタ ンパク質を含むレーンの総てのタンパク質バンドが可視化された。

このプロトコルは、背景染色を殆ど伴わない極めて少量のタンパク質の検出に使 用し得る。

実施例１３ タンパク質の存在下及び非存在下におけるプロメガグリーン１の吸光に対する溶 液ｐＨの効果 添加したタンパク質の存在下及び非存在下におけるプロメガグリーン１の吸光に 対する溶液ｐＨの効果を、液体１ｍｌ当たりＯ又は１００μｇのタンパク質（ウ シ血清アルブミン（ＢＳＡ））を含む種々の溶液にプロメガグリーン１溶液を１ ：１０００（ｖ／ｖ）で希釈することによって調べた。試験した溶液は、強酸性 のもの（１８ＨＣＩ）、中酸性のもの（２％酢酸）、弱酸性のもの（５０ｍＭ酢 酸アンモニウム、ｐＨ４，０）　、低塩基性のもの（５０ＩＩＭ重炭酸アンモニ ウム、ｐＨ７，８）及び強塩基性のもの（５００陪−トリスペース）である。溶 液の吸光スペクトルを７００〜３４０ｎＭで測定したところ、ピーク吸光度は下 記の通りであった。

タンパク質存在下　タンパク質非存在下溶液　ｗａｘ　ＡＢＳ　ｗ＋ａｘ　＾Ｂ Ｓ強酸性　６４９ｎｓ　Ｏ，２７６４１ｎ輪　０．３９中酸性　６３１０−　〇 、８３　６３５ｎｍ　０．９８弱酸性　６３６ｎ＊　０．４９　６３８ｎｍ　Ｏ ，２５弱塩基性　６３６ｎｍ　Ｏ，４９６３７ｎｍ　Ｏ，２６強塩基性　６３７ ｎ輪０．２２　６３７ｎｗ＋　０．１２８これらの結果は、タンパク質の非存在 下での前記染料の吸光度が溶液のｐＨに対する依存性を示し、従って前記染料を 広範囲のｐＨ指示剤として使用し得ることを明らかにしている。

更に、染料タンパク質複合体は染料のみの場合と異なる吸光度を示す。この効果 は、強酸性溶液で見られるような吸光度の増加、又は弱酸性もしくは塩基性溶液 で見られるような吸光度の低下をもたらし得る。従って前記染料は、染料のみの 場合と比較した染料タンパク質複合体の増加又は減少を測定することによりタン パク質の存在を測定できるタンパク質定量フォーマットで使用し得る。

実施例１４ プロメガグリーン１を用いる高感度溶液タンパク質定量アッセイの開発 プロメガグリーン１を用いる溶液中のタンパク質の高感度定量のフォーマットを 最終的に決定するために、プロメガグリーン１ストツク溶液を、溶液１１１当た り０．５．１ｏ、２０．４０．６０．８０及び１００μｇノタンハク質（−ＢＳ Ａ）を含む０．５Ｍトリスペースに１　：２５０　（Ｖ／Ｖ　’）及び１：１０ ００（ｖ／ｖ）で希釈した。これらの溶液を室温で３時間インキュベートした後 、溶液の吸光度を６３０ｎｗ＋で測定した。

タンパク質濃度　６３０ｎ−での吸光度（μｇ／ｍｌ）　染料希釈度　染料希釈 度１：１０００　１：２５０ ０　０．０７９　０．５４３ ５　０．０８９　０．５１５ １０　０．０５９　０．４７２ ２０　０．０５１　０．４２７ ４０　０．０４８　０．３８６ ６０　０．０４７　０．３５８ ８０　０．０４４　０．３４２ １００　０．０４３　Ｇ、３１７ これらの結果から明らかなように、前記フォーマットは溶液のタンパク質含量を 極めて高い感度で測定するのに使用し得る。

実施例１５ ＳｔｌＳ−ＰＡ（：Ｅ電気泳動によって分離したタンパク質を定量するためのプ ロメガグリーン１の使用 ５Ｏ５−ＰＡ（：Ｅ電気泳動によって分離したタンパク質を定量する場合のプロ メガグリーン１の有用性を下記の方法で立証した。１０％５ＤＳ−ＰＡ（：Ｅゲ ルを実施例５と同様に調製した。Ｐｒｏｓｅｇａ　Ｍｉｄ−Ｒａｎｇｅ　Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｈｅｉｇｈｔ　５ｔａｎｄａｒｄｓを充填緩衝液に希釈して、溶 液５．１中にバンド当たり２．０．１．０．０，５及び０．２５μｇのタンパク 質を含む溶液を調製した。これらの各溶液の２つ組５μＩ溶液を１０分間９５℃ に加熱した後、ゲル中の１０個の試料ウェルのうちの１つに充填した０次いで、 移動染料がゲルの底部から溶離されるまでゲルを１６０■で電気泳動にかけた。

ゲルが脱色され、染色タンパク質からのシグナルが３０％メタノール、４％酢酸 中で９０分間にわたり増加した。

バンド当たり２．０．１．０、Ｏ，Ｓ及び０．２５μｇのタンパク質を含むレー ンからの９７．４．６６．２．５５．０及び４２．７キロダルトン標準の２つ組 バンドの対のうちの１つを、タンパク質を含まないゲル部分からの２つの対照ゲ ルセグメントとして剃刀の刃で切り取った。これらの切断セグメントを、２％Ｓ ＯＳを入れた個々の１．５ｍｌ　Ｅｐｐｅｂｄｏｒｆ管内に配置し、室温で７２ 時間インキュベートした。その後、抽出セグメントから溶液を除去し、酢酸を最 終濃度２％（ｖ／ｖ　）まで加えた０次いで、溶液の６３ｏｎ−での吸光度を測 定した。

６３０ｎｍでの吸光度 タンパク質試料 タンパク質　ブランク　部分　９７ｋＤ６６Ｋｄ５′５ｋＤ４３Ｋｄｌ（μ「／ バンド） ０　．０１８　．０１５ ０．２５　．０３２　．０５２　．０５３　．０４２０．５０　．０５３　．０ ７４　．０６３　．０６４１．００　．０Ｂ３　．１３８　．１０５　．１２６ ２．００　．１２８　．１９２　．１３８　．１９５これらのデータから明らか なように、プロメガグリーン１は５ＯＳ−ＰＡにＥ電気泳動によって分離したタ ンノくり質の定量に使用し得る。この方法は感度が極めて高く、２５００ｇ程度 の微量のタンパク質を定量することができる。

実施例１６ 固定用支持体に移動中のタンパク質をその場で染色するためのプロメガグリーン １の使用 ニトロセルロース、ナイロン、ガラス又はポリビニルジフルオリドのような固定 用支持体の使用は、免疫化学又はタンパク質の配列分析で極めて一般的なことと なって（する。

この種の支持体へのタンパク質の移動中にタン／にり質を染色するためのプロメ ガグリーン１の有用性を立証するために、５ＯＳ−ＰＡ［；Ｅゲルを実施例１５ と同様にＸｌｌ製し、充填し且つ操作した。　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏ＋ａｐ ａｎｙのＴ＋＊ｍｏｂｉｌｏｎ　Ｐ（登録商標）のセグメン１−を１００％メタ ノールで３０秒間湿潤させ、次いで移動緩衝液（ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｂｕｆｆｅ ｒ）　（２５ｓＭ）リスペース、１９２ｍＭグリシン）中で２分間平衡化した。

２つのＨｈａｔ＊ａｎ　３ｍＭシートを移動緩衝液中に浸漬し、これらの部材を 用いて、１つのＷｈａｔｍａｎ紙シートと、５Ｏ５−ＰＡＧＥゲルと、Ｉｍｍｏ ｂｉｌｏｎシートと、最終的Ｎｈａｔｍａｎシートとからなるトランスファーサ ンドイッチを形成した。このサンドイッチをＨｏｅｆｆｅｒ移動装置（ｔｒａｎ ｓｆｅｒ　ａｐｐａｒａｔｕＳ）内に配置し、サンドイッチの１１ｍｏｂｉｌｏ ｎ側が正極方向に向くように配向した。この装置を４℃に配置し、３０分間１０ ■を該装置に印加し、次いで電圧を３０Ｖに上げて更に１２０分間印加した。

次いで前記移動装置を分解すると、ゲルと接触していたＩｍｍｏｂｉｌｏｎメン プランの表面が、バンド当たり２．０及び１．０μｇのタンパク質を含んでいた レーン内で可視タンパク質バンドを示した０次いでＴｍｍｏｂｉｌｏｎメンプラ ンを４５％メタノール、５％酢酸中に２分間浸漬した。この操作によって、■− ｍｏｂｉｌｏｎメンプランに移動したタンパク質の染色が増進され、総ての濃度 のタンパク質バンドが容易に見えるようになった。これらのデータから明らかな ように、前記染料は固定用支持体への電気泳動中にタンパク質を染色するのに使 用し得、またゲル中で見られた増進が前記支持体に移動したタンパク質によって も示され得る。

実施例１７ ゲル電気泳動によって分離したタンパク質の回収におけるプロメガグリーン１の 使用 ゲル電気泳動によって分離したタンパク質の回収におけるプロメガグリーン１の 有用性を下記の方法で立証した。

８％５ＯＳ−ＰＡＧＥゲルを前述のように調製し、レーン当たり４μｇの各タン パク質の濃度でＰｒｏ＋＊ｅｇａ　Ｍｉｄ−Ｒａｎｇｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　 Ｍｅｉｇｈｔ　Ｍａｒｋｅｒｓを充填した。このゲルをカソード緩衝液（１２５ １）中２００μｍのオクチルクマシー（プロメガグリーン１）ストック溶液で１ ６０ｖで操作した。

電気泳動後、９７．６６．５５．４３及び４０キロダルトンのタンパク質を含む ゲルセグメントを４つの連続的レーンから切り取り、細かく切り刻み、０．０２ ％ＳＯＳ　（ｗ／ｖ　）を含むｐＨ７，８の５０℃ｗＮ重炭酸アンモニウムを０ ．５＋ＩＩ＋入れた個々の１．５ｍｌ　Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管内に配置した。こ れらの管を５０℃で１４時間インキュベートした。

その後、前記管をマイクロフユージュ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ　）で１分間回転さ せて、切り刻んだアクリルアミドをペレット化し、０　、４７ｍ　ｌの上清を除 去して新しい１．５ｍｌ管に移した。

溶離タンパク質試料のそれぞれがらの４つの溶液のうち２つを５ｐｅｅｄ−Ｖａ ｅで乾燥し、別の２つをまずマイクロフユージュで３０分間遠心分離することに より５０００ダルトン力ツトオフＮｉｌＮ１１ｌｉ遠心分離濃縮器を介して限外 濾過した。次いで、これらの濃縮溶液を５ｐｅｅｄ−Ｖａｃで乾燥した。

乾燥した試料を２５μｍの１×充填緩衝液に再懸濁し、９５℃で１０分閉放熱し た。これらの試料を、前述のように調製した２　ツ（７）　’）　ｘ　／Ｌ／数 １５．０．７５ｍｍ　１０％５ＯＳ−ＰＡＧＥゲルニ充填した。これらのゲルを 、カソード緩衝液（１２５ｍ１）中のプロメガグリーン１ストツク溶液２００μ ｍで１６０Ｖで操作した。電気泳動後、ゲルを３０％メタノール、４％酢酸中で １時間増進処理した。この時点でゲル中には、所期のタンパク質バンドがレーン 中に見られた。これらのデータから明らかなように、前記染料はゲル電気泳動に よって分離したタンパク質の回収に使用し得る。

実施例１８ 新規の回収方法を使用してゲル電気泳動により分離したタンパク質を回収する場 合の１０メガグリーン１の使用プロメガグリーン１は電気泳動分離中のタンパク 質の染色に使用できるため、ゲル電気泳動によって分離したタンパク質はゲル中 に配置した液体リザーバ内に回収できるものと決定した。これは、その場で染色 したタンパク質についてのみ可能である。そうでない場合には、液体リザーバを どこに配置すべきかが不明だからである。

そこで、８％５ＯＳ−ＰＡ（：Ｅゲルを前述の実施例と同様に調製し、充填し、 操作した。操作終了後、ゲルを包囲しているガラスプレートの１つを除去して、 ９７．６６．４ｏ及び３１キロダルトン標準のすぐ下のゲルから１．ＯＸｏ、３ ｃｍのスロットを切り取った。次いでゲルを、緩衝液チャンバ内に２５１１ＩＭ トリスペース、１９２ｆｆｉＮグリシン（電気泳動緩衝液）を装置の中央の隆起 部分のレベルまで充填したフラットベッド電気泳動装置内に配置した。ゲルは、 残りのガラスプレートの上方のアクリルアミドゲルが電極緩衝液で満たされるよ うに装置内に配置した。前記スロットにも電極緩衝液を充填し、移動緩衝液を含 浸させたｌｌｈａｔｍａｎ　３ｍＭ紙ウィック（ｗｉｃｋ）を用いてゲルと緩衝 液チャンバとを電気的に接続し、装置に１６０ｖを２分間印加した。その後、ス ロット内の［漬液を除去して１．５ｍｌ　Ｅｐｐｅｎｄｏｒ４管内に配置し、前 記スロットに新しい電極Ｉ！衝漬液再充填し、電圧を印加した。このサイクルを 更に３回繰り返し、同一種類のスロットがらの試料をプールし、５ｐｅｅｅ−Ｖ ａｃで乾燥した。

乾燥後、試料を２５μｍの１×試料緩衝液に再溶解した。１０％５ＯＳ−ＰＡＧ Ｅゲルを実施例５と同様に調製した。該ゲル上に試料を充填し、電気泳動を実施 例５と同様に行った。操作終了後、染色を３０％メタノール、４％酢酸中で増進 させた。

ゲルの分析の結果、この方法によって所望のタンパク質バンドが捕捉されていた 。従ってこのプロトコルは、電気泳動後にゲルを染色し、ゲルを脱色し、ＳＤＳ で再平衡化し、又は特別の電気泳動装置を用いてタンパク質を電気溶離（ｅｌｅ ｅｔｒｏｅｌｕｔｅ）する必要を伴わずに、電気泳動によってタンパク質を単離 することができる。この方法では特に、分離タンパク質バンドが初期の電気泳動 分離時に視覚的に見えるという事実によって前記利点が得られる。

実施例１９ タンパク質の部分的タンパク質分解生成物の分析における１０メガグリーン１の 使用 ５ＯＳ−ＰＡＧＥｔ気泳動を用いる部分的タンパク質分解生成物の分析によって タンパク質を比較することは文献に広く記述されている。この分析は、クリーブ ランド（Ｃｌｅａｖｅｌａｎｄ）分析と称し、タンパク質に発生し得る多くの種 類の共有結合変化（ｃｏｖａｌｅｎｔ　ｃｈａｎｇｅ）に関して重要な情報を提 供し得るものである。

前記染料をこの種の分析で有利に使用できるか否かを決定するために、下記の検 査を行った。

８％５ＯＳ−ＰＡＧＥを実施例５と同様に調製した。４μｇの牛血清アルブミン を含み、予め９５℃で５分間加熱した１×充填緩衝液の５μｍ試料を幾つかのウ ェル内に配置し、実施例５と同様に電気泳動を行った。

第２の厚さ１．０−Ｈの１６％５ＤＳ−ＰＡにＥゲルを実施例５と同様に調製し た。

電気泳動後、ＢＳ＾試料を含むゲルのセグメントを剃刀の刃で切り取り、第２の １６％ゲルの試料ウェルのうち３つのウェルに充填した０次いで、それぞれ０． ５μ６のエンドプロテアーゼにｌｕ　Ｃ，０，５μｇのエンドプロテアーゼＬｙ ｓ　Ｃ及び０．１ｇｇのアルカリ性プロテアーゼを含む１×充填ＨＩＩ液２０μ ｍを、ゲル切片の入っている個々のウェルに加えた。更に、予め９５℃で１５分 間加熱した１×充填緩衝液中４μｇＬ：ｒ）ＢＳ＾の溶液５μｍを第２粗目の３ つのウェル内に配置した。これら３つの試料の各々に、それぞれ０．５μｇのエ ンドプロテアーゼＧｌｕ　Ｃ１０，５μ、のエンド１０テアーゼＬｙｓ　Ｃ又は ０．１ｇｇのアルカリ性プロテアーゼを含む個々の溶液を２０μｍ加えた６次い でゲルを、カソード緩衝液（１２５ｍｌ）中に存在するオクチルクマシー（即ち プロメガグリーン１）のストック溶液２００μｍで５０Ｖで操作した。染料バン ドが積層ゲルと分離ゲルとの間の界面に到達した時点で装置への電圧の印加を３ ０分間切断し、その後電圧を再印加し、１６０ｖに調整し、電気泳動を移動染料 がゲルの底部から出現するまで続けた。

この時点で、３０％メタノール、４％酢酸を用いて染色を増進させた。消化試料 の部分的タンパク質分解パターンが極めて短時間で容易に明らかになった。

これらの結果は、プロメガグリーン１の使用がクリーブランドタイプのタンパク 質分析を妨害しないことを示している。これらの結果は更に、前記染料を用いる と、前述のような分析で通常必要とされる染色、脱色及び再平衡化といったステ ップが不要になるため、前記分析が簡単になることをも示している。

実施例２０ アシドブルー２５誘導体の合成 アシドブルー（＾ａｉｄ　Ｂｌｕｅ）２５　（＾Ｉｄｒｉｅｈ　Ｃｈｅ＋５ｉｃ ａｌ　Ｃｏ、。

Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｍｉｓｃｏｎｓｉｎ、ｌｌ５Ａ、カタログＮｏ、２１，０ ６８−４）　（３，０ｇ、７２ｍｍｏｌ）をピリジン（５０曽１　）と共に同時 蒸発させて水分を除去した。残渣をピリジン（１００ｍ１　）に溶解し、得られ た溶液を還流まで加熱した。還流に到達した後、塩化オクタノイル（２，５＋ａ ｌ、２当量）を滴下した０反応はすぐに生起し、混合物の色が青から赤褐色に変 化したことによって示された。５分間反応させた後、４：１クロロホルム：メタ ノール混合物を溶剤として用いてシリカゲルプレートで反応混合物の薄層クロマ トグラフィーを行ったところ、前記混合物は主に、移動速度のより速い２つの生 成物と幾らかの出発材料とを含んでいた。前記反応混合物に更に３当量の塩化オ クタノイルを加え、得られた混合物を更に５分間還流させた。メタノールを加え て過剰な酸塩化物を分解し、次いて最終物質を回転蒸発器内での蒸発により乾燥 した。

少量の前記乾燥物質を２悄１のメタノールに溶解し、染料混合物として使用でき るようにした（ｒ未精製」誘導体化アシドブルー調製物）。

残りの物質をトルエンで２回共沸（ａｚｏｔｒｏｐｉｃａｌｌｙ）蒸留してピリ ジン混入物を除去し、乾燥し、分別して、精製染料として試験した。

実施例２１ アシドブルー２５誘導体の分別 実施例２０で得た精製物質をクロロホルム：メタノール（１０：１）に再溶解し 、１０：１クロロホルム：メタノールを溶離液として用いる３００ｇのシリカゲ ルカラム上に配置した。

フラクションを集め、４：１クロロホルム：メタノールを溶剤として用いるシリ カゲルプレート上でＴＬＣクロマトグラフィーにかけて染料組成を調べた。移動 速度のより速い紫色の主要物質を集め、回転蒸発器で乾燥した。

シリカゲルカラム用の溶離溶剤を４：１クロロホルム：メタノールに変えた。更 に別のフラクションを集めた。これらのフラクションを前述のようにＴＬＣにか けて染料組成を調べ、移動速度のより遅い第２の主要物質（色はチェリーレッド であった）をプールし乾燥した。

実施例２２ ＳＯ５−ＰＡＧＥｉｉ気泳動中のタンパク質検出での未精製アシドブルー２５誘 導体の使用 ３つのゲルを実施例５で説明したように製造した。

Ｐｒｏ＋ｓ＋４ａ　Ｍｉｄ−Ｒａｎｇｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｉｌｅｉｇｈｔ 　５ｔａｎｄａｒｄｓを実施例５に記載の２×試料Ｍ衝液で１×に希釈して、標 準混合物中に存在するタンパク質種を溶液１０μｍ当たりそれぞれ２、■、０． ７５．０．５．０．４．０，３．０．２及びｏ、ｉｐ、含んでいる試料を製造し た。各溶液１０μｍを３つのゲルのレーン内に充填し、それらを、１．０．０． ７５又は０．５％（ｖ／ｖ）の誘導化アシドブルー２５調製物（未精製）を含ん でいるカソード溶液を含む３つの異なるＢｉｏ−Ｒａｄ　Ｍｉｎｉｐｒｏｔｅａ ｎ　ＩＩ　ｇｅｌ　ａｐｐａｒａｔｉ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、 　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　ＵＳＡ）内に入れた１次いで、１５ｍ＾／ゲルの電 流を適用して、試料をゲル内で分画した。タンパク質バンドは、試料が電気泳動 実施中にゲル中で分離するときにゲルを通じて移動する赤バンドとして少なくと も０．４ｙｇ／バンドのタンパク質の検出限界で可視化した。従って、変性染料 によって電気泳動中にタンパク質を視覚化することができる。

実施例２３ ＳＯＳ−ＰＡ（：Ｅ電気泳動中のタンパク質検出での未精製アシドブルー２５誘 導体と未変性アシドブルー２５との比較２つのゲルを実施例５で説明したように 製造した。

Ｐｒｏ＋＊ｅｇａ　Ｍｉｄ　Ｒａｎｇｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｗｅｉｇｈｔ　 ５ｔａｎｄａｒｄｓを実施例５に記載の２×試料緩衝液で１ｘに希釈して、それ ぞれ溶液１０μｍ当たり１μｇのタンパク質を含んでいる試料を製造した。溶液 を９５℃で５分間加熱した。溶液を室温に冷まし、２つのゲルの別々の充填ウェ ルに２０μｍ、１０μＩ、５μｍ及び２．５μ＋の溶液を充填した。ゲルを旧ｏ −Ｒａｄ　Ｎｉｎ１ｐｒｏｔｅａｎ　ＩＩｇｅｔ　ａｐｐａｒａｔｉ内で結合し た。一方のゲル用のカソード緩衝溶液は実施例２０に記載の１％（ν／Ｖ）のア シドブルー２５講導体溶液混合物（未精製）を含み、他方のゲル用のカソード緩 衝液は０．０１％（ｗ／ｖ）の非変性アシドブルー２５を含んでいた１次いで、 １５−＾／ゲルの電流をゲルに適用して試料を分離した。アシドブルー２５の未 精製誘導体をカソード１衝液中に置いたゲルではタンパク質種当たり０．２５μ ｇと低いレベルでタンパク質バンドが見られたが、カソード１衝液中に置かれた 非誘導化アシドブルー２５を有するゲルではタンパク質バンドは見られなかった 。従って、アシドブルー２５の誘導体ではＳ［１Ｓ−ＰＡ（１；Ｅゲル内で分画 するときにタンパク質を視覚化することができたが、出発染料材料（非誘導化ア シドブルー２５）では視覚化できなかった。

実施例２４ ＳＤＳ−ＰＡＧＥｉ気泳動中のタンパク質検出での精製アシドブルー２５誘導体 の使用 ゲルを実施例５で説明したように製造した。

Ｐｒｏ＋＊ｅｇａ　Ｍｉｄ−Ｒａｎｇｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｗｅｉｇｈｔ　 ５ｔａｎｄａｒｄをＩＸ充填溶液（実施例５に記載の２Ｘ充填溶液を希釈して製 造）に希釈して、溶液１０μｍ当たりそれぞれ１０００．８００．６００．４０ ０．２００及び１１００ｎのタンパク質を含んでいる溶液を製造した。

これらの溶液の試料１０μｍをゲル中に充填した。１個のゲルを２つのＢｉｏ− Ｒａｄ　Ｍｉｎｉｐｒｏｔｅａｎ　ＩＩ　Ｈｅｌ　ａｐｐａｒａｔｉの一方内で 結合した６ アシドブルー２５をオクタノイルクロライドと反応させ、次いでシリカゲルカラ ムクロマトグラフィーにかけて得られた精製染料誘導体（実施例２０及び２１） を１００ｍ１の水・メタノール（１・１　、ｖ／ｖ　）に溶解し、これらの溶液 を、再溶解した上方（紫色）の染料誘導体では２％（ｖ／ｖ）、下方（鮮紅色） の染料誘導体では１％（ｖ／ｖ）とする２つのゲルのカソード緩衝液に加えた。

　２０−＾／ゲルで電気泳動して試料を分画した。　３０分後に、タンパク質は 分離ゲル中で分離し始め、ゲルに適用した全てのタンパク質濃度での全てのタン パク質稽で、殆ど全てのバンドを見ることができた。このことは、アシドブルー ２５がら製造したどの主要染料誘導体も５ＯＳ−ＰＡＧＥゲル中で移動するので 、タンパク質の高感度検出のために使用できたことを示している。

実施例２５ ダンジルクロライド誘導体の合成 ３０蒙ｇのダンジルクロライドを１．５＋ｓｌのアセトンに溶解した溶液を、８ ．５ｍｌの１００Ｊリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９，５に加えて、５つの別個の 溶液を製造した。これらの溶液の各々に、以下のアミン：ｎ−ブチルアミン、５ ｅｅ−ブチルアミン、ｔ−ブチルアミン、ｎ−オクチルアミン及びｎ−ドデシル アミンのいずれか一種を０．１５蒙−ｏｌｅ／ｍｌでアセトンに溶解した溶液１ ＋＊ｌを加えた。３０Ｂのダンジルクロライドを１．５ｍｌのアセトンに溶解し た溶液を８．５１の１００ＭＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐｉ（９，５に加え、こ れに１．０＋ｓｌのアセトン及び２０＋Ｈの固体硫酸アンモニウムを加える別の 反応も実施した０反応は室温で１５分間インキュベートして行った。この時間中 に、溶液は以下の特性を示した。

反応物　外観 ｎ−ドデシルアミン　深黄色沈澱物 ｎ−オクチルアミン　白濁溶液 ｔ−ブチルアミン　黄色溶液 他の全ての物質　黄色溶液 反応溶液をア七トンで１５輸１に希釈して、−晩インキユベートした。

溶液試料をシリカゲル薄層クロマトグラフィーのプレート上に滴下して、クロロ ホルムで展開させた。薄層クロマトグラフィーのプレートを展開させ、プレート をトランスイリュミネーター（ｔｒａｎｓｉｌｌｕｍｉｎａＬｏｒ）上に置いて 蛍光種を視覚化した。観測された種の多くは全ての試料中に存在していた。しか しながら、各反応物は、所望される誘導体を示す単一の主要種も示していた。こ の単一種は反応で使用するアミンによって移動度が規則的に変化し、また対照反 応（硫酸アンモニウムでの操作）では存在しないので、これらは望ましい誘導体 であると決定した。

実施例２６ ダンシルクロライト誘導体の精製 実施例２５の各反応溶液２１を別個に、２０ｘ２０ｃｍのシリカゲル薄層クロマ トグラフィー（ＴＬＣ’）のプレート上に調製のために滴下した。クロロホルム を使用して展開させ、トランスイリュミネーター上でのプレートの観測によって プレート上で分離した蛍光種を視覚化した後に、プレートをかみそりの刃でこす って、単一の化学種を含んでいるプレートの区域内のシリカゲルをプレートから 除去し、ゲルを１５１の管に移動させて、１０１のエタノールで溶離した。

−晩溶離した後に、３μｌの溶出液を５ｘ２０ｃｍのシリカゲルのプレートに加 えて、クロロホルムで展開させた。第２のプレート上で分画した蛍光種を視覚化 すると、誘導体が精製されたことが分かった。

誘導体を精製して得られた溶出液の試料をエタノールで２０倍に希釈し、４００ 〜２２０ｎ−で得られた溶液の吸収を測定した。　３２８ｎ−での溶液の吸収を 、実施例２７の染色調査での誘導体の濃度の指針として使用した。

実施例２７ 精製ダンシル誘導体を使用しての電気泳動後のタンパク質の検出 前述のＧｅｎｅ　Ｆｕｓｉｏｎｓ、　５ｉｌｈａｖｙ、Ｂｅｒｍａｎ、Ｅｎｑｕ ｉｓｔによる実験で説明したように、著者の記載するＳＯＳ濃度を使用して、数 種の５ＯＳ−ＰＡＧＥミニゲルを製造した。　Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｍｉｄ　Ｒａｎ ｇｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｈｅｉｇｈｔ　５ｔａｎｄａｒｄｓの試料を前記参考 文献に記載の充填溶液に希釈して、溶液１０μｍ当たりそれぞれ２００．１００ ．５０．２５０及び１２．５ｎｇのタンパク質種を含んでいる溶液を製造した。

これらの溶液をゲル上に充填し、試料用のトラッキング染料がゲルの底部に達す るまでゲル当たり１０−＾を適用して試料をゲル中で分画した０次いで、ゲルを 蒸留水で１分間、１０％トリクロロ酢酸（ｗ／ｖ）で１５分間、次いで１０％メ タノール（Ｖ／Ｖ　）で１５分間洗浄した１次いで分画した標準液を含んでいる 約５ｘ６ｅ糟のゲルセグメントを、０．０５０Ｄ３２ｓ−当量の各ダンシル誘導 体（実施例２６参照）を含んでいる２％エタノール溶液（５０ｍｌ）に移動させ た。

室温で１５分開放置した後に、トランスイリュミネーター上でゲルを視覚的に観 測し、Ｐｏ１ａｒｏｉｄ型６６７フイルムを装填したカメラ（Ｐｏｌａｒｏｉｄ 　Ｃｏｒｐ、、　ＣａｍｂｒｉｄＦｌｅ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ。

ＵＳ＾）を使用して、またＴｉｆＩｅｎ　４０．５　Ｆ１５オレンジフィルター （Ｔｉｆｆｅｎ　Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ　Ｃｏ、、　Ｈａｐｐａｕｇｅ、 　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

ＵＳ＾）を使用して写真を撮った。この時点で、オクチルダンシル誘導体で染色 したゲル上で分画した全ての標準バンドをゲルの写真で容易に視覚化した。ドデ シルダンシル誘導体で染色したゲルの２００ｎｇ及び１００ｎＨの試料の標準タ ンパク質バンドの幾つかが見えた。他の誘導体では染色は認められなかった。

ゲルセグメントを各染色溶液に戻して、−晩インキユベートした。翌朝、前述し たように全てのゲルセグメントを再度トランスイリュミネーター上で再度視覚化 して、写真を撮った。この時点で、（ダンジルクロライドを硫酸アンモニウムと 反応させて生成した）対照のダンジルアミン溶液又は３種のブチルダンシル誘導 体で染色したゲル中ではバンドは見えなかった。オクチル及びドデシルダンシル 誘導体で染色したゲル中で分画した標準液のタンパク質バンドは全て容易に見え た。しかしながら、ウシ血清アルブミン及びオボアルブミンタンパク質をオクチ ルダンシル染料で染色して一晩インキユベートすると、幾分不鮮明になるように 思えた。一般に、種々の分画した種で観測された蛍光信号の強さによって測定さ れるのと同じ−ように、バンドは染色された。従って、このデータは、誘導体が 同様の感度でタンパク質を検出するのではなく、検出限界及び染色の速度が、使 用する特定の誘導体に依存することを示している、更にはこれらのデータは、ダ ンシルのオクチル及びドデシル誘導体がこの分子のアミノ又はブチル誘導体に比 べて遥かに良好な染料であることを示している。

実施例２８ 付加的なダンシル誘導体の合成 ２７ｍｇ　（０，１ｍｍｏｌｅ）のダンシルりロライトを１ｍｌのアセトンに溶 解した溶液を含んでいる数個の１５１の管の各々に、ｎ−ブチルアミン、ｎ−ヘ キシルアミン、ｎ−オクチルアミン及びｎ−デシルアミンを５０μｍ加えた。他 の２つの管の各々にそれぞれｎ−ドデシルアミン及びエチルｐ−アミノ安息香酸 を１００糟ｇ加えた。室温で１分間置いた後に、以下の事項を観察した。ブチル 、ヘキシル、オクチル、デシル及びドデシル反応物の色はオレンジ色から黄色に 変化し、デシル及びドデシル反応物では沈澱物が生成した。エチルｐ−アミノ安 息香酸反応物では変色は観察されなかった。

５０μＩの１０８８ａＯＲ及び１００μｍの水をこの反応混合物に加えた。この 時点で、エチルアミノ安息香酸溶液は元のオレンジ色から淡黄色に変化した。溶 液試料をシリカゲル薄層クロマトグラフィーのプレート上に滴下し、クロロホル ムを使用して展開させた。トランスイリュミネーター上でプレートを観測すると 、前記反応の各々が単一移動度を有する新規化学種を生成することが判明した。

次いで、これらの種を実施例２６で説明したようにシリカゲル薄層クロマトグラ フィーで精製して、回収した。精製した溶出液の試料を再度クロマトグラフィー にがけな、試料中の蛍光種の視覚化によって、単一の蛍光種に精製されたことが 判明した。

更なる調査を実施する前に、溶出液をそれぞれエタノールで５０−１に希釈した 。

実施例２９ アセトン中で製造したダンシル誘導体を使用しての５ＯＳ−ＰＡＧＥゲル中での 分画タンパク質の検出層つかの１５−ウェル、５ＯＳ−ＰＡＧＥミニゲルを実施 例２７で説明したように注入し、実施例２７で説明したように希釈したＰｒｏｍ ｅｇａ　Ｍｉｄ　Ｒａｎｇｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｗｅｉｇｈｔ　５ｔａｎｄ ａｒｄｓで充填して、ゲルの別個のレーンにそれぞれ１０００．３００．１００ ゜５０、２５．１２．５及び６．２５ｎｇ／バンドのタンパク質を含んでいる試 料を提供した。トラッキング染料がゲルの底部に達するまでゲル当たり２０ｍ＾ を適用して、試料を分画した。全てのゲルを１０％トリクロロ酢酸中に５分間置 き、次いで１０％（ｖ／ｖ）メタノール中で１０分間インキュベートした０次い でゲルを、実施例２８で説明した（５０ｍｌのエタノールに溶解した）２％（ｖ ／ｖ）の誘導体溶出液を含んでいる１０％メタノール溶液中でインキュベートし た。ゲルをトランスイリュミネーターに移動し、２時間の染色後に視覚化し、写 真を撮った。以下の事項を観測した。１０００及び３００ｎｇ／バンドのタンパ ク質を含んでいるレーンのみが、ｎ−ブチルダンシル誘導体でインキュベートし たゲル中に見えた。

１０００．３００．１００．５０及び２５ｎｇ／バンド含んでいるレーンが、ま た１２．５ｎｇ／バンド含んでいるレーンでは幾つかのバンドが、ｎ−ヘキシル 誘導体でインキュベートしたゲル中に見えた。ｎ−オクチル誘導体で染色したゲ ルでは、蛍光強度が低いものの、はぼ同様の結果が得られた。デシル誘導体で染 色したゲル中に存在するバンドでは、標準液の１０００．３００．１００．５０ 及び２５ｎｇのバンドの不鮮明な視覚化が見られたが、ドデシル誘導体では３０ ０ｎｇ／バンドのみでバンドの検出が見られた。ｐ−アミノ安息香酸エチルエス テル誘導体で染色したゲルは良好な染色を示し、バンドの検出は２５ｎｇ／バン ドと低いタンパク質レベルで行われた。

染色溶液中で一晩インキユベートした後に、ゲルを再度観測して、再度写真を撮 った。得られた結果はほぼ先に得られな結果と同様であったが、デシル、特にド デシル誘導体で検出感度の増加が観測され、その結果ＩＺ、５ｎｇ／バンドのタ ンパク質を含んでいるレーンに存在するバンドの少なくとも幾つかを視覚化する ことができた。

次いで、ゲルを１％酢酸中に置いて、この溶液を室温で３時間インキュベートし た後に、非結合染料を除去し、再度写真を撮った。デシル及びドデシル誘導体で 検出感度の増加が観測され、その結果デシル及びドデシル誘導体の場合６．２５ ｎｇ／バンドのタンパク質を含んでいるレーンに存在するタンパク質種の大半が 見えた。

従って、アセトン中で製造し、効果のない誘導体に対してダンシルをあまり使用 せずに製造した誘導体は元の誘導体と同じくタンパク質を染色することができた 。更にはこ染色結果との間に相関関係があることを実証した。

実施例３０ ドデシルダンシル染料での電気泳動後染色の最適化代替染色条件がドデシルダン シル染料での蛍光染色によるタンパク質の検出を改善するかどうかを決定するた めに以下の実験を実施した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製の２個 の１２％５ＤＳ−ＰＡにＥミニゲルを使用し、隣接レーンにそれぞれ２５及び５ Ｎｇ／バンドのタンパク質を含んでいるタンパク質バンドを生成するためにゲル の交互レーンに充填した希薄Ｐｒｏｓｅｇａ　Ｍｉｄ−Ｒａｎｇｅ　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒ　Ｗｅｉｇｈｔ　５ｔａｎｄａｒｄｓの試料を分画した。製造業者によ って推奨されるようにゲルをＢｉｏ−Ｒａｄ　Ｍｉｎｉｐｒｏｔｅａｎ　ＩＩ電 気泳動ユニット内で操作し、スライスして、各レーンが２５Ｎｇ及び５Ｎｇの試 料を含んでいる２つのレーンセグメントを製造した。以下の溶液（蒸留水、１％ 酢酸、１％トリクロロ酢酸、５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍ）リスペース、０． ５Ｍ重炭酸アンモニウムｐＨ５，ｏ、２ＭトリスｐＨ８，０，０，０５Ｍ水酸化 ナトリウム及び１０％エタノール）（５０謡１）の各々に１つの切片を置き、次 いで（５０１のエタノールに溶解した）実施例２８のドデシルダンシル誘導体溶 液２００μｍを含んでいる第２の溶液５０鋤１中でセグメントをインキュベート した。ゲルを室温で一晩染色し、次いで実施例２７で説明したようにトランスイ リュミネーター上で観測し、酸及び０．５Ｍ重炭酸アンモニウムｐ）１５．０に 溶解した染料でインキュベートしたゲルは、２５Ｎｇ／バンドのタンノ（り質を 含んでいるレーンで蛍光タンパク質バンドを示したが、２Ｍ）リスｐＨ８，０に 溶解した染料でインキュベートしたゲルの染色は遥かに弱かった。この時点では 、池の染色溶液で分画タンパク質種は視覚化されなかった。１％トリクロロ酢酸 溶液中で染色したゲルセグメントは、タンパク質の検出もバックグラウンド染色 も示さなかったが、他の全ての溶液は少なくともバックグラウンド染色を示した 。これは、使用する特定染料誘導体がトリクロロ酢酸溶液中で生じる強酸性条件 下では発光させることができないことによると考えられた。

これらの溶液中で染料が変化しないままであるかどうかを決定し、また染料用条 件を標準化するために、ゲルセグメントを５０＋ｓｌの蒸留水中でインキュベー トした。１時間後にセグメントを再度観測して、写真を撮った。１％酢酸、１％ トリクロロ酢酸、２Ｎ）リスｐＦ！８．０及び０．５Ｍ重炭酸アンモニウムｐｆ １５．０の溶液中で染色したゲルで染色が見られた。

これらのゲルの中では、１％酢酸及びトリクロロ酢酸の溶液中で染色したゲルの 蛍光度がより大きかった。従って、染色感度は染色条件に依存し、弱酸性条件が 染色感度を改善するように思われる。

実施例３１ ドデシルダンシル染料での染色の最適化実施例３０の実験はドデシルダンシル染 料でのタンパク質の染色が可能であることを示していたので、また固定が染色の 実施を可能とすると報告されていたので、酢酸／エタノール溶液を使用して固定 段階と染色段階とを組合わせると検出が改善され得るかどうかを決定するために 以下の実験を実施した。２個の１２％５ＯＳ−ＰＡＧＥゲルを希釈したＰｒｏｍ ｃ４ａ　Ｍｉｄ　Ｒａｎｇｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｗｅｉｇｈｔ　５ｔａｎｄ ａｒｄで操作して、ゲル中に存在するバンド当たり２０Ｎｇ、Ｌｏｎｇ及び５Ｎ ｇのタンパク質を含んでいるタンパク質試料を生成した。ゲルは実施例２７で説 明したように製造し、タンパク質は製造業者に推奨されているようにＢｉｏ　Ｒ ａｄ　Ｍｉｎｉｐｒｏｔｅａｎ　ＩＩゲルシステムのゲル上で分画した。ゲルを 切断して、各レーンが前述した濃度のタンパク質を含んでいる３つの試料レーン を含んでいるゲルセグメントを生成し、以下の５０ｍ１の固定溶液（３０％エタ ノール、２０％酢酸、４０％エタノール、１０％酢酸：４０％エタノール、２０ ％酢酸；５０％エタノール、１０％酢酸、５０％エタノール、２０％酢酸）のい ずれかに１５分分間−た。１５分間インキュベートした後に、（５０＋ｍ、ｌの エタノールの溶解した実施例２８の）ドデシルダンシル染料溶液を５０μｍ含ん でいる別の同一の固定溶液５０−１中にゲルを移動させた。３時間後に、５０− １の５０ｍＭ　）リスーＣＩｐＨ８，０中に一上で視覚化して、写真を撮った。

３０又は４０％エタノールと１０又は２０％酢酸とを含んでいる溶液中で染色し たゲルセグメントの全てのタンパク質バンドがゲルセグメント中で微かに見えた 。

視覚化した後に、セグメントを各染色溶液に戻し、−晩インキユベートした。翌 朝セグメントを、予め異なる溶液中でインキュベートせずに直接トランスイリュ ミネーター上で視覚化して、写真を撮った。全ての濃度での全てのタンパク質バ ンドが写真上のゲルで容易に見えた。これらの結果は、５ｎ８／バンドと低量の タンパク質レベルでのタンパク質の検出をこの染料を用いて実施できることを示 している。

実施例３２ ドデシルダンシル染料でのインゲル（ｉｎ−ｇｅｌ　）染色ドデシルダンシル染 料でのインゲル染色が実施できるかどうかを決定するために、実施例５に記載の ゲル緩衝液及び操ｆヤ（ｒｕｎｎｉｎｇ）　Ｍ新液中に試薬濃縮物を含んでいる ゲルを実施例５で説明したように製造して、操作した。但し１　）　（５０ｎｌ のエタノールに溶解した実施例２８の）ドデシルダンシル染料をプロメガグリー ン１の代わりに、０．１％（ｖ／ｖ　）カソード１ｌｌｉ液に加え、２　）　Ｐ ｒｏｗ＋ｅｇａ　Ｍｉｄ−ＲａｎｇｅＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｈｅｉｇｈｔマーカ ーを、実施例５で説明したようにＩＸ充填［新液に希釈し、ゲル上に充填して、 それぞれが１１０００ｎ／レーン〜３．１Ｂｇ／レーンの濃度のタンパク質を含 んでいるレーンを製造した。を気泳動後に、前述したようにゲルを直接トランス イリュミネーター上に置き、視覚化し、写真を撮った。　１２．５Ｂｇ／バンド と低いタンパク質濃度でゲル中に存在する分画タンパク質では、分子量がより大 きい多くの種でタンパク質バンドが見られた。しかしながら、ゲルを通じて中間 点より先に移動させることのできる移動度でのタンパク質種の染色は容易に検出 されなかった。

従って、ゲル損作中の染色はドデシルダンシル染料で実施でき、また移動度の小 さいタンパク質種で特に好ましい。

実施ＰＡ３３ ＭＤＰＦのドデシル及びオクチル誘導体の合成固体ＭＤＰＦ、　２−メトキシ− ２，４−ジフェニル−３（２Ｂ）フラノン（ＦＬＵＫＡ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃ ｏ、、　Ｒｏｎｋｏｎｋｏｍａ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。

ＵＳＡ）　１８ｍｇを４５０μｍのジメチルホルムアミド（即ちＮ、Ｎ−ジメチ ルホルムアミド）に溶解した溶液を、テープでカバーしたねじ込みキャップ管内 で、０．０７ｍｍθ１ｅのドデシル又はオクチルアミンを４５０μ＋の５０：５ ０　（ｖ／ｖ）アセトン：　５０ｍＭ硼酸ナトリウム、５０ｗＭ塩化カリウムｐ Ｈ９，３に溶解した溶液と混合した。１５分後に、更に５０：５０　（ｖ／ｖ） アセトン：　５０ｍＭ硼酸ナトリウム、５０−Ｎ塩化カリウム１００μｍを管に 加えて、ストックＭＤＰＦ誘導体溶液を製造した。

実施例３４ ＭＤＰＦのオクチル及びドデシル誘導体でのゲルの染色１５ウエル、１２％ゲル を実施例５で説明したように製造し、希釈したＰｒｏｓｅｇａ　Ｍｉｄ　Ｒａｎ ｇｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＷｅｉｇｈｔＳｔａｎｄａｒｄｓで充填して、２０ ０．１００．８０．６０．４０．２０及び１０ｎｇ／バンドのタンパク質を有す る試料を含むレーンを製造した。ゲルを実施例５で説明したように操作したが、 カソード緩衝液に１０メガグリーン１を加えなかった。を気泳動後に、ゲルをレ ーンの間で切断して、それぞれ前述した濃度の分画タンパク質試料を含んでいる ゲルセグメントを生成し、これらを室温で２５〜３０分間３０％メタノール中に 置いた。次いで、実施例３３のストック染料溶液を０．５％（ｖ／ｖ）の濃度で 蒸留水に希釈し、これらの溶液５０ｍ　ｌを使用して、ゲルを染色した。１時間 インキュベートした後に、トランスイリュミネーターを使用してゲルを視覚化し 、写真を撮った。オクチルＭＤＰＦ誘導体を含んでいるゲルは、標準混合物から 分画した大半の種で、２００ｇ／バンドと低い濃度のタンパク質種の染色蛍光バ ンドを示した。次いでゲルを５％メタノール中に置き、−晩脱色した。

−晩脱色した後に、ゲルセグメントを再度トランスイリュミネーター上に置き、 視覚化し、写真を撮った。この時点で、ドデシルＭＤＰＦ誘導体で染色したゲル は、２０ｎｇ／バンドとタンパク質濃度の低いレーンで蛍光染色タンパク質種を 示した。しかしながら、オクチルＭＤＰＦ誘導体で染色したゲルのほとんど全て の蛍光染色は脱色プロトコール中に失われた６にもかかわらず、ゲル中のタンパ ク質の高感度電気泳動後染色にこれらの誘導体を使用することができる。

実施例３５ ＭＤＰＦのオクチル及びドデシル誘導体でのインゲル染色２つの１０−ウェル、 １２％ゲルを実施例５で説明したように製造し、希釈したＰｒｏｍｅｇａ　Ｍｉ ｄ　Ｒａｎｇｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＷｅｉｇｈｔＳｔａｎｄａｒｄｓで充填 して、２００．１００．８ｏ、６ｏ、４ｏ、２ｏ、１ｏ及び５Ｂｇ／バンドのタ ンパク質を含んでいるレーンを製造し、次いで電気泳動によって分画した。これ らのタンパク質を実施例５に記載の充填緩衝液１０μＩ中のゲルに加え、次いで ２０％グリセロール、１％ドデシル硫酸ナトリウム溶液中でｉ　：　１００に希 釈した誘導体ストック溶液（実施例３３）１０μｍを、ウェルに加えた。次いで 、ゲルを実施例５で説明したように操作した。但し、０．５ｍｌの誘導体染料ス トックをゲル中のカソード緩衝液に加え、プロメガグリーン１染料を溶液から除 去した。前述したようにゲルをトランスイリュミネーター上に置き、次いで電気 泳動し、肉眼で観測して、写真を撮った。タンパク質バンドの染色は、ドデシル 誘導体に対し全てのタンパク質では８０ｎｌ（／バンド以下で、３１ｋｄａｌｔ ｏｎ標準液（カルボニックアンヒドラーゼ）では６０ｎｇ／バンド以下で見られ た。バンドの染色は、オクチル誘導体に対して全てのタンパク質では６０ｎｇ／ バンドで見られ、カルボニックアンヒドラーゼは４０ｎｇ／バンド以下で検出で きた。従って、いずれの染料もタンパク質のインゲル染色に使用することができ る。

実施例３６ フルオレセインイソチオシアネートの誘導体の合成２３０μ＋ｇのインチオシア ネート（異性体Ｉ　、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　ＳＬ、　Ｌｏｕ ｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、　ＵＳ＾）を１２＋ａｌのアセトンに溶解して、フ ルオレセインインチオシアネートをアセトンに溶解したストック溶液を製造した 。この溶液の試Ｆ１２ｍｌを別々の試験管に入れ、ｐ−アミノ安息香酸カリウム （１７，５ｍｇ／輸１）　（反応１）、フェニレンジアミン（１０８輸ｇ／請１ ）（反応２）又はｐ−アミノ安息香酸エチル（１６，５ｍｇ／＋＊Ｉ）（反応３ ）を含んでいる１餉１の１；１アセトン：　５０１Ｍ硼酸ナトリウム、　５０＋ ａＨ塩化カリウムｐＨ９，３を加えた。他の２種の反応混合物を次のように製造 した。一方の混合物は、フルオレセインイソチオシアネートストック４−１と、 前述したフェニレンジアミンストック１輸１とを含んでおり（反応４ン、他方の 混合物は、フルオレセインストック２１と、１：１アセトン：　５０＋＊Ｎ硼酸 ナトリウム、５０−Ｎ塩化カリウムｐＨ９，３１＋ｓｌとを含んでおり、試薬は 加えない（反応５）。

室温で一晩インキユベートした後に、１＊Ｉの２００ｍＮ＃酸アンモニウム、５ ００１１Ｎトリス−ＨＣｌｐＨ８，９を反応物に加えた。

更に４時間経過した後に、最終容量が１５ｍ１になるようにエタノールを溶液に 加えて、誘導化染料のストック溶液を製造した。　これらの反応を以下の誘導体 を製造する工程と規定した。

反応番号　誘導体 １　ｐ−アミン安息香酸フルオレセイン２　フルオレセインフェニレンジアミン とジフルオレセインフェニレンジアミンとの混合物 ３　エチルｐ−アミ７安息香酸フルオレセイン４　ジフルオレセインフェニレン ジアミン５　アミノフルオレセイン 実施例３７ ゲル中で分画したタンパク質の電気泳動後染色でのフルオレセインイソチオシア ネート誘導体の使用６個の１２％ゲルを実施例２７で説明したように製造し、希 釈したＰｒｏｍｅｇａ　Ｍｉｄ　Ｒａｎｇｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｌｌｅｉｇ ｈｔ　５ｔａｎｄａｒｄで充填して、１０００．５００．２００．１００．７５ ．５ｏ、２５及ヒｌＯｎｇ／バンドのタンパク質を含んでいるレーンを製造した 。ゲルを実施例２７で説明したように操作し、次いでゲルを５０％メタノール中 で１５分間インキュベートした０次いでゲルを個別の５０１の染色溶液に移動さ せた。この溶液は４０％メタノールで１：５００に希釈した実施例３６のストッ ク誘導化染料溶液であった。１時間後に、これらの溶液を除去し、５０ｍ１の１ ０％メタノールで脱色した。更に３０分後に、ゲルをトランスイリュミネーター 上で視覚化して、写真を撮った。

アミノフルオレセイン及びｐ−アミノ安息香酸フルオレセイン誘導体で染色した ゲルでタンパク質バンドが見えたが、バンドは１０００．５００及び２００ｎｇ ／バンドのタンパク質を含んでいるレーンでのみ見えた。更には、アミン誘導体 によって９７．６６．５５及び４０ｋＤａ　（キロダルトン）の標準液のみが検 出が可能で、ｐ−アミノベンゾイル誘導体で９７．５５．４０及び３１ｋＤａの 標準襦のみが検出が可能であった。この時点では、エチルｐ−アミノベンゾイル 誘導体で染色したゲルで、７５Ｂ／バンドと少量のタンパク質を含んでいるレー ンで全てのタンパク質を検出することができた。

次いで、ゲルを５０−１の１０％メタノール中に置き、室温で一晩インキユベー トした。−晩インキユベートした後に、ゲルをトランスイリュミネーター上で視 覚化して、写真を撮った。この時点で、ジフルオレセインフェニレンジアミン、 エチルｐ−アミノベンゾイル及びｐ−アミノベンゾイル誘導体で染色したゲルは 、１０００．５００及び２００ｎｇ／バンドのタンパク質を含んでいるレーンで 全てのタンパク質種の染色を示した。アミノ誘導体で染色したゲル（反応５）は 、タンパク質種が１０００及び５００ｎｇ／バンドのタンパク質を含んでいるレ ーンでのみ検出される程度に色あせた。しかしながらこれらのレーンでは、前述 したように特定のタンパク質種のみが染色された。これらの結果は、フルオレセ インインチオシアネートを種々の疎水性有機試薬で誘導化すると、得られる化合 物の変性タンパク質に対する結合親和性が増し、従って有機試薬での誘導化のよ うにタンパク質と共有結合できないアミン誘導体に比べて変性タンパク質の検出 怒度を改善することができることを示している。

実施例３８ フルオレセインインチオシアネートのドデシル及びオクチルアミン誘導体の合成 フルオレセインインチオシアネート（異性体Ｉ　、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ 　Ｃｏ、）　１８＋ｓｇを４５０μ＋のジメチＪレホルムアミドに溶解した溶液 を、０．０５ｍｍｏｌのオクチル又はドデシルアミンをアセトン：　５０＋ｓＭ 硼酸ナトリウム、５０論Ｈ塩化カリウムｐＨ９，３の１＝１混合物に懸濁液とし て加えたものと混合した。

次いで、前述したアセトンと硼酸ナトリウムと塩化カリウムとの溶液を加えて反 応混合物を１−１に希釈して、ストツ。

り染料溶液を製造した。使用する才でこれらのストック溶液を室温で保持した。

実施例３９ 変性タンパク質の検出におけるフルオレセインイソチオシアネートのドデシルア ミノ及びオクチルアミノ誘導体の使用 ゲルを実施例３４で説明したように製造し、充填した。

ゲルを３０％メタノール中で１５分間インキュベートして、タンパク質を固定し 、次いで実施例３８に記載のストック染料溶液を蒸留水で０．５％（ｖ／ｖ）の 濃度に希釈して製造した実施例３８の染料溶液５０−１中でインキュベートした 。染料溶液中で１時間インキュベートした後に、ゲルを５％メタノール中に置き 、３０分後にゲルセグメントをトランスイリュミネーター上に置いて視覚化して 、写真を撮った。実施例２７で説明したようにセグメントの写真を撮った。この 時点では、８０ｎｇ／バンドとタンパク質濃度の低いドデシルアミノ誘導体で染 色したゲルでタンパク質バンドを視覚化した。オクチルアミン誘導体で染色した ゲルは、タンパク質バンドの視覚化を妨げる高いバックグラウンド蛍光を有して いた。

次いで、ゲルセグメントを脱色溶液中に戻して、−晩インキユベートした。−晩 インキユベートした後に、オクチルアミノ誘導体で染色したゲルのセグメントを ３０％メタノール溶液に移動させ、このメタノール溶液中で１時間インキュベー トした後に再度視覚化して、写真を撮った。この時点で、４０ｎｇ／バンドとタ ンパク質濃度の低い蛍光標識バンドでタンパク質を検出した。これらのデータは 実施例３７及び３８のデータと共に、線状炭化水素（ＪＩＩＭを加えて染料を改 質すると、得られる材料のタンパク質への非共有結合性が改善されることを示し ている。

本発明は特に本明細書で説明した特定例に限定されず、変形例が以下の請求の範 囲内に包含されると理解すべきである。

国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０９Ｂ　５５１００　 Ａ　７３０６−４Ｈ５７１００Ｒ７３０６−４Ｈ Ｐ　７３０６−４Ｈ ６９１００Ａ　７３０６−４Ｈ ２７３０６−４Ｈ ＧＯＩＮ　３３／６８　７０５５−２ＪＩ

Claims (80)

【特許請求の範囲】
1. １．式Ｉ： （Ｘ１）−（Ｄ１）ｍ−（Ｘ２）ｎＩ 〔式中、Ｄ１は、 （ｉ）式Ｘ： ▲数式、化学式、表等があります▼Ｘ （式中、Ｒ１１，Ｒ１２及びＲ１３は独立して水素及びＣ１−６アルキルから構 成される群から選択され、Ｒ１４及びＲ１５は独立してＣ１−６アルキルから構 成される群から選択され、Ｒ１６はＣ１−２０アルキル、フェニル、アルキル基 が１〜１０個の炭素原子を有するアルコキシフェニル、及びアルキル基が１〜１ ０個の炭素原子を有するアルキルフェニルから構成される群から選択される）の 部分、 （ｉｉ）式ＸＸ： ▲数式、化学式、表等があります▼ＸＸ（式中、Ｒ２１及びＲ２２は独立して水 素及び−（Ｃ＝Ｏ）−から構成される群から選択され、但しＲ２１及びＲ２２の 少なくとも一方は−（Ｃ＝Ｏ）−である）の部分、（ｉｉｉ）式ＸＸＸＡ： ▲数式、化学式、表等があります▼ＸＸＸＡ（式中、−Ｌ３０−部分は−（ＮＨ ）（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−、−ＳＯ２ＮＨ−（式中、スルホニル基の硫黄は−ＣＯ２Ｈ 部分を担持するフェニルに直接結合している）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−（式中、− （Ｃ＝Ｏ）−基の炭素は−ＣＯ２Ｈ部分を担持するフェニルに直接結合している ）、−ＣＨ２Ｓ−（式中、−ＣＨ２−基の炭素は−ＣＯ２Ｈ部分を担持するフェ ニルに直接結合している）、−Ｓ−■及び−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２Ｓ−（式中、 −（ＮＨ）の窒素は−ＣＯ２Ｈ部分を担持するフェニルに直接結合している）か ら構成される群から選択され且つ−ＣＯ２Ｈ部分に対してパラ又はメタ位に配置 され、Ｒ３１は−ＯＨ及び ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ３３及びＲ３４は独立してＣ１−６アルキルから選択される）から構 成される群から選択され、Ｒ３２はＲ３１が−ＯＨである場合には酸素であり、 Ｒ３１が▲数式、化学式、表等があります▼ である場合には ▲数式、化学式、表等があります▼ である）のフルオレセイン部分、 （ｉｖ）式ＸＬ： ▲数式、化学式、表等があります▼ＸＬ（式中、Ｒ５１は水素及びＣ１−６アル キルから構成される群から選択される）の部分、及び （ｖ）式ＬＸＸ： ▲数式、化学式、表等があります▼ＬＸＸ（式中、Ｒ７１及びＲ７２は独立して Ｃ１−１０アルキルから選択される）の部分から構成される群から選択され、ｍ は各染料分子中の部分Ｄ１の数であり、１又は２であり、ｎは各染料分子中の部 分Ｘ２の数であり、０又は１であり、Ｄ１が式Ｘで表される場合には、ｍは１で あり、ｎは０であり、Ｘ１はＣ１−２０アルキル、フェニル、ベンジル、任意の １つの位置でＣ１−１０アルキル、クロロ、ブロモ、ニトロ又はシアノで置換さ れたフェニル、及びフェニル環上の任意の１つの位置でＣ１−１０アルキル、ク ロロ、ブロモ、ニトロ又はシアノで置換されたベンジルから構成される群から選 択され、 Ｄ１が式ＸＸで表される場合には、ｍは１であり、ｎは０（Ｒ２１及びＲ２２の いずれか一方がＨである場合）又は１であり、Ｘ１及びＸ２は独立してＣ１−２ ０アルキル、フェニル、ベンジル、任意の１つの位置でＣ１−１０アルキル、ク ロロ、ブロモ、ニトロ又はシアノで置換されたフェニル、及びフェニル環上の任 意の１つの位置でＣ１−１０アルキル、クロロ、ブロモ、ニトロ又はシアノで置 換されたベンジルから構成される群から選択され、 Ｄ１が式ＸＸＸＡで表される場合には、ｍは１又は２であり、ｎは０であり、Ｘ １は （ｉ）−Ｘ３−Ｒ６２（式中、−Ｘ３−はＣ１−２０アルキレニルであり、Ｒ６ ２はＸ３の任意の１つの位置に配置され、水素、ブロモ、クロロ、ヒドロキシル 、 ▲数式、化学式、表等があります▼ −（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ６３、又はｍが２である場合には式ＸＸＸＡの第２の部分との 単結合であり、Ｒ６３及びＲ６４は独立して水素及びＣ１−１０アルキルから選 択される）、（ｉｉ）▲数式、化学式、表等があります▼及び（ｉｉｉ）▲数式 、化学式、表等があります▼（式中、Ｒ６５はブロモ、クロロ、シアノ、ニトロ 、▲数式、化学式、表等があります▼ −（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ６３、又はｍが２である場合には式ＸＸＸＡの第２の部分との 単結合である） から構成される群から選択され、 Ｄ１が式ＬＸＸで表される場合には、ｍは１又は２であり、ｎは０であり、Ｘ１ は （ｉ）▲数式、化学式、表等があります▼及び（ｉｉ）▲数式、化学式、表等が あります▼（式中、Ｒ６５はブロモ、クロロ、シアノ、ニトロ、▲数式、化学式 、表等があります▼ −（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ６３、又はｍが２である場合には式ＬＸＸの第２の部分との単 結合である）から構成される群から選択され、 Ｄ１が式ＸＬで表される場合には、ｍは１又は２であり、ｎは０であり、Ｘ１は （ｉ）−Ｘ３−Ｒ６６（式中、Ｒ６６はＸ３中の任意の１つの位置に配置され、 水素、ブロモ、クロロ、ヒドロキシル、▲数式、化学式、表等があります▼ −（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ６３、又はｍが２である場合には式ＸＬの第２の部分との単結 合である）、 （ｉｉ）▲数式、化学式、表等があります▼及び（ｉｉｉ）▲数式、化学式、表 等があります▼（式中、Ｒ６７はブロモ、クロロ、シアノ、ニトロ、▲数式、化 学式、表等があります▼ −（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ６３、又はｍが２である場合には式ＸＬの第２の部分との単結 合である） から構成される群から選択される］ の染料又は式Ｉの染料の塩。
2. ２．Ｄ１が式Ｘの部分であることを特徴とする式Ｉの染料又はその塩。
3. ３．Ｒ１１及びＲ１２が水素及びメチルから構成される群から独立して選択され 、Ｒ１３が水素であり、Ｒ１４及びＲ１５が両方ともエチルであり、Ｒ１６がエ チル及びエトキシフェニルから構成される群から選択され、Ｘ１がＣ１−２０ア ルキル、フェニル及びベンジルから構成される群から選択されることを特徴とす る請求項２に記載の染料。
4. ４．Ｒ１１及びＲ１２が両方とも水素又は両方ともメチルであり、Ｒ１６がエト キシフェニルであり、Ｘ１がＣ１−１２ｎ−アルキル及びフェニルから構成され る群から選択されることを特徴とする請求項３に記載の染料又はその塩。
5. ５．Ｒ１１及びＲ１２が両方とも水素であり、Ｘ１はＣ１−１２ｎ−アルキルで あることを特徴とする請求項４に記載の染料又はその塩。
6. ６．Ｒ１１及びＲ１２が両方ともメチルであり、Ｘ１がＣ１−１２ｎ−アルキル であることを特徴とする請求項５に記載の染料又はその塩。
7. ７．Ｘ１がメチル、ヘブチル又はウンデシルであることを特徴とする請求項５に 記載の染料又はその塩。
8. ８．Ｘ１がメチル、ヘブチル又はウンデシルであることを特徴とする請求項６に 記載の染料又はその塩。
9. ９．Ｄ１が式ＸＸの部分であり、ｎが０又は１であり、Ｘ１及びＸ２がＣ１−２ ０アルキル、フェニル及びベンジルから構成される群から独立して選択されるこ とを特徴とする請求項１に記載の染料又はその塩。
10. １０．ｎが０又は１であり、Ｘ１及びＸ２がＣ１−１２ｎ−アルキルから構成さ れる群から独立して選択されることを特徴とする請求項９に記載の染料又はその 塩。
11. １１．ｎが１であり、Ｘ１及びＸ２が同一であり且つメチル、ヘブチル及びウン デシルから構成される群から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の染 料又はその塩。
12. １２．Ｘ１及びＸ２がヘブチルであることを特徴とする請求項１１に記載の染料 又はその塩。
13. １３．請求項２から１２のいずれか一項に記載の染料のナトリウム塩。
14. １４．Ｄ１が式ＸＸＸＡ（式中、Ｌ３０は−ＣＯ２Ｈ部分に対してメタ位に配置 された−（ＮＨ）（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−部分である）で表されることを特徴とする請 求項１に記載の染料又はその塩。
15. １５．Ｒ３１が−ＯＨであり、Ｘ１がＣ１−２０アルキル及び▲数式、化学式、 表等があります▼ から構成される群から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の染料又は その塩。
16. １６．Ｘ１がＣ１−１２ｎ−アルキル、▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ６８は水素又はＣ１−３アルキルである）、▲数式、化学式、表等が あります▼及び▲数式、化学式、表等があります▼から構成される群から選択さ れることを特徴とする請求項１５に記載の染料又はその塩。
17. １７．Ｘ１がオクチル、ドデシル、 ▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数 式、化学式、表等があります▼及び▲数式、化学式、表等があります▼から構成 される群から選択されることを特徴とする請求項１６に記載の染料又はその塩。
18. １８．Ｄ１が式ＸＬの部分であり、Ｘ３−Ｒ６６がＣ１−２０アルキル、フェニ ル又はベンジルであることを特徴とする請求項１に記載の染料。
19. １９．Ｒ５１がエチルであり、Ｘ３−Ｒ６６がＣ１−１２ｎ−アルキルであるこ とを特徴とする請求項１８に記載の染料。
20. ２０．Ｘ３−Ｒ６６がオクチル又はドデシルであることを特徴とする請求項１９ に記載の染料。
21. ２１．Ｄ１が式ＬＸＸで表されることを特徴とする請求項１に記載の染料。
22. ２２．Ｘ１が▲数式、化学式、表等があります▼であることを特徴とする請求項 ２１に記載の染料。
23. ２３．Ｒ７１及びＲ７２が同一であり且つＸ１が▲数式、化学式、表等がありま す▼，▲数式、化学式、表等があります▼及び▲数式、化学式、表等があります ▼から構成される群から選択されることを特徴とする請求項２２に記載の染料。
24. ２４．Ｒ７１及びＲ７２が両方ともメチルであることを特徴とする請求項２１か ら２３のいずれか一項に記載の染料。
25. ２５．（Ａ）式ＩＩ： （Ｘ１１）−（Ｄ１）ｍ−（Ｘ２）ｎＩＩ［式中、Ｄ１は、 （ｉ）式Ｘ： （式中、Ｒ１１，Ｒ１２及びＲ１３は独立して水素及びＣ１−６アルキルから構 成される群から選択され選択され、Ｒ１４及びＲ１５は独立してＣ１−６アルキ ルから構成される群から選択され、Ｒ１６はＣ１−２０アルキル、フェニル、ア ルキル基が１〜１０個の炭素原子を有するアルコキシフェニル、及びアルキル基 が１〜１０個の炭素原子を有するアルキルフェニルから構成される群から選択さ れる）の部分、 （ｉｉ）式ＸＸ； （式中、Ｒ２１及びＲ２２は独立して水素及び−（Ｃ＝Ｏ）−から構成される群 から選択され、但しＲ２１及びＲ２２の少なくとも一方は−（Ｃ＝Ｏ）−である ）の部分、（ｉｉｉ）式ＸＸＸＡ； （式中、−Ｌ３０−部分は−（ＮＨ）（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−、−ＳＯ２ＮＨ−（式中 、スルホニル基の硫黄は−ＣＯ２Ｈ部分を担持するフェニルに直接結合している ）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−（式中、−（Ｃ＝Ｏ）−基の炭素は−ＣＯ２Ｈ部分を担 持するフェニルに直接結合している）、−ＣＨ２Ｓ−（式中、−ＣＨ２−基の炭 素は−ＣＯ２Ｈ部分を担持するフェニルに直接結合している）、−Ｓ−■及び− ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２Ｓ−（式中、−（ＮＨ）の窒素は−ＣＯ２Ｈ部分を担持す るフェニルに直接結合している）から構成される群から選択され且つ−ＣＯ２Ｈ 部分に対してパラ又はメタ位に配置され、Ｒ３１は−ＯＨ及び ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ３３及びＲ３４は独立してＣ１−６アルキルから選択される）から構 成される群から選択され、Ｒ３２はＲ３１が−ＯＨである場合には酸素であり、 Ｒ３１が▲数式、化学式、表等があります▼ である場合には ▲数式、化学式、表等があります▼ である）のフルオレセイン部分、 （ｉｖ）式ＸＬ： （式中、Ｒ５１は水素及びＣ１−６アルキルから構成される群から選択される） の部分、及び （ｖ）式ＬＸＸ： （式中、Ｒ７１及びＲ７２は独立してＣ１−１０アルキルから選択される）の部 分から構成される群から選択され、ｍは各染料分子中の部分Ｄ１の数であり、１ 又は２であり、ｎは各染料分子中の部分Ｘ２の数であり、０又は１であり、Ｄ１ が式Ｘで表される場合には、ｍは１であり、ｎは０であり、Ｘ１１はＣ１−２０ アルキル、フェニル、ベンジル、任意の１つの位置でＣ１−１０アルキル、クロ ロ、ブロモ、ニトロ又はシアノで置換されたフェニル、及びフェニル環上の任意 の１つの位置でＣ１−１０アルキル、クロロ、ブロモ、ニトロ又はシアノで置換 されたベンジルから構成される群から選択され、 Ｄ１が式ＸＸで表される場合には、ｍは１であり、ｎは０（Ｒ２１及びＲ２２の いずれか一方がＨである場合）又は１であり、Ｘ１１及びＸ２は独立してＣ１− ２０アルキル、フェニル、ベンジル、任意の１つの位置でＣ１−１０アルキル、 クロロ、ブロモ、ニトロ又はシアノで置換されたフェニル、及びフェニル環上の 任意の１つの位置でＣ１−１０アルキル、クロロ、ブロモ、ニトロ又はシアノで 置換されたベンジルから構成される群から選択され、 Ｄ１が式ＸＸＸＡ又はＬＸＸで表される場合には、ｍは１又は２であり、ｎは０ であり、Ｘ１１は（ｉ）−Ｘ３−Ｒ６２（式中、−Ｘ３−はＣ１−２０アルキレ ニルであり、Ｒ６２はＸ３の任意の１つの位置に配置され、水素、ブロモ、クロ ロ、ヒドロキシル、 ▲数式、化学式、表等があります▼ −（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ６３、又はｍが２である場合には、式ＸＸＸＡの第２の部分（ Ｄ１が式ＸＸＸＡで表される場合）又は式ＬＸＸの第２の部分（Ｄ１が式ＬＸＸ で表される場合）との単結合であり、Ｒ６３及びＲ６４は独立して水素及びＣ１ −１０アルキルから選択される）、 （ｉｉ）▲数式、化学式、表等があります▼及び（ｉｉｉ）▲数式、化学式、表 等があります▼（式中、Ｒ６５はブロモ、クロロ、シアノ、ニトロ、▲数式、化 学式、表等があります▼ −（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ６３、又はｍが２である場合には式ＸＸＸＡの第２の部分（Ｄ １が式ＸＸＸＡで表される場合）又は式ＬＸＸの第２の部分（Ｄ１が式ＬＸＸで 表される場合）との単結合である） から構成される群から選択され、 Ｄ１が式ＸＬで表される場合には、ｍは１又は２であり、ｎは０であり、Ｘ１１ は （ｉ）−Ｘ３−Ｒ６６（式中、Ｒ６６はＸ３中の任意の１つの位置に配置され、 水素、ブロモ、クロロ、ヒドロキシル、▲数式、化学式、表等があります▼ −（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ６３、又はｍが２である場合には式ＸＬの第２の部分との単結 合である）、 （ｉｉ）▲数式、化学式、表等があります▼及び（ｉｉｉ）▲数式、化学式、表 等があります▼（式中、Ｒ６７はブロモ、クロロ、シアノ、ニトロ、▲数式、化 学式、表等があります▼ −（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ６３、又はｍが２である場合には式ＸＬの第２の部分との単結 合である） から構成される群から選択される］ の染料とタンパク質との複合体を形成する段階と、（Ｂ）（ｉ）染料中のＤ１が 式Ｘ又はＸＸで表される場合には複合体中の式ＩＩの染料の存在により複合体の 色を観察することにより、又は（ｉｉ）染料中のＤ１が式ＸＸＸＡ，ＸＬ又はＬ ＸＸで表される場合には複合体中の式ＩＩの染料の存在により複合体の色又は蛍 光を観察することにより、複合体を検出する段階とを含む、タンパク質の検出方 法。
26. ２６．タンパク質がポリアクリルアミド又はアガロースゲルに含まれることを特 徴とする請求項２５に記載の方法。
27. ２７．支持体がポリアクリルアミドであり、染料においてＤ、が式Ｘで表される ことを特徴とする請求項２６に記載の方法。
28. ２８．染料においてＲ１１及びＲ１２が両方とも水素又は両方ともメチルであり 、Ｒ１３が水素であり、Ｒ１４及びＲ１５がエチルであり、Ｒ１６がエトキシフ ェニルであり、Ｘ１１がＣ１−１２ｎ−アルキル及びフェニルから構成される群 から選択されることを特徴とする請求項２７に記載の方法。
29. ２９．染料においてＸ１１がメチル、ヘブチル又はウンデシルであることを特徴 とする請求項２８に記載の方法。
30. ３０．支持体がポリアクリルアミドであり且つ染料においてＤ１が式ＸＸで表さ れることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
31. ３１．染料においてｎが０又は１であり、Ｘ１１及びＸ２がＣ１−１２ｎ−アル キルから独立して選択されることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
32. ３２．染料においてＸ１１及び存在する場合にはＸ２がヘプチルであることを特 徴とする請求項３１に記載の方法。
33. ３３．ｎが１であることを特徴とする請求項３１に記載の方法。
34. ３４．ｎが１であることを特徴とする請求項３２に記載の方法。
35. ３５．支持体がポリアクリルアミドであり且つ染料においてＤ１が式ＸＸＸＡ（ 式中、Ｌ３０は−（ＮＨ）（Ｃ＝Ｓ）（ＮＨ）−である）で表されることを特徴 とする請求項２６に記載の方法。
36. ３６．染料において−（ＮＨ）（Ｃ＝Ｓ）（ＮＨ）一部分が−ＣＯ２Ｈ部分に対 してメタ位に配置されることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
37. ３７．染料においてＲ３１が−ＯＨであり、Ｘ１１がＣ１−２０アルキル及び ▲数式、化学式、表等があります▼ から構成される群から選択されることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
38. ３８．染料においてＸ１１がＣ１−１２ｎ−アルキル、▲数式、化学式、表等が あります▼ （式中、Ｒ６６は水素又はＣ１−３アルキルである）、▲数式、化学式、表等が あります▼及び▲数式、化学式、表等があります▼から構成される群から選択さ れることを特徴とする請求項３７に記載の方法。
39. ３９．染料においてＸ１１がオクチル、ドデシル、▲数式、化学式、表等があり ます▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります ▼及び▲数式、化学式、表等があります▼から構成される群から選択されること を特徴とする請求項３８に記載の方法。
40. ４０．支持体がポリアクリルアミドであり、染料においてＤ１が式ＬＸＸで表さ れることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
41. ４１．染料においてＲ７１及びＲ７２が同一であり、Ｘ１１がＣ１−２０アルキ ル及び ▲数式、化学式、表等があります▼ から構成される群から選択されることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
42. ４２．染料においてＸ１１がＣ１−１２アルキル、▲数式、化学式、表等があり ます▼ （式中、Ｒ６６は水素文はＣ１−３アルキルである）、▲数式、化学式、表等が あります▼及び▲数式、化学式、表等があります▼から構成される群から選択さ れることを特徴とする請求項４１に記載の方法。
43. ４３．染料においてＸ１１がＣ１−１２ｎ−アルキル、▲数式、化学式、表等が あります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があり ます▼及び▲数式、化学式、表等があります▼から構成される群から選択される ことを特徴とする請求項４２に記載の方法。
44. ４４．染料においてＸ１１が、 ▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数 式、化学式、表等があります▼及び▲数式、化学式、表等があります▼から構成 される群から選択されることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
45. ４５．染料においてＸ１１がＣ８−１２ｎ−アルキルから構成される群から選択 されることを特徴とする請求項４３に記載の方法。
46. ４６．染料においてＲ７１及びＲ７２が両方ともメチルであることを特徴とする 請求項４１から４５のいずれか一項に記載の方法。
47. ４７．支持体がポリアクリルアミドであり且つ染料においてＤ１が式ＬＸで表さ れることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
48. ４８．染料においてＸ３−Ｒ６６がＣ１−２０アルキル、フェニル及びベンジル から構成される群から選択されることを特徴とする請求項４７に記載の方法。
49. ４９．染料においてＲ５１がエチルであり且つＸ３−Ｒ６６がＣ１−１２ｎ−ア ルキルであることを特徴とする請求項４８に記載の方法。
50. ５０．染料においてＸ３−Ｒ６６がオクチル又はドデシルであることを特徴とす る請求項４９に記載の方法。
51. ５１．（ａ）タンパク質を含有するサンプル溶液をポリアクリルアミド又はアガ ロースゲルに加える段階と、（ｂ）電気泳動を使用してサンプルをタンパク質フ ラクションに分離する段階と、 （ｃ）支持体上のタンパク質を式ＩＩ：（Ｘ１１）−（Ｄ１）ｍ−（Ｘ２）ｎＩ Ｉ［式中、Ｄ１は、 （ｉ）式Ｘ： （式中、Ｒ１１，Ｒ１２及びＲ１３は独立して水素及びＣ１−６アルキルから構 成される群から選択され、Ｒ１４及びＲ１５は独立してＣ１−６アルキルから構 成される群から選択され、Ｒ１６はＣ１−２０アルキル、フェニル、アルキル基 が１〜１０個の炭素原子を有するアルコキシフェニル、及びアルキル基が１〜１ ０個の炭素原子を有するアルキルフェニルから構成される群から選択される）の 部分、 （ｉｉ）式ＸＸ： （式中、Ｒ２１及びＲ２２は独立して水素及び−（Ｃ＝Ｏ）−から構成される群 から選択され、但しＲ２１及びＲ２２の少なくとも一方は−（Ｃ＝Ｏ）−である ）の部分、（ｉｉｉ）式ＸＸＸＡ： （式中、−Ｌ３０−部分は−（ＮＨ）（Ｃ＝Ｓ）ＮＨ−、−ＳＯ２ＮＨ−（式中 、スルホニル基の硫黄は−ＣＯ２Ｈ部分を担持するフェニルに直接結合している ）、−（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ−（式中、−（Ｃ＝Ｏ）−基の炭素は−ＣＯ２Ｈ部分を担 持するフェニルに直接結合している）、−ＣＨ２Ｓ−（式中、−ＣＨ２−基の炭 素は−ＣＯ２Ｈ部分を担持するフェニルに直接結合している）、−Ｓ−■及び− ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ２Ｓ−（式中、−（ＮＨ）の窒素は−ＣＯ２Ｈ部分を担持す るフェニルに直接結合している）から構成される群から選択され且つ−ＣＯ２Ｈ 部分に対してパラ又はメタ位に配置され、Ｒ３１は−ＯＨ及び ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ３３及びＲ３４は独立してＣ１−６アルキルから選択される）から構 成される群から選択され、Ｒ３２はＲ３１が−ＯＨである場合には酸素であり、 Ｒ３１が▲数式、化学式、表等があります▼ である場合には ▲数式、化学式、表等があります▼ である）のフルオレセイン部分、 （ｉｖ）式ＸＬ： （式中、Ｒ５１は水素及びＣ１−６アルキルから構成される群から選択される） の部分、及び （ｖ）式ＬＸＸ： （式中、Ｒ７１及びＲ７２は独立してＣ１−１０アルキルから選択される）の部 分から構成される群から選択され、ｍは各染料分子中の部分Ｄ１の数であり、１ 又は２であり、ｎは各染料分子中の部分Ｘ２の数であり、０又は１であり、Ｄ１ が式Ｘで表される場合には、ｍは１であり、ｎは０であり、Ｘ１１はＣ１−２０ アルキル、フェニル、ベンジル、任意の１つの位置でＣ１−１０アルキル、クロ ロ、ブロモ、ニトロ又はシアノで置換されたフェニル、及びフェニル環上の任意 の１つの位置でＣ１−１０アルキル、クロロ、ブロモ、ニトロ又はシアノで置換 されたベンジルから構成される群から選択され、 Ｄ１が式ＸＸで表される場合には、ｍは１であり、ｎは０（Ｒ２１及びＲ２２の いずれか一方がＨである場合）又は１であり、Ｘ１１及びＸ２は独立してＣ１− ２０アルキル、フェニル、ベンジル、任意の１つの位置でＣ１−１０アルキル、 クロロ、ブロモ、ニトロ又はシアノで置換されたフェニル、及びフェニル環上の 任意の１つの位置でＣ１−１０アルキル、クロロ、ブロモ、ニトロ又はシアノで 置換されたベンジルから構成される群から選択され、 Ｄ１が式ＸＸＸＡ又はＬＸＸで表される場合には、ｍは１又は２であり、ｎは０ であり、Ｘ１１は（ｉ）−Ｘ３−Ｒ６２（式中、−Ｘ３−はＣ１−２０アルキレ ニルであり、Ｒ６２はＸ３の任意の１つの位置に配置され、水素、ブロモ、クロ ロ、ヒドロキシル、 ▲数式、化学式、表等があります▼ −（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ６３、又はｍが２である場合には、式ＸＸＸＡの第２の部分（ Ｄ１が式ＸＸＸＡで表される場合）又は式ＬＸＸの第２の部分（Ｄ１が式ＬＸＸ で表される場合）との単結合であり、Ｒ６３及びＲ６４は独立して水素及びＣ１ −１０アルキルから選択される）、 （ｉｉ）▲数式、化学式、表等があります▼及び（ｉｉｉ）▲数式、化学式、表 等があります▼（式中、Ｒ６５はブロモ、クロロ、シアノ、ニトロ、▲数式、化 学式、表等があります▼ −（Ｃ＝０）ＯＲ６３、又はｍが２である場合には式ＸＸＸＡの第２の部分（Ｄ １が式ＸＸＸＡで表される場合）又は式ＬＸＸの第２の部分（Ｄ１が式ＬＸＸで 表される場合）との単結合である） から構成される群から選択され、 Ｄ１が式ＸＬで表される場合には、ｍは１又は２であり、ｎは０であり、Ｘ１１ は （ｉ）−Ｘ３−Ｒ６６（式中、Ｒ６６はＸ３中の任意の１つの位置に配置され、 水素、ブロモ、クロロ、ヒドロキシル、▲数式、化学式、表等があります▼ −（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ６３、又はｍが２である場合には式ＸＬの第２の部分との単結 合である）、 （ｉｉ）▲数式、化学式、表等があります▼及び（ｉｉｉ）▲数式、化学式、表 等があります▼（式中、Ｒ６７はブロモ、クロロ、シアノ、ニトロ、▲数式、化 学式、表等があります▼ −（Ｃ＝Ｏ）ＯＲ６３、又はｍが２である場合には式ＸＬの第２の部分との単結 合である） から構成される群から選択される］ の染料で染色する段階と、 （ｄ）（ｉ）染料中のＤ１が式Ｘ又はＸＸで表される場合には複合体中の式ＩＩ の染料の存在により複合体の色を観察することにより、又は（ｉｉ）染料中のＤ １が式ＸＸＸ，ＸＬ又はＬＸＸで表される場合には複合体中の式ＩＩの染料の存 在により複合体の色又は蛍光を観察することにより、染色されたタンパク質を検 出する段階とを含む、サンプル中のタンパク質の検出方法。
52. ５２．ゲルがポリアクリルアミドであり且つ染料においてＤ１が式Ｘで表される ことを特徴とする請求項５１に記載の方法。
53. ５３．染料においてＲ１１及びＲ１２が両方とも水素又は両方ともメチルであり 、Ｒ１３が水素であり、Ｒ１４及びＲ１５がエチルであり、Ｒ１６がエトキシフ ェニルであり、Ｘ１１がＣ１−１２ｎ−アルキル及びフェニルから構成される群 から選択されることを特徴とする請求項５２に記載の方法。
54. ５４．染料においてＸ１１がメチル、ヘブチル又はウンデシルであることを特徴 とする請求項５３に記載の方法。
55. ５５．ゲルがポリアクリルアミドであり且つ染料においてＤ１が式ＸＸで表され ることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
56. ５６．染料においてｎが０又は１であり、Ｘ１１及びＸ２がＣ１−１２ｎ−アル キルから独立して選択されることを特徴とする請求項５５に記載の方法。
57. ５７．染料においてＸ１１及び存在する場合にはＸ２がヘプチルであることを特 徴とする請求項５６に記載の方法。
58. ５８．ｎが１であることを特徴とする請求項５６に記載の方法。
59. ５９．ｎが１であることを特徴とする請求項５７に記載の方法。
60. ６０．ゲルがポリアクリルアミドであり且つ染料においてＤ１が式ＸＸＸＡ（式 中、Ｌ３０は−（ＮＨ）（Ｃ＝Ｓ）（ＮＨ）−である）により表されることを特 徴とする請求項５１に記載の方法。
61. ６１．染料において−（ＮＨ）（Ｃ＝Ｓ）（ＮＨ）−部分が−ＣＯ２Ｈ部分に対 してメタ位に配置されることを特徴とする請求項６０に記載の方法。
62. ６２．染料においてＲ３１が−ＯＨであり且つＸ１１がＣ１−２０アルキル及び ▲数式、化学式、表等があります▼ から構成される群から選択されることを特徴とする請求項６１に記載の方法。
63. ６３．染料においてＸ１１がＣ１−１２ｎ−アルキル、▲数式、化学式、表等が あります▼ （式中、Ｒ６８は水素又はＣ１−３アルキルである）、▲数式、化学式、表等が あります▼及び▲数式、化学式、表等があります▼から構成される群から選択さ れることを特徴とする請求項６２に記載の方法。
64. ６４．染料においてＸ１１がオクチル、ドデシル、▲数式、化学式、表等があり ます▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります ▼及び▲数式、化学式、表等があります▼から構成される群から選択されること を特徴とする請求項６３に記載の方法。
65. ６５．ゲルがポリアクリルアミドであり且つ染料においてＤ１が式ＬＸＸで表さ れることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
66. ６６．染料においてＲ７１及びＲ７２が同一であり且つＸ１１がＣ１−２０アル キル及び ▲数式、化学式、表等があります▼ から構成される群から選択されることを特徴とする請求項６５に記載の方法。
67. ６７．染料においてＸ１１がＣ１−１２アルキル、▲数式、化学式、表等があり ます▼ （式中、Ｒ６８は水素又はＣ１−３アルキルである）、▲数式、化学式、表等が あります▼及び▲数式、化学式、表等があります▼から構成される群から選択さ れることを特徴とする請求項６６に記載の方法。
68. ６８．染料においてＸ１１がＣ１−１２ｎ−アルキル、▲数式、化学式、表等が あります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があり ます▼及び▲数式、化学式、表等があります▼から構成される群から選択される ことを特徴とする請求項６７に記載の方法。
69. ６９．染料においてＸ１１が ▲数式、化学式、表等があります▼，▲数式、化学式、表等があります▼，▲数 式、化学式、表等があります▼及び▲数式、化学式、表等があります▼から構成 される群から選択されることを特徴とする請求項６８に記載の方法。
70. ７０．染料においてＸ１１がＣ８−１２ｎ−アルキルから構成される群から選択 されることを特徴とする請求項６８に記載の方法。
71. ７１．染料においてＲ７１及びＲ７２が両方ともメチルであることを特徴とする 請求項６６から７０のいずれか一項に記載の方法。
72. ７２．ゲルがポリアクリルアミドであり且つ染料においてＤ１が式ＸＬで表され ることを特徴とする請求項５１に記載の方法。
73. ７３．染料においてＸ３−Ｒ６６がＣ１−２０アルキル、フェニル及びベンジル から構成される群から選択されることを特徴とする請求項７２に記載の方法。
74. ７４．染料においてＲ５１がエチルであり且つＸ３−Ｒ６６がＣ１−１２ｎ−ア ルキルであることを特徴とする請求項７３に記載の方法。
75. ７５．染料においてＸ３−Ｒ６６がオクチル又はドデシルでであることを特徴と する請求項７４に記載の方法。
76. ７６．タンパク質を電気泳動させたポリアクリルアミド又はアガロース支持体中 のタンパク質の検出方法に係り、該方法が、 （Ａ）支持体中のタンパク質を式ＩＩＩ：（Ｘ１２）−（Ｄ３）ＩＩＩ ［式中、Ｄ３は式Ｘ： （式中、Ｒ１１，Ｒ１２及びＲ１３は独立して水素及びＣ１−６アルキルから構 成される群から選択され、Ｒ１４及びＲ１５は独立してＣ１−６アルキルから構 成される群から選択され、Ｒ１６はＣ１−２０アルキル、フェニル、アルキル基 が１〜１０個の炭素原子を有するアルコキシフェニル及びアルキル基が１〜１０ 個の炭素原子を有するアルキルフェニルであり、Ｘ１２はＣ１−２０アルキル、 フェニル、ベンジル、任意の１つの位置でＣ１−１０アルキル、クロロ、ブロモ 、ニトロ又はシアノに置換されたフェニル、及びフェニル環上の任意の１つの位 置でＣ１−１０アルキル、クロロ、ブロモ、ニトロ又はシアノに置換されたベン ジルから構成される群から選択される）の部分である］ の染料で染色する段階と、 （Ｂ）約３未満のｐＨを有する水溶液に支持体を浸漬する段階と、 （Ｃ）染色したタンパク質を可視化する段階とを含む方法。
77. ７７．支持体がポリアクリルアミドであり、染料においてＲ１１及びＲ１２が両 方とも水素又は両方ともメチルであり、Ｒ１３が水素であり、Ｒ１４及びＲ１５ がエチルであり、Ｒ１６がエトキシフェニルであり、Ｘ１２がＣ１−１２ｎ−ア ルキル及びフェニルから構成される群から選択されることを特徴とする請求項７ ６に記載の方法。
78. ７８．染料においてＸ１２がメチル、ヘブチル又はウンデシルであることを特徴 とする請求項７７に記載の方法。
79. ７９．水溶液が約５％の酢酸溶液であること特徴とする請求項７７に記載の方法 。
80. ８０．水溶液が約５％の酢酸溶液であること特徴とする請求項７８に記載の方法 。