KR100445939B1 - 알루미늄 이온을 포함하는 단백질 염색용 처리용액 및 이를 이용한 단백질 염색방법 - Google Patents

알루미늄 이온을 포함하는 단백질 염색용 처리용액 및 이를 이용한 단백질 염색방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 알루미늄 이온을 포함하는 단백질 염색용 처리용액 및 이를 이용한 염색방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 쿠마쉬 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue; CBB) 염색액으로 단백질을 염색할 때에 사용하는 것으로 알루미늄 이온을 포함하는 처리용액 및 이를 이용한 단백질 염색방법에 관한 것이다.
이러한 본 발명에 따라 알루미늄 이온을 포함하는 처리용액을 사용하여 단백질을 CBB-스테이닝하면 검출한계가 낮아져 그 감도가 향상되고 염색시간이 단축될 뿐만 아니라 디-스테이닝 과정을 생략해도 되는 장점을 가진다.

Description

알루미늄 이온을 포함하는 단백질 염색용 처리용액 및 이를 이용한 단백질 염색방법{Treating Solution Containing Aluminium Ion for Staining Protein and Staining Method Using the Same}
본 발명은 알루미늄 이온을 포함하는 단백질 염색용 처리용액 및 이를 이용한 염색방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 쿠마쉬 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue; 이하 "CBB"라 약칭함) 염색액으로 단백질을 염색할 때에 사용하는 것으로 알루미늄 이온을 포함하는 처리용액 및 이를 이용한 단백질 염색방법에 관한 것이다.
염색(staining)은 프로테오믹스(proteomics)에서의 실험 결과를 해석하는데 중요한 것으로, 2차원 공간에 단백질들을 가시화(可視化)하는 단계를 말한다. 이하의 명세서상에서 언급되는 "염색"과 "스테이닝"은 같은 의미로 사용되는 것이다.
또한, 2-차원 겔 전기영동(2-dimentional gel electrophoresis; 이하 "2-D 겔 전기영동"이라 약칭함)은 2차원 공간에 단백질의 고유한 특성인 분자량과 전하량의 차이를 이용해서 세포내 전체 단백질들을 펼쳐 보이는 것으로, 여러 환경에서의 단백질 발현의 차이를 비교 분석하는 기초가 된다.
일반적으로 프로테오믹스에서 상기 2-D 겔 전기영동을 기반으로 하는 단백질 염색은 실버(silver) 염색액, 형광을 이용한 염색액 및 G250 또는 R250과 같은 CBB 염색액 등 통상의 흡수형 염색액에 의해 수행되어 왔다.
이중 실버 염색액에 의해 수행되는 실버-스테이닝의 경우 뛰어난 감도를 나타내기는 하지만, 단백질 타입에 의존하는 단점을 보인다.
반면, CBB 염색액은 다른 염색액에 비해 경제적으로 유리하고, 고비용의 장치를 사용할 필요가 없으며, 용이한 실험 과정에 의해 수행되어 질 뿐만 아니라, 단백질 타입에 의존하지 않는 장점을 가지기 때문에 2-D 겔 전기영동에 의해 단백질을 분석하거나, 그 외 모세관 전기영동에 의해 단백질을 분석하는 등 여러 조건에서 단백질 분석시 염색에 유효하게 적용되어 왔다.
그러나 CBB 염색액은 프로테오믹스에서 가장 대표적으로 사용되는 것이기는 하나, 검출한계가 약 30ng/밴드 이상으로 그 감도가 낮을 뿐만 아니라, 스테이닝 및 디-스테이닝 하는데 1 - 2일 정도가 소요되는 것에서 알 수 있듯이 시간이 많이 걸리는 문제점이 있었다.
한편, 종래에 CBB-스테이닝시에 염색액과 단백질 간 소수성의 상호작용을 향상시킴으로써 염색 감도를 좋게 하기 위하여, 암모니움 이온을 포함하는 처리용액을 사용한 바 있다.
본 발명의 목적은 CBB-스테이닝으로 단백질을 염색할 때에 검출한계를 낮춰 감도를 향상시킬 뿐만 아니라 염색 시간을 단축시키기 위하여, 알루미늄 이온을 포함하는 처리용액 및 이를 이용한 단백질 염색방법을 제공하는 것이다.
도 1a는 본 발명에 따라 알루미늄 이온 15%를 포함하는 처리용액을 사용하여 겔로 전기영동한 각종 단백질을 CBB-스테이닝한 결과를 나타내는 도면.
도 1b는 본 발명에 따라 알루미늄 이온 5%를 포함하는 처리용액을 사용하여 겔로 전기영동한 각종 단백질을 CBB-스테이닝한 결과를 나타내는 도면.
도 1c는 암모니움 이온을 포함하는 처리용액을 사용하여 겔로 전기영동한 각종 단백질을 CBB-스테이닝한 결과를 나타내는 도면.
도 1d는 겔로 전기영동한 각종 단백질을 실버-스테이닝한 결과를 나타내는 도면.
도 2는 염색시간 경과에 따른 염색의 상대적 강도 변화를 나타내는 그래프.
도 3은 쥐의 뇌세포로부터 얻은 100㎍의 단백질을 본 발명에 따라 CBB-스테이닝한 결과를 나타내는 도면.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 알루미늄 이온(aluminium ion)을 포함하는 단백질 염색용 처리용액 및 이를 이용한 단백질 염색방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
먼저, 본 발명에서는 CBB-스테이닝으로 단백질을 염색할 때에 사용하는 알루미늄 이온을 포함하는 처리용액을 제공한다.
이는 3가의 양이온인 알루미늄 이온(Al3+)을 사용함으로써 용액의 이온 세기를 증가시키게 되어 단백질과 염색액의 상호작용을 강화시키는 역할을 하게 한다.
상기 알루미늄 이온은 알루미늄 염에 의해 제공되는데, 이 알루미늄 염은 알루미늄 설페이트(aluminium sulfate), 알루미늄 클로라이드(aluminium chloride) 및 알루미늄 아세테이트(aluminium acetate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고, 특히 알루미늄 설페이트가 가장 바람직하게 사용된다.
이러한 알루미늄 염의 사용량은 전체 처리용액에 대하여 1 내지 40%의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다. 만약 알루미늄 염의 사용량이 1% 보다 적게 되면 염색시간 및 정도에 미치는 효과가 줄게 되고, 40% 보다 많게 되면 백그라운드 부분의 염색이 강해지기 때문에 단백질을 확인할 수 없게 된다.
또한 상기 처리용액은 알코올 화합물을 5 내지 40%의 함량으로 포함하는데, 알코올 화합물은 적절한 염색을 위해 반드시 포함되어야 하는 구성성분으로서 그 사용량이 5% 보다 적게 되면 염색이 지연되고, 40% 보다 많게 되면 염색이 잘 되지 않게 된다.
상기 알코올 화합물은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군으부터 선택되는 것이 바람직하고, 특히 에탄올을 사용하는 것이 바람직하다.
다음, 본 발명에서는 상기 알루미늄 염을 포함하는 처리용액을 이용한 단백질 염색방법을 제공한다.
본 발명에 따른 단백질 염색방법은 하기의 단계를 포함한다.
(a) 소정의 정제된 단백질에 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis; 이하 "SDS-PAGE"라 약칭함)을 수행한 결과 얻어진 겔을 탈이온수로 세정하는 단계;
(b) 상기 결과물을 제 1 용액 및 제 2 용액으로 처리하는 단계;
(c) 상기 결과물을 알루미늄 이온을 포함하는 제 3 용액을 이용하여 처리하는 단계; 및
(d) 상기 결과물에 CBB 염색액를 포함하는 제 4 용액을 첨가하는 단계.
먼저, (a) 단계에서는 소정의 정제된 단백질을 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔로 전기영동한 다음, 유리 플레이트로부터 제거된 겔을 탈이온수로 간단하게 세정한다.
다음, (b) 단계에서는 상기 (a) 단계로부터 얻어진 겔을 제 1 용액인 30%의 에탄올 및 2%의 인산을 포함하는 수용액으로 3번씩 처리하고 나서, 제 2 용액인 2%의 인산을 포함하는 수용액으로 3번씩 처리한다.
다음, (c) 단계에서는 상기 (b) 단계로부터 얻어진 겔을 제 3 용액인 1 내지 40%의 알루미늄 이온, 5 내지 40%의 알코올 화합물 및 2%의 인산을 포함하는 수용액에 침전시킨다.
마지막으로, (d) 단계에서는 상기 (c) 단계로부터 얻어진 결과물인 겔이 침전되어 있는 제 3 용액에 제 4 용액인 CBB 염색액으로서 G250 2% 및 0.2g/L의 소디움 아지드(sodium azide)를 포함하는 수용액을 첨가하는데, 제 4 용액의 최종 농도가 0.5 내지 2%가 되도록 조절한다.
이때 겔의 크기가 7 ×10㎝인 경우에는 상기 제 1 내지 제 4 용액의 사용량을 50㎖로 하고, 20 ×24㎝인 경우에는 250㎖로 한다. 또한, 상기 제 1 내지 제 3 용액에서의 처리 시간은 각각 30분씩으로 하며, CBB 염색액을 포함하는 제 4 용액에서의 처리 시간은 30분 내지 48시간으로 한다.
도 1a 내지 도 1d는 본 발명의 효과를 나타내기 위하여 토끼, 대장균, 소 또는 달걀 등으로부터 추출한 여러 종류의 단백질을 2차원 공간에서 겔로 전기영동한 다음 염색한 것을 나타낸 도면이다.
도 1a의 경우 본 발명에 따른 단백질 염색방법에 따라 알루미늄 이온 15%를 포함하는 처리용액을 사용하여 CBB-스테이닝한 결과를 나타내고, 도 1b 역시 본 발명에 따른 단백질 염색방법에 따라 알루미늄 이온 5%를 포함하는 처리용액을 사용하여 CBB-스테이닝한 결과를 나타낸다.
반면, 도 1c는 종래에도 실시된 바와 같이 암모니움 이온을 포함하는 처리용액을 사용하여 CBB-스테이닝한 결과를 나타내고, 도 1d는 산성의 은을 사용하여 실버-스테이닝한 결과를 나타낸다.
이때 도 1a 내지 도 1d에 나타나 있는 레인(lane)들은 각각의 단백질 분자량(단위 : kDa)을 표시하는 것으로서, 이는 위에서부터 차례대로 토끼 골격 근육의 미오신(200kDa), 대장균의 갈락토시다아제(116kDa), 토끼 근육의 포스포릴라제 b(97kDa), 소 혈청의 알부민(66kDa), 달걀 흰자위의 오발부민(45kDa) 및 소의 카르보닉 안하이드라제(31kDa)를 나타낸다. 또한, 도면 상단의 숫자는 단백질이희석되었음을 나타내는 것으로서 그 수치가 커질수록 희석의 정도가 커짐을 나타낸다.
본 발명에 따라 알루미늄 이온을 포함하는 처리용액을 사용하여 CBB-스테이닝한 결과를 보여주는 도 1a 및 도 1b의 경우는 암모니움 이온을 포함하는 처리용액을 사용하여 CBB-스테이닝한 결과를 보여주는 도 1c와 비교하였을 때, 희석이 많이 되었을 때에도 염색이 우수하게 된 것으로부터 검출한계가 낮아졌음을 알 수 있다.
본 발명에서의 단백질 검출한계는 0.5ng/band 이하로서, 암모니움 이온을 포함하는 처리용액을 사용하였을 때보다 염색 감도가 약 2배 내지 10배로 향상된다.
아울러, 본 발명에 따라 알루미늄 이온을 포함하는 처리용액을 사용하여 CBB-스테이닝한 결과를 보여주는 도 1a 및 도 1b의 경우는 실버-스테이닝한 결과를 보여주는 도 1d와 비교하면, 실버-스테이닝의 경우, 맨 위의 미오신 단백질의 경우는 염색이 거의 안되는 등 단백질 타입에 의존하는 것을 나타내지만, 본 발명의 용액은 사용된 모든 단백질이 검출된 것으로부터 단백질 타입에 의존하지 않음을 알 수 있다.
또한, 도 2는 단백질 염색시간 경과에 따른 상대적 강도 변화를 나타내는 그래프로서, 본 발명에 따라 알루미늄 이온을 포함하는 처리용액을 사용하여 CBB-스테이닝 한 경우의 염색 강도가 암모니움 이온을 포함하는 처리용액을 사용하여 CBB 스테이닝 한 경우의 염색 강도보다 훨씬 우수하기 때문에 염색에 걸리는 시간이 단축되었음을 알 수 있다.
본 발명에서는 암모니움 이온을 포함하는 처리용액을 사용하였을 때보다 염색시간이 10%정도 감소될 뿐만 아니라, 90% 정도 염색이 완성되는 데에는 2시간 정도가 소요된다.
마지막으로, 도 3은 쥐의 뇌세포로부터 얻은 100㎍의 단백질을 본 발명에 따라 CBB-스테이닝한 결과를 나타내는 도면으로서, 도면에서 보이는 뚜렷한 스팟으로부터 본 발명에 따라 알루미늄 이온을 포함하는 처리용액을 사용함으로써 CBB-스테이닝에 의해 단백질 염색이 우수하게 진행되었음을 알 수 있다.
한편, 단백질이 없는 상태에서도 염료가 겔에 결합하여 백그라운드를 형성하는데, 본 발명에서는 알루미늄 이온, 알코올 화합물 및 CBB 염색액의 양을 상기에서 언급한 양으로 조절함으로써 디스테이닝을 하지 않아도 단백질의 위치나 양을 측정하는데 지장이 없게 한다.
이하 본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같다.
단, 본 발명이 하기의 실시예에 국한되는 것은 아니다.
실시예
토끼 골격 근육의 미오신, 대장균의 갈락토시다아제, 토끼 근육의 포스포릴라제 b, 소 혈청의 알부민, 달걀 흰자위의 오발부민 및 소의 카르보닉 안하이드라제로 이루어진 정제된 단백질을 크기가 7 ×10㎝인 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔로 전기영동한 다음, 유리 플레이트로부터 제거된 겔을 탈이온수로 간단하게 세정하였다. 다음, 제 1 용액인 30%의 에탄올 및 2%의 인산용액 50㎖를 사용하여 30분간 3번씩 처리하고 나서, 역시 제 2 용액인 2%의 인산용액 50㎖를 사용하여 30분간 3번씩 처리하였다.
다음, 제 3 용액인 15%의 황산 알루미늄, 20% 에탄올 및 2%의 인산 용액 50㎖에 30분간 침전시킨 후, 제 4 용액인 G250 2% 및 0.2g/L의 소디움 아지드(sodium azide) 용액을 첨가하여 제 4 용액의 최종 농도가 1%가 되도록 하고, 이때의 염색 시간은 120분이 되도록 조절하여 본 발명에 따라 단백질에 CBB-스테이닝을 실시하였다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따라 알루미늄 이온을 포함하는 처리용액을 사용하여 단백질을 CBB-스테이닝하면 검출한계가 낮아져 그 감도가 향상되고 염색시간이 단축될 뿐만 아니라 디-스테이닝 과정을 생략해도 되는 장점을 가진다.

Claims (8)

  1. 단백질 염색용 쿠마쉬 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) 염색액에 있어서, 알루미늄 이온(aluminium ion)을 전체 염색액에 대하여 1-40(w/v)% 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 염색용 처리용액.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 알루미늄 이온은 알루미늄 설페이트(aluminium sulfate), 알루미늄 클로라이드(aluminium chloride) 및 알루미늄 아세테이트(aluminium acetate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 알루미늄 염(aluminium salt)으로부터 제공되는 것을 특징으로 하는 단백질 염색용 처리용액.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 염색액은 전체 처리용액에 대하여 5 내지 40(v/v)%의 알코올 화합물을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 염색용 처리용액.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
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