CN104502606B - 1‑芘基‑碳酰肼在糖蛋白特异性检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的研究方向是涉及糖蛋白特异性荧光检测技术的领域，具体地说是1‑芘基‑碳酰肼(UGF202)的合成及其衍生物在糖蛋白特异性荧光检测中的应用。本发明提供了1‑芘基‑碳酰肼进行糖蛋白特异性荧光检测的方法，包括以下四个步骤：将电泳分离后的含蛋白质样品的凝胶于固定液中固定；高碘酸溶液氧化；维生素C水溶液冲洗；染色。本发明具有灵敏度极高，可检测低至0.5ng的糖蛋白、特异性好、操作步骤简便，节省时间、重现性好、线性关系好、质谱兼容性好、使用安全、成本低廉等优点，可较好地适用于高通量蛋白质组学的研究。

Description

1-芘基-碳酰肼在糖蛋白特异性检测中的应用
技术领域
本发明涉及糖蛋白特异性荧光检测技术，具体地说是1-芘基-碳酰肼(UGF202)的设计合成及其在糖蛋白特异性荧光检测中的应用。
背景技术
糖基化是蛋白质翻译后修饰最重要的方式之一，是必需的生理过程。目前已知哺乳动物蛋白质中至少有二分之一发生了糖基化，这些糖蛋白广泛分布于组织、细胞、体液中，特别是在细胞膜表面、体液等中含量丰富，对蛋白质生物学功能的正确发挥起着至关重要的作用。如糖蛋白的糖链部分影响着蛋白质的折叠、溶解度、半衰期、抗原性和生物活性等；蛋白间的相互作用、蛋白与受体的特异性结合等过程的分子基础是糖链与蛋白的相互识别；许多恶性肿瘤组织与正常组织相比显示出蛋白质糖基化的明显差异。不但目前已知的很多疾病的诊断标志物是糖蛋白，而且通过国际标准认证的药物中，糖蛋白也占到较高的比例。
目前，国外的生物试剂公司在糖蛋白检测的领域一直处于领先的地位，研发了一系列糖蛋白检测的试剂盒。但多数产品价格高昂，检测步骤繁琐，并不利于糖蛋白组学研究的发展。而且，国内在在现有的生物试剂的基础上，进行生物实验的成本居高不下，无法实现经济效益与实验共同发展。本发明开发的UGF202荧光染色方法灵敏度略优于Pro-QEmerald 300试剂盒，是一种灵敏、便捷、特异的糖蛋白荧光检测技术，必将极大地促进生物技术基础研究的发展。
发明内容
本发明的目的在于提供UGF202的合成及其衍生物在糖蛋白特异性荧光检测中的应用。
本发明所述的UGF202相关化合物是指UGF202阴离子为母核的钠盐、钾盐和铵盐等。
UGF202母核为：
为了实现本发明的目的，本发明还提供了应用UGF202进行糖蛋白特异性荧光检测的方法包括如下步骤：
1)将经SDS-PAGE电泳后含蛋白质样品的凝胶置于固定液中固定10～60min，弃固定液。优选的固定时间为30min，固定液可以是含有50％甲醇和5％乙酸的水溶液；
2)在高碘酸溶液里氧化10～60min，其中高碘酸溶液为含重量体积比0.1～1％的高碘酸及按体积比0.5～5％的乙酸水溶液。然后用按体积比0.2～2％的维生素C的水溶液冲洗1～3次，每次1～10min；优选的氧化时间为20min，优选的氧化液组成为含重量体积比0.5％的高碘酸及按体积比3％的乙酸水溶液；氧化后优选的洗脱次数为1次，每次5min，优选的洗脱液组成为重量体积比为0.8％的维生素C溶液；
3)加入染色液5～60min，其中染色液为含重量体积比0.0001～0.002％的UGF202或其衍生物，按体积比1～10％的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，以及按体积比30～50％的乙醇。优选的染色时间为20min，优选的染色液组成为含重量体积比0.0001％的UGF202及按体积比5％的DMF和40％的乙醇；
4)检测，可在激光扫描仪下观察染色后的糖蛋白。
前期研究表明该技术有如下优点：
1)灵敏度高：UGF202糖蛋白特异性荧光检测法灵敏度略优于Pro-Q Emerald 300的灵敏度；
2)操作简单迅速：操作步骤少，可在75min内完成；
3)重现性好：受温度、摇床摆动频率等外部条件影响较小；
4)可逆性好：容易脱色；
5)质谱兼容性好：由于UGF202荧光检测法不影响蛋白质结构，所以可与MALDI-TOF等质谱仪高度兼容；
6)使用安全：采用毒性低的染料，提高实验操作的安全性，对环境污染小；
7)成本低。
附图说明
图1.UGF202的化学结构；
图2.在一向电泳分离后的SDS-PAGE胶上，糖蛋白荧光染色法与其它染色法检测蛋白质标准品效果的比较。(A)UGF202糖蛋白荧光染色法，(B)Pro-Q Emerald 300糖蛋白荧光染色法，(C)Pro-Q Emerald 488糖蛋白荧光染色法，(D)SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法。Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法和SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法均按照文献记载操作。采用Sigma公司的8种不同标准蛋白质为样品：Transferrin(糖蛋白)，BSA(非糖蛋白)，IgG(糖蛋白)，OVA(糖蛋白)，α1-acid glycoprotein(糖蛋白)，α-casein(非糖蛋白)，β-casein(非糖蛋白)，avidin(糖蛋白)，在图中用斜体字表示糖蛋白。带1，250ng；带2，125ng；带3，64ng；带4，32ng；带5，16ng；带6，8ng；带7，4ng；带8，2ng；带9，1ng；带10，0.5ng。
图3.在一向SDS-PAGE胶上，UGF202糖蛋白荧光染色法与其它染色方法检测实际样品效果的比较。(A)UGF202糖蛋白荧光染色法，(B)Pro-Q Emerald 300糖蛋白荧光染色法，(C)Pro-Q Emerald 488糖蛋白荧光染色法，(D)SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法。Pro-QEmerald糖蛋白荧光染色法和SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法均按照文献记载操作。采用的一共有四个样品，从人血清中提取的总蛋白，人成纤维细胞提取的总蛋白，小鼠肝组织提取的总蛋白，小鼠心肌提取的总蛋白。各种蛋白样品从左至右(从1到10)，倍倍稀释。
图4.在二向SDS-PAGE胶上，UGF202糖蛋白荧光染色法与其它染色方法检测实际样品效果的比较。(A)UGF202糖蛋白荧光染色法，(B)Pro-Q Emerald 300糖蛋白荧光染色法，(C)Pro-Q Emerald 488糖蛋白荧光染色法，(D)SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法。分离样品为小鼠肝脏总蛋白；IPG胶条长13em，pH 3-10；分离胶的浓度为11.4％；样品上样量为25μg/胶条。
图5.在一向SDS-PAGE胶上，UGF202糖蛋白荧光染色法与其它染色方法针对糖蛋白染色特异性的考察。(A)UGF202糖蛋白荧光染色法，(B)Pro-Q Emerald 300糖蛋白荧光染色法，(C)Pro-Q Emerald 300糖蛋白荧光染色法，(D)SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法。用PNGase F去除标准蛋白transferrin及人血清总蛋白中N-链糖。(-)表示未经PNGase F处理的，(+)表示经PNGase F处理的。
具体实施方式
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
实施例1 UGF202糖蛋白特异性荧光染色
图1是1-芘基碳酰肼的化学结构式。
UGF202糖蛋白荧光染色法采用如下述步骤进行：
1)将经SDS-PAGE电泳后的蛋白质样品凝胶置于50％甲醇和5％乙酸水溶液中固定30min，弃固定液；
2)在高碘酸溶液里氧化20min，其中高碘酸溶液为含重量体积比0.5％的高碘酸及按体积比3％的乙酸水溶液。然后用按重量体积比0.8％的维生素C水溶液冲洗1次，5min；
3)加入染色液染色20min，其中染色液为含重量体积比0.0001％的UGF202及按体积比5％的DMF和40％的乙醇溶液；
4)检测，可在激光扫描仪下观察染色后的蛋白。
按照上述方法分别用UGF202的钠盐、钾盐、铵盐等衍生物进行蛋白质染色，结果表明用这些衍生物均能够得到类似于UGF202的检测结果。
实验例1UGF202糖蛋白荧光染色法与其它染色法对标准蛋白检测效果对比。
(A)UGF202糖蛋白荧光染色法，(B)Pro-Q Emerald 300糖蛋白荧光染色法，(C)Pro-Q Emerald 488糖蛋白荧光染色法，(D)SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法。Pro-Q Emerald糖蛋白荧光染色法和SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法均按照文献记载；采用Sigma公司的8种不同标准蛋白质为样品。带1，250ng；带2，125ng；带3，64ng；带4，32ng；带5，16ng；带6，8ng；带7，4ng；带8，2ng；带9，1ng；带10，0.5ng。结果如图2所示，表明UGF202糖蛋白荧光染色法检测灵敏度略优于Pro-Q Emerald 300糖蛋白荧光染色法，比Pro-Q Emerald488试剂盒高8倍。
实验例2 UGF202糖蛋白荧光染色法与其它染色法对不同样品的检测效果对比。
(A)UGF202糖蛋白荧光染色法，(B)Pro-Q Emerald 300糖蛋白荧光染色法，(C)Pro-Q Emerald4 88糖蛋白荧光染色法，(D)SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法，均按照文献记载操作。采用的四个样品分别是：从人血清中提取的总蛋白，人成纤维细胞提取的总蛋白，小鼠肝组织提取的总蛋白，小鼠心肌提取的总蛋白。其中采用提取的人血清总蛋白为样品，其上样量为：带1，500ng；带2，250ng；带3，125ng；带4，64ng；带5，32ng；带6，16ng；带7，8ng；带8，4ng；带9，2ng；带10，1ng。结果如图3所示，表明UGF202糖蛋白荧光染色法检测灵敏度略优于Pro-Q Emerald 300糖蛋白荧光染色法，远远高于Pro-Q Emerald 488试剂盒。
实验例3 UGF202糖蛋白荧光染色法与其它染色法对人血清总蛋白测效果对比。
将上述人血清总蛋白经二向凝胶电泳分离后，分别采用(A)UGF202糖蛋白荧光染色法，(B)Pro-Q Emerald 300糖蛋白荧光染色法，(C)Pro-Q Emerald488糖蛋白荧光染色法，(D)SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法，结果如图4所示。显示UGF202糖蛋白荧光染色法能检测到Pro-Q Emerald 300糖蛋白荧光染色法检测到的绝大部分蛋白斑点，而且能检测到部分Pro-Q Emerald 300糖蛋白荧光染色法检测不到的斑点，表明UGF202蛋白荧光染色法是一种操作简单，而且灵敏度可同Pro-Q Emerald 300糖蛋白荧光染色法媲美的方法。
实验例4 UGF202糖蛋白荧光染色法针对糖蛋白特异性检测的考察。
用PNGase F去除标准蛋白α1-acid glycoprotein和人血清总蛋白中N-链糖。将上述蛋白经一向凝胶电泳分离后，分别采用(A)UGF202糖蛋白荧光染色法，(B)Pro-Q Emerald300糖蛋白荧光染色法，(C)Pro-Q Emerald488糖蛋白荧光染色法，(D)SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法，结果如图5所示。去除N-链糖后的标准蛋白transferring糖蛋白和人血清总蛋白可被SYPRO Ruby全蛋白荧光染色法检测，但几乎难以被UGF202糖蛋白荧光染色法及Pro-QEmerald 300糖蛋白荧光染色法识别，显示两者选择性相似，比Pro-Q Emerald 488糖蛋白荧光染色法的特异性明显要好。进一步说明UGF202糖蛋白荧光染色法对糖蛋白检测具有高度特异性。
图2-5中的参考染色方法及其相关文献
Pro-Q Emerald 300糖蛋白染色法操作方法参见文献：Thomas H.Steinberg，Karen Pretty On Top Kiera N.Berggren，Wayne F.Patton，(2001)Rapid and simplesingle nanogram detection of glycoproteins in polyacrylamide gels and onelectroblots.Proteomics 1，841-855.
Pro-Q Emerald 488糖蛋白染色法操作方法参见文献：Courtenay Hart.，BirteSchulenberg.，Thomas H.Steinberg.，Wai-Yee Leung.，Wayne F.Patton，R.(2003)Detection of glycoproteins in polyacrylamide gels and on electroblots usingPro-Q Emerald 488dye，a fluorescent periodate Schiff-basestain.Electrophoresis 24，588-598。
SYPRO Ruby荧光染色法操作方法参见文献：Malone，J.，Radabaugh，M.，Leimgruber，R.，Gerstenecker，G.(2001)Practical aspects of fluorescent stainingfor proteomic application.Electrophoresis 22，919-932。

Claims (5)

1.一种凝胶上糖蛋白特异性荧光检测方法，其包括步骤：
1)将经SDS-PAGE电泳后，包含分离的蛋白质样品的凝胶置于固定液中固定10～60min，弃固定液；
2)在高碘酸溶液里氧化10～60min，其中高碘酸溶液为含按重量体积比0.1～1.0％的高碘酸及按体积比0.5～5％的乙酸的水溶液，然后用按重量体积比0.2～2％的维生素C的水溶液冲洗1～3次，每次1～10min；
3)加入染色液，其中染色液为含按重量体积比0.0001～0.002％的(E)-1-芘基碳酰肼，按体积比1～10％的N，N-二甲基甲酰胺，以及按体积比30～50％的乙醇的溶液，染色10～40min；
4)检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中凝胶固定时间为30min，固定液为含按体积比50％的甲醇和5％的乙酸的水溶液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中凝胶在高碘酸溶液里的氧化时间20min，其中高碘酸溶液为含按重量体积比0.5％的高碘酸及按体积比3％的乙酸的水溶液，然后用按重量体积比0.8％的维生素C的水溶液冲洗1次，5min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)染色液为含按重量体积比0.0001％的(E)-1-芘基碳酰肼，按体积比5％的N，N-二甲基甲酰胺，以及按体积比40％的乙醇的溶液；染色时间为20min。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)是在激光扫描仪下观察染色后的糖蛋白。
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