CN102590099B - 8-苯胺基-1-萘磺酸及其衍生物在蛋白质荧光检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及蛋白质荧光检测技术，具体地说是8-苯胺基-1-萘磺酸(简称ANS)及其衍生物在蛋白质荧光检测中的应用。本发明还提供了应用ANS进行蛋白质荧光检测的方法，包括步骤：将蛋白质样品电泳后的凝胶在固定液中固定，去离子水冲洗；染色，去离子水冲洗；检测。本发明具有灵敏度高、操作简单迅速、重现性好、染色背景浅、线性关系好、可逆性好、兼容性好、使用安全、成本低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质荧光检测技术，具体地说涉及蛋白质的一种新的荧光染料。
背景技术
在生命科学研究领域，离不开对生命的基本物质蛋白质和DNA的研究，也就离不开对蛋白质的检测技术。尤其是最近几年，随着基因组学和蛋白质组学的飞速发展，使我们对蛋白质的分离检测技术有了更高的要求。
蛋白质的检测方法有很多，包括浊度法、凯氏定氮法、吸光光度法、荧光光度法，以及新发展起来的共振瑞利散射法、高效液相色谱法、毛细管电泳分析法等。荧光光度法是目前研究最多、应用最广、操作较为简便、灵敏度较高的检测方法。ANS属于萘磺酸类化合物，将ANS及其衍生物应用于凝胶蛋白质检测可为蛋白质染色提供一种快速、灵敏的方法，其灵敏达到1～2ng/band，可与经典荧光染色法SYPRORuby相媲美。
发明内容
本发明的目的提供ANS及其衍生物在蛋白质荧光检测中的应用。
本发明所述的ANS相关化合物是指以ANS为母核的钠盐、钾盐、铵盐、镁盐、钙盐或锌盐。
ANS母核为：
为了实现本发明的目的，本发明提供了一种电泳凝胶上蛋白质负染的方法，包括如下步骤：
1)将经SDS-PAGE电泳后的蛋白质样品凝胶置于固定液中固定10～60min，弃固定液，然后用去离子水冲洗1～20min；优选的固定时间为20min，去离子水冲洗时间为5min，固定液可以是含有40％乙醇和10％乙酸的水溶液；
2)加入荧光染色液染色1～30min，用去离子水冲洗1～10min，其中所述染色液为含按重量体积比0.0001％～0.01％的ANS或其衍生物及按体积比为10～30％乙醇、5～15％乙酸的水溶液；优选的染色时间为10min，去离子水冲洗时间为1min，优选的ANS或其衍生物的浓度是0.002％，乙醇浓度为24％，乙酸浓度为7％；
3)检测，检测波长为250～370nm，优选为312nm。
本发明方法具有如下优点：
1)高灵敏度：与SYPRORuby相媲美；
2)操作简单迅速：操作步骤少，可在40min内完成；
3)重现性好：受温度、摇床摆动频率等外部条件影响较小；
4)染色背景浅；
5)线性关系好：能在较大范围内对蛋白质进行半定量测定；
6)可逆性好：容易脱色；
7)兼容性好：可与MALDI-TOF等质谱仪器高度兼容；
8)使用安全：采用毒性低的荧光染料，提高实验操作的安全性，对环境污染小；
9)成本低。
附图说明
图1.ANS的化学结构；
图2.ANS荧光染色法与其它的蛋白质检测方法灵敏度的比较。采用Sigma公司的标准蛋白质(SDS6H2)为样品，蛋白质载样量(每条带)如下：带1，500ng；带2，250ng；带3，125ng；带4，63ng；带5，32ng；带6，16ng；带7，8ng；带8，4ng；带9，2ng；带10，1ng。观察以下染色方法的灵敏度：(A)考马斯亮蓝G-250染色法；(B)ANS荧光染色法；(C)SYPRORuby荧光染色法；
图3.HEK-293总蛋白提取液经二向电泳后，分别用(A)考马斯亮蓝G-250染色法；(B)ANS荧光染色法及(C)SYPRORuby荧光染色法染色，进行二向凝胶图像的比较。
图4.比较在一向SDS-PAGE胶上(A)考马斯亮蓝G-250染色法；(B)ANS荧光染色法及(C)SYPRORuby荧光染色法检识的标准蛋白的线性范围。五种不同分子量的标准蛋白质(β-半乳糖苷酶、磷酸化酶、碳酸酐酶、牛血清蛋白、卵白蛋白)在10％聚丙烯酰胺凝胶中分离。染色后，蛋白质带用Tina2.09图象分析软件分析。蛋白质质量范围在1～500ng。
具体实施方式：
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
实施例1ANS蛋白质荧光染色
图1.是ANS的化学结构式。ANS蛋白质荧光染色实验采用下述步骤进行：
1)将经SDS-PAGE电泳后的蛋白质样品(SDS6H2)凝胶置于固定液中20min，去离子水冲洗5min，固定液为体积百分含量40％乙醇，10％乙酸的水溶液；
2)在染色液中染色10min，用去离子水冲洗1min，染色液为含0.002％ANS(W/V)及40％乙醇/10％乙酸的水溶液；
3)被染色的凝胶直接放在透射仪上，312nm处透射，记录影像。
按照上述方法分别用ANS的钠盐、钾盐、铵盐、镁盐、钙盐或锌盐进行蛋白质染色，结果表明用这些衍生物均能得到类似于ANS的检测结果。SDS-PAGE参照《分子克隆实验指南》第三版相关部分进行。
实验例1ANS与其它染色法染色效果对比
(A)考马斯亮蓝G-250染色法；(B)ANS荧光染色法，(C)SYPRORuby荧光染色法。蛋白质载样量(每条带)如下：带1，500ng；带2，250ng；带3，125ng；带4，63ng；带5，32ng；带6，16ng；带7，8ng；带8，4ng；带9，2ng；带10，1ng。结果如图2所示，考马斯亮蓝G-250染色法在带6之后就已经检测不出来了。而ANS荧光染色法在带10仍隐约可见，灵敏度和SYPRORuby荧光染色法大致一致。其中ANS荧光染色采用实施例1的方法进行，考马斯亮蓝G-250染色法及SYPRORuby荧光染色法分别按下述方式进行：
考马斯亮蓝G-250染色法[1]：
1)将电泳后的凝胶置于固定液(12％三氯乙酸水溶液)中1小时；
2)在染色工作液(0.1％w/vCBBG-250，20％甲醇，2％w/v磷酸，10％w/v硫酸铵)中染色2小时，再用25％甲醇冲洗至胶面干净；
3)被染色的胶放在透光板上记录影像或直接干胶。
SYPRORuby荧光染色法[2]：
1)将电泳后的凝胶放在SYPRORuby染色工作液中染色不少于3小时，再用10％甲醇/7％乙酸溶液冲洗30min；
2)被染色的凝胶直接放在透射仪上，312nm处透射，记录影像。
实验2HEK-293总蛋白二向电泳染色
取HEK-293细胞液，3000rpm离心10min收集细胞，用PBS洗液清洗，加入裂解液(50mMTris，pH7.5，1mMEDTA，0.4mMPMSF)，利用超声破碎仪破碎细胞。15000rpm离心20min，收集上清，即得HEK-293提取液(粗蛋白制品)。将上述粗蛋白制品经二向凝胶电泳后，分别采用实施例1ANS荧光染色法及实验1中考马斯亮蓝G-250染色法和SYPRORuby荧光染色法进行染色，结果如图3所示。由图3可以看出HEK-293经SYPRORuby染色后可视化的大多数蛋白质斑点，经过ANS荧光染色后也可以看见，而且有些没有被SYPRORuby染色显示出来的蛋白质也可被ANS荧光染色很清楚地显示出来。由此显示了ANS荧光染色法是一种简单、灵敏的方法。
实验3ANS荧光染色法与SYPRORuby荧光染色法线性动态范围的对比
五种不同分子量的标准蛋白质(β-半乳糖苷酶、磷酸化酶、碳酸酐酶、牛血清蛋白、卵白蛋白)在10％聚丙烯酰胺凝胶中分离，经(A)ANS荧光染法；(B)SYPRORuby荧光染色法染色后，用Tina2.09图像软件分析标准蛋白上样量与条带强度的线性曲线，从而比较两种染色方法的线性范围。标准蛋白质上样量范围为1～500ng由图4显示ANS荧光染法与SYPRORuby荧光染色法具有一致的线性范围。
参考文献：
1.V.Neuhoff，N.Arold，D.Taube，ImprovedstainingofproteinsinpolyacrylamidegelsincludingisoelectricfocusinggelswithclearbackgroundatnanogramsensitivityusingCoomassieBrilliantBlueG-250andR-250.Electrophoresis9(1988)，255-262.
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Claims (5)
1.一种蛋白质荧光检测方法，其包括步骤：
1)、将经SDS-PAGE电泳后的蛋白质样品凝胶置于固定液中固定10-60min，弃固定液，然后用去离子水冲洗1-20min；
2)、加入荧光染色液染色1-30min，用去离子水冲洗1-10min，其中所述染色液为含按重量体积比0.002％的8-苯胺基-1-萘磺酸及按体积比为40％乙醇和10％乙酸的水溶液；
3)、检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中蛋白固定时间为20min，然后用去离子水冲洗5min。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中染色的时间为10min，然后用去离子水冲洗1min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)检测波长为250-370nm。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中检测波长为312nm。
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