KR20110003501A - 모세관 전기영동에 의한 ｄｎａ의 분석 - Google Patents

Abstract

본 발명은 핵산의 존재에 대해 분석되는 샘플이 모세관 전기영동에 의해 분리되는 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다. 샘플 주입 및 분리의 조건은 본 방법의 극도로 높은 민감성을 허용하며, 이는 예를 들어, 치료 또는 백신접종을 위한 단백질을 포함하는 샘플 내 게놈 DNA 오염물의 결정 또는 존재, 양 및/또는 크기의 품질관리 목적을 위해 사용될 수 있다.

Description

모세관 전기영동에 의한 ＤＮＡ의 분석{ANALYSIS OF DNA BY MEANS OF CAPILLARY ELECTROPHORESIS}

본 발명은 핵산의 존재에 대해 분석되는 샘플이 모세관 전기영동에 의해 분리되는 핵산을 검출하는 방법에 관한 것이다. 샘플 주입 및 분리의 조건은 본 방법의 극도로 높은 민감성을 허용하며, 이는 예를 들어, 특히 인플루엔자의 치료 또는 백신접종을 위해 의도되는 샘플 내 게놈 DNA 오염물의 결정 또는 존재 및/또는 크기의 품질관리 목적을 위해 사용될 수 있다.

인플루엔자는 오르토믹소바이러스(orthomyxoviruses)의 군으로부터의 바이러스에 의해 야기되는 질병이다. 이 질병을 초래하는 것은 주로 A형, 드물게는 B형 그리고 사실상 거의 없는 C형이다.

인플루엔자에 대한 가장 좋은 예방 수단은 인플루엔자 A형 및 B형에 대해 이용가능한 백신접종이다. 인플루엔자에 대한 백신은 1952년 이래로 알려져 있다. 달걀 내 바이러스 증식의 종래 접근은 백신의 생성을 위해 적어도 6개월을 필요로 한다. 세포 배양물의 사용은 달걀 사용 이상의 몇 가지 이점을 가지는 또 다른 접근이다.

세포 배양물에서 제조되는 생성물에 대해, 규제위원회에 의해 평가되는 한 변수는 그것의 트랜스포밍 가능성에 기인하는 잔여 숙주 세포 DNA의 함량이다. 숙주 세포 DNA와 관련되는 위험을 최소화하는 한 가지의 가능한 방법은 백신에 존재하는 DNA의 양을 감소시키는 것이다. 또 다르게는, 최종 생성물에 남아있는 핵산이 그것의 종양유발 가능성을 상실한 것으로 나타날 수 있다.

MDCK 세포 (Madin-Darby canine kidney cells)에 관하여, 카니스 파밀리아리스(Canis familiaris)의 게놈은 2004년에 완전히 서열화되었고; 이는 인터넷에서 이용가능하다. Novartis Vaccines의 연구에서, 특정 기능을 가지는 약 25000개의 유전자 중 단지 13개만이 500 bp 미만의 길이를 가진다는 것을 보여주었다. 이들 13개의 유전자는 종양유발 가능성을 가지지 않는 것으로 발견되었다.

이런 발견은, 핵산의 존재 및 크기 분포에 대해, 백신과 같이 핵산을 잠재적으로 포함하는 샘플의 분석을 위한 매우 민감한 방법을 개발할 필요를 나타내었다.

백신 제조의 과정 동안 핵산의 양 및 크기 분포를 평가하기 위해, 다른 과정 단계로부터의 샘플을 분석할 수 있다. 이는 이들 제조과정 샘플이 그것의 화학적 조성에서 서로 다르다는 추가적인 어려움을 야기한다. 함유된 DNA의 농도에 큰 차이가 있으며, 이는 10³까지일 수 있다. 따라서, 분석방법의 개발은 도전적인 작업이다.

핵산의 절대 농도의 수량화는 몇몇 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 280 nm 및 260 nm에서 광학 밀도의 광도계 검출은 샘플의 핵산 농도와 단백질 함량 둘 다에 대한 판단을 허용한다. 형광염료에 기초한 시험은 더욱 민감하다. 예를 들어, PicoGreen®은 약 312 pg/ml dsDNA 미만의 검출 한계를 가진다. 그러나 이 시험은 샘플 내 불순물에 매우 민감하며, 결과는 높은 변화도를 가진다. Threshold System® 시험은 6.2-400 pg/ml 사이의 농도로 DNA를 수량화할 수 있다. 그러나, 이 시험들은 어떤 양적 정보를 제공하지 않는다.

핵산, 예컨대 게놈 DNA의 양적 분석을 위해, 고전적인 아가로스 슬랩 겔 전기영동이 가장 빈번하게 사용된다. 따라서, 하기 실시예에서 상세하게 설명되는 바와 같이, 아가로스 겔 전기영동에 의해 인플루엔자 백신의 생성으로부터 샘플을 분석하는 것이 우선 시도되었다. 초기 정제 단계로부터의 샘플 내 DNA는 이 방법에 의해 검출될 수 있었던 반면, 후반 단계들로부터의 샘플 및 최종 생성물의 농도는 너무 낮아서 분석을 할 수 없었다. 유사하게, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동은 샘플의 분석에 적합하지 않다는 것이 발견되었다.

모세관 겔 전기영동이 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 같은 광범위한 물질의 분석을 위해 사용될 수 있다는 것은 알려져 있다[C. Heller, Electrophoresis 629, Issue 2 (2001); Menzinger et al., Analysis of agrochemicals by electrophoresis, J. Chromatogr. A 891 (2000), 45; Mitchelson et al., electrophoresis of nucleic acids, Vol II, Practical applications of capillary electrophoresis, Humana Press Totowa, New Jersey 2001]. 이 방법은 높은 효율성 및 민감성을 가지며, 빨리 수행될 수 있다.

놀랍게도, 본 발명자들은 백신 생성의 다양한 단계 동안 모세관 겔 전기영동이 핵산, 특히 DNA의 분석에 대해 매우 민감하고 믿을 수 있는 시험을 제공하는데 적합할 수 있다는 것을 발견하였다. 결과 방법은 선행 기술의 필요를 만족시키며 본 발명 하의 문제를 해결한다.

본 발명자들은 샘플 내 핵산의 존재 및/또는 크기 분포를 분석하기 위한 방법을 개발하였으며, 샘플을 하기 단계들을 포함하는 모세관 겔 전기영동에 의해 분리한다,

a) 2 내지 10초 동안 약 7 내지 약 35 kPa에서, 바람직하게는 약 5초 동안 약 20 또는 21 kPa에서 물로 모세관의 유체역학적 전-주입,

b) 10-60초 동안 5-15 kV에서, 바람직하게는 약 30초 동안 약 10kV에서 샘플의 동전기적 주입,

c) 2-10초 동안 약 3 내지 14 kPa에서, 바람직하게는 약 5초 동안 약 7 kPa에서 물로 유체역학적 후-주입,

d) 200-275 V/cm로, 바람직하게는 225 내지 250 V/cm로 분리,

e) 핵산의 검출.

본 방법의 신뢰성 및 견실성을 개선하기 위해, a, b 및/또는 c 단계 후 모세관의 단부를 물과 접촉함으로써 세척 단계를 수행하는 것이 권고된다.

이 방법은 DNA의 존재 및/또는 크기 분포에 대해 분석되는 샘플이 모세관 겔 전기영동에 의해 분리될 때 최적의 민감성 및 신뢰성을 나타내고, 하기의

a) 5초 동안 약 21kPa에서 물로 모세관의 유체역학적 전-주입 단계,

b) 90초 동안 10 kV에서 샘플의 동전기적 주입 단계,

c) 5초 동안 약 7 kPa에서 물로 유체역학적 후-주입 단계,

d) 250 V/cm로 분리 단계,

e) 레이저 유발 형광에 의한 핵산의 검출 단계를 포함하며,

분리 버퍼는 EnhanCE 염료와 같은 삽입 염료(intercalating dye)를 포함하며, 내부표준 및 플루오레신 용액은 5초 동안 약 21 kPa에서 단계 a와 b 사이에 함께 또는 개별적으로 주입되고, 세척 단계는 단계 b 다음 및/또는 단계 c 다음에 내부표준의 주입 단계들 후 수행된다.

유체역학적 주입은 모세관의 입구에서 압력, 예컨대 정수압을 사용함으로써, 또는 모세관의 출구에서 진공 또는 부압을 발생시킴으로써 달성될 수 있다. 보통, 샘플은 샘플 바이알과 모세관 단부 사이에 압력차를 발생시킴으로써 로딩되며, 압력은 샘플 바이알에서 상승된다. 바람직하게는, 모세관의 다른 단부는 또한 액체, 예를 들어, 버퍼 또는 물에 잠긴다. 정수압에 의한 주입을 위해(중력의 영향), 모세관의 입구에서 샘플 바이알은 특정 높이로 상승될 수 있다. 버퍼 수준과 샘플 수준뿐 아니라 샘플 밀도 사이의 차이는 로딩에 영향을 미친다. 실제로, 압력 및 주입 시간의 생성물은 압력의 상승 및 하강을 늦추면서 샘플의 주입된 양의 계산을 위해 사용된다. 약 7 kPa은 약 1 psi에 대응하는 것으로 이해된다.

동전기적 주입은 전기영동을 기초로 하며 전기삼투 이동은 모세관 내 전기장에 의해 발생된다. 모세관의 입구가 샘플 바이알로 연장되고, 몇 초 동안 전압이 적용될 때, 샘플의 하전된 성분은 바이알로 이동한다. 주입된 샘플 성분의 농도는 주입 시간 또는 전압을 변화시킴으로써 달라질 수 있다. 따라서, 본 발명의 내용에서, 이것들은 적당량의 샘플의 주입을 달성하기 위해 변화될 수 있다. 주입된 샘플의 양은 또한 모세관 내 전기삼투 유량 및 샘플 성분의 이동성에 의존한다.

동전기적 주입은 분석물의 농축을 야기하며 따라서 높은 민감성을 가지는 샘플의 분석에 사용될 수 있다는 것은 당업계에 공지되어 있다(Krivacsy et al, Journal of Chromatography A, 834 (1999) 21-44; Butler et al, J. Chromatogr. B 658 (1994) 271-280). 그러나, 본 발명의 내용에서, 본 발명자들은 놀랍게도 DNA의 CGE 분석을 위해, 유체역학적 주입이 더욱 높은 민감성을 얻는데 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 예상외로, 분리 버퍼의 길이를 대응적으로 감소시키는 모세관의 효과적인 길이(검출기까지의 길이)의 약 20-40%에 샘플에 의한 모세관의 흔치않은 주입은 탁월한 결과를 이끈다. 선행 방법과 비교하여 본 방법의 견실성 및 민감성은 개선되었다.

따라서 본 방법은 핵산의 존재 및/또는 크기 분포를 분석하는 방법을 제공하며, 핵산을 포함하는 샘플을 하기 단계들을 포함하는 모세관 겔 전기영동에 의해 분리한다,

i) 유체역학적 주입에 의해 검출기까지의 모세관 길이의 20-40%에 샘플을 주입하는 단계,

ii) 핵산을 분리하는 단계,

iii) 핵산을 검출하는 단계.

바람직하게는, 핵산은 DNA, 바람직하게는 dsDNA이다. 본 발명의 방법은 게놈 DNA 및/또는 DNA의 분해 생성물, 특히 게놈 DNA의 분해 생성물의 분석에 특히 적합하다. 박테리아 게놈 DNA, 플라스미드 DNA 및/또는 바이러스 DNA 뿐만 아니라 그것의 분해 생성물이 또한 조사될 수 있다. 본 방법은, 예를 들어, 한정되지 않은 크기의 DNA의 분해 생성물의 존재 및/또는 크기 분포를 결정하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명자들은 예상외로 샘플이 유체역학적 주입에 의해 검출기까지의 모세관 길이의 20-40%에 주입될 때 양호한 결과가 얻어질 수 있다는 것을 보여주었다. 바람직하게는, 샘플은 검출기까지의 모세관 길이의 약 25% 내지 35%, 가장 바람직하게는 검출기까지의 모세관 길이의 약 30%에 주입된다. 당업계에서, 샘플은 보통 검출기까지의 모세관 길이의 0.5% 이하에 주입된다(Butler et al, J. Chromatogr. B 658 (1994) 271-280). 일반적으로, 백만개의 이론단에 의한 분리 및 5% 피크 퍼짐을 허용하도록 제공하기 위해, 주입 부피는 0.2 %의 모세관 부피이어야 한다[Capillary electrophoresis: theory and practice, Patrick Camilleri; Edition: 2, illustrated; published by CRC Press, 1998; ISBN 084939127X, 9780849391279; page 26].

당업자는 샘플을 바람직한 길이의 모세관에 주입하는 샘플의 주입을 위한 조건을 용이하게 결정할 수 있다. 조건은, 예를 들어, 사용되는 모세관의 길이에 의존한다. 바람직하게는, 장시간 및 낮은 압력이 샘플 주입을 위해 사용된다. 한 구체예에서, 샘플 주입은 14 내지 35 kPa의 압력에서 3분 이상, 예를 들어, 약 3 내지 약 4.5분 이상, 바람직하게는 21 내지 28 kPa에서 약 3.5 내지 약 4분 동안, 가장 바람직하게는 약 21 kPa에서 약 4분 동안이다. 이들 조건은 예를 들어, 검출기에서 약 35-45 cm, 예를 들어, 약 39cm의 길이를 가지는 모세관에 대해 적당하다.

바람직한 구체예에서, 본 방법은 단계 i) 전에, 바람직하게는 2 내지 10초 동안 1 내지 34kPa, 더 바람직하게는 5초 동안 7 kPa에서 물에 의한 모세관의 유체역학적 전-주입을 포함한다.

바람직한 구체예에서, 본 방법은 단계 i)과 ii) 사이에 바람직하게는 2 내지 10초 동안 1 내지 34 kPa, 더 바람직하게는 5초 동안 7 kPa에서 물에 의한 모세관의 유체역학적 후-주입을 포함한다.

바람직하게는, 본 방법은 단계 i) 전에 물에 의한 모세관의 유체역학적 전-주입과 단계 i)과 ii) 사이에 물에 의한 모세관의 유체역학적 후-주입을 둘 다 포함한다.

본 발명의 방법에서, 예를 들어, 물에 의한 전-주입 전 및/또는 샘플 주입 후 세척 단계를 수행함으로써 오염물을 감소시키는 것은 바람직하다. 세척은, 예를 들어, 모세관의 양 단부를 물과 접촉시킴으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 분리는 바람직하게는 200 내지 275 V/cm, 더 바람직하게는 약 200 내지 약 255 V/cm 또는 약 250 V/cm이다.

모세관 내의 핵산은 원하는 용도로써 요구되는 민감성에 이르는 어떤 적당한 방법에 의해 검출될 수 있다. 형광 검출은, 특히, 레이저광이 여기 동안 사용된다면(레이저 유발 형광, LIF), 예를 들어, 낮은 검출 한계로(즉, 높은 민감성) 탁월한 민감성 및 선택성을 허용한다. LIF는 UV 검출보다 약 2 내지 100배 더 민감하며, 신호의 매우 높은 직선성을 제공한다. 극적인 예로, 민감성은 단일 분자의 검출까지 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에서, 검출은 바람직하게는 레이저-유발 형광에 의한다.

DNA의 검출을 위해, LIF 검출은 다른 방법으로 사용될 수 있다. 첫 번째 방법은 더 낮은 UV 범위에서 본래 DNA의 자연형광을 기초로 한다. 이는 그것의 자연 환경에서 DNA의 분석을 허용한다. 예를 들어, 펄스 KrF 248 nm 레이저 또는 275 nm에 의한 UV 레이저 또는 이것 또는 유사한 범위의 파장에 의한 다른 레이저는 여기 동안 공급원으로서 사용된다. 제 2 변이체는 간접 형광을 사용한다. 형광 모세관 전기영동 시스템은 뉴클레오티드 또는 DNA의 분리동안 레이저(예를 들어, 325 nm He-Cd 레이저)에 의해 여기된다. 추가적 방법이 DNA 서열화를 위해 통상적으로 사용되며 적당한 형광체에 의한 분석물의 직접 공유 표지를 필요로 한다.

가장 널리 사용되는 방법에서, 핵산에 통합되고 분자의 길이, 배치 및 전하를 변화시키는 삽입 염료가 사용된다. 염료와 핵산의 복합체는 여기 파장의 광선하에서 강하게 형광성인 반면, 자유 염료는 그렇지 않다. 이 방법에 대해, 488 nm Ar 이온 레이저가 가장 적합하다. 브롬화에티듐은 가장 흔한 삽입 염료이다. 또한 종종 모노머 또는 다이머 삽입물질로서 그것의 유도체가 이용가능하다. 예를 들어, 염료 티아졸 오렌지(TO)는 검출의 매우 높은 민감성을 허용한다. 염료 POPO-3, YOYO-3 및 YOYO-1은 더욱 더 민감하다. 바람직한 염료는 EnhanCE 염료이다(Beckman Coulter, Fullerton, USA). 추가의 유용한 염료는 WO 03/089586에 개시되어 있다.

본 발명의 내용에서, 모세관 겔 전기영동을 위한 분리 버퍼는 핵산을 검출하는데 적당한 염료, 바람직하게는 삽입 염료, 가장 바람직하게는 EnhanCE 염료를 포함하는 것이 바람직하다. 따라서 핵산은 컬럼 상에서 착색된다. 바람직하게 사용되는 EnhanCE 염료의 농도는 약 0.25-1 μl/ml 분리 버퍼, 가장 바람직하게는 약 0.5 μl/ml 분리 버퍼이다.

본 발명의 한 구체예에서, DNA, 바람직하게는 게놈 DNA, 또는 그것의 분해 생성물의 존재에 대해 분석되는 샘플을

i) 약 21-28 kPa의 압력에서 3 내지 4.5분 동안, 바람직하게는, 약 28 kPa에서 약 4분 동안 유체역학적 주입에 의해 검출기까지의 모세관 길이의 약 30%에 샘플을 주입하는 단계

ii) 약 255 V/cm로 핵산을 분리하는 단계,

iii) 레이저 유발 형광에 의해 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 모세관 겔 전기영동에 의해 분리하며,

단계 i) 전에, 바람직하게는 약 5초 동안 약 7 kPa에서 물에 의한 모세관의 유체역학적 전-주입 단계를 더 포함하고,

단계 i)과 ii) 사이에, 바람직하게는 약 5초 동안 약 7 kPa에서 물에 의한 모세관의 유체역학적 후-주입 단계를 더 포함하고,

세척 단계는 물에 의한 전-주입 전 및/또는 샘플 주입 후 수행되며,

분리 버퍼는 삽입 염료, 바람직하게는 EnhanCE 염료를, 예를 들어, 0.5 μl/ml 분리 버퍼의 농도로 포함한다.

상대적인 이동성 값의 분배를 위해 내부표준이 사용된다면 통상적인 용도를 위한 본 방법의 신뢰성은 더 향상될 수 있다는 것이 발견되었다. 내부표준은 샘플과 함께 분리된다. 이는 샘플의 주입 전 바람직하게는 약 1-20초 동안 약 7-35 kPa에서, 가장 바람직하게는 약 10초 동안 약 20 kPa 또는 약 21 kPa에서 직접 주입될 수 있다. 그러나, 하기 논의되는 바와 같이, 데이터의 분석은 또한 이동성 대신에 시간에 대하여 수행될 수 있다. 내부표준(ISTD)은 샘플로부터 핵산의 검출 방해의 위험을 최소화하도록 선택되어야 한다. 인플루엔자 백신 생산으로부터 샘플 분석의 내용에서, ISTD는, 예를 들어, 10 내지 300 bp, 예를 들어 약 20 내지 약 200 bp의 길이를 가지는 ss 또는 ds DNA 단편, 특히 ds DNA 단편일 수 있다. ISTD는 또한 50bp 미만의 ssDNA, 예를 들어, 23 bp ssDNA 프라이머일 수 있다. 한 구체예에서, ISTD는 10 bp의 dsDNA 단편이다. 이는 보통 첫 번째 핵산 샘플 전에 검출되고 따라서 핵산 검출의 시작을 표시하며 또한 검출에 대한 대조군으로서 역할을 한다.

핵산 크기 분포의 분석을 가능하게 하기 위해, 샘플은 관심의 적어도 하나의 한정된 크기의 핵산, 예를 들어, 약 200 bp, 약 500bp 및/또는 약 2000bp 길이를 가지는 DNA로 스파이킹될 수 있다. 이러한 정의된 핵산은 또한 내부표준에 포함될 수 있다.

추가로 또는 대안적으로, 플루오레신과 같은 검출가능한 형광 염료의 용액, 예를 들어 물 중에서 1:10으로 희석된 플루오레신은 워터 플러그의 주입 후 및 샘플 주입 전 사용될 수 있다. 예를 들어, 플루오레신 용액은 2 내지 10초 동안 약 7 내지 34 kPa에서, 바람직하게는 약 5초 동안 약 21 kPa에서 유체역학적으로 주입된다. 이 피크는 가장 작은 표준 피크 전에 검출되고 두 가지 목적의 역할을 한다: 첫 번째로, 이는 표준을 위한 이동성 마커이고, 두 번째로, 이는 레이저의 제어로서 역할을 한다.

ISTD 및 검출가능한 형광 염료의 용액은 함께 또는 개별적으로 둘 중 하나의 순서로 주입될 수 있다. 각각 또는 둘 다는 또한 샘플과 혼합될 수 있다.

샘플 로딩을 위한 가장 바람직한 변수 및 샘플의 분리는 중성 내부 코팅, 바람직하게는 폴리아크릴아미드 코팅이 있는 용융 실리카 모세관에 대해 결정되었다. 모세관은 75 μm 내지 125 μm, 바람직하게는 약 100 μm의 내부 직경을 가지는 것이 바람직하다.

Beckman Coulter (eCap DNA Capillary, 100 μm I. D. 477477)로부터의 eCAP dsDNA 키트로 이용가능한 모세관이 가장 바람직하다. 주어진 변수는 다른 중성 코팅된 모세관으로 변형될 수 있다. 다른 모세관에 대해, 본 설정은 최적의 결과를 얻기 위해 특히 주어진 범위 내에서 약간 변형될 필요가 있다. 본 발명자들은 본 발명의 방법이 다른 모세관 및 모세관 겔 전기영동 시스템, 예를 들어, 폴리비닐 알코올-코팅된(PVA) 모세관(Agilent Technologies, Part number: G160U-61419)에 의해 수행될 수 있다는 것을 증명하였다.

모세관의 안정성을 개선하기 위해, 외부 폴리이미드 코팅이 보통 존재한다. 본 방법의 신뢰성을 개선시키기 위해 외부 측에서 모세관의 양 단부에서 2mm까지는 코팅되지 않는 것이 바람직하다. 추가로, 외부 코팅은 검출 자리에서 제거되어야 할 필요가 있다.

분석 전에, 모세관은 세척되어야 하고 낮은 배경신호 및 샘플 검출의 양호한 품질을 보장하도록 평형을 유지해야 한다.

더 긴 모세관, 예를 들어, 검출기까지 거리가 50cm인 60cm 모세관이 사용될 수 있지만, 검출기까지의 거리가 약 29-50 cm, 예를 들어 39 cm 또는 약 40 cm(예를 들어, 49 cm 또는 약 50 cm 총 길이)라면 결과의 품질은 영향받지 않는다는 것을 발견하였다. 모세관 길이의 감소는 더 짧은 분리 시간을 초래한다. 검출기까지의 길이에 따라서, 분리는 40분 또는 그 이상 동안 수행될 수 있다. 분리는 약 40-55분, 바람직하게는 약 45분 동안 수행되는 것이 바람직하며, 이는 약 10 bp 내지 약 10000 kb의 DNA를 검출하는데 충분한 것으로 나타났다. 필요하다면, 검출 시간은 관심의 크기의 핵산 검출을 허용하는 것에 적합하게 될 수 있다.

분리 동안 시스템의 온도는 약 17 내지 30℃, 바람직하게는 약 18 내지 25℃이다. 가장 양호한 결과는 약 20℃로 발견되었다.

모세관에서 마이크로버블 형성의 잠재적인 문제를 제거하기 위해, 약 14-69 kPa, 바람직하게는 약 34 kPa의 압력이 분리 동안 모세관에 적용될 수 있다.

본 발명의 방법에서 바람직하게 사용되는 모세관 겔 전기영동을 위한 시스템은 PACE MDQ Molecular Characterization System 또는 ProteomeLab PA 800 Protein Characterization System (Beckman Coulter)이다.

바람직한 분리 버퍼는 낮은 점성도를 가지는 가교되지 않은, 물리겔인 8 내지 9.5의 pH, 바람직하게는 8.8의 pH를 가지는 버퍼이다. 분리 버퍼는 폴리아크릴아미드를 함유하며 Tris-Borate 버퍼일 수 있다. 예를 들어, Beckman Coulter로부터의 eCAP dsDNA 키트에서 이용가능한 분리 버퍼가 사용될 수 있다.

샘플은 모세관 겔 전기영동과 양립가능한 샘플 버퍼에 있다. 바람직하게는, 버퍼는 Tris-HCl 버퍼(10 mM, pH 8-9, 가장 바람직하게는, pH 8.8)이다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 분석되는 샘플은 치료 또는 백신접종을 위한 약학 조성물 또는 포유동물, 특히 인간에 투여를 위한 다른 조성물이다. 샘플은 게놈 DNA 및/또는 그것의 분해 생성물의 존재에 대해 분석되는 것이 바람직하다. 샘플은 제조과정의 샘플 또는 백신 제조, 특히 인플루엔자에 대한 백신의 과정으로부터 최종 생성물인 것이 가장 바람직하다. 예를 들어, 이것들은 하기 한정되는 B1 내지 B8 샘플 또는 백신 제조의 1가 또는 3가 벌크의 샘플 중 어떤 것일 수 있다. 샘플은 또한 예를 들어 식료품이 상당한 양의 DNA, 특히 특정 크기의 DNA를 함유하지 않는다는 것을 증명하는 식료품, 예컨대 유전자이식 식물로부터 유래된 식료품으로부터 나올 수 있다.

바람직하게는, 백신은 세포 배양물, 예를 들어, MDCK, PER.C6, Vero 세포로부터 제조되는 인플루엔자 백신이다. 백신은 전체 비리온, 스플리트 비리온 또는 정제된 표면 글리코단백질을 포함할 수 있다.

인플루엔자 백신 생산으로부터의 샘플, 또는 일반적으로 포유동물에 투여에 적합한 조성물로부터 샘플의 분석의 내용에서, 본 발명의 방법은 DNA, 바람직하게는 숙주 세포로부터의 게놈 DNA 및/또는 그것의 분해 생성물의 분석에 바람직하게 사용된다. 이러한 DNA 및 DNA 분해 생성물은 한정되지 않은 길이를 가질 수 있다. 그러나, 본 방법은 또한 다른 샘플에서 DNA의 검출, 예를 들어, 한정된 길이의 DNA, 유전자 치료 벡터, RNA 또는 ssDNA의 분석을 위해 유리하게 사용될 수 있다. 바람직하게는, 본 방법은 샘플, 예를 들어, 백신 제제가 잠재적으로 종양 유발 DNA를 포함하지 않는다는 것을 증명하도록 수행된다.

본 발명의 방법은 샘플(따라서 유도되는 제제, 예를 들어, 백신 제제)이 종양유발 가능성이 없다는 것, 즉 그것이 500 bp 이상, 바람직하게는 400 bp 이상, 더 바람직하게는 200 bp 이상의 길이를 가지는 DNA 단편을 함유하지 않는다는 것을 증명하는데 유리하게 사용될 수 있다.

일부 샘플, 특히 상당한 양의 단백질 또는 고농도의 염을 포함하는 것에 대해, 하기에 상세하게 설명하는 것과 같이, 모세관 전기영동에 대한 로딩 전에, 샘플이 하기 단계들을 포함하는 방법으로 전처리 되었다면 상당히 더 양호한 결과가 얻어진다.

i) 샘플을 바람직하게는 SDS의 존재하에서 프로테이나아제 K에 의해 분해한다, 그리고

ii) 핵산이 추출된다.

이러한 전처리는 특히 단백질 및/또는 염과 같은 오염물의 존재하에서 주입 방법의 품질 및 민감성을 특히 향상시킨다. 핵산 추출은 또한 본 방법의 전반적인 검출 한계를 상승시키면서 샘플을 농축하기 위해 사용될 수 있다. 신뢰가능한 결과가, 예를 들어, 농도에 대해 약 10배로써 핵산 추출을 사용하여 얻어질 수 있다. 추출 후, 핵산은, 예를 들어 상기 설명한 바와 같은 CGE 내 샘플 버퍼로서 적당한 버퍼에서 바람직하게 취해진다.

바람직하게는, 비드, 예를 들어, 자기 비드에 대한 부착에 기초하는 핵산 추출 방법이 사용된다. MagNA pure® 시스템(Roche)이 핵산 추출을 위해 사용될 수 있다. 따라서 본 발명은 핵산 추출과 CGE를 조합하는 DNA 분석 방법을 제공한다.

바람직하게는, 본 발명의 방법은 하나의 크기의 DNA 단편에 대해 적어도 100 pg/ml, 적어도 80 pg/ml, 적어도 50 pg/ml, 적어도 10 pg/ml, 적어도 9 pg/ml, 적어도 5 pg/ml, 적어도 2 pg/ml 또는 적어도 1 pg/ml의 민감성을 가지는 핵산의 정량 분석을 허용한다. 하나의 크기, 예를 들어, 200 bp, 500 bp 또는 2000 bp의 DNA의 약 1 pg은 잘 인식할 수 있는 스파이크를 제공하는 샘플을 스파이킹하는데 사용될 수 있다. 검출 한계는 바람직하게는 하나의 크기의 적어도 200 fg DNA, 더 바람직하게는 하나의 크기의 적어도 20 fg DNA이다.

한 양태에서, 본 발명은 상기 설명한 방법을 수행하는 단계를 포함하는 핵산의 크기를 결정하는 방법을 제공한다. 핵산의 크기는 내부 또는 외부 크기 표준 또는 샘플을 스파이킹하기 위해 사용되는 핵산과 비교함으로써 결정된다. 한 구체예에서, 인플루엔자 백신 생성으로부터 샘플 분석의 내용에서, 외부 크기 표준이 사용되며, 이는 샘플의 각 시리즈 전 및 후에 실행되어야 한다.

본 발명은 또한 상기 설명한 방법을 수행하는 단계를 포함하는 샘플 내 핵산의 크기분포를 결정하는 방법을 제공하며, 핵산의 크기 분포는 내부 또는 외부 크기 표준과 비교함으로써 또는 샘플을 스파이킹 하는데 사용되는 핵산과 비교함으로써 결정된다.

바람직하게는, 본 방법에서 검출되는 신호는 강도 대 시간 또는 이동성을 나타내는 곡선으로 변형되며, 이는 크기 표준(들)의 시간 또는 이동성 또는 핵산에 대한 크기를 평가하기 위한 샘플을 스파이킹하기 위해 사용되는 핵산과 비교된다.

샘플 내 핵산의 크기분포에 관심이 있다면, 이는 관심의 크기 범위(예를 들어, 200 bp 이상, 250 bp 이상, 300 bp 이상, 400 bp 이상, 500 bp 이상)에서 핵산의 백분율을 결정하기 위해 분석될 수 있다. 이것 때문에, 곡선하면적은 관심의 크기 범위(즉, 관심의 크기 범위의 종점 사이, 예를 들어, 0-500 bp)에 대해 계산되고 곡선하총면적과 비교하여 관심의 크기 범위에서 핵산의 백분율을 얻는다.

그것의 민감성, 신뢰성 및 견실성 때문에, 본 발명의 방법은 치료 또는 백신접종을 위한 단백질 또는 핵산을 포함하는 샘플의 품질관리에 유리하게 사용될 수 있다. 따라서 본 방법은 백신, 바람직하게는 인플루엔자에 대한 백신의 제조 후 또는 동시에 바람직하게 사용된다.

한 양태에서, 본 발명은 포유동물에 투여를 위한 조성물의 제조를 위한 방법을 제공하며, 조성물로부터의 샘플을 본 발명의 방법에 의해 분석한다. 바람직하게는, 본 조성물은 약학 조성물, 가장 바람직하게는 백신, 예를 들어, 인플루엔자에 대한 백신이다. 샘플은 또한 예를 들어, 식료품이 상당한 양의 DNA, 특히 특정 크기의 DNA를 함유하지 않는다는 것을 증명하는 식료품, 예컨대, 유전자이식 식물로부터 유래된 식료품으로부터 나올 수 있다.

본 발명은 또한 모세관 겔 전기영동에 의해 샘플을 분리하는 단계 및 레이저 유발 형광에 의해 핵산을 검출하는 단계를 포함하는 샘플, 예를 들어, 인플루엔자 백신과 같은 백신 제조의 다양한 단계로부터의 샘플 내 핵산의 존재 및/또는 크기를 분석하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 핵산은 게놈 DNA 및/또는 DNA, 특히 게놈 DNA의 분해 생성물이다.

샘플은 제조 과정으로부터의 제조 과정 샘플 또는 최종 생성물, 예를 들어, 인플루엔자 백신의 제조로부터 1가 벌크 또는 3가 벌크일 수 있다. 샘플을 전처리 및/또는 로딩하고 분석을 수행하는 바람직한 방법은 본 방법의 최적의 민감성 및 신뢰성을 달성하기 위해 유리하게 사용될 수 있다. 이 방법은 샘플(예를 들어, 세포 배양물로부터 유도된, 예를 들어, 포유동물에 투여를 위한 조성물, 예를 들어, 백신 제제, 특히 인플루엔자 바이러스 제제)이, 예를 들어, 200 bp 이상, 250 bp 이상, 300 bp 이상, 400 bp 이상, 500 bp 이상의 길이를 가지는 핵산과 같이 종양유발 가능성을 가지는 핵산을 함유하지 않는다는 것을 증명하기 위해 유리하게 사용될 수 있다. 따라서 본 방법은 샘플의 종양유발 가능성 및/또는 기능적 유전자의 존재를 결정하기 위해 사용될 수 있다.

따라서 본 방법은 또한 조성물, 특히 포유동물에 투여를 위한 조성물, 예컨대 백신 제제의 종양유발 가능성을 결정하는 방법을 제공하며, 조성물로부터 샘플 내 게놈 DNA 또는 그것의 분해 생성물은 모세관 겔 전기영동에 의해, 바람직하게는 본 발명의 방법에 따라서 분해된다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 분석되는 백신에 관한 것이다.

본 발명 및 이것의 바람직한 구체예를 야기하는 실험은 예시를 위해 하기 실시예에서 설명되지만, 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 변형이 만들어질 수 있고 일부 최적화 단계는 다른 수단을 사용하여 또는 사용하지 않고 유리하게 사용될 수 있다는 것이 당업자에 의해 용이하게 인식될 것이다.

본원에서 모든 인용되는 간행물은 본원에 완전히 포함된다.

도 1 30초 동안 103 kPa에서 유체역학적 주입이 있는 모세관 겔 전기영동에 의해 심한 DNA 오염이 있는 인플루엔자 백신 발효의 제조과정 샘플의 분석, 샘플의 희석은 없음. 샘플 B3 및 B4에 대한 스케일은 5배 더 작다.
도 2 10초 동안 7 kPa에서 유체역학적 주입이 있는 모세관 겔 전기영동에 의한 1 kb 표준과 비교한 MDCK 게놈 DNA의 분석. 괄호안의 수는 캘리브레이션 피크의 정상 지점을 나타낸다.
도 3 6.7/6.8 하에서 설명한 바와 같은 방법에 의한 B3 샘플의 분석. 결정한 크기 범위는 그래프에서 나타낸다.
도 4 6.7하에서 설명한 바와 같은 본 발명의 방법에 의해 가장 적은 DNA의 농도를 가지는 B8 샘플의 분석(Threshhold® 분석에 의해 결정한 바와 같이 <1 ng/ml). 결정된 크기 범위는 그래프에 나타낸다. 21 bp보다 큰 핵산은 검출되지 않았다.
도 5 30초 동안 10 kV에서 샘플 주입으로 6.7하에서 설명한 바와 같은 방법에 의한 1 kb 표준의 분석
도 6 처리 없이(상부 곡선) 및 16시간 동안 베타-프로프리오락톤 처리 후(하부 곡선) 5초 동안 9 kV에서 주입으로 10 bp 표준의 분석. 최소 농도에서조차도, 1668 bp 피크는 여전히 정확한 크기로 검출될 수 있다.
도 7 1 kb 표준 및 내부표준(23개 염기, ssDNA)에 의한 캘리브레이션, 이동성에 따른 피크의 확인.
도 8 10개의 발효로부터 8개의 과정 단계들에서 DNA의 총량의 비교(DNA 함량(μg), 제조과정의 대조군 B1-B8).
도 9 창까지 모세관의 다른 길이에 대한 샘플(194 bp 분획을 포함, 1 μg/ml)의 유체역학적 주입(HD)의 비교. x-축: 창까지 길이의 플러그%, y-축: 임의 단위(32 Karat 소프트웨어에 의해 제공되는 절대값), 첫 번째 값: 194 bp 피크의 피크 높이, 두 번째 값: 194 bp 피크의 피크 면적.
도 10 각각 3가지의 농도(상부 -3-: 1 ng/ml, 중간 -2-: 100 pg/ml, 바닥 -1- : 10 pg/ml)로 유체역학적 주입에 의해 검출기 창에 모세관의 A:25% 및 B: 50% 로딩이 있는 대표적인 샘플의 CGE 분리의 비교(3 psi /21 kPa, A: 3.75 분, B: 7.5 분),
도 11 인플루엔자 균주 및 마커 농도의 CGE 분석. CGE 분석(3 psi (21 kPa)에서 유체역학적으로 주입되는 샘플, 검출기 창에 대한 길이의 30%): 1-dsDNA 1000 test mix, Beckman, 표준 100 pg/ml. 2-솔로몬, 3-말레이시아, 4-위스콘신.
도 12 스파이킹된 샘플의 CGE 분석. 샘플을 3 psi (21 kPa), 검출기 창에 대한 길이의 30%에서 유체역학적으로 주입하였다: 스파이킹된 1-dsDNA 표준, 2+3 - 바이러스 균주 Brisbane, 200 bp, 500 bp 및 2000 bp의 한정된 DNA로 스파이킹된 샘플 (2번 반복) .
도 13 프로테이나아제 K 및 DNA 추출로 전처리되고, 스파이킹된 MDCK 세포로부터 추출한 게놈 DNA의 CGE 분석. 게놈 DNA(바닥에서 상부: 스파이킹된 1-dsDNA 표준. 2+3 - 1Ong/ml MDCK DNA, 4+5 - 110 ng/ml MDCK DNA)를 200 bp, 500 bp 및 2000 bp의 한정된 DNA 단편으로 스파이킹하였고, 샘플을 3 psi (21 kPa), 검출기 창에 대한 길이의 30%에서 유체역학적으로 주입하였다.

실시예

1. 샘플

백신의 제조를 위해, MDCK 세포(Madin Darby Canine Kidney)를 예를 들어, EMEA에 의해 인정되는 생성물 Optaflu의 제조를 위해 당업계에 공지된 프로토콜에 따라서 사용할 수 있다. 바람직하게는, 현탁액 셀 라인 MDCK-CDM (Novartis Vaccines)이 사용된다.

간단하게, 인플루엔자 서브유닛 백신의 제조를 위해, 인플루엔자 바이러스는 MDCK-CDM 현탁액 배양물에서 배양되며 몇몇 단계들을 포함하는 과정들에 의해 정제된다.

바이러스 수확이 원심분리에 의해 제거된 후, 여과 (0.45 μm) 및 양이온 크로마토그래피를 수행한다. 결합 바이러스를 NaCl 용액을 사용하여 컬럼으로부터 용리하고 그 다음 바이러스를 농축한다. 바이러스는 베타프로프리오락톤(BPL)에 의해 불활성화되며, 이는 또한 여전히 존재하는 어떤 MDCK DNA를 심하게 손상시킨다.

서브유닛 백신, 헤마그글루티닌 및 뉴라미니다아제의 제조를 위한 표면 항원을 CTAB(세틸트리메틸암모늄브로마이드)에 의해 가용화하고, 바이러스 코어를 초원심 분리에 의해 제거한다. CTAB를 제거한다. 이후에, 22 μm의 막에 대한 여과를 수행한다. 이들 단계들 다음에 음이온 교환 크로마토그래피 및 정용-한외여과를 한다. 정제를 여과에 의해 끝낸다. 이에 의해, 또한 1가 벌크 또는 모노벌크로 불리는 항원 농축물을 얻는다. 마이크로여과한 모노벌크를 백신의 제형화를 위해 식물을 혼합하는 단계로 보낸다.

본 과정은 또한 하기 다이아그램으로부터 볼 수 있으며, 각 단계의 부피는 제공되고 특정 단계 후 취한 샘플은 B1-B8로써 나타난다:

● 교반병에서 세포의 배양 및

● 바이러스의 배양

● 분리 및 여과(B1)

● 확실한 바이러스 수확

● 양이온 교환 크로마토그래피(B2)

● 제 1 농도/정용여과(diafiltration)(B3)

● 불활성화/가수분해(B4)

● CTAB-처리/초원심 분리

● 제 1 멸균 여과 (0.2 μm) (B5)

● 흡착기 처리 (30 1)

● 제 2 멸균 여과(0.2 μm) (B6)

● 음이온 교환 크로마토그래피(B7)

● 제 2 농도/정용여과(10 1)

● 멸균 여과 (0.2 μm) (B8)

● 항원 농축물/1가의 벌크 (10 1)

1가의 벌크를 얻은 후, 3개의 다른 바이러스 균주(보통 2개의 A 균주 및 1개의 B 균주)로부터 항원을 포함하는 3가의 벌크를 발생시켰다. 현재 백신은 대부분 3가의 백신이다. 모든 사양 및 안전성 필요조건이 동의된다면, 백신은 판매할 준비가 된다. 중요한 것은, 샘플 B8은 백신의 분석 및 품질관리에 결정적인 중요성을 가진다는 것이다.

분석을 위해 샘플을 취한 표시한 시점을 본 과정 중에 "창"으로서 사용할 수 있다. 명확하게, 이들 제조과정의 샘플은 그것의 화학적 조성이 서로 다르다. 10³ 까지일 수 있는, 함유되는 DNA의 농도에서 큰 차이가 있다.

하기에서, 샘플은 그것의 조성과 관련하여 간단하게 특정되고, 분석의 가능성있는 문제가 언급된다(인용되는 DNA 함량은 10개의 연이은 분석으로부터 초래된다):

● B1 : 단백질로 오염된 정제 바이러스 수확. 많은 양의 게놈 DNA (40 000 bp 이하)를 포함하는 100-4500 ng/ml의 DNA 함량. 단백질의 간섭 영향은 가능성이 있다. 가변적이고, 많은 양의 DNA는 겔의 과부하를 야기한다. 선택된 방법의 크기 범위는 관심의 분자에 적당해야 한다.

● B2 : CS 컬럼으로부터 40% 피크, 제 1 농도 단계. 양이온 교환에 의해, DNA를 부분적으로 제거한다. 단백질 및 염(컬럼으로부터 용리)으로 강하게 오염된 50-750 ng/ml 사이의 DNA 함량. 단백질의 간섭 영향은 가능성이 있다.

● B3 : 500 kDa의 크기 배제 및 버퍼 교환과 함께 정용여과에 의한 제 2 농축 단계. 1000-3000 μg/ml의 단백질 농도. 추가로, 샘플은 5 μg/ml 이하로 결과에 영향을 미치는 Tween 80, 비-이온성 세제를 포함하며, 이는 모노벌크 이하로 제조과정 중에 제거되지 않는다. DNA 함량은 제조과정에서 가장 높은 농도인 500-5500 ng/ml이다. B1에 대한 차이점.

● B4 : B3과의 유일한 차이는 BPL의 첨가와 몇 시간 동안의 배양이다. DNA 함량은 50-1200 ng/ml로 떨어지며, 그것의 특징은 변화된다. 단백질 및 세제 함량은 B3과 같다.

● B5 : 막 단백질은 CTAB에 의해 가용화되고, 초원심분리에 의해 수행되었다. CTAB 함량은 800-3000 μg/ml 사이이다. 세제 및 단백질 농도는 B3과 유사하다. DNA의 함량은 5-26 ng/ml으로 떨어진다.

● B6: CTAB를 제거하였고, 샘플을 멸균 여과하였다. 세제 및 단백질 함량은 감소된다. DNA의 함량은 <1-15 ng/ml이며, 이는 본 과정의 마지막까지 변하지 않는다.

● B7 : 음이온 교환 크로마토그래피에 의한 최종 정제 단계를 수행하였다. 추가 물질은 B6와 같다.

● B8 : 모노벌크. 물질을 정용/한외여과하였고 버퍼를 교환하였고, 대략 2배로써 단백질 농도에서 상승을 초래하였다. 이는 DNA 크기의 분석에 대하여 가장 중요한 샘플이다.

단백질 함량은 1500 μg/ml이며, DNA 함량은 1 ng/ml (통상적인 검출 한계 하에서) 내지 15 ng/ml 미만이다.

2. 샘플 전처리

샘플 전처리는 변경될 수 있으며, 예를 들어, 단계들의 순서가 변경되어 분석되는 샘플에 따라서 최적의 결과를 이룰 수 있다.

2.1 프로테이나아제 K

일부 실시예에 대해(하기 참조), 샘플들을 프로테이나아제 K로 분해하였다. 간섭 단백질, 특히 뉴클레아제를 이 단계에 의해 제거한다.

20 μl의 효소의 희석되지 않은 저장 용액(2 mg/ml 프로테아나아제 K, Cat. No. 19133, Qiagen)을 1ml의 샘플에 대해 사용하였고 56℃에서 16 내지 20시간 동안 배양하였다(워터배스, +/- 3℃)

분해가 SDS의 존재하에서 수행된다면 더 양호한 결과가 얻어진다는 것을 발견하였다. 2% SDS-용액을 프로테이나아제 K(2 mg/ml)에 1:1로 첨가하였다. 50 μl의 이 혼합물을 500 μl의 샘플을 분해하기 위해 사용하였다. 혼합 후, 혼합물을 56℃에서 밤새 배양하였다(16 내지 20시간).

2.2 DNA 추출

DNA 추출을 예를 들어, 샘플 내 함유된 단백질 및 염으로부터 DNA의 정제를 위해서뿐만 아니라, 선택적으로 샘플의 농축을 위해서 사용할 수 있다.

DNA를 예를 들어, 제조업자의 설명서에 따라서 Wako Pure Chemical Industries로부터의 요오드화나트륨 방법을 위한 키트에 의해 추출할 수 있다.

또 다르게는 DNA를 제조업자의 설명서에 따라서 Roche로부터의 MagNA pure® 시스템을 사용하여 추출하였다. 이는 본 과정의 자동화를 허용한다. 10배로써 DNA의 농도를 달성하였다.

2.3 농도

DNA 추출에 의해 정제되는 샘플을 60분 동안 진공 원심분리기(Speedvak)로 완전히 건조시켰다. 10 μl 물에 펠렛의 용해는 성공적이지 않았다. 50 μl까지 용매의 부피의 상승은 단지 부분적인 성공을 이끌었다. 낮은 DNA 함량을 가지는 샘플(B5-B8)로부터의 펠렛을 웰에 용해시켰고 한편, 다른 샘플로부터의 펠렛을 완전히 용해시키지 않았다. 본 접근은 하기 실험에 대해 추가로 사용하지 않았다.

다음에, 막에서의 농도에 대해, 3 kDa 및 10 kDa의 배제 크기를 가지는 친수성 셀룰로오스 막을 시험하였다(Microcon YM-3 및 YM-10, Millipore). 500 μl의 최대 로딩을 사용하였다. 유체가 필터에 남지 않았을 때 원심분리를 중단하였지만, 그러나, 필터 단위를 2번의 추천 시간 동안 최대로 원심분리하였다. 필터 상에 여전히 유체가 있다면, 필터의 막힘을 의심하고, 매트릭스는 각 샘플의 농도에 적당한 것으로 고려하지 않았다. 사용한 막 필터의 불감부피는 10 μl이었다. 따라서, 이론적 농도계수는 50이다.

하기 변수를 원심분리를 위해 사용하였다:

● 3 kDa 막: 14000 g, 100분, 25℃

● 10 kDa 막: 14000 g, 30 분, 25℃.

농축 샘플을 수확하기 위해, 필터 단위를 뒤집고 새로운 캡에서 원심분리하였다(100Og, 3분, 25℃) .

전처리하지 않은 단백질을 포함하는 샘플이 이런 접근에 의한 농도에 덜 적합하다는 것을 발견하였다. 두 개의 막 모두 이 경우에 용이하게 차단되었다. 단지 프로테이나아제 K에 의해 분해된 샘플을 2배의 시간 동안 원심분리하여야 했다. 샘플 B1 및 B2에 대해, 여전히 3 kDa 막을 차단하였다. 더 짧은 시간에 훨씬 더 양호한 결과가 10 kDa 막에 의해 획득되었다. 100 내지 1000 bp의 관심의 범위에서 DNA 단편이 상실되지 않았고, 거의 40배로써 농축은 막 원심분리에 의해 도달된다는 것을 비교실험이 증명하였다(데이터는 제시하지 않음).

막에 있어서 원심분리에 의한 DNA의 농축은 본 발명의 방법에서 샘플의 전처리에 사용될 수도 있고 또는 사용되지 않을 수도 있다.

3. DNA의 정량화

핵산의 농도를 260 nm에서 흡광을 기초로(단백질에 대해 280nm에서 흡광과 비교하여) 결정할 수 있다. 그러나, 검출 한계는 약 0.25 μg/ml이며, 몇몇의 다른 물질은 또한 동일한 파장에서 흡수한다.

PicoGreen dsDNA 정량화 시약(Molecular Probes)은 약 312 pg/ml dsDNA의 검출한계를 가지는 매우 민감한 형광염료를 기초로 한다. 본 방법은 또한 RNA 또는 ssDNA의 검출에 적당하며, 본 시험은 빨리 행해지며 다소 저렴하다. 그러나, 본 결과는 샘플 내 오염물의 농도에 따라서 30%까지 다르다. 이 시험의 결과는 샘플 내 DNA 농도를 추정하기 위해 사용될 수 있다.

DNA 농도의 결정을 바람직하게는 Threshold® System[Threshold® Total DNA Assay Kit from Molecular Devices]으로 수행한다.

송아지 흉선 DNA를 표준으로서 사용하였다. 백신 생성의 과정 단계로부터 모든 샘플은 하기 전처리를 받았다: 16-20시간 동안 56℃에서 프로테이나아제 K-SDS-분해(상기 참조) 및 상업적 키트로 DNA 추출. 대조군, 표준 및 샘플을 105℃에서 15-30분 동안 변성시켜 샘플은 ssDNA로서 존재하였다. 모든 샘플을 37℃에서 60분 동안 표지 시약(Biotin-SSB (단일 표준 결합 단백질) 및 우레아제에 콘쥬게이트된 DNA에 대한 항체)으로 배양하였다. 획득한 반응 복합체를 결합한 스트렙타아비딘과 함께 특정 필터 단위, 니트로셀룰로오스 막에서 여과하였다. 세척 단계 후, 필터 막을 기질 용액으로 채운 전위차식 검출기에 제공하고, 검출을 시작한다. 우레아제에 의해 촉매화한 우레아의 분해는 표면 포텐셜의 변화를 야기한다. 시간에 따른 전압의 곡선은 샘플 내 DNA 농도에 비례한다. 데이터를 동역학적으로 기록하고 표준 곡선을 기초로 정량화한다.

핵산의 크기 분포를 결정하기 위해 본 발명의 방법과 조합하여, 예를 들어, Threshold® 시스템에 의한 절대 DNA 함량의 결정은 특정 크기의 핵산의 양을 결정하기 위해 사용될 수 있다.

4. 슬랩 겔에서 아가로스 겔 전기영동

브롬화에티듐(EtBr)이 있는 바로 사용할 수 있는 겔 카세트를 제조업자의 프로토콜(Invitrogen)에 따라서 사용하였다. DNA의 크기 범위에 따라서, 0.8%, 1.2%, 2% 및 4%의 농도를 사용하였다. 분리를 38분 동안 60 V에서 수행하였다. 1:200 희석으로 1 kb+ DNA 래더 표준 (Invitrogen)을 크기 마커로서 사용하였다.

민감성을 개선하기 위해, 겔 카세트를 열었고 겔을 30-45분 동안 SYBR®-Gold (Molecular Probes, Eugene, USA)로 염색하였다. 염료의 농축물을 제조업자의 설명서(Molecular Probes, product information, revised 2001)에 따라서 TE 버퍼에서 1:10 000으로 희석하였다. 희석한 용액을 5일 후 교환하였다. 겔을 30-45분 동안 염색하였다. SYBR®-Gold로, 민감성을 EtBr 균주에 대해 5배로써 향상시켰다.

가장 높은 농도의 DNA를 가지는 생성 시리즈를 사용하였다. 가장 높은 농도를 가지는 2개의 샘플(B3, B4)을 우선 분석하였다. DNA 농도에 대한 기준으로서, Threshold® 전체 DNA 분석을 사용하였다. 2개의 샘플을 전처리 없이, 또는 DNA 추출과 함께 및 DNA 추출 없이 프로테이나아제 K로 분해 후 사용하였다. 전처리가 있고 없는 중요한 차이점은 단백질과 DNA 사이의 상호작용에 기인하여 관찰된다(데이터는 제시하지 않음). 아마도, 더 큰 복합체가 형성되며, 이는 겔 안으로 이동할 수 없다. 이를 효소 분해에 의해 용해하였다. DNA 추출은 본 내용에서 추가 이점을 야기하지 않았다. 따라서, 전처리에 의해 달성되는 개선을 이들 샘플에 대해 확인할 수 있다.

분석을 동일 시리즈로부터 모든 제조 과정의 샘플로 반복하였다. 이 실험에서, DNA-추출은 간섭 화합물 없이 명확한 결과를 얻는데 도움을 준다(데이터는 제시하지 않음). 프로테이나아제 K 단독의 처리는 B2 샘플 내 높은 염 농도 및 B5 샘플 내 CTAB의 간섭 존재(세틸트리메틸암모늄 브로마이드)를 제거하지 않았다. DNA 추출은 모든 간섭 물질을 제거하였다.

그러나, 분석은 샘플 내 DNA의 농도는 나중 제조 과정의 단계들로부터 취해지거나 또는 최종 생성물 내 농도는 이 방법에 의한 검출에 충분하지 않다는 것을 보여주었다. 민감성에 대하여 명확한 결과를 얻기 위해, MDCK 세포로부터 게놈 DNA의 희석 시리즈를 분석하였다(데이터는 제시하지 않음).

10 ng/ml의 최소 DNA 농도를 발견하였다. 이는 백신의 생성과정에서와 같이 DNA 분석의 더 민감한 방법을 확립하는 필요성을 증명하며, 이러한 DNA 농도는 이미 샘플 B5로부터 출발하여 도달될 수 있다.

분석의 초점은 DNA의 크기분포에 있다. 1.2% 아가로스 겔에서, 100 bp보다 작은 단편은 어떤 샘플로 검출되지 않는다는 것을 보여주었다. 대조적으로, 모세관 전기영동 (하기 참조)에서 100 bp 보다 작은 많은 단편들이 특히 베타프로피오락톤으로 처리 후 검출되었다.

슬랩 겔에서 이 크기 범위를 참조하기 위해, 4% 아가로오스 겔을 0.8% 아가로오스 겔에 대한 대조로서 사용하였다. 2개의 모노 벌크(B8) 샘플을 분석하였다. 0.8% 겔은 작은 단편의 분리에 적당하지 않았고, 이는 러닝 프론트에서 지연되었고 다른 크기 범위로 나타났다. 4% 겔은 작은 단편의 검출에 더 적당하였다. 따라서, 두 농축물의 아가로스 겔은 완전한 크기 범위의 분석을 위해 필요로 되었다.

5. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동

폴리아크릴아미드는 분명하고 매우 얇은(1 mm) 겔의 생성을 허용하며, 이는 매우 분명하고 뚜렷한 밴드를 야기한다.

폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 위해, 4 내지 20%의 기울기 겔, TBE (Tris-Borat-EDTA 버퍼, Novex)를 사용하였다. 35분 동안 200V에서 분리하였다. 겔을 SYBR®-Gold로 염색하였다. 크기 마커로서, 1kb+ 표준을 1:200의 희석으로 사용하였다. 완전한 일련의 제조과정 샘플(B1-B8)을 분석하였다(데이터는 제시하지 않음).

아가로스 슬랩 겔과 비교하여, 밴드의 더 양호한 선명도를 달성하였다- 특히 관심의 100 kb의 크기 범위에서. 완전한 범위에 있어서 단편 크기의 분석은 아가로스 겔 전기영동에서 더 양호하다.

그러나, 슬랩 겔 내 폴리아크릴아미드 겔 전기영동은 또한 나중의 제조과정 샘플 내 핵산의 결정을 허용하는 민감성을 달성하지 않는다. 게다가, 본 방법은 비싸고 독성인 아크릴아미드의 조작을 필요로 한다.

6. 모세관 겔 전기영동

6.1 분리 시스템의 기본적 설정

P/ACE MDQ Molecular Characterisation System (Beckman Coulter)을 분리를 위해 사용하였다. 488 nm의 여기 및 520 nm의 방출 필터의 파장을 가지는 아르곤 이온 레이저를 검출을 위해 사용하였다. 이 시스템에 사용되는 모세관은 내부 측에 중성으로 코팅된 100 μm의 내부 직경을 가지는 용융 실리카 모세관이었다(eCap dsDNA 키트, Beckman Coulter). 다른 물질이 모세관에 대해 사용될 수 있다. 중성 코팅(폴리아크릴아미드계 친수성 표면)은 전기삼투흐름(EOF)을 거의 완전하게 억제하며 모세관의 내부 표면에 의한 분석물의 상호작용을 최소화한다. 두 효과는 모두 밴드의 선명도 및 재현성을 개선한다.

모세관의 내부 표면을 커버하기 위해 이중 코팅을 사용하였다. 제 1 코팅을 용융 실리카 모세관의 자유 실란올 기에 결합하고 이것들을 커버하였다. 친수성 폴리아크릴아미드의 제 2 코팅은 소수성 상호작용을 감소시킨다. 이 코팅은 약 200번 이상의 분리에 안정하며, 분리를 악화시키는 힘은 안정성의 상실에 대한 표지로서 사용될 수 있다.

모세관의 기계적 안정성을 개선하기 위해, 모세관의 외부 표면을 약 10 μm의 폴리이미드 코팅으로 커버하며, 코팅이 UV 광선을 투과하지 않기 때문에, 이를 검출 동안 제거한다.

처음에 사용한 모세관의 완전한 길이는 60cm이었고 검출기까지 50cm 이었다. 최적화의 과정을 위해, 길이를 50cm로 변경하였고 검출기까지는 약 40(39cm)이었다. 모든 분리를 역극성으로, 즉 음극 끝에서 검출기에 의해 수행하였다. 분리 버퍼로서, 약 8.8-8.9의 pH를 가지는 Tris-Borat 버퍼를 사용하였다. 버퍼는 본 발명의 방법에 가장 적당한 낮은 점성도를 가지는 가교되지 않은 물리겔의 군에 속한다. 이는 역학적 기공구조를 가지며 열에 민감하지 않다. 사용 전, 버퍼를 0.45 μm 시린지 상단 필터로 여과하였고 초음파 배스에서 10분 동안 탈기하여 버블의 형성을 방지한다.

각 사용 후 겔 매트릭스를 교환하였다. 첫 번째 분리 전, 새로운 모세관을 새로운 버퍼와 함께 136 kPa (20 psi (평방 인치 당 파운드), 1 psi는 6894,75728034313 Pa에 해당)에서 10분 동안 조절하였다. 각 실행 전, 모세관을 136 kPa에서 5분 동안 새로운 버퍼로 채웠다. 각 분리 후, 모세관을 204 kPa에서 5분 동안 버퍼로 세척하였다. 바람직하게는, 증류수에 의한 세척 단계를 수행하지 않았고, 이 방법으로서, 모세관 내 조건을 더욱 일정하게 유지하여, 모세관의 내부 코팅의 더 긴 수명을 야기한다. 3.9 μl의 모세관의 부피로, 요구되는 버퍼의 양을 무시하였다. 제조업자에 의해 제안되는 20℃의 분리 온도를 사용하였다.

LIF-검출기(레이저 유발 형광)의 변수를 하기와 같이 설정하였다:

- 역학적 범위: 100 RFU

- 필터: 정상

- 피크 너비 16-25

- 데이타 속도 4 Hz.

통합을 위한 알고리즘을 "표준 CE"에서 설정하였고 이동 시간과 관련하여 수행하였다. LIF-단위의 캘리브레이션을 제조업자의 프로토콜에 따라서 수행하였고[P/ACE MDQ LIF Detector Manual, 718113-AB, Beckman Coulter, Fullerton, USA] 획득한 1.1배를 사용하였다.

6.2 최적화

하나의 일련의 제조 과정 샘플로부터, 가장 높은 DNA 함량을 가지는 2개의 샘플을 사용하였다(B3 및 B4). 샘플을 상기 설명한 바와 같이 DNA-추출에 의해 정제하였다.

우선, 프로토콜에 따라서 표준 방법[Care and Use instructions for eCAP dsDNS 1000, 726412-C, Beckman coulter]을 사용하였다. 200 V/cm의 전계 강도, 3 kPa에서 10초에 걸쳐 유체역학적 주입 및 총 20분의 지속기간을 사용하였다. 컬럼을 로딩하기 위한 변수를 높은 민감성을 가지는 게놈 DNA를 검출하기 위해 그것의 적합함에 대해 연구하였고, 2개의 선택된 샘플에 대해 최적화하였다.

백신 제조의 베타프로프리오락톤 처리 효과를 명확하게 관찰할 수 있었다. B3-샘플과 대조적으로, 피크는 게놈 DNA에 대해 검출되지 않았지만, 작은 단편에서 DNA의 분해가 관찰되었다(데이터는 제시하지 않음).

더 긴 시간 기간 동안 저장한 B3-샘플에서, 더 작은 단편에서 게놈 DNA의 분해를 또한 관찰하였다. 예를 들어, 현재 발효로부터 B3 샘플을 4개월 동안 4-8℃에서 저장한 B3 샘플(동일한 바이러스 균주에 의한 발효로부터)과 비교하였다. 아마도 샘플 내 뉴클레아제의 효소 활성에 기인하는 분해는 중간 길이의 DNA 단편에 대해 가장 강하다(20-25분). 이 효과 때문에, 뉴클레아제가 샘플에 존재하고 분해가 방지되는 것이라면, 프로테이나아제 K에 의한 분석에 대해 취한 샘플의 즉시 처리가 필요하다. 낮은 특이성을 가지는 엔도프로테이나아제인 프로테이나아제 K는 모든 단백질을 분해하고 불활성화한다.

이 효과는 나중의 제조 과정 샘플(B4-B8)에 의해 관찰되지 않는다. 이는 효소가 다운스트림 과정을 견디지 못하는 것으로 문제없이 추정될 수 있다.

가장 양호한 결과를 가지는 변수의 조합은 추가 분석을 위해 유지된다.

완전한 일련의 제조 과정 샘플을 DNA-추출에 의해 정제하였고 모든 샘플 내 핵산이 결정될 수 있는지 여부를 참조하기 위해 분석하였다(도 1).

이들 예비 실험에서, 몇몇 문제가 발생하였다: 주로, 분석의 민감성은 모든 샘플 내 핵산을 분석하기에 충분하지 않다. 게다가, 예상한 바와 같이, DNA는 뾰족하게 분리된 피크로 나타나지 않으며, 이는 크기의 정확한 결정을 어렵게 만든다. 또한, 처음 3개의 과정 샘플에 관하여 완전한 DNA의 결정에서, B1에 대해서보다 B3에 대해서 약 5배 더 높은 DNA 농도를 나타낸 참고 시험으로서 Threshold® 분석과 상관관계가 없었다. 그러나, 도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 980 ng/ml DNA를 가지는 B1 샘플의 전기 영동도는 12 ng/ml의 B7 샘플과 더욱 유사한 것으로 나타났다.

6.3 캘리브레이션

정량 분석을 위해, 적당한 크기 표준이 필요하였다. 완전한 분리를 달성할 목적으로, 10 bp 마커(DNA ladder Cat. No. 10821-051, Invitrogen), 1 kb 마커 (eCAP 1000 dsDNA test mix, φX-174 HaeIII, Cat. No. 477414, Beckman Coulter) 및 2 kb 마커(20.000 dsDNA test mix λDNA/HindIII 단편, Cat. No. 477483 Beckman Coulter)를 비교하였다. 평가를 위한 기준은 2개의 이웃하는 DNA 분획의 기준선의 분리 및 통합을 위한 그것의 적절성에 대한 피크의 형태이었다. 분리 과정의 지속은 단지 부수적인 관심을 가진다. 초점은 샘플 내 존재하는 DNA 길이의 완전한 범위의 적절한 분리에 있다. 마커에 의한 캘리브레이션은 분리를 위해 선택된 매트릭스와 함께, 선형성의 면적은 약 1000 bp의 길이로 남는다는 것을 보여주었다. 낮은 범위에서, 이는 약 10 bp로 연장한다(데이터는 제시하지 않음).

예상했던 바와 같이, 분화력은 큰 분자에 덜 적합한 분리 매트릭스를 만드는 1000 bp 이상의 DNA 분자에 대해 감소하였다. MDCK 게놈 DNA를 모세관 전기영동에 의해 분석하였다(도 2). MDCK 피크의 넓은 형태는 DNA가 분리되지 않았고, 크기에 의해 용이하게 분석될 수 없음을 나타내었다. 그러나, 중요한 것은 본 발명 하의 문제에 충분한 게놈 DNA의 존재가 검출될 수 있다는 것이다. 선택 조건하에서, 게놈 DNA의 양호한 검출을 위해 35분이 필요하였다.

크기 표준 및 샘플이 공동-주입된다면, 양과 관련한 가장 정확한 결과가 획득된다. 1회 실행으로 상기 언급한 모든 3가지 크기 표준을 분리하는 것이 가능한지 여부를 시험하였다(데이터는 제시하지 않음). 피크의 양호한 분리를 획득하였다. 분석되는 샘플 내 DNA의 길이가 공지되어 있다면, 공동-주입은 분석에 양호한 방법이 되는 것으로 보인다. 그러나, 이 선택은, 샘플 피크 및 마커 피크가 덧붙여지는 위험이 높기 때문에, 크기가 알려져 있지 않은 경우에 또는 크기가 마커 단편의 크기에 대응한다면 바람직하지 않다.

분리의 각 시리즈의 시작 및 마지막에, 표준에 의한 캘리브레이션을 수행할 수 있다. 본 발명 하의 분석에 대해, 1kb 표준(가장 작은 밴드 72 bp)이 바람직하며, 모든 추가 실험에 대해 사용하였다. 선택 매트릭스에서 분리는 10 bp의 범위에서 선형이기 때문에, 외삽은 72bp 이하의 크기의 결정을 위해 사용될 수 있다.

저장 용액으로서 농축 형태로 표준을 저장하는 것은 바람직하다(예를 들어, 200 μg/ml). 희석액은 매일 새로 제조되어야 한다.

6.4 분리의 길이 및 전계 강도

상기 설명한 실험에 대해, 분리를 15초 동안 7 kPa, 역극성에서 200 V/cm, 검출기에서 50cm의 모세관 길이 및 분리 온도 20℃로 유체역학적 주입 후 수행하였다. 이들 설정으로, 1 kb 표준을 약 35분에 분리할 수 있었다.

그러나 더욱더 양호한 결과, 특히 분리의 더 양호한 효능 및 분석의 더 짧은 지속이 250 V/cm으로 획득된다는 것을 발견하였다. 300 V/cm와 같은 더 높은 값은 분해능을 상당히 감소시킨다. 따라서, 200 내지 275 V/cm, 특히 225 내지 265 또는 240 내지 260 V/cm로 분리가 바람직하다. 하기 실험을 250-255 V/cm로 수행하였다. 분석의 지속에 관하여, 모세관의 길이는 검출기에서 40cm가 되도록 선택하였다. 이 변화는 분리 효율에 영향을 미치지 않았다.

이 측정에 의해, 분석의 지속을 35분 내지 23분으로 단축시킬 수 있었다.

필요 시간을 더 감소시키기 위해, 분리 지속시 온도의 효과를 분석하였다. 이는 30℃의 분리 온도가 분리 시간을 감소시켰지만, 271 bp 및 281 bp의 피크의 분리를 감소시켰음을 나타낼 수 있었다. 따라서, 16 내지 25℃의 분리 온도가 바람직하다.

더 높은 분리 온도를 선택한 경우에, 변수 또는 매트릭스의 추가 개조를 수행하여야 한다.

6.5 분석 품질의 개선

몇 번, 오염물을 샘플로부터 수행하였다. 또한, 동일 샘플의 반복 분석으로부터 결과에 상당한 변화가 있었다.

이 문제를 다루기 위해, 샘플의 주입 후, 물로 간단한 유체역학적 주입을 도입하였다. 놀랍게도, 이 단계는 단독으로 분석의 재현성을 이미 상당히 개선하였다.

결과를 샘플 바이알과 모세관의 각 접촉 전 및/또는 후 모세관의 단부를 세척함으로써 더욱 개선하였다. 모세관/전극 단부를 물이 있는 바이알에 담금으로써 세척을 바람직하게 수행하였다. 오염을 최소화하기 위해, 물의 다른 바이알을 세척 동안 및 물의 유체역학적 주입 동안 사용하였다.

물은 바람직하게는 정제수, 특히 증류수 또는 탈이온수 또는 이중증류수이다.

게다가, 모세관의 바깥쪽의 코팅이 예를 들어, 플레이밍(flaming)에 의해 모세관 말단에서 약 2 mm의 길이로 제거되었다면, 결과는 개선되었다

6.6 민감성

민감성 문제는 특히 pg/ml의 범위 내 DNA 농도로 Mono Bulk 샘플을 분석할 때, 아가로스 겔 전기영동의 결과 및 모세관 겔 전기영동의 초기 결과로부터 명백하였다.

DNA에 대한 염료의 광범위한 선택은, 예를 들어, 삽입 염료를 이용가능하다. 형광에 의해, 특히 아르곤 레이저 하에서 검출가능한 염료는 본 발명의 방법에서 사용에 가장 적합하다. 브롬화에티듐 또는 그것의 유도체가 바람직하며, 특히 Beckman Coulter로부터의 EnhanCE 염료가 바람직하다. 바람직하게는, 남는 염료를 분리 버퍼에 첨가하고 컬럼 상의 DNA를 염색한다. 따라서, 주입 전 염료와 DNA를 접촉할 필요가 없다. 비교 실험은 이것이 매우 "단조로운" 기준선 및 높은 선택성을 유발하기 때문에, 이 방법이 주입 전 염색에 더 우수하다는 것을 보여주었다.

염료의 사용은 10배로써 향상된 신호를 이끌었다(데이터는 제시하지 않음). 삽입은 DNA 분자를 더 길게 만들었고, 이는 분리의 지속을 약간 증가시켰다. 피크의 형성이 향상되며, 이는 분자의 변형된 전기적 전하에 기인하게 되는 것으로 보인다. 약간 더 높게, 일정한 배경 신호가 관찰되었다. 이들 실험을 기초로, 분리 버퍼에서 LIF 검출에 적당한 브롬화에티듐 유도체에 기초한 삽입 염료, 특히 EnhanCE, 즉, 0.1-5 μl 농도의 EnhanCE, 바람직하게는 ml 분리 버퍼 당 0.5-1 μl 염료를 첨가하는 것이 바람직하다.

버퍼를 입자를 제거하기 위해 막(0.22 또는 0.45 μm)을 통한 여과로써 제조하고, 초음파 배스 또는 진공 농축기에서 10분 동안 탈기한 후, 염료를 첨가하였다. 염료의 첨가 후, 버퍼는 이들 처리에 대한 염료의 민감성 때문에 여과 또는 탈기되어서는 안 된다. 따라서, 염료는 공기의 도입 없이 잘 섞여야한다. 가장 적합한 방법은 피펫으로 용액을 주의하여 반복적으로 취하는 것이다. 제제는 또한 빛에 민감하다. 희석에서, 염료는 약 10시간 후 분해되며, 이는 분리 서열의 총 지속기간을 제한한다. 한 시리즈에서 약 40개의 샘플을 분리하는 것이 기술적으로 가능하다. 그러나, 실행 당 총 40분의 지속기간으로, 염료는 충분히 안정하지 않다. 따라서, 한 시리즈에 15개 이하의 샘플을 시험하는 것이 바람직하다.

6.7 샘플 농도

매운 낮은 핵산 농도를 가지는 샘플, 예컨대 일부 모노 벌크 샘플에 대해, 본 방법의 민감성은 여전히 핵산의 결정에 충분하지 않았다.

막 원심분리를 통한 샘플의 농도에 의해, 특히 DNA 추출 후, DNA의 농도는 상당히 향상될 수 있었다. DNA 추출 후, 샘플의 부피는 500 μl이었다. CE에 대한 최소 부피는 약 10 μl이었다. 따라서, 최대 농축 계수는 50이었고, 이는 상기 상세하게 설명한 바와 같은 막 원심분리에 의해 사용될 수 있었다. 그러나, 이 방법으로 얻은 변화가능한 부피 때문에, 농축 계수를 정확하게 결정할 수 없었다.

민감성을 개선하게 위한 두 번째 가능성은 모세관에서 샘플을 실행하기 전 온라인 농도이다[Osbourn et al., On-line preconcentration methods for capillary electrophoresis, Electrophoresis 21 (2000), 2768-2779; Quirino et al., Sample stacking of cationic and anionic analytes in capillary electrophoresis, Journal of Chromatography A, Vol. 902 (2000), 119-135]. " 필드 증폭 시료 스태킹(field amplified sample stacking)"(FASS), 유체역학적 방법에 의해 샘플을 포커싱하거나, 또는 동전기적 주입 "필드 증폭 시료 주입(field amplified sample injection)" (FASI)에 의해 샘플을 포커싱하는 두 가지의 가능성이 있다.

FASS에 대해, 샘플은 버퍼 자체를 실행하는 것보다 더 낮은 전도성의 동일 버퍼에서, 또는 가장 단순한 경우로는 물에서 용해되어야 한다. 그 후 샘플을 유체역학적으로 주입한다. 샘플 용액과 버퍼 사이의 계면에서, 분자는 전압 하에서 계면에 대한 방향으로 가속화되고, 따라서, 샘플이 포커싱된다. 이 효과는 샘플의 주입 전 매우 농축된 버퍼의 쇼트 플러그의 전-주입에 의해 향상될 수 있다.

FASI는 낮은 전도도를 가지는 샘플 용액이 있는 제 1 바이알로부터 버퍼로 채운 모세관으로 동전기적 주입을 사용한다. 이론상, 농도의 큰 차이는 강한 포커싱을 유발한다.

큰 부피를 가지는 또 다른 FASS-주입은 EOF를 기초로 하는 [Osbourn et al., On-line preconcentration methods for capillary electrophoresis, Electrophoresis 21 (2000), 2768-2779]에서 설명된다. EOF가 충분하지 않기 때문에, 본 방법이 상기 설명한 코팅 모세관과 함께 사용에 적합하지 않다는 것이 실험적으로 나타났다(데이터는 제시하지 않음). EOF의 결핍이 바깥쪽의 압력에 의해 보상될 수 있는지 여부를 시도하였다. 이 방법에 의해, 샘플 플러그는 전압 하에서 거꾸로 이동할 수 있었다. 그러나, 포커싱을 멈추기 위한 최적 시간을 찾기 위해 전류를 변화시키는 방향이 없고, 따라서 재현가능한 결과를 얻는 것은 어렵다.

추가 실험이 EOF의 사용이 없는 샘플 포커싱에서 집중되었다.

지금까지 설명한 방법은 물의 전-주입과 함께 샘플의 동전기적 주입에 의해 적합하게 된다. 본 방법의 민감성은 이 단계에 의해 상당히 향상될 수 있다는 것이 발견되었다.

본 샘플의 농도를 최대화하기 위해, 동전기적 주입이 있는 샘플 포커싱의 온라인 방법을 그 후 막 여과에 의한 샘플의 농도와 조합하였다.

하기 프로토콜은 가장 양호한 결과를 유발하는 조건 하에서 샘플 처리 및 동전기적 샘플 주입을 사용하는 분석을 설명한다:

인플루엔자 백신의 제조로부터 제조과정의 샘플을 프로테이나아제 K로 분해한 후(예를 들어, 56℃에서 1시간 또는 밤새), DNA-추출에 의한다. 결과 샘플(예를 들어, 500 μl)을 막 원심분리(예를 들어, 10 kDa의 분획량으로 centricon 막을 통해)로써 농축하였다.

10-25 μl의 부피를 하기 조건 하에서 모세관 겔 전기영동으로써 분리하였다:

● 물의 유체역학적 전-주입, 예를 들어, 5초 동안 3 kPa에서,

● 동전기적인 샘플 주입, 예를 들어, 30초 동안 10 kV에서,

● 물의 유체역학적 후-주입, 예를 들어, 5초 동안 1 kPa에서,

● 예를 들어, 35분 동안 250 V/cm로 DNA를 염색하기 위한 염료를 포함하는 분리 버퍼에 의한 분리(예를 들어, 3 μl/ml에서 EnhanCE).

크기 마커를 동일 조건 하에서 분리의 각 시리즈의 시작 및 마지막에 실행하였다.

상기 언급한 바와 같이, 프로테이나아제 K 및 DNA 추출에 의한 샘플의 처리는 단지 B3 샘플과 같은 상당한 양의 단백질, 및/또는 높은 염 농도를 포함하는 샘플을 필요로 한다. 그러나, 샘플의 더 나은 비교를 위해, 모든 샘플을 동일한 방법으로 처리하였다.

본 프로토콜에 따라서, 백신 제조의 몇몇 발효 단계를 완전히 분석하였다. 발효 과정의 시작에서, DNA는 게놈 DNA로서 존재하며, 마지막에 이를 베타프로프리오락톤 처리에 의해 강하게 손상시켰다. 따라서, 때때로 몇 분에 걸쳐서 브로드 피크가 발생하였고, 이는 크기를 정확하게 할당하는 것을 어렵게 한다.

6.8 결과의 분석

시간 또는 이동성 창을 이전에 설명한 바와 같이 획득한 결과의 분석을 위해 사용하였다.

시간을 대신하는 이동성이 피크의 확인을 위해 사용되는 것이 바람직하다. 이 접근에서, 각 실행으로 획득한 결과에서 작은 변화는 보충될 수 있다. 특히, 시간-의존적 피크 확인에서, 폴리아크릴아미드 네트워크의 느린 가수분해는 실험에서 실험의 시간 축에서 약간 뒤쪽으로 이동을 이끈다. 피크가 그것의 한정된 시간 창을 이탈한다면, 그것들을 확인하기는 더 어렵다.

이동성은 하전된 입자가 전기장에서 이동하는 법을 정량적으로 정의하는 변수이다. 높은 이동성을 가지는 성분은 낮은 이동성을 가지는 성분보다 더 빠르게 이동한다. 이동성은 일정하지 않으며 분석 동안 선택된 변수에 의존한다. 제공된 전압의 변화 또는 매트릭스의 느린 가수분해와 같은 분리의 변수의 변화는 정의된 이동성의 표준을 사용하여 보충될 수 있다. 하나의 전제조건은 안정한 pH이며, 이는 버퍼의 사용에 의해 보증된다.

이동성의 분석은 처음 표준 피크(72 bp)가 선택되기 위한 기준점을 필요로 한다.

분석을 위한 소프트웨어, 32 Karat®는 선택된 크기의 범위에 대응하는 시간 창의 분석을 허용한다. 이 크기 범위에서 피크를 요약하였고 그것의 면적을 계산하였다. 따라서, 완전한 면적에 관해서, 특정 크기 범위에서 DNA의 비율을 결정할 수 있었다(도 3).

가장 낮은 DNA의 농도를 함유하는 B8 샘플의 분석에서(threshold® 분석으로 결정한 바와 같이 < 1ng/ml), 18 내지 21 bp의 DNA 단편을 검출할 수 있었다. 따라서 21 bp 보다 더 긴 핵산은 샘플에 함유되지 않았음을 나타내기 위해 본 발명의 방법을 사용할 수 있었다.

6.9 민감성의 제한을 결정

1 kb 표준의 희석 시리즈를 본 발명의 방법의 민감성 제한을 결정하기 위해 분석하였다. 3 이상의 노이즈 비율로 신호를 가지는 유일한 피크가 고려된 피크였다. 100 pg/ml의 표준의 최소 DNA 농도를 결정하였다. 이들 결과를 단일 DNA 분획으로 결정한 아가로스 겔 전기영동에 의해 검출한 DNA의 최소 농도와 직접 비교할 수 없다. 대조적으로, 1 kb 표준은 11개의 단편을 함유하였고, 이것의 정량적 조성을 계산하지 않았다. 가장 작은 DNA 단편(72 bp)에 관한 민감성을 평가하기 위해, 완전한 면적의 대응하는 피크의 면적의 백분율(0.69%)을 계산하였다. 72 bp 단편의 농도를 약 0.7 pg/ml가 되는 것으로 결정하였다.

아가로스 겔과 비교하여, 모세관 겔 전기영동에 기초한 방법의 민감성은 14 000배로써 더 높다. 흥미롭게는, 이 민감성은 단지 단일 길이의 DNA 단편의 검출을 사용한다. 이는 1 ng/ml를 포함하는 샘플 내 DNA의 검출에 대해 농축 단계들이 요구된다는 것을 설명한다.

민감성은 DNA 단편의 길이에 의존한다. 더 긴 단편에서, 더 많은 염료를 삽입할 수 있고, 이는 더 강한 신호를 유발한다(도 5).

6.10 분석 비용의 최소화

몇몇 문제들은, 분리에 직접적으로 영향을 미치지는 않지만, 실험에 크게 영향을 미치고, 그것의 비용은 연구 과정에서 조사하였다.

사용된 가장 비싼 시약은 분리 버퍼이다. 제조업자(Beckham Coulter)의 표준 프로토콜에 의해 제안된 바와 같이, 2 ml 저장 바이알을 사용하였다. 모세관 온도를 조절하는 동안, 모세관의 전극 및 단부를 담근 분리 버퍼가 있는 저장 바이알은 보통 실온에 있다. 이는 버퍼의 빠른 가수분해를 야기하여, 그것의 시브(sieve) 효과를 상실한다. 또한, 염료는 1일 이상은 안정하지 않고 - 또한 샘플로부터 오염이 전달되는 위험이 있기 때문에 버퍼 바이알을 매일 교환하는 것이 바람직하다.

200 μl PCR 바이알은 모세관 겔 전기영동에서 분리 버퍼를 위한 저장 바이알로서 유리하게 사용될 수 있다는 것을 발견하였다. 검출 전류에 기초하여, 본 버퍼의 최적 용량을 분리 버퍼의 저장 바이알의 쌍 당 최대 5개의 분리가 되도록 결정하였다. 분화력의 감소는 관찰되지 않았다. 대표적인 비용의 계산은 상당한 절감이 이루어질 수 있음을 증명하였다. 따라서, 900€ 가격에서 시험 키트는 60ml의 분리 버퍼를 포함한다. 제조업자에 의해 제안된 방법으로, 약 150회의 실행을 수행하였다. 더 작은 저장 바이알의 사용은 가능한 분리 버퍼의 동일한 양으로 600회의 실행을 제공한다. 따라서, 이러한 작지만 효과적인 측정에 의해 비용은 4분의 1로 낮춰진다.

따라서 200 μl의 바이알에 분리 버퍼를 포함하는 모세관 겔 전기영동을 위한 키트가 제공된다. 바람직하게는, 키트는 적합한 염료, 예를 들어, EnhanCE 염료 및 표준, 예를 들어, Beckman Coulter로부터의 1kb 표준(72 bp 내지 1,353 bp의 11개 단편을 함유하는 Hae III 제한효소 분해 φl74 DNA로 구성), 및 선택적으로 상기 설명한 바와 같이 코팅한 모세관을 포함한다.

6.11 트러블슈팅

실험 과정에서, 단발력 불이행을 관찰하였다. 그것이 사실이 경우, 본 실행을 분석을 위해 사용할 수 없었다. 이 문제를 분리 동안 모세관에 마이크로버블 형성으로 찾아내었다. 분리 버퍼의 제조에서 탈기 단계를 제외한다면, 효과는 더욱 흔한 것으로 나타났다. 더 긴 시간 동안 탈기는 본 문제의 빈도를 감소시켰다. 분리 단계 동안 모세관의 양 단부에 약 34 kPa의 압력을 사용함으로써, 이 문제를 효과적으로 회피하였다.

점성 겔로 작업하는 하나의 위험은 모세관 및 전극 외부의 분리 버퍼의 저장 바이알의 뚜껑에 딱딱한 크러스트를 유발할 수 있는 용매의 증발이다. 저장 바이알의 뚜껑은 모세관을 열리게 한다. 모세관이 회수될 때 이곳에서 크러스트가 형성된다면, 이는 다음 실험에서 모세관의 파괴를 유발할 수 있다. 전극 상의 침전은 바람직하지 않은 크리핑 전류를 유발할 수 있고 피크의 분리에 부정적으로 영향을 미친다. 결과적으로, 뚜껑을 매일 교환하는 것과 모세관의 전극 및 외부를 청소하는 것이 권고된다.

실험 과정에서, 샘플은 바이알로부터 샘플의 주입에 의해 희석된다는 것을 관찰하였다(데이터는 제시하지 않음). 따라서, 동일 샘플의 다수의 결정이 계획되어 있다면 몇몇 샘플 알리쿼트를 제공하였다.

6.12 베타프로프리오락톤 처리의 영향

베타프로프리오락톤(BPL)이 CGE에 의한 DNA의 분리에서 어떤 효과를 가지는지를 조사하였다.

백신의 발효 과정에서, BPL은 알킬화에 의해 DNA를 불활성화하며, BPL 분자는 가교 및 변성을 유발하는 DNA의 친핵성 중심과 반응한다. 더 긴 접촉시, 단일 가닥 절단이 나타나며 단일 염기는 상실될 수도 있다. 접촉이 충분히 길다면, DNA는 발효를 받으며 그것의 생물학적 활성을 상실한다.

실험에서 사용한 3개의 크기 마커(10 bp, 1 kb 및 2 kb 표준, 상기 참조)를 백신 제조와 같이 16시간 동안 BPL로 처리하였다. DNA의 일반적인 더 낮은 강도를 관찰하였다(도 6). 적은 농도에서 피크는 완전히 사라졌다. 이 실험은 BPL이 DNA의 분리의 특징에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타내었다. DNA가 존재하는 한, 염료를 삽입할 수 있고, 신호를 유발한다. 더 짧은 단편은 더 긴 단편보다 더 빨리 분해되는 것으로 보인다.

6.13 내부표준에 의한 더 양호한 정확성

분석의 정확성을 내부표준(ISTD)에 의해 개선할 수 있다. 적당한 물질을 각 샘플 주입 전 로딩할 수 있고, 피크의 확인을 위한 기준으로서 사용하여, 외부적 영향을 제거한다. 표준은 샘플로서 동일 분류의 물질에 속해야 한다. 샘플에 의한 영향을 최소화하기 위해, ISTD는 샘플 피크 전에 나타나야 한다. 23개의 염기 프라이머(ssDNA)를 첫 번째 실험을 위해 선택하였고, 이는 강하게 검출되었다. 이 피크는 "-10.000"의 이동성이 할당되었지만, 정확한 값은 분리 변수에 의존하며, 예를 들어 다른 소프트웨어의 사용과 다를 수 있다. 음의 대수 기호는 역극성(입구에서 음극)에 의해 설명된다. 따라서, 대표적인 실험에서, 크기 표준의 피크는 ISTD와 비교하여 상대적 이동성이 할당되었다. 이 방법에 의해, 캘리브레이션은 외부 영향에 덜 민감하다. ISTD의 농도는 10 μg/ml이었고, 이를 5초 동안 21 kPa로 유체역학적으로 주입하였다(도 7).

6.14 요약

본 발명의 방법에 의해 달성한 검출의 제한은 72 bp의 단편에 대해 약 9 pg/ml dsDNA이었다. 이는 100 zmol (10^-21 mol)에 대응한다. 이는 660 g/ml의 분자량을 가지는 dsDNA에 대해 밀리리터로 90210개의 분자에 대응한다. 단지 100 μl를 분석을 위해 사용하였다. 30초에 걸친 동전기적 주입으로, 바이알에 존재하는 모든 분자가 모세관으로 이동하였음을 추정하였다. 따라서, 이 크기의 약 9000개의 dsDNA 분자는 검출에 충분하다.

상세하게는, 한 구체예에서, 본 방법은 하기 단계들을 포함한다:

1. 샘플을 그것을 취한 후 바람직하게는 직접 56℃에서 1시간 동안 프로테아나아제 K로 분해하였다. 또 다르게는, 샘플을 모든 적절한 샘플이 함께 처리될 수 있을 때까지 -20℃에서 또는 그 이하에서 저장할 수 있다. 상기 설명한 바와 같은 SDS의 존재하에서 프로테이나아제 K에 의해 샘플을 처리하는 것은 바람직하다.

2. 샘플로부터 DNA를 추출하고(예를 들어, Wako로부터의 상업적으로 이용가능한 DNA 추출 키트에 의함), 정제수 또는 버퍼에 용해하였다. 특히 농축 샘플에 대해, 부피는 DNA 추출 전 부피와 동일해야 한다.

3. 샘플을 3 kDa 또는 바람직하게는 10 kDa의 배제 크기가 있는 막, 예를 들어, 친수성 셀룰로오스 막, 예컨대 Millipore로부터의 Centricon 필터에 걸쳐 농축할 수 있다. 유체는 원심분리 후 필터에서 보여서는 안 된다. 농도에 대한 적당한 변수는, 예를 들어, 14.000 g, 15분, 20℃이고, 농축물 수확에 대해, 3.000 g, 3분, 20℃이다.

단계 1은 샘플 내, 예를 들어 샘플 B6-B8 내 단백질의 양을 무시해도 좋을지 여부를 필요로 하지 않는다는 것을 비교 실험으로써 나타내었다. 여기서, 분해가 있고 없는 그리고 DNA 추출이 있고 없는 샘플 간의 차이점은 관찰되지 않았다(데이터는 제시하지 않음). 염 및 다른 오염물의 양이 분석을 방해하지 않는다면 단계 2는 필요하지 않고, 샘플 내 핵산의 농도가 이전의 농도가 없는 검출에 충분하다면 단계 3은 필요하지 않다. 그러나, 비교되는 다른 샘플이 동일한 방법으로 처리된다는 것은 바람직하다. 단지, 예를 들어, 모노벌크 샘플 또는 비교가능한 샘플을 분석하는 것이라면, 프로테이나아제 K 분해 및 DNA 추출에 의해 분배하는 것이 권해지고, 따라서 비용은 절약되고 샘플 당 분석 시간은 약 3시간에서 약 30분으로 감소된다.

4. 모세관 전기영동 시스템, 예를 들어, P/ACE MDQ 분자 특징 시스템, Beckman Coulter은 하기와 같이 제조된다:

- 488 nm에서 레이저 유발 형광으로 검출, 방출 520 nm.

- 모세관: 중성으로 코팅됨

- 모세관 크기: 50.2 cm, 검출기까지 약 40cm(39cm) 총 길이, 내부 직경 100 μm

- 새로운 모세관을 분리 버퍼로, 예를 들어, 10분 동안 조절하였다.

물론, 비교가능한 시스템 및 모세관을 사용할 수 있다.

5. 소프트웨어를 조절하는 것에 관해, 하기 설정이 들어가야 한다.

- 통합 방식 "표준 CE"

- 이동성에 기초한 피크 확인

- 분리 온도 20℃, 샘플에 대한 저장 온도 4℃

- 분리 온도가 도달된 후 실행을 시작

- 전류에 관한 실행의 조절

- 역동적 범위 100 RFU

- 필터: 정상

- 피크 폭 16-25

- 데이터 속도 4 Hz.

6. 분리 버퍼를 제조한다(예를 들어, Tris-Borat-Gel 버퍼, pH 8.8-8.9 (예를 들어, Beckman Coulter, 이는 동결건조로 이용가능하고, 4-8℃에서 24시간 동안 지속적인 혼합하에서 용해하고, 4-8℃에서 30시간 동안 안정하다). 필요한 양의 버퍼를 0.45 μm 필터막에서 정제하고 초음파 배스에서 약 10분 동안 탈기한다. 2 ml 분리 버퍼를 세척 버퍼로서 염료 없이 유지한다. 나머지에, 3 μl의 염료를 1ml 분리 버퍼에 대해 첨가하고, 조심스러운 피펫팅에 의해 혼합을 균질화하고, 공기가 들어가지 않도록 한다. 분리 버퍼를 200 μl PCR 바이알에서 나눈다. 제제는 빛에 민감하고 10시간 동안 저장할 수 있다.

7. 표준의 희석을 제조한다. 특히, 샘플이 물에 있다면, 정제수를 이 목적을 위해 사용한다. 표준 농도는 100 ng/ml이다. "eCAP 1000 dsDNA Test Mix φl74 HaeIII"이 크기 마커로서 권고된다. 표준은 바람직하게는 동일한 날에 실행의 각 시리즈의 시작과 끝에 샘플로서 동일 조건하에서 시험되는 것이다.

8. 하기 서열의 사건을 샘플 또는 캘리브레이션 실행에 대해 결정할 수 있었다:

- 염료를 포함하는 분리 완충제에 의한 모세관을 평형을 유지, 136 kPa에서 5분

- 물에 모세관 및 전극의 단부를 담금으로써 세척, 0 kPa, 1초

- 물의 유체역학적 주입, 21 kPa, 5초

- ISTD의 유체역학적 주입, 21 kPa, 5초

- 물에 모세관 및 전극의 단부를 담금으로써 세척, 0 kPa, 1 s

- 샘플의 동전기적인 주입, 역극성에서 10 kV, 30초(입구에서 음극)

- 모세관의 단부 및 전극을 물에 담금으로써 세척, 0 kPa, 1초

- 역극성(입구에서 음극)으로 12 kV 및 30분으로 분리, 바람직하게는, 매 5번째 샘플 다음에, 분리 버퍼의 바이알을 교환한다

- 약 30분 동안 데이터의 수집

- DNA 염료 없이 분리 버퍼에 의한 모세관의 세척 단계, 204 kPa, 5분

- 모세관의 단부 및 전극을 물에 담금으로써 세척, 0 kPa, 1초

- 모세관을 물에서 출발 위치로 가져온다

- 종결.

9. 데이터를 수집하고 32-Karat 소프트웨어로 분석한다. 각 분석 피크를 소프트웨어에 의해 인식하여야 한다. 그러나, 필요하다면, 방식 통합이 행해질 수 있다. 바람직하게는, 백신 생산으로부터 제조 과정의 샘플을 DNA의 4개의 크기 범위의 존재를 위해 분석한다. 따라서, 4개의 군을 첨가하고, 캘리브레이션 후 특정 시간/이동성 창에 할당한다. 이는 다음의 크기 범위에 해당할 수 있다: <200 bp, 200-500 bp, 500-1000 bp 및 >1000 bp. 피크 면적의 백분율을 계산한다.

10. 필요하다면, 기록을 회수한다.

이 방법으로 달성한 데이터의 재현성을 2가지의 방법으로 시험하였다. 피크 확인을 위한 표준 편차의 상대적 백분율은 1.28%였다. 면적의 통합을 위한, 이 값은 4.04%였다. 따라서, 본 방법은 매우 재현가능한 결과를 이끌었다.

6.15 오차의 논의

측정에 영향을 미치는 조건에서 모든 변화가 또한 ISTD에 영향을 미치기 때문에, 측정에서 침투성의 변화는 각 측정에 의한 내부표준의 사용에 의해 보충된다.

본 방법에 의해 달성되는 데이터의 재현성을 시험하였다.

내부표준 피크가 인식되어야 하는 신뢰 면적을 계산해야 한다. 이 피크의 이동시간의 상대적인 표준 편차는 10회 측정 동안 0.24분이었다. 0.24분의 값은 소프트웨어에 대한 ISTD에 대해 시간 창으로서 정의하였다. 따라서 이 값은 대략 0.5분으로 프로그램 설정에 도입하였다. 소프트웨어에 대해, 이는 피크가 정의된 시간 전 또는 후에 0.25분 나타나야 하고, 다르게는 측정이 분석되지 않는다는 것을 의미한다. 피크 확인을 위한 표준 편차의 상대적 백분율은 매우 낮은 1.28%이었다(이는 1000bp의 크기에 대해 +/- 12 bp의 편차를 의미하며, 무시 가능하다).

이 면적의 통합을 위해, 표준 편차의 상대적 백분율은 4.04%이었다.

따라서, 본 방법은 매우 재생가능한 결과를 이끈다.

이는 각 크기 범위의 샘플 피크를 연관시키기 위한 크기 표준으로 캘리브레이션하는데 결정적이다. 상관계수는 보정점의 선형성의 측정이며, 이는 10 bp 표준에 대해 0.99인 것으로 결정하였다. 1 kb 표준에 대해, 이는 0.95이다. 이들 값은 충분하다.

6.16 샘플 내 크기분포 및 DNA의 농도

조사한 발효로부터 크기 분포에 대한 결과는 제조 과정 샘플 중 5개에 대해 표 2로서 존재한다. 크기 분포를 표 2로서 나타낸다.

크기 분포의 제시는 샘플 내 존재하는 DNA 농도를 참작하지 않는다. 상기 설명한 바와 같이, B8의 99%는 10g/ml의 평균 DNA 농도와 관련되며, 한편 B1 샘플에서 DNA 농도는 4000 ng/ml 만큼 높을 수 있다.

따라서, DNA의 농도는 백신 제조의 과정 동안 몇 차수(orders of magnitude)로써 감소되었다. DNA의 절대량을 나타낼 때 감소는 더 명백하다(도 9).

2개의 제조 단계는 이 감소에 가장 중요하게 기여하는 것으로 확인할 수 있었다. 제 1 단계는 양이온 교환 크로마토그래피이고, 제 2 단계는, 놀랍게도 CTAB에 의한 처리이다. 이 단계의 마지막에, CTAB에 의한 처리 다음에 바람직하게는 정용여과이다.

앞서 논의한 바와 같이 BPL에 의한 처리는 DNA 크기 감소의 대부분에 기여하였다. 예를 들어, PCR에 의한 베타-액틴의 증폭을 시험함으로써, 샘플 내 DNA가 BPL 처리 후 여전히 생물학적으로 활성일 수 있는지 여부를 조사하였다(데이터는 제시하지 않음). 증폭은 이들 샘플 중 어떤 것에 대해서도 관찰되지 않았고, 샘플 내 완전하고 기능적인 주형이 존재하지 않는다는 것을 나타내었다. 프로브에 의한 추가 실험, 알려진 발암유전자와 관련된 이들 중 일부는 또한 기능적 DNA가 발효 과정에서 살아남지 않는다는 것을 나타내었고(데이터는 제시하지 않음), 따라서 본 발명의 방법으로 얻은 결과를 확인한다.

6.17 조절에 의한 백신의 순응도

백신의 100 pg DNA/용량의 조절 최대치에 대해, 200 pg/ml는 0.5 ml 용량의 백신에서 가장 높게 허용되는 DNA의 농도이다. DNA가 적어도 약 9.0 pg/ml의 민감성으로 질적으로 분석될 수 있기 때문에, 본 발명은 DNA의 오염에 대해 백신의 품질관리 방법을 제공하며, 이는 모세관 겔 전기영동을 사용한다.

7. 유체역학적 샘플 주입에 의한 모세관 겔 전기영동

7.1 동전기적 및 유체역학적 샘플 주입의 비교

샘플 DNA의 동전기적인 (EK) 주입은 샘플 내 DNA의 모세관으로 완전한 주입을 유발하지 않았다는 것을 발견하였다. 대조적으로, 샘플과 함께 반복된 EK 주입은 결과를 유의하게 변화시키지 않는다는 것, 즉 샘플 DNA의 단지 중요하지 않은 부분이 각 주입시 주입되었고, 예상과 반대로, EK 주입은 컬럼 내 샘플 DNA의 농도를 유발하지 않았다는 것을 주목하였다(데이터는 제시하지 않음).

더 높은 양의 샘플 DNA를 유체역학적 주입으로 주입하는 것이 가능한지 여부를 시험하였다. 몇몇 방법을 시험한 후, 샘플이 있는 모세관의 효과적인 길이의 26% 이상의 유체역학적 주입이 동전기적 주입보다 더 나은 결과를 이끈다는 것을 발견하였다(도 9). 26%에서 피크 높이는 10000(임의 단위)보다 높으며, 한편 상기 설명한 바와 같은 동전기적 주입에 의한 동일 실험에서(90초, 10 kV), 단지 10000 미만의 피크 높이가 194 bp 피크 동안 도달될 수 있었다.

도 10은 각각 3개의 농도(상부: 1 ng/ml, 중간: 100 pg/ml, 바닥: 10 pg/ml)에서, 유체역학적 주입(3 psi /21 kPa, 3.75 분 또는 7.5 분)에 의한 검출기 창에 모세관의 25% 및 50% 로딩이 있는 대표적인 샘플, dsDNA1OOO test mix (Beckman)의 CGE 분리의 비교를 나타낸다. 25% 로딩에서 분리는 양호한 결과 및 허용가능한 분해능을 나타내는 한편, 50% 로딩에서, 피크의 분해능은 더 이상 허용가능하지 않다. 복합체 인자들이 결과의 품질에 영향을 미치기 때문에, 이들 결과는 예측할 수 없었다.

7.2 본 발명의 CGE 방법에 의한 인플루엔자 백신 생산으로부터 1가 벌크의 분석

3개의 다른 바이러스 균주의 제조로부터 1가의 벌크를 본 발명의 바람직한 방법에 따르는 DNA에 의한 오염에 대해 분석하였다. 샘플을 프로테이나아제 K로 56℃에서 처리하였고, 5배로써 진공 원심분리로 농축하였고 핵산을 MagNa Pure ® (Roche) 방법 (Total NA LV Kit®, Roche)에 따라서 추출하고, 50 μl의 샘플 버퍼(eCap dsDNA 1000 키트, Beckman) 내 1 ml 샘플을 취하여, 이를 CGE 분석을 위해 사용하였다(3 psi (21 kPa)에서 유체역학적으로 주입된 샘플, 검출기 창까지의 30% 길이).

3개의 바이러스 균주 및 2개의 마커 농도의 분석 결과(dsDNA 1000 테스트 믹스, Beckman, 절대 DNA 농도: 1 ng (상단으로부터 4번째) 및 100 pg/ml (바닥)를 도 11에 나타낸다. H1/Solomon (상단)의 제제는 200 bp보다 긴 상당한 양의 DNA를 포함한다. B/Malaysia (상단으로부터 2번째)로부터의 제제는 200 bp DNA보다 작은 상당한 양의 DNA, 및 200 bp보다 긴 소량의 DNA를 포함한다. H3/위스콘신 (상단으로부터 3번째)의 제제는 200 bp보다 긴 상당한 양의 DNA를 포함하지 않는다. 단지 매우 짧은 DNA 단편이 이 제제에서 검출가능하다(10 bp 길이의 내부표준에 더하여).

200 bp (높은 피크), 500 bp 및 2000 bp의 DNA 단편과 함께 스파이킹된 인플루엔자 균주 Brisbane의 1가 벌크로부터 동일 조건하에서 얻은 전기 영동도는 도 12에 나타내며(상단 및 중간 선: 샘플의 2배 결정, 바닥 선 ds DNA 1000 테스트 키트(Beckman 100 pg/ml), 또한 스파이킹된다.

7.3 본 발명의 방법에 의한 세포 DNA(MDCK 세포)의 분석

MDCK 세포의 추출을 프로테이나아제 K 처리 및 MagNaPure DNA ® (Roche) 추출을 포함하는 본 발명의 방법에 따라서 제조하고 처리하였다. 한정하지 않은 크기의 DNA를 CGE(7.2에서와 같은 조건)(도 13)에 의해 분석하였다. 200 bp, 500 bp 및 2000 bp의 스파이크는 용이하게 눈에 보이며 크기 분포의 결정을 허용한다.

Claims (21)

1. 핵산을 포함하는 샘플을 모세관 겔 전기영동에 의해 분리하는,
   i) 유체역학적 주입에 의해 검출기까지의 모세관 길이의 20-40%에 샘플을 주입하는 단계,
   ii) 핵산을 분리하는 단계,
   iii) 핵산을 검출하는 단계를 포함하는
   핵산의 존재 및/또는 크기 분포를 분석하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 핵산은 DNA, 더 바람직하게는 게놈 DNA 및/또는 DNA의 분해 생성물인 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 샘플 주입은 14 내지 35 kPa의 압력에서 3 내지 4.5분 동안인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 i) 전에, 바람직하게는 2 내지 10초 동안 1 내지 34 kPa에서 물에 의한 모세관의 유체역학적 전-주입 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 i)과 ii) 사이에, 바람직하게는 2 내지 10초 동안 1 내지 34 kPa에서 물에 의한 모세관의 유체역학적 후-주입 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 분리는 200 내지 275 V/cm인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 검출은 레이저-유발 형광에 의하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 적어도 하나의 한정된 관심의 크기의 핵산으로 스파이킹되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 분리 버퍼는 핵산을 검출하는데 적당한 염료, 바람직하게는 EnhanCE 염료를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 모세관 겔 전기영동에 의해 분리되는 게놈 DNA 또는 그것의 분해 생성물의 존재에 대해 분석되는 샘플은
    i) 21-28 kPa의 압력에서 3 내지 4.5분 동안 유체역학적 주입에 의해 검출기까지의 모세관 길이의 약 30%에 샘플을 주입하는 단계
    ii) 255 V/cm로 핵산을 분리하는 단계,
    iii) 레이저 유발 형광에 의해 핵산을 검출하는 단계를 포함하며,
    단계 i) 전에, 바람직하게는 5초 동안 7 kPa에서 물에 의한 모세관의 유체역학적 전-주입 단계를 더 포함하고,
    단계 i)과 ii) 사이에, 바람직하게는 5초 동안 7 kPa에서 물에 의한 모세관의 유체역학적 후-주입 단계를 더 포함하고,
    세척 단계는 물에 의한 전-주입 전 및/또는 샘플 주입 후, 바람직하게는 모세관의 양 단부를 물과 접촉시킴으로써 수행되며,
    분리 버퍼는 삽입 염료, 바람직하게는 EnhanCE 염료를 0.5 μl/ml 분리 버퍼의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 본 방법은 적어도 200 fg DNA의 하나의 크기의 검출에 적합한 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 모세관은 검출기까지 39cm의 길이를 가지며, 분리는 40 내지 55분, 바람직하게는 약 45분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 분리 버퍼는 8 내지 9.5의 pH, 바람직하게는 8.8의 pH를 가지는 버퍼, 가장 바람직하게는 상기 pH를 가지는 Tris-Borat 버퍼인 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 약학 조성물이고 DNA 또는 그것의 단편의 존재에 대해 분석되며, DNA는 바람직하게는 게놈 DNA이며, 바람직하게는 샘플이 기능 유전자를 포함하는 DNA 및/또는 종양유발 가능성을 가지는 DNA를 함유하거나 또는 함유하지 않는다는 것을 증명하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 하기 단계들,
    ● 선택적으로, 샘플을 바람직하게는 SDS의 존재하에서 프로테이나아제 K로 분해하는 단계,
    ● 핵산을 추출하는 단계를 포함하는 방법으로 전처리된 것을 특징으로 하는 방법.
16. 포유동물에 투여를 위한 조성물의 제조 방법으로서, 그것의 샘플을 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 모세관 겔 전기영동에 의해 샘플을 분리하는 단계 및 레이저 유발 형광에 의해 핵산을 검출하는 단계를 포함하며, 핵산은 게놈 DNA 및/또는 DNA의 분해 생성물인, 샘플 내 핵산의 존재 및/또는 크기 분포를 분석하는 방법.
18. 제 17 항에 있어서, 핵산의 존재 및/또는 크기 분포의 분석은 샘플의 종양유발 가능성 및/또는 샘플 내 기능 유전자의 존재를 결정하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 샘플은 백신, 바람직하게는 인플루엔자 백신의 제조로부터 나오는 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제 17 항 내지 제 19 항에 있어서, 샘플을 제 1 항 내지 제 15 항의 방법에 따라서 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 분석된 백신.
    

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