JP2004317297A - 染色剤及び当該染色剤を用いた染色方法 - Google Patents
染色剤及び当該染色剤を用いた染色方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004317297A JP2004317297A JP2003111584A JP2003111584A JP2004317297A JP 2004317297 A JP2004317297 A JP 2004317297A JP 2003111584 A JP2003111584 A JP 2003111584A JP 2003111584 A JP2003111584 A JP 2003111584A JP 2004317297 A JP2004317297 A JP 2004317297A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- staining
- electrophoresis
- buffer
- nbd
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
【課題】蛍光色素を利用した染色剤であり、該染色剤を利用したタンパク質の高速検出方法を提供する。
【解決手段】蛍光色素もしくはその誘導体を少なくとも１種類含有してなることを特徴とする染色剤。また、上記染色剤を用いた染色方法。
【解決手段】蛍光色素もしくはその誘導体を少なくとも１種類含有してなることを特徴とする染色剤。また、上記染色剤を用いた染色方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、電気泳動におけるタンパク質の検出に用いる、蛍光色素もしくはその誘導体を含む染色剤及び該染色剤を用いたタンパク質の検出方法に関する。また、本発明は、生物試料、例えば、細菌、酵母、かび、藻類、原生動物等の微生物、動植物の細胞、組織、及び染色体の染色方法及び観察法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質の電気泳動後の担体上での検出及び定量は色素染色法がよく用いられる。
【特許文献１】
特開平５年−１５７７３３号公報
【特許文献２】
特開２００３−２９３０４号公報
色素染色法ではそれぞれの公報に示されている様なＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）という色素を用いた方法が最も主流であり、ＣＢＢとタンパク質との分子間相互作用によりタンパク質にＣＢＢを付着させ、可視化するという染色法である。電気泳動終了後、ゲル中に染色剤等の試薬を浸透・透析させることにより検出を行う。比較的簡便であり、高い再現性を持つが、最大検出感度は約１００ｎｇであり微量なタンパク質の検出・定量には不向きである。また染色・固定・脱色行程はすべてゲルを介しており、染色剤等の試薬の浸透・透析が必要であるため、根本的にこの染色法は時間がかかり、通常２〜１６時間を要する。さらに、染色時間・試薬濃度の設定条件等によりバックグラウンドが高くなってしまう。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記のような現状に鑑み、蛍光色素を利用した染色剤であり、バックグラウンドの染色が少ない染色剤を提供するとともに、該染色剤を利用したタンパク質の高速検出方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、従来はアミンをラベル化する色素である７−ｃｈｌｏｒｏ−４−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌｅ（ＮＢＤ−Ｃｌ）が、安定性、染色性に優れ、タンパク質の染色成分として非常に優れた性質を有すること、並びに当該色素が無蛍光性であり、アミノ基との反応後に蛍光を発する性質の利用を考案し、これらの知見により本発明を完成した。
【０００５】
即ち、本発明の第一は、蛍光色素もしくはその誘導体を有効成分として含有することを特徴とする染色剤である。本発明の第二は、蛍光色素もしくはその誘導体により染色することを特徴とする高速染色方法である。
【発明の実施の形態】
【０００６】
以下、上記発明を各発明ごとに説明する。
（１）染色剤 本発明の染色剤は、蛍光色素もしくはその誘導体（以下、単に「蛍光色素等」という）を有効成分として少なくとも１種類含有する。ここで用いられる蛍光色素にはＮＢＤ−ＣｌやＤａｎｓｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ に代表されるアミン標識用プローブや、Ｄａｎｓｙｌａｍｉｄｏｅｔｈｙｌ Ｍｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｓｕｌｆｏｎａｔｅに代表されるチオール標識用プローブ、４−Ｂｒｏｍｏｍｅｔｈｙｌ−７−Ｍｅｔｈｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎに代表されるカルボン酸標識用プローブなどを例示することができ、これらの中でもＮＢＤ−Ｃｌが好ましい。また、ここで用いられる蛍光色素等は、ラベル化反応後に蛍光を持つものであれば特に限定されないが、電気泳動後の検出を考慮し、励起波長と蛍光波長の差が大きく、励起波長に紫外線を使用しないものが好ましい。さらに、蛍光色素等を数種類含有する染色剤を用いてもよい。
【０００７】
本発明の染色剤は、水溶液やアルコールなどに溶解させて使用する。ここで用いる水溶液としては、蒸留水、トリス緩衝液等を例示することができ、これらの溶液のｐＨは染色剤に含まれる蛍光色素等により異なるが、プローブ化反応に最適なｐＨであれば良い。アルコールとしてはメタノール、エタノール等を例示することができ、アルコール濃度は電気泳動に影響を与えない濃度であれば良いが、４０重量％以下であることが好ましい。また、溶液中のイオン強度は染色剤の反応性に影響を与える為、なるべく低い物が望ましい。以上の条件を考慮し、メタノール３３重量％の水溶液が一般的な使用には好ましい。水溶液中に溶解させる蛍光色素等の量は、染めようとするサンプルの分子量や濃度、染色時間、蛍光強度などに応じて決めればよいが、水溶液中の蛍光色素等の濃度が０．００１〜１．０重量％程度になるようにするのが好ましい。
０．００１重量％以下だと、反応性の点で好ましくなく、また１．０ 重量％以上だと蛍光色素の溶解性の点で好ましくない。しかしながら、蛍光強度の高い蛍光色素等はこの限りではない。
本発明の染色剤は、例えば、タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動前の染色に使用することができる。 染色時間は、染めようとするタンパク質の分子量や濃度、染色剤に含まれる蛍光色素等の蛍光強度などに応じて決めればよいが、通常は、５分〜１５分程度とするのが好ましい。通常用いられているＣＢＢによる染色では、３０分〜１２０分の染色が必要であり、これに比べて格段に染色時間が短縮された。また、電気泳動前に染色を行うため、電気泳動後の脱色操作が不必要となり、染色・脱色操作にかかる時間が大幅に短縮された。また、本染色剤は蛋白質だけでなく核酸の染色にも使用することが出来る。
【０００８】
（２）染色方法 本発明の染色方法は、蛍光色素等を用いて染色する。ここで用いられる蛍光色素等は、「（１）染色剤」の欄で述べたものと同様のものが使用できる。具体的な染色方法としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動前の染色法を例示することができる。しかしながら、あらかじめゲルに含有させる場合や、電気泳動後に染色する場合もある。
【０００９】ポリアクリルアミドゲル電気泳動前の染色法は、電気泳動前にタンパク質を染色剤と反応させることにより染色を行う方法である。反応時間は、染めようとするタンパク質の分子量や濃度、染色剤に含まれる蛍光色素等の反応性に応じて決めればよいが、通常は、５分〜１５分程度が適当である。また、反応温度は染めようとするタンパク質の分子量や濃度、染色剤に含まれる蛍光色素等の反応性に応じて決めればよいが、通常は室温〜６０℃が適当である。さらに、この染色時間は「（１）染色剤」の欄で述べた理由により、従来法より短縮されている。
【００１０】
【実施例】以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００１１】
〔実施例１〕蛋白質染色時の緩衝液の影響
蛍光色素として、８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ（Ｍｅｔｈａｎｏｌ １００ｍＬ、ＮＢＤ−Ｃｌ （ＳＩＧＭＡ社）０．１６６ｇ）を利用した。染色時に、１０ｍＭの緩衝液（ｐＨ９．５）：８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ ＝ １：２ の割合で混合し、これを染色剤とした。サンプル：染色剤 ＝ １：２の割合で混合し、６０℃で５分間反応させた。ここにＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ６．８） ０．１２５Ｍ、グリセロール２０重量％、２−メルカプトエタノール１０重量％、ＳＤＳ ４重量％、ブロモフェノールブルー ０．００２重量％を蒸留水１Ｌに溶解）を等量加え、１００℃で５分間保温した。その後、アガロールゲル電気泳動を行った。電気泳動には、ＴＢＳ緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン８９ｍＭ、ホウ酸８９ｍＭ、ＳＤＳ ０．１重量％を蒸留水１Ｌに溶解）、３％アガロースゲル（ＴＢＳ緩衝液１００ｍＬ、ＳｅａｋｅｍＧＴＧアガロース（ＢＭＡ社）３ｇ）を加熱溶解し、ゲルトレイに流し込んで平板としたものを用い、左からレーン１〜３までを使用した。電気泳動するサンプルは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＳＩＧＭＡ社）５００ｎｇを使用した。各レーンの染色用緩衝液は表１の通りである。また、電気泳動装置はＭＵＰＩＤ−ＩＩ（株式会社アドバンス製）を利用し、１００Ｖで約４５分間電気泳動を行った。表１は、サンプルを染色する際に使用した緩衝液の組成を示す表である。
【表１】表 １
【００１２】検出にはブラックライト（ピーク波長３６０ｎｍ）による励起・蛍光の発色を利用し、撮影時に偏光フィルター（５００ｎｍ以下の波長をカットするフィルター）を利用した。
【００１３】電気泳動像は図１の通りであった。図１からわかるように緩衝液の種類による差異はほとんど見られなかった。しかし、染色剤との反応性が最も低い炭酸緩衝液の使用が好ましいことが明らかとなった。
【００１４】
〔実施例２〕蛋白質染色時の緩衝液濃度の影響
蛍光色素として、８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ（Ｍｅｔｈａｎｏｌ １００ｍＬ、ＮＢＤ−Ｃｌ （ＳＩＧＭＡ社）０．１６６ｇ）を利用した。染色時に、１０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）：８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ ＝ １：２ の割合で混合し、これを染色剤とした。サンプル：染色剤 ＝ １：２の割合で混合し、６０℃で５分間反応させた。ここにＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ６．８） ０．１２５Ｍ、グリセロール２０重量％、２−メルカプトエタノール１０重量％、ＳＤＳ ４重量％、ブロモフェノールブルー ０．００２重量％を蒸留水１Ｌに溶解）を等量加え、１００℃で５分間保温した。その後、アガロールゲル電気泳動を行った。電気泳動には、ＴＢＳ緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン８９ｍＭ、ホウ酸８９ｍＭ、ＳＤＳ ０．１重量％を蒸留水１Ｌに溶解）、３％アガロースゲル（ＴＢＳ緩衝液１００ｍＬ、ＳｅａｋｅｍＧＴＧアガロース（ＢＭＡ社）３ｇ）を加熱溶解し、ゲルトレイに流し込んで平板としたものを用い、左からレーン１〜３までを使用した。電気泳動するサンプルは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＳＩＧＭＡ社）５００ｎｇを使用した。各レーンの染色用緩衝液の濃度は表２の通りである。また、電気泳動装置はＭＵＰＩＤ−ＩＩ（株式会社アドバンス製）を利用し、１００Ｖで約４５分間電気泳動を行った。表２は、サンプルを染色する際に使用した緩衝液の濃度を示す表である。
【表２】表 ２
【００１５】検出にはブラックライト（ピーク波長３６０ｎｍ）による励起・蛍光の発色を利用し、撮影時に偏光フィルター（５００ｎｍ以下の波長をカットするフィルター）を利用した。
【００１６】電気泳動像は図２の通りであった。図２からわかるように緩衝液の濃度は１０ｍＭが最適であることが明らかとなった。
【００１７】
〔実施例３〕蛋白質染色時の反応温度の影響
蛍光色素として、８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ（Ｍｅｔｈａｎｏｌ １００ｍＬ、ＮＢＤ−Ｃｌ （ＳＩＧＭＡ社）０．１６６ｇ）を利用した。染色時に、１０ｍＭの緩衝液（ｐＨ９．５）：８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ ＝ １：２ の割合で混合し、これを染色剤とした。サンプル：染色剤 ＝ １：２の割合で混合し、６０℃で５分間反応させた。ここにＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ６．８） ０．１２５Ｍ、グリセロール２０重量％、２−メルカプトエタノール１０重量％、ＳＤＳ ４重量％、ブロモフェノールブルー ０．００２重量％を蒸留水１Ｌに溶解）を等量加え、１００℃で５分間保温した。その後、アガロールゲル電気泳動を行った。電気泳動には、ＴＢＳ緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン８９ｍＭ、ホウ酸８９ｍＭ、ＳＤＳ ０．１重量％を蒸留水１Ｌに溶解）、３％アガロースゲル（ＴＢＳ緩衝液１００ｍＬ、ＳｅａｋｅｍＧＴＧアガロース（ＢＭＡ社）３ｇ）を加熱溶解し、ゲルトレイに流し込んで平板としたものを用い、左からレーン１〜３までを使用した。電気泳動するサンプルは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＳＩＧＭＡ社）５００ｎｇを使用した。各レーンの反応温度は表３の通りである。また、電気泳動装置はＭＵＰＩＤ−ＩＩ（株式会社アドバンス製）を利用し、１００Ｖで約４５分間電気泳動を行った。表３は、サンプルを染色する際の反応温度を示す表である。
【表３】表 ３
【００１８】検出にはブラックライト（ピーク波長３６０ｎｍ）による励起・蛍光の発色を利用し、撮影時に偏光フィルター（５００ｎｍ以下の波長をカットするフィルター）を利用した。 電気泳動像は図３の通りであった。図３からわかるように反応温度は６０℃が最適であることが明らかとなった。
【００１９】
〔実施例４〕蛋白質染色時の反応時間の影響
蛍光色素として、８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ（Ｍｅｔｈａｎｏｌ １００ｍＬ、ＮＢＤ−Ｃｌ （ＳＩＧＭＡ社）０．１６６ｇ）を利用した。染色時に、１０ｍＭの緩衝液（ｐＨ９．５）：８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ ＝ １：２ の割合で混合し、これを染色剤とした。サンプル：染色剤 ＝ １：２の割合で混合し、６０℃で反応させた。ここにＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ６．８） ０．１２５Ｍ、グリセロール２０重量％、２−メルカプトエタノール１０重量％、ＳＤＳ ４重量％、ブロモフェノールブルー ０．００２重量％を蒸留水１Ｌに溶解）を等量加え、１００℃で５分間保温した。その後、アガロールゲル電気泳動を行った。電気泳動には、ＴＢＳ緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン８９ｍＭ、ホウ酸８９ｍＭ、ＳＤＳ ０．１重量％を蒸留水１Ｌに溶解）、３％アガロースゲル（ＴＢＳ緩衝液１００ｍＬ、ＳｅａｋｅｍＧＴＧアガロース（ＢＭＡ社）３ｇ）を加熱溶解し、ゲルトレイに流し込んで平板としたものを用い、左からレーン１〜５までを使用した。電気泳動するサンプルは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＳＩＧＭＡ社）５００ｎｇを使用した。各レーンの反応時間は表４の通りである。また、電気泳動装置はＭＵＰＩＤ−ＩＩ（株式会社アドバンス製）を利用し、１００Ｖで約４５分間電気泳動を行った。表４は、サンプルを染色する際の反応時間を示す表である。
【表４】表 ４
【００２０】検出にはブラックライト（ピーク波長３６０ｎｍ）による励起・蛍光の発色を利用し、撮影時に偏光フィルター（５００ｎｍ以下の波長をカットするフィルター）を利用した。
電気泳動像は図４の通りであった。図４からわかるように反応時間は５分〜１５分がよく、その中でも１０分間の反応が最適であることが明らかとなった。
【００２１】
〔実施例５〕蛋白質染色時の塩濃度の影響
蛍光色素として、８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ（Ｍｅｔｈａｎｏｌ １００ｍＬ、ＮＢＤ−Ｃｌ （ＳＩＧＭＡ社）０．１６６ｇ）を利用した。染色時に、１０ｍＭの緩衝液（ｐＨ９．５）：８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ ＝ １：２ の割合で混合し、これを染色剤とした。サンプル：染色剤 ＝ １：２の割合で混合し、６０℃で１０分間反応させた。ここにＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ６．８） ０．１２５Ｍ、グリセロール２０重量％、２−メルカプトエタノール１０重量％、ＳＤＳ ４重量％、ブロモフェノールブルー ０．００２重量％を蒸留水１Ｌに溶解）を等量加え、１００℃で５分間保温した。その後、アガロールゲル電気泳動を行った。電気泳動には、ＴＢＳ緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン８９ｍＭ、ホウ酸８９ｍＭ、ＳＤＳ ０．１重量％を蒸留水１Ｌに溶解）、３％アガロースゲル（ＴＢＳ緩衝液１００ｍＬ、ＳｅａｋｅｍＧＴＧアガロース（ＢＭＡ社）３ｇ）を加熱溶解し、ゲルトレイに流し込んで平板としたものを用い、左からレーン１〜８までを使用した。電気泳動するサンプルは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＳＩＧＭＡ社）５００ｎｇを使用し、ここに調べる塩溶液を所定の濃度加えた。各レーンの塩濃度は表５の通りである。また、電気泳動装置はＭＵＰＩＤ−ＩＩ（株式会社アドバンス製）を利用し、１００Ｖで約４５分間電気泳動を行った。表５は、サンプルに加えた塩の種類と終濃度を示す表である。
【表５】表 ５
【００２２】検出にはブラックライト（ピーク波長３６０ｎｍ）による励起・蛍光の発色を利用し、撮影時に偏光フィルター（５００ｎｍ以下の波長をカットするフィルター）を利用した。
【００２３】電気泳動像は塩化ナトリウムの場合は図５の通りであった。また、塩化カルシウムの場合は図６の通りであった。図５、図６からわかるように塩化ナトリウムではほとんど影響は無いが、塩化カルシウムの場合は２５０ｍＭ以上の濃度では反応が阻害されることが明らかとなった。
【００２４】
〔実施例６〕検出限界の測定
蛍光色素として、８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ（Ｍｅｔｈａｎｏｌ １００ｍＬ、ＮＢＤ−Ｃｌ （ＳＩＧＭＡ社）０．１６６ｇ）を利用した。染色時に、１０ｍＭの緩衝液（ｐＨ９．５）：８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ ＝ １：２ の割合で混合し、これを染色剤とした。サンプル：染色剤 ＝ １：２の割合で混合し、６０℃で１０分間反応させた。ここにＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ６．８） ０．１２５Ｍ、グリセロール２０重量％、２−メルカプトエタノール１０重量％、ＳＤＳ ４重量％、ブロモフェノールブルー ０．００２重量％を蒸留水１Ｌに溶解）を等量加え、１００℃で５分間保温した。その後、アガロールゲル電気泳動を行った。電気泳動には、ＴＢＳ緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン８９ｍＭ、ホウ酸８９ｍＭ、ＳＤＳ ０．１重量％を蒸留水１Ｌに溶解）、３％アガロースゲル（ＴＢＳ緩衝液１００ｍＬ、ＳｅａｋｅｍＧＴＧアガロース（ＢＭＡ社）３ｇ）を加熱溶解し、ゲルトレイに流し込んで平板としたものを用い、左からレーン１〜８までを使用した。電気泳動するサンプルは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＳＩＧＭＡ社）を使用し、ここに調べる塩溶液を所定の濃度加えた。各レーンのＢＳＡ量は表６の通りである。また、電気泳動装置はＭＵＰＩＤ−ＩＩ（株式会社アドバンス製）を利用し、１００Ｖで約４５分間電気泳動を行った。さらに、比較対照としてＣＢＢ染色を同時に行った。表６は、サンプルとして使用したＢＳＡの量を示す表である。
【表６】表 ６
【００２５】検出にはブラックライト（ピーク波長３６０ｎｍ）による励起・蛍光の発色を利用し、撮影時に偏光フィルター（５００ｎｍ以下の波長をカットするフィルター）を利用した。
【００２６】電気泳動像はＮＢＤ−Ｃｌ染色の場合は図７の通りであった。また、ＣＢＢ染色の場合は図８の通りであった。図７、図８からわかるように検出感度はＣＢＢ染色の場合とほぼ同等であることが明らかとなった。
【００２７】
〔実施例７〕蛋白質の電気泳動
蛍光色素として、８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ（Ｍｅｔｈａｎｏｌ １００ｍＬ、ＮＢＤ−Ｃｌ （ＳＩＧＭＡ社）０．１６６ｇ）を利用した。染色時に、１０ｍＭの緩衝液（ｐＨ９．５）：８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ ＝ １：２ の割合で混合し、これを染色剤とした。サンプル：染色剤 ＝ １：２の割合で混合し、６０℃で１０分間反応させた。ここにＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ６．８） ０．１２５Ｍ、グリセロール２０重量％、２−メルカプトエタノール１０重量％、ＳＤＳ ４重量％、ブロモフェノールブルー ０．００２重量％を蒸留水１Ｌに溶解）を等量加え、１００℃で５分間保温した。その後、アガロールゲル電気泳動を行った。電気泳動には、ＴＢＳ緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン８９ｍＭ、ホウ酸８９ｍＭ、ＳＤＳ ０．１重量％を蒸留水１Ｌに溶解）、３％アガロースゲル（ＴＢＳ緩衝液１００ｍＬ、ＳｅａｋｅｍＧＴＧアガロース（ＢＭＡ社）３ｇ）を加熱溶解し、ゲルトレイに流し込んで平板としたものを用い、左からレーン１〜６までを使用した。電気泳動するサンプルは、は表７の通りであり、各１μｇを使用した。また、電気泳動装置はＭＵＰＩＤ−ＩＩ（株式会社アドバンス製）を利用し、１００Ｖで約４５分間電気泳動を行った。表７は、サンプルとして使用した蛋白質の名称を示す表である。
【表７】表 ７
【００２８】検出にはブラックライト（ピーク波長３６０ｎｍ）による励起・蛍光の発色を利用し、撮影時に偏光フィルター（５００ｎｍ以下の波長をカットするフィルター）を利用した。
【００２９】電気泳動像は図９の通りであり、全ての蛋白質が検出された。
【００３０】
〔実施例８〕ポリアクリルアミドゲル電気泳動への応用
蛍光色素として、８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ（Ｍｅｔｈａｎｏｌ １００ｍＬ、ＮＢＤ−Ｃｌ （ＳＩＧＭＡ社）０．１６６ｇ）を利用した。染色時に、１０ｍＭの緩衝液（ｐＨ９．５）：８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ ＝ １：２ の割合で混合し、これを染色剤とした。サンプル：染色剤 ＝ １：２の割合で混合し、６０℃で１０分間反応させた。ここにＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ６．８） ０．１２５Ｍ、グリセロール２０重量％、２−メルカプトエタノール１０重量％、ＳＤＳ ４重量％、ブロモフェノールブルー ０．００２重量％を蒸留水１Ｌに溶解）を等量加え、１００℃で５分間保温した。その後、アガロールゲル電気泳動を行った。電気泳動には、ＴＢＳ緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン８９ｍＭ、ホウ酸８９ｍＭ、ＳＤＳ ０．１重量％を蒸留水１Ｌに溶解）、１０％ポリアクリルアミドゲルを用い、左からレーン１〜６までを使用した。電気泳動するサンプルは、は表８の通りであり、各２μｇを使用した。また、電気泳動装置はＭＵＰＩＤ−ＩＩ（株式会社アドバンス製）を利用し、２０ｍＡで約１００分間電気泳動を行った。表８は、サンプルとして使用した蛋白質の名称を示す表である。
【００３１】
【表８】表 ８
【００３２】検出にはブラックライト（ピーク波長３６０ｎｍ）による励起・蛍光の発色を利用し、撮影時に偏光フィルター（５００ｎｍ以下の波長をカットするフィルター）を利用した。
【００３３】電気泳動像は図１０の通りであり、全ての蛋白質が検出された。この結果より、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にも応用可能であることが明らかとなった。
【００３４】
〔実施例９〕染色阻害剤の検討
蛍光色素として、８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ（Ｍｅｔｈａｎｏｌ １００ｍＬ、ＮＢＤ−Ｃｌ （ＳＩＧＭＡ社）０．１６６ｇ）を利用した。染色時に、１０ｍＭの緩衝液（ｐＨ９．５）：８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ ＝ １：２ の割合で混合し、これを染色剤とした。サンプル：染色剤 ＝ １：２の割合で混合し、６０℃で１０分間反応させた。ここにＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ６．８） ０．１２５Ｍ、グリセロール２０重量％、２−メルカプトエタノール１０重量％、ＳＤＳ ４重量％、ブロモフェノールブルー ０．００２重量％を蒸留水１Ｌに溶解）を等量加え、１００℃で５分間保温した。その後、アガロールゲル電気泳動を行った。電気泳動には、ＴＢＳ緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン８９ｍＭ、ホウ酸８９ｍＭ、ＳＤＳ ０．１重量％を蒸留水１Ｌに溶解）、３％アガロースゲル（ＴＢＳ緩衝液１００ｍＬ、ＳｅａｋｅｍＧＴＧアガロース（ＢＭＡ社）３ｇ）を加熱溶解し、ゲルトレイに流し込んで平板としたものを用い、左からレーン１〜３までを使用した。電気泳動するサンプルは、ＢＳＡ５００ｎｇであり、これに阻害剤を表９の量添加したものを使用した。また、電気泳動装置はＭＵＰＩＤ−ＩＩ（株式会社アドバンス製）を利用し、１００Ｖで約４５分間電気泳動を行った。表９は、使用した阻害剤の名称および終濃度を示す表である。
【表９】表 ９
【００３５】検出にはブラックライト（ピーク波長３６０ｎｍ）による励起・蛍光の発色を利用し、撮影時に偏光フィルター（５００ｎｍ以下の波長をカットするフィルター）を利用した。
電気泳動像は図１１の通りであり、還元剤によって反応が阻害されることが明らかとなった。
【００３６】
【発明の効果】
本発明の染色剤によって、従来用いられているＣＢＢ染色よりも、はるかに短時間で感度良く染色することが可能になった。また、電気泳動前に染色するため、脱色工程を省略することが可能になった。さらに、ＣＢＢ染色では染色されない核酸を染色することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】３％アガロースゲルを用いて、ＮＢＤ−Ｃｌを用いて染色した蛋白質（ＢＳＡ）の電気泳動を行った結果を示す図である。
【図２】３％アガロースゲルを用いて、ＮＢＤ−Ｃｌを用いて染色した蛋白質（ＢＳＡ）の電気泳動を行った結果を示す図である。
【図３】３％アガロースゲルを用いて、ＮＢＤ−Ｃｌを用いて染色した蛋白質（ＢＳＡ）の電気泳動を行った結果を示す図である。
【図４】３％アガロースゲルを用いて、ＮＢＤ−Ｃｌを用いて染色した蛋白質（ＢＳＡ）の電気泳動を行った結果を示す図である。
【図５】３％アガロースゲルを用いて、ＮＢＤ−Ｃｌを用いて染色した蛋白質（ＢＳＡ）の電気泳動を行った結果を示す図である。
【図６】３％アガロースゲルを用いて、ＮＢＤ−Ｃｌを用いて染色した蛋白質（ＢＳＡ）の電気泳動を行った結果を示す図である。
【図７】３％アガロースゲルを用いて、ＮＢＤ−Ｃｌを用いて染色した蛋白質（ＢＳＡ）の電気泳動を行った結果を示す図である。
【図８】３％アガロースゲルを用いて、蛋白質（ＢＳＡ）の電気泳動を行い、ＣＢＢ染色を行った結果を示す図である。
【図９】３％アガロースゲルを用いて、ＮＢＤ−Ｃｌを用いて染色した表７に示した蛋白質の電気泳動を行った結果を示す図である。
【図１０】１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて、ＮＢＤ−Ｃｌを用いて染色した表８に示した蛋白質の電気泳動を行った結果を示す図である。
【図１１】３％アガロースゲルを用いて、ＮＢＤ−Ｃｌを用いて染色した蛋白質（ＢＳＡ）の電気泳動を行った結果を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、電気泳動におけるタンパク質の検出に用いる、蛍光色素もしくはその誘導体を含む染色剤及び該染色剤を用いたタンパク質の検出方法に関する。また、本発明は、生物試料、例えば、細菌、酵母、かび、藻類、原生動物等の微生物、動植物の細胞、組織、及び染色体の染色方法及び観察法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質の電気泳動後の担体上での検出及び定量は色素染色法がよく用いられる。
【特許文献１】
特開平５年−１５７７３３号公報
【特許文献２】
特開２００３−２９３０４号公報
色素染色法ではそれぞれの公報に示されている様なＣｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｂｌｕｅ（ＣＢＢ）という色素を用いた方法が最も主流であり、ＣＢＢとタンパク質との分子間相互作用によりタンパク質にＣＢＢを付着させ、可視化するという染色法である。電気泳動終了後、ゲル中に染色剤等の試薬を浸透・透析させることにより検出を行う。比較的簡便であり、高い再現性を持つが、最大検出感度は約１００ｎｇであり微量なタンパク質の検出・定量には不向きである。また染色・固定・脱色行程はすべてゲルを介しており、染色剤等の試薬の浸透・透析が必要であるため、根本的にこの染色法は時間がかかり、通常２〜１６時間を要する。さらに、染色時間・試薬濃度の設定条件等によりバックグラウンドが高くなってしまう。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記のような現状に鑑み、蛍光色素を利用した染色剤であり、バックグラウンドの染色が少ない染色剤を提供するとともに、該染色剤を利用したタンパク質の高速検出方法を提供することを目的とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究の結果、従来はアミンをラベル化する色素である７−ｃｈｌｏｒｏ−４−ｎｉｔｒｏｂｅｎｚｏ−２−ｏｘａ−１，３−ｄｉａｚｏｌｅ（ＮＢＤ−Ｃｌ）が、安定性、染色性に優れ、タンパク質の染色成分として非常に優れた性質を有すること、並びに当該色素が無蛍光性であり、アミノ基との反応後に蛍光を発する性質の利用を考案し、これらの知見により本発明を完成した。
【０００５】
即ち、本発明の第一は、蛍光色素もしくはその誘導体を有効成分として含有することを特徴とする染色剤である。本発明の第二は、蛍光色素もしくはその誘導体により染色することを特徴とする高速染色方法である。
【発明の実施の形態】
【０００６】
以下、上記発明を各発明ごとに説明する。
（１）染色剤 本発明の染色剤は、蛍光色素もしくはその誘導体（以下、単に「蛍光色素等」という）を有効成分として少なくとも１種類含有する。ここで用いられる蛍光色素にはＮＢＤ−ＣｌやＤａｎｓｙｌ Ｃｈｌｏｒｉｄｅ に代表されるアミン標識用プローブや、Ｄａｎｓｙｌａｍｉｄｏｅｔｈｙｌ Ｍｅｔｈａｎｅｔｈｉｏｓｕｌｆｏｎａｔｅに代表されるチオール標識用プローブ、４−Ｂｒｏｍｏｍｅｔｈｙｌ−７−Ｍｅｔｈｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎに代表されるカルボン酸標識用プローブなどを例示することができ、これらの中でもＮＢＤ−Ｃｌが好ましい。また、ここで用いられる蛍光色素等は、ラベル化反応後に蛍光を持つものであれば特に限定されないが、電気泳動後の検出を考慮し、励起波長と蛍光波長の差が大きく、励起波長に紫外線を使用しないものが好ましい。さらに、蛍光色素等を数種類含有する染色剤を用いてもよい。
【０００７】
本発明の染色剤は、水溶液やアルコールなどに溶解させて使用する。ここで用いる水溶液としては、蒸留水、トリス緩衝液等を例示することができ、これらの溶液のｐＨは染色剤に含まれる蛍光色素等により異なるが、プローブ化反応に最適なｐＨであれば良い。アルコールとしてはメタノール、エタノール等を例示することができ、アルコール濃度は電気泳動に影響を与えない濃度であれば良いが、４０重量％以下であることが好ましい。また、溶液中のイオン強度は染色剤の反応性に影響を与える為、なるべく低い物が望ましい。以上の条件を考慮し、メタノール３３重量％の水溶液が一般的な使用には好ましい。水溶液中に溶解させる蛍光色素等の量は、染めようとするサンプルの分子量や濃度、染色時間、蛍光強度などに応じて決めればよいが、水溶液中の蛍光色素等の濃度が０．００１〜１．０重量％程度になるようにするのが好ましい。
０．００１重量％以下だと、反応性の点で好ましくなく、また１．０ 重量％以上だと蛍光色素の溶解性の点で好ましくない。しかしながら、蛍光強度の高い蛍光色素等はこの限りではない。
本発明の染色剤は、例えば、タンパク質のポリアクリルアミドゲル電気泳動前の染色に使用することができる。 染色時間は、染めようとするタンパク質の分子量や濃度、染色剤に含まれる蛍光色素等の蛍光強度などに応じて決めればよいが、通常は、５分〜１５分程度とするのが好ましい。通常用いられているＣＢＢによる染色では、３０分〜１２０分の染色が必要であり、これに比べて格段に染色時間が短縮された。また、電気泳動前に染色を行うため、電気泳動後の脱色操作が不必要となり、染色・脱色操作にかかる時間が大幅に短縮された。また、本染色剤は蛋白質だけでなく核酸の染色にも使用することが出来る。
【０００８】
（２）染色方法 本発明の染色方法は、蛍光色素等を用いて染色する。ここで用いられる蛍光色素等は、「（１）染色剤」の欄で述べたものと同様のものが使用できる。具体的な染色方法としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動前の染色法を例示することができる。しかしながら、あらかじめゲルに含有させる場合や、電気泳動後に染色する場合もある。
【０００９】ポリアクリルアミドゲル電気泳動前の染色法は、電気泳動前にタンパク質を染色剤と反応させることにより染色を行う方法である。反応時間は、染めようとするタンパク質の分子量や濃度、染色剤に含まれる蛍光色素等の反応性に応じて決めればよいが、通常は、５分〜１５分程度が適当である。また、反応温度は染めようとするタンパク質の分子量や濃度、染色剤に含まれる蛍光色素等の反応性に応じて決めればよいが、通常は室温〜６０℃が適当である。さらに、この染色時間は「（１）染色剤」の欄で述べた理由により、従来法より短縮されている。
【００１０】
【実施例】以下、本発明を実施例を挙げて具体的に説明するが、本発明はこれらに何ら限定されるものではない。
【００１１】
〔実施例１〕蛋白質染色時の緩衝液の影響
蛍光色素として、８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ（Ｍｅｔｈａｎｏｌ １００ｍＬ、ＮＢＤ−Ｃｌ （ＳＩＧＭＡ社）０．１６６ｇ）を利用した。染色時に、１０ｍＭの緩衝液（ｐＨ９．５）：８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ ＝ １：２ の割合で混合し、これを染色剤とした。サンプル：染色剤 ＝ １：２の割合で混合し、６０℃で５分間反応させた。ここにＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ６．８） ０．１２５Ｍ、グリセロール２０重量％、２−メルカプトエタノール１０重量％、ＳＤＳ ４重量％、ブロモフェノールブルー ０．００２重量％を蒸留水１Ｌに溶解）を等量加え、１００℃で５分間保温した。その後、アガロールゲル電気泳動を行った。電気泳動には、ＴＢＳ緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン８９ｍＭ、ホウ酸８９ｍＭ、ＳＤＳ ０．１重量％を蒸留水１Ｌに溶解）、３％アガロースゲル（ＴＢＳ緩衝液１００ｍＬ、ＳｅａｋｅｍＧＴＧアガロース（ＢＭＡ社）３ｇ）を加熱溶解し、ゲルトレイに流し込んで平板としたものを用い、左からレーン１〜３までを使用した。電気泳動するサンプルは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＳＩＧＭＡ社）５００ｎｇを使用した。各レーンの染色用緩衝液は表１の通りである。また、電気泳動装置はＭＵＰＩＤ−ＩＩ（株式会社アドバンス製）を利用し、１００Ｖで約４５分間電気泳動を行った。表１は、サンプルを染色する際に使用した緩衝液の組成を示す表である。
【表１】表 １
【００１３】電気泳動像は図１の通りであった。図１からわかるように緩衝液の種類による差異はほとんど見られなかった。しかし、染色剤との反応性が最も低い炭酸緩衝液の使用が好ましいことが明らかとなった。
【００１４】
〔実施例２〕蛋白質染色時の緩衝液濃度の影響
蛍光色素として、８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ（Ｍｅｔｈａｎｏｌ １００ｍＬ、ＮＢＤ−Ｃｌ （ＳＩＧＭＡ社）０．１６６ｇ）を利用した。染色時に、１０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）：８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ ＝ １：２ の割合で混合し、これを染色剤とした。サンプル：染色剤 ＝ １：２の割合で混合し、６０℃で５分間反応させた。ここにＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ６．８） ０．１２５Ｍ、グリセロール２０重量％、２−メルカプトエタノール１０重量％、ＳＤＳ ４重量％、ブロモフェノールブルー ０．００２重量％を蒸留水１Ｌに溶解）を等量加え、１００℃で５分間保温した。その後、アガロールゲル電気泳動を行った。電気泳動には、ＴＢＳ緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン８９ｍＭ、ホウ酸８９ｍＭ、ＳＤＳ ０．１重量％を蒸留水１Ｌに溶解）、３％アガロースゲル（ＴＢＳ緩衝液１００ｍＬ、ＳｅａｋｅｍＧＴＧアガロース（ＢＭＡ社）３ｇ）を加熱溶解し、ゲルトレイに流し込んで平板としたものを用い、左からレーン１〜３までを使用した。電気泳動するサンプルは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＳＩＧＭＡ社）５００ｎｇを使用した。各レーンの染色用緩衝液の濃度は表２の通りである。また、電気泳動装置はＭＵＰＩＤ−ＩＩ（株式会社アドバンス製）を利用し、１００Ｖで約４５分間電気泳動を行った。表２は、サンプルを染色する際に使用した緩衝液の濃度を示す表である。
【表２】表 ２
【００１６】電気泳動像は図２の通りであった。図２からわかるように緩衝液の濃度は１０ｍＭが最適であることが明らかとなった。
【００１７】
〔実施例３〕蛋白質染色時の反応温度の影響
蛍光色素として、８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ（Ｍｅｔｈａｎｏｌ １００ｍＬ、ＮＢＤ−Ｃｌ （ＳＩＧＭＡ社）０．１６６ｇ）を利用した。染色時に、１０ｍＭの緩衝液（ｐＨ９．５）：８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ ＝ １：２ の割合で混合し、これを染色剤とした。サンプル：染色剤 ＝ １：２の割合で混合し、６０℃で５分間反応させた。ここにＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ６．８） ０．１２５Ｍ、グリセロール２０重量％、２−メルカプトエタノール１０重量％、ＳＤＳ ４重量％、ブロモフェノールブルー ０．００２重量％を蒸留水１Ｌに溶解）を等量加え、１００℃で５分間保温した。その後、アガロールゲル電気泳動を行った。電気泳動には、ＴＢＳ緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン８９ｍＭ、ホウ酸８９ｍＭ、ＳＤＳ ０．１重量％を蒸留水１Ｌに溶解）、３％アガロースゲル（ＴＢＳ緩衝液１００ｍＬ、ＳｅａｋｅｍＧＴＧアガロース（ＢＭＡ社）３ｇ）を加熱溶解し、ゲルトレイに流し込んで平板としたものを用い、左からレーン１〜３までを使用した。電気泳動するサンプルは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＳＩＧＭＡ社）５００ｎｇを使用した。各レーンの反応温度は表３の通りである。また、電気泳動装置はＭＵＰＩＤ−ＩＩ（株式会社アドバンス製）を利用し、１００Ｖで約４５分間電気泳動を行った。表３は、サンプルを染色する際の反応温度を示す表である。
【表３】表 ３
【００１９】
〔実施例４〕蛋白質染色時の反応時間の影響
蛍光色素として、８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ（Ｍｅｔｈａｎｏｌ １００ｍＬ、ＮＢＤ−Ｃｌ （ＳＩＧＭＡ社）０．１６６ｇ）を利用した。染色時に、１０ｍＭの緩衝液（ｐＨ９．５）：８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ ＝ １：２ の割合で混合し、これを染色剤とした。サンプル：染色剤 ＝ １：２の割合で混合し、６０℃で反応させた。ここにＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ６．８） ０．１２５Ｍ、グリセロール２０重量％、２−メルカプトエタノール１０重量％、ＳＤＳ ４重量％、ブロモフェノールブルー ０．００２重量％を蒸留水１Ｌに溶解）を等量加え、１００℃で５分間保温した。その後、アガロールゲル電気泳動を行った。電気泳動には、ＴＢＳ緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン８９ｍＭ、ホウ酸８９ｍＭ、ＳＤＳ ０．１重量％を蒸留水１Ｌに溶解）、３％アガロースゲル（ＴＢＳ緩衝液１００ｍＬ、ＳｅａｋｅｍＧＴＧアガロース（ＢＭＡ社）３ｇ）を加熱溶解し、ゲルトレイに流し込んで平板としたものを用い、左からレーン１〜５までを使用した。電気泳動するサンプルは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＳＩＧＭＡ社）５００ｎｇを使用した。各レーンの反応時間は表４の通りである。また、電気泳動装置はＭＵＰＩＤ−ＩＩ（株式会社アドバンス製）を利用し、１００Ｖで約４５分間電気泳動を行った。表４は、サンプルを染色する際の反応時間を示す表である。
【表４】表 ４
電気泳動像は図４の通りであった。図４からわかるように反応時間は５分〜１５分がよく、その中でも１０分間の反応が最適であることが明らかとなった。
【００２１】
〔実施例５〕蛋白質染色時の塩濃度の影響
蛍光色素として、８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ（Ｍｅｔｈａｎｏｌ １００ｍＬ、ＮＢＤ−Ｃｌ （ＳＩＧＭＡ社）０．１６６ｇ）を利用した。染色時に、１０ｍＭの緩衝液（ｐＨ９．５）：８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ ＝ １：２ の割合で混合し、これを染色剤とした。サンプル：染色剤 ＝ １：２の割合で混合し、６０℃で１０分間反応させた。ここにＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ６．８） ０．１２５Ｍ、グリセロール２０重量％、２−メルカプトエタノール１０重量％、ＳＤＳ ４重量％、ブロモフェノールブルー ０．００２重量％を蒸留水１Ｌに溶解）を等量加え、１００℃で５分間保温した。その後、アガロールゲル電気泳動を行った。電気泳動には、ＴＢＳ緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン８９ｍＭ、ホウ酸８９ｍＭ、ＳＤＳ ０．１重量％を蒸留水１Ｌに溶解）、３％アガロースゲル（ＴＢＳ緩衝液１００ｍＬ、ＳｅａｋｅｍＧＴＧアガロース（ＢＭＡ社）３ｇ）を加熱溶解し、ゲルトレイに流し込んで平板としたものを用い、左からレーン１〜８までを使用した。電気泳動するサンプルは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＳＩＧＭＡ社）５００ｎｇを使用し、ここに調べる塩溶液を所定の濃度加えた。各レーンの塩濃度は表５の通りである。また、電気泳動装置はＭＵＰＩＤ−ＩＩ（株式会社アドバンス製）を利用し、１００Ｖで約４５分間電気泳動を行った。表５は、サンプルに加えた塩の種類と終濃度を示す表である。
【表５】表 ５
【００２３】電気泳動像は塩化ナトリウムの場合は図５の通りであった。また、塩化カルシウムの場合は図６の通りであった。図５、図６からわかるように塩化ナトリウムではほとんど影響は無いが、塩化カルシウムの場合は２５０ｍＭ以上の濃度では反応が阻害されることが明らかとなった。
【００２４】
〔実施例６〕検出限界の測定
蛍光色素として、８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ（Ｍｅｔｈａｎｏｌ １００ｍＬ、ＮＢＤ−Ｃｌ （ＳＩＧＭＡ社）０．１６６ｇ）を利用した。染色時に、１０ｍＭの緩衝液（ｐＨ９．５）：８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ ＝ １：２ の割合で混合し、これを染色剤とした。サンプル：染色剤 ＝ １：２の割合で混合し、６０℃で１０分間反応させた。ここにＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ６．８） ０．１２５Ｍ、グリセロール２０重量％、２−メルカプトエタノール１０重量％、ＳＤＳ ４重量％、ブロモフェノールブルー ０．００２重量％を蒸留水１Ｌに溶解）を等量加え、１００℃で５分間保温した。その後、アガロールゲル電気泳動を行った。電気泳動には、ＴＢＳ緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン８９ｍＭ、ホウ酸８９ｍＭ、ＳＤＳ ０．１重量％を蒸留水１Ｌに溶解）、３％アガロースゲル（ＴＢＳ緩衝液１００ｍＬ、ＳｅａｋｅｍＧＴＧアガロース（ＢＭＡ社）３ｇ）を加熱溶解し、ゲルトレイに流し込んで平板としたものを用い、左からレーン１〜８までを使用した。電気泳動するサンプルは、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ＳＩＧＭＡ社）を使用し、ここに調べる塩溶液を所定の濃度加えた。各レーンのＢＳＡ量は表６の通りである。また、電気泳動装置はＭＵＰＩＤ−ＩＩ（株式会社アドバンス製）を利用し、１００Ｖで約４５分間電気泳動を行った。さらに、比較対照としてＣＢＢ染色を同時に行った。表６は、サンプルとして使用したＢＳＡの量を示す表である。
【表６】表 ６
【００２６】電気泳動像はＮＢＤ−Ｃｌ染色の場合は図７の通りであった。また、ＣＢＢ染色の場合は図８の通りであった。図７、図８からわかるように検出感度はＣＢＢ染色の場合とほぼ同等であることが明らかとなった。
【００２７】
〔実施例７〕蛋白質の電気泳動
蛍光色素として、８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ（Ｍｅｔｈａｎｏｌ １００ｍＬ、ＮＢＤ−Ｃｌ （ＳＩＧＭＡ社）０．１６６ｇ）を利用した。染色時に、１０ｍＭの緩衝液（ｐＨ９．５）：８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ ＝ １：２ の割合で混合し、これを染色剤とした。サンプル：染色剤 ＝ １：２の割合で混合し、６０℃で１０分間反応させた。ここにＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ６．８） ０．１２５Ｍ、グリセロール２０重量％、２−メルカプトエタノール１０重量％、ＳＤＳ ４重量％、ブロモフェノールブルー ０．００２重量％を蒸留水１Ｌに溶解）を等量加え、１００℃で５分間保温した。その後、アガロールゲル電気泳動を行った。電気泳動には、ＴＢＳ緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン８９ｍＭ、ホウ酸８９ｍＭ、ＳＤＳ ０．１重量％を蒸留水１Ｌに溶解）、３％アガロースゲル（ＴＢＳ緩衝液１００ｍＬ、ＳｅａｋｅｍＧＴＧアガロース（ＢＭＡ社）３ｇ）を加熱溶解し、ゲルトレイに流し込んで平板としたものを用い、左からレーン１〜６までを使用した。電気泳動するサンプルは、は表７の通りであり、各１μｇを使用した。また、電気泳動装置はＭＵＰＩＤ−ＩＩ（株式会社アドバンス製）を利用し、１００Ｖで約４５分間電気泳動を行った。表７は、サンプルとして使用した蛋白質の名称を示す表である。
【表７】表 ７
【００２９】電気泳動像は図９の通りであり、全ての蛋白質が検出された。
【００３０】
〔実施例８〕ポリアクリルアミドゲル電気泳動への応用
蛍光色素として、８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ（Ｍｅｔｈａｎｏｌ １００ｍＬ、ＮＢＤ−Ｃｌ （ＳＩＧＭＡ社）０．１６６ｇ）を利用した。染色時に、１０ｍＭの緩衝液（ｐＨ９．５）：８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ ＝ １：２ の割合で混合し、これを染色剤とした。サンプル：染色剤 ＝ １：２の割合で混合し、６０℃で１０分間反応させた。ここにＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ６．８） ０．１２５Ｍ、グリセロール２０重量％、２−メルカプトエタノール１０重量％、ＳＤＳ ４重量％、ブロモフェノールブルー ０．００２重量％を蒸留水１Ｌに溶解）を等量加え、１００℃で５分間保温した。その後、アガロールゲル電気泳動を行った。電気泳動には、ＴＢＳ緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン８９ｍＭ、ホウ酸８９ｍＭ、ＳＤＳ ０．１重量％を蒸留水１Ｌに溶解）、１０％ポリアクリルアミドゲルを用い、左からレーン１〜６までを使用した。電気泳動するサンプルは、は表８の通りであり、各２μｇを使用した。また、電気泳動装置はＭＵＰＩＤ−ＩＩ（株式会社アドバンス製）を利用し、２０ｍＡで約１００分間電気泳動を行った。表８は、サンプルとして使用した蛋白質の名称を示す表である。
【００３１】
【表８】表 ８
【００３３】電気泳動像は図１０の通りであり、全ての蛋白質が検出された。この結果より、ポリアクリルアミドゲル電気泳動にも応用可能であることが明らかとなった。
【００３４】
〔実施例９〕染色阻害剤の検討
蛍光色素として、８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ（Ｍｅｔｈａｎｏｌ １００ｍＬ、ＮＢＤ−Ｃｌ （ＳＩＧＭＡ社）０．１６６ｇ）を利用した。染色時に、１０ｍＭの緩衝液（ｐＨ９．５）：８．３ｍＭ ＮＢＤ−Ｃｌ ＝ １：２ の割合で混合し、これを染色剤とした。サンプル：染色剤 ＝ １：２の割合で混合し、６０℃で１０分間反応させた。ここにＳＤＳ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液（ｐＨ６．８） ０．１２５Ｍ、グリセロール２０重量％、２−メルカプトエタノール１０重量％、ＳＤＳ ４重量％、ブロモフェノールブルー ０．００２重量％を蒸留水１Ｌに溶解）を等量加え、１００℃で５分間保温した。その後、アガロールゲル電気泳動を行った。電気泳動には、ＴＢＳ緩衝液（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン８９ｍＭ、ホウ酸８９ｍＭ、ＳＤＳ ０．１重量％を蒸留水１Ｌに溶解）、３％アガロースゲル（ＴＢＳ緩衝液１００ｍＬ、ＳｅａｋｅｍＧＴＧアガロース（ＢＭＡ社）３ｇ）を加熱溶解し、ゲルトレイに流し込んで平板としたものを用い、左からレーン１〜３までを使用した。電気泳動するサンプルは、ＢＳＡ５００ｎｇであり、これに阻害剤を表９の量添加したものを使用した。また、電気泳動装置はＭＵＰＩＤ−ＩＩ（株式会社アドバンス製）を利用し、１００Ｖで約４５分間電気泳動を行った。表９は、使用した阻害剤の名称および終濃度を示す表である。
【表９】表 ９
電気泳動像は図１１の通りであり、還元剤によって反応が阻害されることが明らかとなった。
【００３６】
【発明の効果】
本発明の染色剤によって、従来用いられているＣＢＢ染色よりも、はるかに短時間で感度良く染色することが可能になった。また、電気泳動前に染色するため、脱色工程を省略することが可能になった。さらに、ＣＢＢ染色では染色されない核酸を染色することが可能になった。
【図面の簡単な説明】
【図１】３％アガロースゲルを用いて、ＮＢＤ−Ｃｌを用いて染色した蛋白質（ＢＳＡ）の電気泳動を行った結果を示す図である。
【図２】３％アガロースゲルを用いて、ＮＢＤ−Ｃｌを用いて染色した蛋白質（ＢＳＡ）の電気泳動を行った結果を示す図である。
【図３】３％アガロースゲルを用いて、ＮＢＤ−Ｃｌを用いて染色した蛋白質（ＢＳＡ）の電気泳動を行った結果を示す図である。
【図４】３％アガロースゲルを用いて、ＮＢＤ−Ｃｌを用いて染色した蛋白質（ＢＳＡ）の電気泳動を行った結果を示す図である。
【図５】３％アガロースゲルを用いて、ＮＢＤ−Ｃｌを用いて染色した蛋白質（ＢＳＡ）の電気泳動を行った結果を示す図である。
【図６】３％アガロースゲルを用いて、ＮＢＤ−Ｃｌを用いて染色した蛋白質（ＢＳＡ）の電気泳動を行った結果を示す図である。
【図７】３％アガロースゲルを用いて、ＮＢＤ−Ｃｌを用いて染色した蛋白質（ＢＳＡ）の電気泳動を行った結果を示す図である。
【図８】３％アガロースゲルを用いて、蛋白質（ＢＳＡ）の電気泳動を行い、ＣＢＢ染色を行った結果を示す図である。
【図９】３％アガロースゲルを用いて、ＮＢＤ−Ｃｌを用いて染色した表７に示した蛋白質の電気泳動を行った結果を示す図である。
【図１０】１０％ポリアクリルアミドゲルを用いて、ＮＢＤ−Ｃｌを用いて染色した表８に示した蛋白質の電気泳動を行った結果を示す図である。
【図１１】３％アガロースゲルを用いて、ＮＢＤ−Ｃｌを用いて染色した蛋白質（ＢＳＡ）の電気泳動を行った結果を示す図である。
Claims (5)
- 蛍光色素を有効成分として少なくとも１種類を含有してなることを特徴とする染色剤。
- アミノ基・カルボキシル基・スルホン基をラベル化することで蛍光を発する蛍光色素誘導体を有効成分として少なくとも１種類を含有してなることを特徴とする請求項１に記載の染色剤。
- アミノ基・カルボキシル基・スルホン基をラベル化することで蛍光を発する蛍光色素及び蛍光色素誘導体の混合物を有効成分として含有してなることを特徴とする請求項１に記載の染色剤。
- 電気泳動を行う前に、試料に前記染色剤を添加することで、試料を着色する請求項１，２，３に記載の染色剤の使用方法。
- 前記塩基性色素が、ＮＢＤ−Ｃｌである請求項１乃至４に記載の染色剤及び当該染色剤の使用方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003111584A JP2004317297A (ja) | 2003-04-16 | 2003-04-16 | 染色剤及び当該染色剤を用いた染色方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003111584A JP2004317297A (ja) | 2003-04-16 | 2003-04-16 | 染色剤及び当該染色剤を用いた染色方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004317297A true JP2004317297A (ja) | 2004-11-11 |
Family
ID=33472092
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2003111584A Pending JP2004317297A (ja) | 2003-04-16 | 2003-04-16 | 染色剤及び当該染色剤を用いた染色方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2004317297A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006062222A1 (ja) * | 2004-12-06 | 2006-06-15 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | タンパク質の分離方法及び染色方法、並びにこれらの方法に用いるタンパク質染色液及びタンパク質染色用キット |
| JP2006275762A (ja) * | 2005-03-29 | 2006-10-12 | Toyota Motor Corp | 樹脂の劣化度評価方法及び樹脂のリサイクル方法 |
| WO2007046537A1 (ja) * | 2005-10-19 | 2007-04-26 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | タンパク質の分析方法 |
| JP2008128918A (ja) * | 2006-11-24 | 2008-06-05 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 唾液成分のオンチップ分析方法 |
-
2003
- 2003-04-16 JP JP2003111584A patent/JP2004317297A/ja active Pending
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2006062222A1 (ja) * | 2004-12-06 | 2006-06-15 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | タンパク質の分離方法及び染色方法、並びにこれらの方法に用いるタンパク質染色液及びタンパク質染色用キット |
| GB2436048A (en) * | 2004-12-06 | 2007-09-12 | Nat Inst Of Advanced Ind Scien | Method of separating protein, method of staining protein and liquid protein staining agent and protein-staining kit to be used in these methods |
| JPWO2006062222A1 (ja) * | 2004-12-06 | 2008-06-12 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | タンパク質の分離方法及び染色方法、並びにこれらの方法に用いるタンパク質染色液及びタンパク質染色用キット |
| GB2436048B (en) * | 2004-12-06 | 2009-02-11 | Nat Inst Of Advanced Ind Scien | Method of separating protein, method of staining protein and liquid protein-staining agent and protein-staining kit to be used in these methods |
| JP4756422B2 (ja) * | 2004-12-06 | 2011-08-24 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | タンパク質の分離方法及び染色方法、並びにこれらの方法に用いるタンパク質染色液及びタンパク質染色用キット |
| JP2006275762A (ja) * | 2005-03-29 | 2006-10-12 | Toyota Motor Corp | 樹脂の劣化度評価方法及び樹脂のリサイクル方法 |
| JP4529760B2 (ja) * | 2005-03-29 | 2010-08-25 | トヨタ自動車株式会社 | 樹脂の劣化度評価方法及び樹脂のリサイクル方法 |
| WO2007046537A1 (ja) * | 2005-10-19 | 2007-04-26 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | タンパク質の分析方法 |
| JP2007114009A (ja) * | 2005-10-19 | 2007-05-10 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | タンパク質の分析方法 |
| US8062492B2 (en) | 2005-10-19 | 2011-11-22 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Method for analyzing protein |
| JP2008128918A (ja) * | 2006-11-24 | 2008-06-05 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 唾液成分のオンチップ分析方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4079381B2 (ja) | メロシアニン染料タンパク質染色 | |
| CN108139408A (zh) | 蛋白质保持扩展显微法 | |
| Craig et al. | Determination of picomolar concentrations of proteins using novel amino reactive chameleon labels and capillary electrophoresis laser‐induced fluorescence detection | |
| AU2009228981A1 (en) | Analysis of DNA by means of capillary electrophoresis | |
| Araki et al. | Accurate determination of DNA content in single cell nuclei stained with Hoechst 33258 fluorochrome at high salt concentration | |
| JPS6361622B2 (ja) | ||
| JP7197941B2 (ja) | 生体組織染色試薬、生体組織染色キット及び生体組織染色方法 | |
| US7144738B2 (en) | Materials for enhancing staining of biopolymers in matrices | |
| JP2004317297A (ja) | 染色剤及び当該染色剤を用いた染色方法 | |
| US20090223823A1 (en) | Method of separating protein, method of staining protein and liquid protein-staining agent and protein-staining kit to be used in these methods | |
| Jing et al. | The utility of a two‐color fluorescence electrophoretic mobility shift assay procedure for the analysis of DNA replication complexes | |
| US20050287674A1 (en) | Labeling proteins with dyes that are insoluble or only sparingly soluble in water | |
| US8303790B2 (en) | Pre-staining protocol for a protein sample with a pyrylium dye and respective kit | |
| JP2005156564A (ja) | 濃縮アゾ染色液、これを含む染色用キット、及びタンパク質染色液の調製方法 | |
| CN104661731B (zh) | 用于电泳中免染蛋白质检测的改良电极缓冲液 | |
| WO2019213543A1 (en) | 2-[2-[4-[bis(2-sulfoethyl)amino]phenyl]ethenyl]-1-butyl-3,3-dimethyl-3h-indolium hemicyanine dyes for the detection of antibodies and other biomolecules | |
| RU2310204C1 (ru) | Способ количественного определения фетального гемоглобина человека | |
| PL243041B1 (pl) | Preparat do barwienia i oznaczania stężenia białek, jego zastosowanie, sposób barwienia białek, zwłaszcza na żelach poliakrylamidowych oraz sposób oznaczania stężenia białek w roztworach wodnych | |
| CN113945552A (zh) | 一种活细胞线粒体中还原型谷胱甘肽的浓度测定方法 | |
| JP2004163278A (ja) | 染色剤及び当該染色剤の使用方法 | |
| Leyrer-Jackson et al. | Using Western Blotting for the Evaluation of Metabotropic Glutamate Receptors Within the Nervous System: Procedures and Technical Considerations | |
| RU2070323C1 (ru) | Способ определения эффективности терапии хронической почечной недостаточности | |
| IMISCIBLE | PROTEIN ASSAY BY SILVER BINDING | |
| JP2010286326A (ja) | タンパク質の検出・定量方法及びタンパク質の検出・定量用試薬キット | |
| O'GORMAN | CHEMICAL AND PHYSICAL STUDIES OF LAC REPRESSOR. |