WO2006062222A1 - タンパク質の分離方法及び染色方法、並びにこれらの方法に用いるタンパク質染色液及びタンパク質染色用キット - Google Patents

タンパク質の分離方法及び染色方法、並びにこれらの方法に用いるタンパク質染色液及びタンパク質染色用キット Download PDF

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solution
gel
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Ichiji Namatame
Yoshinori Ishii
Yoshimasa Saito
Takayoshi Komatsu
Yasuhiro Ogawa
Takashi Shibata
Hideki Kinoshita
Kenji Yokoyama
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National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology
Sharp Corporation
Toppan Printing Co., Ltd.
Katayanagi Institute
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a protein separation method and staining method in electrophoresis, a protein staining solution used in these methods, and a protein staining kit.
  • Electrophoresis is known as the best method for separating each component in a mixture containing protein.
  • the two-dimensional gel electrophoresis method is widely used because it can separate a crude cell extract into protein components as high as 1,00.
  • a protein-containing sample after the first dimension electrophoresis is treated with sodium dodecyl sulfate (SDS), and then subjected to the second dimension electrophoresis to stain the separated protein. This is a method of cleaning and analyzing.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • This is a method of cleaning and analyzing.
  • the CBB staining method, the Sypro Ruby staining method, etc. are used (Ogino, "Electrophoresis latest protocol", Yodosha, January, 1990).
  • the Ettan DIGE method involves reacting a protein-containing sample with a stain and stopping the reaction. This is a method of subjecting the protein-containing sample after electrophoresis to SDS processing after subjecting it to electrophoresis in the second dimension, and analyzing the protein by subjecting it to electrophoresis in the second dimension. Disclosure of the invention
  • the Ettan DIGE method can perform a staining operation in a shorter time compared to a conventionally known electrophoresis method, but in order to control the amount of the staining agent, an excess of staining agent and protein are used. The reaction needs to be stopped. For this reason, the staining operation becomes complicated. As described above, since the staining operation in the conventional electrophoresis method is complicated, there is an urgent need for a method that can easily and quickly stain and separate proteins.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and the problem to be solved is a method capable of simply and rapidly staining and separating proteins in electrophoresis, and protein staining used in these methods. It is to provide a kit for staining liquid and protein.
  • the present inventors have shortened the dyeing time and dyeing by using a dyeing solution containing a dye and a surfactant in a buffer solution.
  • the present inventors have found that an improvement in sensitivity can be obtained and have completed the present invention.
  • the present invention has the following features.
  • a method for separating proteins by gel electrophoresis comprising a staining step in which a staining solution containing a staining agent and a surfactant in a buffer solution is brought into contact with the protein-containing sample, and a protein-containing sample after the staining step.
  • the gel electrophoresis is SDS polyacrylamide gel electrophoresis
  • the electrophoresis is a two-dimensional electrophoresis having a first-dimensional electrophoresis and a second-dimensional electrophoresis, and the first-dimensional electrophoresis ends before the second-dimensional electrophoresis.
  • a protein staining kit for gel electrophoresis comprising a buffer, a staining agent, and a surfactant.
  • the document further includes an explanation regarding the separation method according to any one of (1) to (1 1) above or the staining method according to (1 2) or (1 3) above.
  • a protein staining solution for gel electrophoresis which contains a staining agent and a surfactant in a buffer solution.
  • FIG. 1 is a diagram showing a two-dimensional electrophoretic image of a mouse brain tissue extract stained by the present staining method in Example 1.
  • FIG. 1 is a diagram showing a two-dimensional electrophoretic image of a mouse brain tissue extract stained by the present staining method in Example 1.
  • FIG. 2 is a diagram showing a two-dimensional electrophoretic image of a mouse brain tissue extract stained by the present staining method in Example 2.
  • FIG. 2 is a diagram showing a two-dimensional electrophoretic image of a mouse brain tissue extract stained by the present staining method in Example 2.
  • FIG. 3 is a diagram showing an SDS-PAGE electrophoresis image of a mouse brain tissue extract stained by this staining method in Example 3.
  • FIG. 4 is a diagram showing an SDS-PAGE electrophoretic image of a mouse brain tissue extract stained by the present staining method in Example 4.
  • FIG. 5 is a view showing a two-dimensional electrophoretic image of a mouse brain tissue extract stained with a staining solution containing no SDS in Comparative Example 1.
  • FIG. 6 is a view showing a two-dimensional electrophoresis image of a mouse brain tissue extract stained by CBB staining in Comparative Example 2.
  • FIG. 7 is a view showing a two-dimensional electrophoretic image of a mouse brain tissue extract stained by the present staining method and Ettan DIGE staining method in Comparative Example 3.
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION will be described in detail with reference to preferred embodiments thereof.
  • the method for separating proteins by gel electrophoresis of the present invention includes a staining step and an electrophoresis step.
  • the staining step is a step in which a staining solution containing a staining agent and a surfactant in a buffer solution is brought into contact with the protein-containing sample.
  • the electrophoresis step is a step of subjecting the protein-containing sample after the staining step to gel electrophoresis.
  • the protein-containing sample is brought into contact with the staining solution before the protein-containing sample is supported on the support.
  • an extract of a biological sample containing plural kinds of proteins can be used.
  • Biological samples include, for example, living cells such as horses, horses, pigs, hidges, dogs, birds, and other living animals such as humans, laboratory animals such as mice and rats, and tissues containing them (for example, Liver tissue, muscle tissue, brain tissue, heart tissue, blood, plasma, serum, body fluid such as lymph, lymph node) or body secretion (for example, urine).
  • tissue containing them for example, Liver tissue, muscle tissue, brain tissue, heart tissue, blood, plasma, serum, body fluid such as lymph, lymph node
  • body secretion for example, urine.
  • the support examples include gels such as polyacrylamide gel and agarose gel.
  • the gel concentration of the support can be appropriately selected according to the molecular weight of the protein to be separated. For example, in the case of a polyacrylamide gel, it is usually 3 to 20%. Further, when the molecular weight of the protein to be separated is unknown or in a wide range, for example, a gel having a concentration gradient of 5 to 20% may be used.
  • a gel having a concentration gradient of 5 to 20% may be used as the above-mentioned gel, for example, an acrylamide and ⁇ , ⁇ -methylenebisacrylamide may be polymerized to prepare a gel having a desired concentration.
  • staining solution As a staining solution used for staining a protein-containing sample, the protein staining solution for gel electrophoresis of the present invention (hereinafter simply referred to as “staining solution”) can be used.
  • the staining solution of the present invention is characterized by containing a staining agent and a surfactant in a buffer solution.
  • buffers known in the art can be used as the buffer, but those that do not inhibit the reaction between the functional group of the staining solution and the functional group of the protein that reacts with the functional group are preferable.
  • Such a buffer solution can be appropriately selected in consideration of the type of staining agent used.
  • a carbonate buffer solution (a buffer solution in which Na 2 C0 3 and NaHC 0 3 are combined), a phosphate buffer solution (Na 2 HP0 4 and NaH 2 P0 4 buffer), Clark and Lubs solution (KH 2 P0 4 and NaOH combined buffer), NaHC0 3 buffer (5% C0 2 or NaOH to adjust pH) ), Imidazol e-HC1 buffer (2, 4, 6-Trimethylpyridine HC1 buffer), Morphol inopropanesulphonic acid (MOPS) KOH buffer, Nonorbital-HC1 buffer (Sodium 5, 5-diethylbarbiturate And HC1), N-ethylraorphol ine-HCl buffer, ⁇ -2-Hydroxyethylpiperazine-N '-et hanesulphonic acid (HEPES)-NaOH buffer, ⁇ -2-Hydroxyethylpiperaz ine-N' _3-propanesulphonic acid (EPPS) -NaOH buffer, N
  • Unaryo of N- hydroxysuccinimidyl de systems (e.g., C y 5, C y 7 ) is carbonate buffer, NaHCO 3 buffer Is preferred.
  • the concentration of the buffer in the staining solution is preferably 10 mM or less, more preferably 3 mM or less. Such concentration exceeds 1 O mM And the protein bands separated by electrophoresis tend to undulate. It should be noted that the concentration of the buffer solution is preferably 0.3 mM or more because the undulation of the band may occur even if the buffer solution concentration is too low.
  • the covalently bonded dyeing agent can form a covalent bond by a chemical reaction with a functional group such as NH 2 group, COOH group, SH group or OH group present in the structure of organic compound, nucleic acid or protein.
  • a functional group such as NH 2 group, COOH group, SH group or OH group present in the structure of organic compound, nucleic acid or protein.
  • stains examples include cyanine dyes (for example, Cy 5, Cy 3, Cy 2, Cy 7 (Araersham Bioscience)), Alexa Fluors, Biotins, B0DIPYs, Fluoresceins, Oligogon Examples include Greens, Rhodamines, Texas reds, Couraarins, NBD (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole) s, and the like.
  • cyanine dyes particularly Cy 5, Cy 3 and Cy 2 (manufactured by Atnershatn Bioscience) are preferable.
  • the concentration of the staining agent in the staining solution is preferably 100 to 1,000 / X gZmL, and more preferably 200 to 500 ⁇ g / mL.
  • concentration is less than 100 gZmL, the fluorescence sensitivity tends to decrease remarkably, and when it exceeds 1,000 gZmL, the fluorescence sensitivity tends to saturate.
  • Non-covalent dyes can also be used in the present invention, for example, Sypro Orange, Sypro red (manufactured by Molecular Probes).
  • a surfactant capable of imparting a negative charge to the protein is preferable, and examples thereof include an anionic surfactant.
  • examples of such surfactants include dodecyl sulfate metal salt, and specific examples include sodium dodecyl sulfate (SDS) and lithium dodecyl sulfate (LDS).
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • LDS lithium dodecyl sulfate
  • Surfactants such as SDS also function as protein solubilizers, but by coexisting SDS and a dye, protein staining and SDS conversion can be performed simultaneously. wear. This allows simple and rapid staining of protein-containing samples.
  • the concentration of the surfactant in the staining solution is preferably 0.5 to 10%, more preferably 1.0 to 5.0%, and even more preferably 1.0 in the case of alkali metal dodecyl sulfate, for example. ⁇ 2.0%.
  • concentration is less than 0.5%, the fluorescence sensitivity tends to decrease, and when it exceeds 10%, the fluorescence sensitivity tends to be saturated.
  • surfactant concentration means wZv.
  • the staining liquid of the present invention may further contain alcohol.
  • alcohol By containing alcohol, protein staining efficiency can be improved. Although the factors for obtaining such effects have not been clearly elucidated, the present inventors presume that one of the factors is the improved permeability of the staining solution to the gel. .
  • the alcohol a linear or branched alcohol having 1 to 4 carbon atoms is suitable, and specific examples include methanol, ethanol, propanol, iso_propanol, butanol sec-ptanol and the like. Among these, methanol, ethanol, propanol, and butanol are preferable, and methanol, ethanol, and propanol are more preferable.
  • the concentration of alcohol in the staining solution is preferably 0.5 to 30%, more preferably 0.5 to 10%, and still more preferably 0.5 to 1.0%. If the concentration is less than 0.5%, the effect of adding alcohol tends to be insufficient, and if it exceeds 30%, the dyeing efficiency tends to decrease. In this specification, the alcohol concentration (%) means ⁇ / ⁇ .
  • the pH of the staining solution of the present invention can be appropriately selected depending on the staining agent used.
  • an amino group-modified staining agent such as N-hydroxysucciniraide type Cy 5, Cy 3, or Cy 2 is used.
  • the staining solution preferably has a pH of 9.5 to 10.0.
  • the protein staining method in gel electrophoresis of the present invention (hereinafter simply referred to as “staining method”) can be applied.
  • staining method of the present invention a staining solution and a protein-containing sample are brought into contact with each other before being subjected to gel electrophoresis, and protein staining and surfactant treatment (such as SDS) are performed. It is characterized by being performed simultaneously.
  • gel electrophoresis is two-dimensional electrophoresis
  • the protein-containing sample that has completed the first-dimensional electrophoresis is brought into contact with the staining solution before the second-dimensional electrophoresis.
  • the staining solution and the protein-containing sample can be contacted by a simple means such as dropping the staining solution onto the gel supporting the protein-containing sample with a pipette or immersing the gel in the staining solution.
  • the contact time between the staining solution and the protein-containing sample may be about 30 minutes, but sufficient staining is possible even after subjecting to electrophoresis immediately after contact.
  • the molecular weights of dyes and proteins differ greatly, and the difference in the migration speed between the two results in the fact that there is a large difference in the proportion of negative charge in the molecular weight (minus charge molecular weight).
  • the electrophoresis process will be described.
  • the protein-containing sample that has been subjected to protein staining and surfactant treatment (such as SDS) in the staining step is subjected to gel electrophoresis.
  • electrophoresis can be performed by a conventionally known method.
  • the gel electrophoresis is not particularly limited as long as it is an electrophoresis method capable of separating proteins. For example, isoelectric focusing, sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide gel electrophoresis (SDS— PAGE), disk gel electrophoresis, slab gel electrophoresis, gel fast electrophoresis.
  • SDS-P AGE and isoelectric focusing are preferable.
  • two-dimensional electrophoresis for example, it is preferable to combine two electrophoresis methods capable of separating proteins from two different factors such as isoelectric point and molecular weight. Specifically, it is preferable to select isoelectric focusing in the first dimension and SDS-PAGE in the second dimension.
  • the gel gradient can be formed by adding an amphoteric carrier (Carrier ampholytes) to a polyacrylamide gel and applying an electric field. Examples include a method of forming an H gradient simultaneously with the preparation of a gel using an acrylamide compound having an electric point. Also In the two-dimensional electrophoresis of isoelectric focusing and SDS-PAGE, a gel containing the protein separated by isoelectric focusing is placed on the end of the second dimension, and isoelectric focusing Proteins are separated by migration in a direction perpendicular to the development direction. In addition, the energization conditions in gel electrophoresis can be appropriately set according to the electrophoresis method or the like.
  • the protein separated by the electrophoresis process described above can be detected by, for example, excising only the band with a cutter knife or the like and measuring the fluorescence intensity at a specific wavelength using a fluorescence analyzer. it can. Furthermore, the protein detected in this way can be analyzed by analyzing the molecular weight, purity, identification, quantification, etc. of the protein after decoloring if necessary, and recovering it by extraction or transfer to a membrane.
  • a composition containing a staining agent, a composition containing a surfactant, and if necessary, a buffer and Z or alcohol are contained in separate containers. It is preferable to prepare a staining solution having a desired concentration and pH by mixing them with each other when staining proteins. Further, as another embodiment, in a container divided into a plurality of sections, a first section storing a composition containing a staining agent, and a second section storing a composition containing a surfactant, A protein staining kit comprising a third section for containing a buffer solution and a fourth section for storing Z or alcohol as required.
  • the protein staining kit of the present invention may further include a document describing the above-described separation method and staining method of the present invention.
  • the composition containing the staining agent and the composition containing the surfactant are preferably adjusted in advance to a desired concentration.
  • Extract of mouse brain thread and tissue (5.2 mg protein / ml 50 mM Tris- HC1 (pH 7.6) / 20% glycerol / 0.3 M sodium chloride / protease inhibitor cocktail 1 tab / 10 mL ( Roche-diagnostics)) were separated by two-dimensional electrophoresis. That is, this extract 7.7 AZ L was swollen (6M Urea / 2 M Thiourea / 2% CHAPS solution 191 L, ampholite (pH 3-10) ⁇ ⁇ ⁇ , 0.
  • IPG immobiline pH gradient
  • staining solution (97 ⁇ 37 7 ⁇ g / raL 2% SDS I 100 mM Na) using fluorescent reagent N-hydroxysuccinimide type Cy5 (Amersham Biosciences) that covalently binds to protein amino group under Al force 2 C0 3 / NaHC0 3 (pH 9.9)) 50 ⁇ is stained by sprinkling with a pipetman on an IPG gel strip and immediately applied to a 4-12% gradient SDS-polyacrylamide electrophoresis gel in the second dimension. The sample was applied and electrophoresed at 200 V for 40 min.
  • Two-dimensional electrophoresis was performed in the same manner as in Example 1 except that the sodium carbonate buffer was changed to 3 mM Na 2 C0 3 / NaHC0 3 , and a protein migration image was observed. As a result, it was confirmed that the undulation of the band could be eliminated while maintaining the protein staining efficiency (Fig. 2). Similar to Example 1, the same electrophoresis pattern as in the CBB staining method was observed.
  • Extract of mouse brain thread and tissue (5 mg protein / ml 50 mM Tris-HC1 (pH 7.6) / 20 glycerol / 0.3 M sodium chloride / protease inhibitor cocktail 1 tab / 10 mL (Roche-diagnostics) ) Were separated by SDS-PAGE. That is, N_hydroxysuccinimide type Cy5 (manufactured by Amersham Biosciences) stain solution (1 mg / ra L 2% SDS I 100 mM Na 2 C0 3 / NaHC0 3 (pH 9, 9)) 10 // L And then incubate at room temperature for 30 minutes. Electrophoresis was performed under the condition of 240 V 15 min.
  • mice brain tissue 5 rag protein / ml 50 mM Tris-HC1 (pH 7.6) / 20% glycerol / 0.3 M sodium chloride / protease inhibitor cocktai l 1 tab / 10 mL (Roche-diagnostics) ) Were separated by SDS-PAGE.
  • Example 5 Perform 2D electrophoresis in the same way as in Example 1 except that a staining solution containing no 2% SDS was used, and that 2D electrophoresis was performed 30 minutes after staining. The protein migration image was observed. As a result, almost no stained protein was observed when a staining solution containing no 2% SDS was used (FIG. 5).
  • CBB staining method was performed, in which the gel after two-dimensional electrophoresis was operated for about 105 minutes.
  • CBB staining was performed using Biosafe-CBB (BIO-RAD). That is, the gel after electrophoresis was washed three times at 0 for 5 minutes, stained with Biosaf-CBB solution for 60 minutes, and then washed at 0 for 30 minutes to complete the staining.
  • the electrophoresis pattern is shown in FIG.
  • this staining method two-dimensional electrophoresis is performed using the protein extract of the same weight according to the above-described example, and the electrophoresis image of the protein is observed with a fluorescence image analyzer, and the Ettan DIGE staining method is used. Compared. As a result, it was clarified that the electrophoretic image obtained by this staining method (FIG. 7A) can be detected with higher sensitivity than the electrophoretic image obtained by the Ettan DIGE staining method (FIG. 7B). In other words, this staining method takes less time compared to the Ettan DIGE staining method.
  • a protein-containing sample by using a staining solution containing a surfactant such as SDS, a protein-containing sample can be dyed in a short time, and color can be developed with high sensitivity.
  • a staining solution containing a surfactant such as SDS since the excessive amount of the stain is migrated before the protein by electrophoresis, no washing operation is required.
  • the first-dimension electrophoresis it can be immediately subjected to the second-dimension electrophoretic migration by staining with a stain containing a surfactant such as SDS. Therefore, the number of steps can be reduced as compared with the conventional protein separation method, and the separation operation can be simplified. Therefore, there is provided a method capable of staining and separating proteins by electrophoresis in a simple and rapid manner.

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Abstract

ゲル電気泳動によるタンパク質の分離方法であって、緩衝液中に染色剤及び界面活性剤を含有する染色液をタンパク質含有サンプルに接触させる染色工程と、染色工程後のタンパク質含有サンプルをゲル電気泳動に供する電気泳動工程とを含む、分離方法。本発明によれば、ＳＤＳ等の界面活性剤を含有する染色液を用いることによりタンパク質含有サンプルを短時間で染色し、しかも高感度で発色させることができる。また、過剰量の染色剤は、電気泳動によってタンパク質よりも先に泳動されるため、洗浄操作も不要である。また、１次元目の電気泳動後にＳＤＳ等の界面活性剤を含有する染色剤で染色することにより直ちに２次元目の電気泳動に供することもできる。そのため、従来のタンパク質の分離方法に比べて工程数を減らすことができ、分離操作の簡略化が可能になる。したがって、簡便かつ迅速な電気泳動におけるタンパク質の分離方法が提供される。

Description

明細書
質の分離方法及び染色方法、 並びにこれらの方法
に用いるタンパク質染色液及びタンパク質染色用キット 技術分野
本発明は、 電気泳動におけるタンパク質の分離方法及び染色方法、 並び【 らの方法に用いるタンパク質染色液及びタンパク質染色用キットに関する。 背景技術
タンパク質を含む混合液中の各成分を最もよく分離する方法として、 電気泳動 法が知られている。 電気泳動法の中でも、 2次元ゲル電気泳動法は、 細胞の粗抽 出液を 1， 0 0 0にものぼる各タンパク質成分に分離することができることから 広く使用されている。 かかる 2次元ゲル電気泳動法は、 例えば、 1次元目の電気 泳動後のタンパク質含有試料をドデシル硫酸ナトリウム （ S D S ) 処理し、 次い で 2次元目の電気泳動に供して分離されたタンパク質を染色、 洗浄し、 解析を行 う方法である。 タンパク質の染色には、 C B B染色法や Sypro Ruby染色法等が使 用されている （菅野， 「電気泳動最新プロトコール」 ， 羊土社， 平成 1 2年 1月 1 0 ) 。
し力、しながら、 上記文献に記載の電気泳動法の多くは、 染色操作に 1時間から 数時間を要し、 また染色後において洗浄処理が不可欠であることから、 染色操作 に時間がかかり過ぎるという問題があった。 .
近年、 このような問題を解決すべく、 効率的な染色操作の可能な Ettan DIGE 法力淀案されて ヽる (Novel experimental design for comparative t o-dimens ional gel analysis - two-dimensional difference gel electrophoresis incor porating a pooled internal standard. Proteomics. 3， 36-44 (2003) )。 Ettan DIGE法は、 タンパク質含有試料を染色剤と反応させ、 その反応を停止した後、 1 次元目の電気泳動に供し、 次いで電気泳動後のタンパク質含有試料を S D S処理 し、 2次元目の電気泳動に供してタンパク質の解析を行う方法である。 発明の開示
Ettan DIGE法は、従来公知の電気泳動法に比較して染色操作を短時間で行うこ とができるものの、 染色剤の量をコント口ールするために過剰の染色剤とタンパ ク質との反応を停止させる必要がある。 このため、 染色操作が煩雑となる。 この ように、 従来の電気泳動法における染色操作は煩雑であることから、 簡便かつ迅 速にタンパク質の染色及び分離を行うことのできる方法が切望されている。 本発明はこのような実情に鑑みなされたものであり、 その解決しょうとする課 題は電気泳動におけるタンパク質の染色及び分離を簡便かつ迅速に行うことので きる方法、 並びにこれらの方法に用いるタンパク質染色液及ぴタンパク質染色用 キットを提供することにある。
本発明者らは、 上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、 緩衝液中に染 色剤及ぴ界面活性剤を含有する染色液を用いて染色することにより、 染色時間の 短縮と染色感度の向上を得ることができることを見出し、 本発明を完成するに至 つた。
すなわち、 本発明は以下の特徴を有する。
( 1 ) ゲル電気泳動によるタンパク質の分離方法であって、 緩衝液中に染色剤及 び界面活性剤を含有する染色液をタンパク質含有サンプルに接触させる染色工程 と、 上記染色工程後のタンパク質含有サンプルをゲル電気泳動に供する電気泳動 工程とを含む、 分離方法。
( 2 ) 上記界面活性剤がドデシル硫酸アルカリ金属塩である、 上記 （1 ) に記載 の分離方法。
( 3 ) 上記ドデシル硫酸アル力リ金属塩がドデシル硫酸ナトリウム又はドデシル 硫酸リチウムである、 上記 （2 ) に記載の分離方法。 (4) 上記染色液中の上記ドデシル硫酸アルカリ金属塩の濃度が 0. 5〜1 0% である、 上記 （2) 又は （3) に記載の分離方法。
(5) 上記染色液中の上記緩衝液の濃度が 1 OmM以下である、 上記 （1) 〜 （ 4) のいずれか一に記載の分離方法。
(6) 上記染色剤が共有結合型染色剤である、 上記 （1) 〜 （5) のいずれか一 に記載の分離方法。
(7) 上記共有結合型染色剤がアミノ基修飾型染色剤である、 上記 （6) に記載 の分離方法。
(8) 上記アミノ基修飾型染色剤がシァニン色素である、 上記 （7) に記載の分 離方法。
( 9 ) 上記ゲル電気泳動が S D Sポリアクリルアミ ドゲル電気泳動である、 上記
(I) 〜 （8) のいずれか一に記載の分離方法。
(1 0) 上記染色工程前にタンパク質含有サンプルを電気泳動に供する工程を備 え、 上記染色工程のタンパク質含有サンプルが上記電気泳動後のタンパク質含有 サンプルである、 上記 （1) 〜 （9) のいずれか一に記載の分離方法。
(I I) 上記電気泳動が等電点電気泳動である、 上記 （1 0) に記載の分離方法
(1 2) ゲル霉気泳動におけるタンパク質の染色方法であって、 ゲル電気泳動に 供する前に、 緩衝液中に染色剤及び界面活性剤を含有する染色液をタンパク質含 有サンプルに接触させる、 染色方法。
(1 3) 上記電気泳動が 1次元目の電気泳動と 2次元目の電気泳動とを有する 2 次元電気泳動であり、 上記 2次元目の電気泳動前に、 上記 1次元目の電気泳動終 了後のタンパク質含有サンプルに上記染色液を接触させる、 上記 （1 2) 記載の 染色方法。
(14) 緩衝液と、 染色剤と、 界面活性剤とを備える、 ゲル電気泳動におけるタ ンパク質染色用キット。 (1 5) アルコールを更に備える、 上記 （14) に記載のタンパク質染色用キッ 卜。
(1 6) 上記 （1) 〜 （1 1) のいずれか一に記載の分離方法、 又は上記 （1 2 ) 若しくは （1 3) に記載の染色方法、 に関する説明を記載した書類を更に備え る、 上記 （14) 又は （1 5) に記載のタンパク質染色用キット。
(1 7) 緩衝液中に染色剤と界面活性剤とを含有する、 ゲル電気泳動用タンパク 質染色液。
(18) アルコールを更に含有する、 上記 （1 7) に記載のゲル電気泳動用タン パク質染色液。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1における、 本染色法により染色したマウス脳組織抽出液の 2 次元電気泳動像を示す図である。
図 2は、 実施例 2における、 本染色法により染色したマウス脳組織抽出液の 2 次元電気泳動像を示す図である。
図 3は、 実施例 3における、 本染色法により染色したマウス脳組織抽出液の S D S— PAGE泳動像を示す図である。
図 4は、 実施例 4における、 本染色法により染色したマウス脳組織抽出液の S D S— PAGE泳動像を示す図である。
図 5は、 比較例 1における、 SDSを含有しない染色液により染色したマウス 脳組織抽出液の 2次元電気泳動像を示す図である。
図 6は、 比較例 2における、 CBB染色法により染色したマウス脳組織抽出液 の 2次元電気泳動像を示す図である。
図 7は、比較例 3における、本染色法及ぴ Ettan DIGE染色法により染色したマ ウス脳組織抽出液の 2次元電気泳動像を示す図である。 発明を実施するための最良の形態 以下、 本発明をその好適な実施形態に即して詳細に説明する。
本発明のゲル電気泳動によるタンパク質の分離方法 （以下、 単に 「分離方法」 という。 ） は、 染色工程と、 電気泳動工程とを含むことを特徴とする。 染色工程 は、 緩衝液中に染色剤及び界面活性剤を含有する染色液をタンパク質含有サンプ ルに接触させる工程である。 また、 電気泳動工程は、 染色工程後のタンパク質含 有サンプルをゲル電気泳動に供する工程である。
まず、 染色工程について説明する。 染色工程においては、 タンパク質含有サン プルを支持体上に担持させる前に、 タンパク質含有サンプルと染色液とを接触さ せる。 タンパク質含有サンプルとしては、 複数種のタンパク質を含む生体試料の 抽出物を使用することができる。 生体試料としては、 例えば、 ヒ トの他ゥシ、 ゥ マ、 ブタ、 ヒッジ、 ィヌ、 トリ等の家畜や家禽、 マウス、 ラット等の実験動物等 の生体細胞、 それを含む組織 （例えば、 肝組織、 筋組織、 脳組織、 心組織、 血液 、 血漿、 血清、 リンパ液等の体液、 リンパ節） 又は体分泌物 （例えば、 尿） 等が 挙げられる。 なお、 ゲル電気泳動後のタンパク質のスポット又はバンドが検出限 界を超える場合には、 予めタンパク質含有サンプルを分離精製や分画処理等を施 しておくことが望ましい。
支持体としては、 ポリアクリルアミ ドゲル、 ァガロースゲル等のゲルが挙げら れる。 支持体のゲル濃度としては、 分離すべきタンパク質の分子量に応じて適宜 選択することが可能であるが、 例えばポリアクリルアミ ドゲルの場合、 通常 3〜 2 0 %である。 また、 分離すべきタンパク質の分子量が分からない場合や広範囲 にわたる場合には、 例えば 5〜 2 0 %の濃度勾配を有するゲルを使用してもよい 。 なお、 前述したゲルとしては、 例えばアクリルアミ ドと、 Ν, Ν -メチレンビスァ クリルアミ ドとを重合して所望濃度のゲルを調製してもよいが、 SureBlotゲル （ 藤沢薬品工業 （株） 社製） 、 レディーゲル （BIO- RAD社製） 、 Immobiline Dry st ripゲノレ、 Ettan DALTゲノレ、 Multiphor IIプレキャス卜ゲノレ、 Phasts systemプ レキヤス卜ゲノレ、 Genephorプレキヤス卜ゲノレ ( ±、 Amersham Biosciences ) 、 NuPAGE Bis-Trisゲノレ、 NuPAGE Tris-Acetateゲノレ、 Tris— Glycineゲノレ、 Tri cineゲル、 IEFゲル、 E- GELゲル、 TBEゲル、 TBE- Ureaゲル（以上、 Invitrogen 社製）、 PAG ミニゲル（第一化学社製）、 PAGEL、 e- PAGEL (以上、 アト一 （株） 社製） 、 XV PANTERAゲル、 Perfect NTゲル（以上、 DRC社製）等のプレキャストゲルとし て商業的に入手してもよい。 なお、 本明細書において支持体のゲル濃度 （％) は 、 w / v %を意味する。
タンパク質含有サンプルの染色に使用する染色液としては、 本発明のゲル電気 泳動用タンパク質染色液 （以下、 単に 「染色液」 という） を使用することができ る。 本発明の染色液は、 緩衝液中に染色剤と界面活性剤とを含有することを特徴 とする。
緩衝液としては、 当該技術分野で公知の種々の緩衝液が使用され得るが、 染色 液の官能基と、 該官能基と反応するタンパク質の官能基との反応を阻害しないも のが好ましい。 かかる緩衝液は、 使用される染色剤の型を考慮して適宜選択する ことができ、 例えば、 炭酸緩衝液 （Na2C03及び NaHC03を組み合わせた緩衝液） 、 リン酸緩衝液 （Na2HP04及び NaH2P04を組み合わせた緩衝液） 、 Clark and Lubs s olution (KH2P04及ぴ NaOHを組み合わせた緩衝液） 、 NaHC03緩衝液 （5% C02又は N aOHにより pHを調整したもの） 、 Imidazol e- HC1緩衝液 （2, 4, 6-Trimethylpyrid ine一 HC1緩衝液) 、 Morphol inopropanesulphonic acid (MOPS) 一 KOH緩衝液、 ノ ノレ ビタール- HC1緩衝液 （Sodium 5, 5-diethylbarbiturate及び HC1を,祖み合わせた 緩衝液) 、 N - ethylraorphol ine-HCl緩衝液、 Ν-2-Hydroxyethylpiperazine-N' - et hanesulphonic acid (HEPES) - NaOH緩衝液、 Ν-2-Hydroxyethylpiperaz ine-N' _3 - propanesulphonic acid (EPPS) -NaOH緩衝液、 N, N- (Bis-2-hydroxymethyl) glycin e (BICINE) - NaOH緩衝液、 Tris- Glycine緩衝液、 Tris- HC1緩衝液、 Tri s- acetate 緩衝：液、 MES (2-morphol inoethanesul fonic acid) 緩衝液、 TRICINE緩衝液が挙 げられる。 これらの中では、 例示として、 N—ヒドロキシスクシンイミ ド系のよ うなアミノ基修飾型染色剤 （例えば、 C y 5、 C y 7 ) を用いる場合には、 炭酸 緩衝液、 NaHC03緩衝液が好適である。 染色液中の緩衝液の濃度は、 1 0 mM以下 が好ましく、 より好ましくは 3 mM以下である。 かかる濃度が 1 O mMを超える と、 電気泳動により分離されたタンパク質のバンドの波打ちが起こる傾向にある 。 なお、 緩衝液の濃度が低過ぎてもバンドの波打ちが起こることがあるため、 緩 衝液の濃度は 0. 3mM以上とすることが望ましい。
染色剤としては、 共有結合型染色剤が好ましい。 ここで、 共有結合型染色剤と は、 有機化合物、 核酸又はタンパク質等の構造中に存在する NH2基、 COOH 基、 SH基又は OH基等の官能基との化学反応により共有結合を形成可能な反応 、 例えば isothiocyanate基、 STP ester &s Sulfonyl chloride 、 N-hydrox ysuccinimidyl (NHS) ester基、 Alkyl halide基、 maleimide基又は Symmetric disulfide基等を構造中に有する染色剤をいう。 かかる染色剤としては、 例えば 、 シァニン色素類 （例えば、 Cy 5、 Cy 3、 Cy 2、 C y 7 (Araersham Biosc ience社製) ) 、 Alexa Fluor類、 Biotin類、 B0DIPY類、 Fluorescein類、 Orego n Green類、 Rhodamine類、 Texas red類、 Couraarin類、 NBD (7 - nitrobenz - 2 - ox a - 1,3-diazole)類等が挙げられる。 これらの共有結合型染色剤の中でも、ァミノ 基 （NH2) 修飾型染色剤が好適であり、 シァニン色素、 特に Cy 5、 Cy 3、 C y 2 (Atnershatn Bioscience社製） が好適である。 染色液中の染色剤の濃度は 、 100〜1， 000 /X gZmLが好ましく、 より好ましくは 200〜 500 μ g/mLである。 かかる濃度が 1 00 gZmL未満であると蛍光感度が顕著に 低下する傾向にあり、 他方 1， 000 gZmLを超えると蛍光感度が飽和する 傾向にある。 なお、 非共有結合型染色剤もまた本発明において使用可能であり、 例えば、 Sypro Orange, Sypro red (以上、 Molecular Probes社製） が使用可能 である。
界面活性剤としては、 タンパク質に対してマイナスチャージを付与可能な界面 活性剤が好ましく、 例えば陰イオン界面活性剤が挙げられる。 かかる界面活性剤 としては、 例えばドデシル硫酸アル力リ金属塩が挙げられ、 具体的にはドデシル 硫酸ナトリウム （SDS) 、 ドデシル硫酸リチウム （LDS) 等が挙げられる。 SDS等の界面活性剤はタンパク質の可溶化剤としても機能するが、 SDSと染 色剤とを共存させることでタンパク質の染色と S D S化とが同時に行うことがで きる。 これにより、 タンパク質含有サンプルの簡便かつ迅速な染色が可能になる 。 また、 染色液中の界面活性剤の濃度は、 例えばドデシル硫酸アルカリ金属塩の 場合、 0. 5〜 10%が好ましく、 より好ましくは 1. 0〜5. 0%、 更に好ま しくは 1. 0〜2. 0%である。 かかる濃度が 0. 5%未満であると蛍光感度が 低下する傾向にあり、 他方 1 0%を超えると蛍光感度が飽和する傾向にある。 な お、 本明細書において界面活性剤の濃度 （％) は、 wZv を意味する。
また、 本発明の染色液は、 アルコールを更に含有してもよい。 アルコールを含 有することで、 タンパク質の染色効率を向上させることができる。 このような効 果が得られる要因については明確に解明されていないが、 染色液のゲルへの浸透 性が改善されることが要因の一つであると、 本発明者らは推察している。 アルコ ールとしては、 炭素数 1〜4の直鎖又は分岐状のアルコールが好適であり、 具体 的には、 メタノール、 エタノール、 プロパノール、 iso_プロパノール、 ブタノー ル sec -プタノール等が挙げられる。 これらの中では、 メタノール、 エタノーノレ、 プロパノール、 ブタノールが好ましく、 メタノール、 エタノール、 プロパノール がより好ましい。 染色液中のアルコールの濃度は、 0. 5〜30%が好ましく、 より好ましくは 0. 5〜 10%、 更に好ましくは 0. 5〜1. 0%である。 かか る濃度が 0. 5 %未満であるとアルコール添加による効果が十分得難い傾向にあ り、 他方 30%を超えると染色効率が低下する傾向にある。 なお、 本明細書にお いてアルコールの濃度 （％) は、 νΖνθ/οを意味する。
本発明の染色液の pHは、 使用される染色剤に応じて適宜選択することができ 、 例えば、 N - hydroxysucciniraide型の C y 5、 Cy 3、 Cy 2のようなァミノ基 修飾型染色剤を使用する場合には、 染色液の P Hは 9. 5〜1 0. 0であること が好ましい。
染色液とタンパク質含有サンプルとの接触には、 本発明のゲル電気泳動におけ るタンパク質の染色方法 （以下、 単に 「染色方法」 という。 ） を適用することが できる。 本発明の染色方法は、 ゲル電気泳動に供する前に染色液とタンパク質含 有サンプルとを接触させ、 タンパク質の染色と界面活性剤処理 （SDS化等） を 同時に行うことを特徴とする。 なお、 ゲル電気泳動が 2次元電気泳動である場合 には、 2次元目の電気泳動前に、 1次元目の電気泳動を終了したタンパク質含有 サンプルと染色液とを接触させる。
染色液と、 タンパク質含有サンプルとの接触は、 タンパク質含有サンプルが支 持されたゲルに染色液をピペットで滴下したり、 ゲルを染色液に浸漬させる等の 簡便な手段によって行うことができる。 染色液とタンパク質含有サンプルとの接 触時間は 3 0分程度としてもよいが、 接触後直ちに電気泳動に供しても十分な染 色が可能である。 また、 染色剤とタンパク質では分子量が大きく異なり、 分子量 に占めるマイナス電荷の割合 （マイナス電荷 分子量） にも大きな違いがあるこ と力ゝら、 両者の泳動速度に大きな差が生ずる。 これにより、 過剰量の染色剤は電 気泳動によってタンパク質よりも先に泳動されるため、 過剰量の染色剤に影響さ れることなくタンパク質を検出することが可能になり、 加えて洗浄操作も不要に なる。 したがって、 簡便かつ迅速にタンパク質の染色を行うことができる。 これ に対し、 従来の染色方法においては、 染色剤とタンパク質とを十分に時間をかけ て反応させる必要があり、 更に洗浄操作も要することから、 染色操作が煩雑で時 間がかかるという不具合を生ずる。 本発明の染色方法と従来公知のタンパク質の 染色方法における染色時間の比較を表 1に示す。
(表 1)
Figure imgf000012_0001
次に、 電気泳動工程について説明する。 電気泳動工程においては、 染色工程で タンパク質の染色と界面活性剤処理 （SD S化等） が行われたタンパク質含有サ ンプルをゲル電気泳動に供する。 なお、 本発明においては、 電気泳動の操作方法 は従来公知の方法により行うことができる。 ゲル電気泳動としては、 タンパク質 を分離し得る電気泳動法であれば特に制限されるものではないが、 例えば、 等電 点電気泳動、 ドデシル硫酸ナトリウム （SDS) ポリアクリルアミ ドゲル電気泳 動 （SDS— PAGE) 、 ディスクゲル電気泳動、 スラブゲル電気泳動、 ゲル等 速電気泳動が挙げられる。 これらの中では、 1次元電気泳動の場合、 SDS— P AGE、 等電点電気泳動が好ましい。 また、 2次元電気泳動の場合には、 例えば 等電点と分子量という 2つの異なる要因からタンパク質を分離し得る 2つの電気 泳動法を組み合わせることが好ましい。 具体的には、 1次元目に等電点電気泳動 を、 2次元目に SD S— PAGEを選択することが好ましい。
また、 等電点電気泳動においてはゲル中にゲル勾配を形成する必要があるが、 ゲル勾配の形成方法としては両性担体 （Carrier ampholytes) をポリアクリルァ ミドゲルに添加して電場をかける方法、 種々の等電点を有するァクリルアミ ド化 合物を用いてゲルの調製と同時に: H勾配を形成する方法等が挙げられる。 また 、 等電点電気泳動と S D S— P A G Eとの 2次元電気泳動おいては、 等電点電気 泳動によつて分離されたタンパク質を含むゲルを 2次元目のゲル端に載せ、 等電 点電気泳動の展開方向に対して直交する方向に泳動させることによりタンパク質 が分離される。 なお、 ゲル電気泳動における通電条件は、 電気泳動法等に応じて 適宜設定することができるが、 例えば、 ZOOM IPG runner system (Invitrogen社 製） を用いた等電点電気泳動の場合には、 例えば、 2 0 0 V 2 0分、 4 5 0 V 1 5分、 7 5 0 V 1 5分、 2 0 0 0 V 3 0分のように段階的に電圧を上げてい く条件に設定する。 また、 S D S— P A G Eの場合には、 2 0 0 Vの通電条件で 泳動する。
前述した電気泳動工程により分離されたタンパク質は、 例えば、 カッターナイ フ等でバンド部分のみを切除し、 蛍光分析装置を用いて特定波長における蛍光強 度を測定することにより、 タンパク質を検出することができる。 さらに、 このよ うにして検出されたタンパク質は、 必要により脱色後、 抽出や膜への転写等によ つて回収することで当該タンパク質の分子量、 純度、 同定、 定量等の分析が可能 である。
本発明のタンパク質染色用キットの実施態様としては、 染色剤を含有する組成 物と、 界面活性剤を含有する組成物と、 必要に応じて緩衝液及び Z又はアルコー ルを個別の容器に収容したキットが挙げられ、 タンパク質を染色する際に、 それ らを互いに混合することで所望の濃度及び p Hを有する染色液を調製することが 好ましい。 また、 他の実施態様としては、 複数に区分けされた容器内に、 染色剤 を含有する組成物を収容する第 1の区分と、 界面活性剤を含有する組成物を収容 する第 2の区分と、 必要に応じて緩衝液を収容する第 3の区分及び Z又はアルコ ールを収容する第 4の区分を備えるタンパク質染色用キットが挙げられる。 さら に、 本発明のタンパク質染色用キットは、 前述した本発明の分離方法や染色方法 に関する説明を記載した書類を更に備えていてもよい。 なお、 染色剤を含有する 組成物及び界面活性剤を含有する組成物は、 予め所望の濃度に調整されているこ とが好ましい。 実施例
以下、 本発明の実施例についてさらに詳細な説明するが、 本発明はこれらの実 施例に限定されるものではない。
(実施例 1 )
マウスの脳糸且織の抽出溶液 （5. 2 mg protein/ml 50 mM Tris- HC1 (pH 7. 6) /20 % glycerol/0. 3 M sodium chloride/protease inhibitor cocktail 1 tab/10 m L (Roche-diagnostics) ) を 2次元電気泳動により分離した。すなわち、本抽出液 7. 7 AZ Lを膨潤液 （6M Urea/2 M Thiourea/2% CHAPS溶液 191 L, ampholite (pH 3-10) Ι μ Ι, 0. l%broraophenol blue 4 μ Ι, 1M dithiothreitol 4 / L) に添カロし混 和した後、本液 155 μ Lを用いて ρΗ3- 10の pH勾配を有する immobiline pH gradi ent (IPG) gel strip (Invitrogen 社）を 16時間膨潤させた。膨潤後、 1次元目の 等電点電気泳動 （ZOOM IPG Runner System) を 200 V 20rain, 450 V 15 min, 750 V 15 min及び 2000 V 30 minの条件で電圧を段階的に上げて行った。
電気泳動後、 アル力リ条件下でタンパク質のァミノ基に共有結合する蛍光試薬 N- hydroxysuccinimide型 Cy5 (Amersham Biosciences) を用いた染色液 (97〜37 7 μ g/raL 2% SDS I 100 mM Na2C03/NaHC03 (pH 9. 9) ) 50 μ ίを IPG gel strip 上に ピぺットマンにより振りかけることで染色し、即座に 2次元目の 4-12% gradient SDS- polyacrylamide電気泳動ゲルにアプライし、 200 V 40 minの条件で泳動を 行った。 なお、 タンパク質と反応していない遊離 Cy5は低分子量であるため、 可 視で水色に見えるバンドとして +極側に先に泳動される。 ゲル電気泳動後、 +極 端の本バンド部分をカッターナイフ等で切除し、 蛍光イメージアナライザー ProE xpress (Perkin- Elmer社） を用いて励起波長 625 nmで、 680 nmの蛍光強度を測 定することにより、 タンパク質の泳動像を観察した。 その結果、 2% SDSを含む C y5染色液を使用した場合には、 バンドの波打ちが生ずるものの、 タンパク質の染 色が向上することが確認された （図 1 ) 。 また、 2次元電気泳動後のゲルを約 10 5分かけて操作を行うクーマシープリリアントプル一 （CBB) 染色法と同様の電気
2 泳動パターンが観察された。 なお、 glycerolの濃度（％)は w/v%を示し、 以下同様 である。
(実施例 2 )
炭酸ナトリウム緩衝液を 3 mM Na2C03/NaHC03に代えたこと以外は、 実施例 1と 同様の方法により 2次元電気泳動を行い、 タンパク質の泳動像を観察した。 その 結果、 タンパク質の染色効率を保った状態でバンドの波打ちを解消できることが 確認された （図 2 ) 。 実施例 1と同様に CBB染色法と同様の電気泳動パターンが 観察された。
(実施例 3 )
マウスの脳糸且織の抽出溶液 （5 mg protein/ml 50 mM Tris- HC1 (pH 7. 6) /20 glycerol/0. 3 M sodium chloride/protease inhibitor cocktail 1 tab/10 mL ( Roche-diagnostics) ) を SDS-PAGEにより分離した。 すなわち、 本抽出液 ΙΟ μ ί に N_hydroxysuccinimide型 Cy5 (Amersham Biosciences社製) 染色液 (1 mg /ra L 2% SDS I 100 mM Na2C03/NaHC03 (pH 9, 9) ) 10 // Lを加えて、 室温で 30分間イン キュベートすることにより染色し、本液 lO /i Lを 10- 20 % gradient SDS - polyacr ylamide電気泳動ゲル （Sure Blot F1 ゲル、 藤沢薬品工業株式会社製） にァプラ ィし、 240 V 15 minの条件で泳動を行った。 泳動後、 ゲルを 10%メタノール /7°/0 酢酸水溶液にて 1時間洗浄後、 蛍光イメージアナライザー ProExpress (Perkin-E lmer社） を用いて励起波長 625 nmで、 680 nmの蛍光強度を測定することにより 、 タンパク質の泳動像を観察した。 また、 染色液中にメタノール、 プロパノール 、 ブタノールを各々 5%添加した染色液を用いて同様の条件で染色し、 泳動した。 アルコール無添加の結果を図 3の lane 1に、メタノール添加した結果を図 3の 1 ane 2に、 プロパノールを添加した結果を図 3の lane 3に、 ブタノールを添加し た結果を図 3の lane 4に、それぞれ示した。アルコール無添加の場合と比較した ところ、 メタノール、 プロパノール、 ブタノールを添加した場合には高感度でタ ンパク質バンドが検出できることが明らかとなった。 なお、 酢酸の濃度（％)は v/v
%を示し、 以下同様である。 (実施例 4 )
マウスの脳組織の抽出溶液 （5 rag protein/ml 50 mM Tris- HC1 (pH 7. 6) /20% glycerol/0. 3 M sodium chloride/ protease inhibitor cocktai l 1 tab/10 mL ( Roche-diagnostics) ) を SDS- PAGEにより分離した。 すなわち、 本抽出液 10 μ ΐ に Ν - hydroxysuccinimide Cy5 (Amersham Biosciences社製) 染色 ( 1 mg/ml 2% SDS I 100 mM Na2C03/NaHC03 (pH 9. 9) ) 10 /z Lを加えて、 室温で 30分間ィン キュベートすることにより染色し、本液 10 // Lを 10-20% gradient SDS-polyacry lamide電気泳動ゲル （Sure Blot F1 ゲル、 藤沢薬品工業株式会社製） にァプラ ィし、 240 V 15 minの条件で泳動を行った。 泳動後、 ゲルを 10%メタノール/ 7% 酢酸水溶液にて 1時間洗浄後、 蛍光イメージアナライザー ProExpress (Perkin-E lraer社） を用いて励起波長 625 nmで、 680 nra の蛍光強度を測定することにより 、 タンパク質の泳動像を観察した。染色液中に 2% SDSの代わりに 2% Lithium do decyl sulfate (LDS)を添加して同様の条件で染色し、 泳動した結果と比較したと ころ、 2% SDS添加の場合 （図 4 lane 2) と比べて 2% LDS添加の場合 （図 4 lan e 3) には、 より高感度で蛋白質バンドが検出できることが明らかとなった。
(比較例 1 )
2% SDSを含まない染色液を用いたこと、染色後 3 0分経過してから 2次元目の 電気泳動を行ったこと以外は、 実施例 1と同様の方法により 2次元電気泳動を行 い、 タンパク質の泳動像を観察した。 その結果、 2% SDSを含まない染色液を用い た場合には、 染色されたタンパク質がほとんど認められなかった （図 5 ) 。
(比較例 2 )
2次元電気泳動後のゲルを約 105分かけて操作を行うクーマシープリリアント ブルー （CBB) 染色法を行った。 C B B染色は、 Biosafe- CBB (BIO- RAD社製） を 用いて行った。 すなわち、 電気泳動後のゲルを 0で 5分間 3回洗浄後、 Biosaf e-CBB溶液で 60分間染色した後、 0で 30分間洗浄することで染色を完了した。 電気泳動パターンを図 6に示した。
(比較例 3 ) マウスの肝臓組織の抽出溶液 （66 mg protein/mL 50 mM Tris-HCl (pH 8. 5) / 20% glycerol/0. 3 M sodium chloride/protease inhibitor cocktai l (Roche - di agnostics社製） ltab/10 mL) を本染色方法又は Ettan DIGE染色方法により染色 し、 2次元電気泳動により分離した。 Ettan DIGE染色方法は、 常法に従った。 す なわち、 本抽出液 1. 5 /z L (100 /i gタンパク質量相当） に 1 mM CyDye DIGE Fluor minimal dye (Amersham Biosciences 社製) /dimethylforraaraide溶液 2 μ L ¾f 添加し、 30分間室温にて反応させた後、 10 mM lysine水溶液 2 μ ίを添加して氷 上で 10分間反応させることで反応を停止させた。 これに 7 M Urea/2 M thiourea /4 CHAPSを加えることにより 100 /X Lにメスアップし、 Cy5標識タンパク質溶液と して 2次元電気泳動を行った。 すなわち、 Cy5標識タンパク質溶液 20 μ 1を膨潤 液 （6 M Urea/2 M Thiourea/2% CHAPS溶液 191 /z L, arapholite (pH3-10) Ι μ Ι, 0. l bromophenol blue μ Ι, 1 M dithiothreitol 4 ^ L) に添力 tlし混和した後、 本液 155 μ Lを用いて pH 3 - 10の pH勾配を有する immobiline pH gradient (IPG ) gel strip (Invitrogen 社） を 16時間膨潤させた。 膨潤後、 1次元目の等電点 電気泳動 （ZOOM IPG Runner System) を 200 V 20 min, 450 V 15 min, 750 V 15 rain及び 2000 V 30 minの条件で電圧を段階的に上げて行った。 電気泳動後、 L DS 平衡化バッファー lmL (4 X LDS (Invitrogen社製） 250 L/H20 750 // L/2 - me rcaptoethanol 10 ^ L) 中で IPG gel stripを 15分間振とうさせ、 2次元目の 4- 12% gradient SDS - polyacrylamide電気泳動ゲルにアプライし、 200 V 40 minの 条件で泳動を行った。 泳動後、 蛍光イメージアナライザー ProExpress (Perkin-E lmer社） を用いて励起波長 625 nmで、 680 nmの蛍光強度を測定することにより 、 タンパク質の泳動像を観察した。 他方、 本染色方法においては、 前述の実施例 に従って同重量のタンパク質抽出液を用いて 2次元電気泳動を行い、 蛍光ィメ一 ジアナライザ一によりタンパク質の泳動像を観察し、 Ettan DIGE染色方法と比較 した。 その結果、 本染色方法により得られた泳動像 （図 7 A) は、 Ettan DIGE 染色方法により得られた泳動像（図 7 B ) より高感度検出が可能であることが明 らかとなつた。 つまり、 本染色方法は、 Ettan DIGE染色方法と比較して短時間の
5 操作で染色することができ、 且つ高感度で検出可能であることが明らかとなった 上記実施例から、 2次元電気泳動において、 1次元目と 2次元目の間で染色液 をタンパク質に接触させる本染色方法により、 短時間で 2次元電気泳動により分 離したタンパク質の泳動像を観察できることが確認された。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 S D S等の界面活性剤を含有する染色液を用いることにより タンパク質含有サンプルを短時間で染色し、 しかも高感度で発色させることがで きる。 また、 過剰量の染色剤は、 電気泳動によってタンパク質よりも先に泳動さ れるため、 洗浄操作も不要である。 さらに、 1次元目の電気泳動後に、 S D S等 の界面活性剤を含有する染色剤で染色することにより、 直ちに 2次元目の電気泳 動に供することもできる。 そのため、 従来のタンパク質の分離方法に比べて工程 数を減らすことができ、 分離操作の簡略化が可能になる。 したがって、 簡便かつ 迅速に、 電気泳動においてタンパク質を染色し、 分離できる方法が提供される。 また、 本発明のタンパク質の染色方法及び分離方法に有用なタンパク質染色液及 びタンパク質染色用キットが提供される。 なお、 本出願は、 日本で出願された特願 2 0 0 4 - 3 5 3 3 9 5を基礎として おり、 その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
6

Claims

請求の範囲
1 . ゲル電気泳動によるタンパク質の分離方法であって、
緩衝液中に染色剤及び界面活性剤を含有する染色液をタンパク質含有サンプル に接触させる染色工程と、
前記染色工程後のタンパク質含有サンプルをゲル電気泳動に供する電気泳動ェ 程と
を含む、 分離方法。
2 . 前記界面活性剤がドデシル硫酸アルカリ金属塩である、 請求の範囲 1に記載 の分離方法。
3 . 前記ドデシル硫酸アル力リ金属塩がドデシル硫酸ナトリウム又はドデシル硫 酸リチウムである、 請求の範囲 2に記載の分離方法。
4 . 前記染色液中の前記ドデシル硫酸アル力リ金属塩の濃度が 0 . 5〜 1 0 %で ある、 請求の範囲 2又は 3に記載の分離方法。
5 . 前記染色液中の前記緩衝液の濃度が 1 O mM以下である、 請求の範囲 1〜4 のいずれか一項に記載の分離方法。
6 . 前記染色剤が共有結合型染色剤である、 請求の範囲 1〜5のいずれか一項に 記載の分離方法。
7 . 前記共有結合型染色剤がアミノ基修飾型染色剤である、 請求の範囲 6に記載 の分離方法。
8 . 前記アミノ基修飾型染色剤がシァニン色素である、 請求の範囲 7に記載の分 離方法。
9 . 前記ゲル電気泳動が S D Sポリアクリルアミ ドゲル電気泳動である、 請求の 範囲 1〜 8のいずれか一項に記載の分離方法。
1 0 . 前記染色工程前にタンパク質含有サンプルを電気泳動に供する工程を備え ヽ
前記染色工程のタンパク質含有サンプルが前記電気泳動後のタンパク質含有サ ンプルである、 請求の範囲 1〜 9のいずれか一項に記載の分離方法。 - 1. 前記電気泳動が等電点電気泳動である、 請求の範囲 10に記載の分離方法
1 2. ゲル電気泳動におけるタンパク質の染色方法であって、
ゲル電気泳動に供する前に、 緩衝液中に染色剤及び界面活性剤を含有する染色 液をタンパク質含有サンプルに接触させる、 染色方法。
1 3. 前記電気泳動が 1次元目の電気泳動と、 2次元目の電気泳動とを有する 2 次元電気泳動であり、
前記 2次元目の電気泳動前に、 前記 1次元目の電気泳動終了後のタンパク質含 有サンプルに前記染色液を接触させる、 請求の範囲 1 2記載の染色方法。
14. 緩衝液と、 染色剤と、 界面活性剤とを備える、 ゲル電気泳動におけるタン パク質染色用キット。
1 5. アルコールを更に備える、 請求の範囲 14に記載のタンパク質染色用キッ
16. 請求の範囲 1〜1 1のいずれか一項に記載の分離方法、 又は請求の範囲 1 2若しくは 1 3に記載の染色方法、 に関する説明を記載した書類を更に備える、 請求の範囲 14又は 1 5に記載のタンパク質染色用キット。
1 7. 緩衝液中に染色剤と界面活性剤とを含有する、 ゲル電気泳動用タンパク質 染色液。
1 8. アルコールを更に含有する、 請求の範囲 1 7に記載のゲル電気泳動用タン パク質染色液。
8
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