DE112005003114T5

DE112005003114T5 - Verfahren zum Trennen von Protein, Verfahren zum Färben von Protein und flüssiges Proteinfärbemittel sowie Proteinfärbekit zur Verwendung bei diesen Verfahren

Info

Publication number: DE112005003114T5
Application number: DE112005003114T
Authority: DE
Inventors: Ichiji Namatame; Yoshinori Ishi; Yoshimasa Saito; Takayoshi Komatsu; Yasuhiro Ogawa; Takashi Shibata; Hideki Kinoshita; Kenji Yokoyama
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Katayanagi Institute; Sharp Corp; Toppan Printing Co Ltd
Current assignee: Sharp Corp
Priority date: 2004-12-06
Filing date: 2005-12-06
Publication date: 2008-05-08
Also published as: GB2436048B; WO2006062222A1; JP4756422B2; US20090223823A1; JPWO2006062222A1; GB0712947D0; CA2589750A1; GB2436048A

Abstract

Verfahren zur Trennung eines Proteins durch Gel-Elektrophorese, umfassend einen Färbeschritt zum In-Kontakt-Bringen einer proteinhaltigen Probe mit einer Färbeflüssigkeit, die ein Färbemittel, ein Tensid und eine Pufferlösung enthält, und einen Elektrophoreseschritt zum Durchführen einer Gel-Elektrophorese mit der proteinhaltigen Probe nach dem Färbeschritt.

Description

Fachgebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Trennverfahren und ein Färbeverfahren für ein Protein bei der Elektrophorese sowie auf eine proteinfärbende Flüssigkeit und einen Proteinfärbekit zur Verwendung bei diesen Verfahren.
Technischer Hintergrund
Als Verfahren, um jede Komponente in einem Gemisch, das ein Protein enthält, am besten zu trennen, ist die Elektrophorese bekannt. Von den Elektrophoresemethoden wird die zweidimensionale Gel-Elektrophorese verbreitet verwendet, da sie einen Zellrohextrakt in bis zu 1000 jeweilige Proteinkomponenten zerlegen kann. Die zweidimensionale Gel-Elektrophorese beinhaltet zum Beispiel das Behandeln einer proteinhaltigen Probe mit Natriumdodecylsulfat (SDS) nach der Elektrophorese in der ersten Dimension, das Durchführen einer Elektrophorese in der zweiten Dimension mit der Probe, das Färben und Waschen des getrennten Proteins und das Analysieren des Proteins. Zum Färben eines Proteins werden das CBB-Färbeverfahren, das Sypro-Ruby-Färbeverfahren und dergleichen verwendet (Sugano, "Electrophoresis New Protocol (Denkieidou Saishin Purotokoru)", Youdosha, 1. Januar 2000).
Da jedoch viele der in der oben genannten Literatur beschriebenen Elektrophoresemethoden eine bis mehrere Stunden für einen Färbeschritt benötigen und nach dem Färben unbedingt einen Waschschritt erfordern, gibt es dass Problem, dass der Färbeschritt zu lange dauert.
Um diese Probleme zu lösen, wurde in den letzten Jahren ein Ettan-DIGE-Verfahren vorgeschlagen, mit dem eine effiziente Färbung durchgeführt werden kann (Novel experimental design for comparative two-dimensional gel analysis: two-dimensional difference gel electrophoresis incorporating a pooled internal standard, Proteomics, 3, 36–44 (2003)). Das Ettan-DIGE-Verfahren ist ein Verfahren, das das Umsetzen einer proteinhaltigen Probe mit einem Färbemittel, das Abbrechen der Reaktion, das Durchführen der Elektrophorese in der ersten Dimension mit dem Reaktionsgemisch, das Durchführen einer SDS-Behandlung mit der proteinhaltigen Probe nach der Elektrophorese und das Durchführen der Elektrophorese in der zweiten Dimension mit der Probe zum Analysieren des Proteins beinhaltet.
Offenbarung der Erfindung
Während man mit dem Ettan-DIGE-Verfahren den Färbeschritt im Vergleich zu herkömmlicherweise bekannten elektrophoretischen Analysen in einer kurzen Zeitspanne durchführen kann, erfordert es ein Abbrechen der Reaktion zwischen überschüssigem Färbemittel und dem Protein, um die Menge des Färbemittels zu steuern. Dadurch wird der Färbeschritt kompliziert. Da, wie oben erwähnt, der Färbeschritt bei herkömmlichen elektrophoretischen Analysen kompliziert ist, gibt es ein Bedürfnis nach einem Verfahren, mit dem man die Färbung und Trennung eines Proteins bequem und schnell durchführen kann.
Die vorliegende Erfindung wurde im Hinblick auf diese tatsächliche Situation gemacht, und das von ihr zu lösende Problem besteht in der Bereitstellung eines Verfahrens, mit dem man die Färbung und Trennung eines Proteins bei der Elektrophorese bequem und schnell durchführen kann, und einer proteinfärbenden Flüssigkeit und eines Proteinfärbekits zur Verwendung bei dem Verfahren.
Die Erfinder haben in einem Versuch, das oben genannte Problem zu lösen, intensive Studien durchgeführt und fanden heraus, dass die Färbezeit verkürzt und die Färbeempfindlichkeit verbessert werden kann, indem man unter Ver wendung einer Färbeflüssigkeit färbt, die ein Färbemittel, ein Tensid und eine Pufferlösung enthält, was zur Fertigstellung der vorliegenden Erfindung führte.
Dementsprechend ist die vorliegende Erfindung durch Folgendes gekennzeichnet.

(1) Verfahren zur Trennung eines Proteins durch Gel-Elektrophorese, umfassend einen Färbeschritt zum In-Kontakt-Bringen einer proteinhaltigen Probe mit einer Färbeflüssigkeit, die ein Färbemittel, ein Tensid und eine Pufferlösung enthält, und einen Elektrophoreseschritt zum Durchführen einer Gel-Elektrophorese mit der proteinhaltigen Probe nach dem oben genannten Färbeschritt.
(2) Verfahren gemäß dem oben genannten Punkt (1), wobei das oben genannte Tensid ein Alkalimetalldodecylsulfat-Salz ist.
(3) Verfahren gemäß dem oben genannten Punkt (2), wobei es sich bei dem oben genannten Alkalimetalldodecylsulfat-Salz um Natriumdodecylsulfat oder Lithiumdocecylsulfat handelt.
(4) Verfahren gemäß dem oben genannten Punkt (2) oder (3), wobei die Konzentration des oben genannten Alkalimetalldodecylsulfat-Salzes in der oben genannten Färbeflüssigkeit 0,5 bis 10% beträgt.
(5) Verfahren gemäß einem der oben genannten Punkte (1) bis (4), wobei die Konzentration der oben genannten Pufferlösung in der oben genannten Färbeflüssigkeit nicht mehr als 10 mM beträgt.
(6) Verfahren gemäß einem der oben genannten Punkte (1) bis (5), wobei das oben genannte Färbemittel ein kovalent bindendes Färbemittel ist.
(7) Verfahren gemäß dem oben genannten Punkt (6), wobei das oben genannte kovalent bindende Färbemittel ein Aminogruppen-modifizierendes Färbemittel ist.
(8) Verfahren gemäß dem oben genannten Punkt (7), wobei das oben genannte Aminogruppen-modifizierende Färbemittel ein Cyaninpigment ist.
(9) Verfahren gemäß einem der oben genannten Punkte (1) bis (8), wobei es sich bei der oben genannten Gel-Elektrophorese um SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese handelt.
(10) Verfahren gemäß einem der oben genannten Punkte (1) bis (9), das weiterhin einen Schritt zur Durchführung einer Elektrophorese mit der proteinhaltigen Probe vor dem oben genannten Färbeschritt umfasst, wobei es sich bei der proteinhaltigen Probe in dem oben genannten Färbeschritt um die proteinhaltige Probe nach der oben genannten Elektrophorese handelt.
(11) Verfahren gemäß dem oben genannten Punkt (10), wobei es sich bei der oben genannten Elektrophorese um eine isoelektrische Fokussierung handelt.
(12) Verfahren zum Färben eines Proteins in der Gel-Elektrophorese, das das In-Kontakt-Bringen einer proteinhaltigen Probe mit einer Färbeflüssigkeit, die ein Färbemittel, ein Tensid und eine Pufferlösung enthält, vor der Gel-Elektrophorese umfasst.
(13) Verfahren gemäß dem oben genannten Punkt (12), wobei es sich bei der oben genannten Elektrophorese um eine zweidimensionale Elektrophorese handelt, die eine Elektrophorese in der ersten Dimension und eine Elektrophorese in der zweiten Dimension umfasst, und die proteinhaltige Probe nach der Beendigung der oben genannten Elektrophorese in der ersten Dimension vor der oben genannten Elektrophorese in der zweiten Dimension mit der oben genannten Färbeflüssigkeit in Kontakt gebracht wird.
(14) Proteinfärbekit für die Gel-Elektrophorese, der eine Pufferlösung, ein Färbemittel und ein Tensid umfasst.
(15) Proteinfärbekit gemäß dem oben genannten Punkt (14), der weiterhin Alkohol umfasst.
(16) Proteinfärbekit gemäß dem oben genannten Punkt (14) oder (15), der weiterhin ein schriftliches Dokument umfasst, das eine Erläuterung des Trennverfahrens gemäß einem der oben genannten Punkte (1) bis (11) oder des Färbeverfahrens gemäß dem oben genannten Punkt (12) oder (13) enthält.
(17) Proteinfärbende Flüssigkeit für die Gel-Elektrophorese, die ein Färbemittel, ein Tensid und eine Pufferlösung umfasst.
(18) Proteinfärbende Flüssigkeit gemäß dem oben genannten Punkt (17), die weiterhin Alkohol umfasst.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein Bild der zweidimensionalen Elektrophorese des Mäusehirn-Gewebeextrakts, der in Beispiel 1 nach dem Färbeverfahren der vorliegenden Erfindung gefärbt wurde.
2 zeigt ein Bild der zweidimensionalen Elektrophorese des Mäusehirn-Gewebeextrakts, der in Beispiel 2 nach dem Färbeverfahren der vorliegenden Erfindung gefärbt wurde.
3 zeigt ein Bild der SDS-PAGE-Elektrophorese des Mäusehirn-Gewebeextrakts, der in Beispiel 3 nach dem Färbeverfahren der vorliegenden Erfindung gefärbt wurde.
4 zeigt ein Bild der SDS-PAGE-Elektrophorese des Mäusehirn-Gewebeextrakts, der in Beispiel 4 nach dem Färbeverfahren der vorliegenden Erfindung gefärbt wurde.
5 zeigt ein Bild der zweidimensionalen Elektrophorese des Mäusehirn-Gewebeextrakts, der in Vergleichsbeispiel 1 mit einer SDS-freien Färbeflüssigkeit gefärbt wurde.
6 zeigt ein Bild der zweidimensionalen Elektrophorese des Mäusehirn-Gewebeextrakts, der in Vergleichsbeispiel 2 nach dem CBB-Färbeverfahren gefärbt wurde.
7 zeigt Bilder der zweidimensionalen Elektrophorese der Mäusehirn-Gewebeextrakte, die in Vergleichsbeispiel 3 nach dem Färbeverfahren der vorliegenden Erfindung und dem Ettan-DIGE-Verfahren gefärbt wurden.
Bester Modus zur Verkörperung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden ausführlich unter Bezugnahme auf zu bevorzugende Ausführungsformen erläutert.
Das Verfahren zur Trennung eines Proteins durch Gel-Elektrophorese gemäß der vorliegenden Erfindung (im Folgenden einfach als "Trennverfahren" bezeichnet) beinhaltet charakteristischerweise einen Färbeschritt und einen Elektrophoreseschritt. Der Färbeschritt beinhaltet das In-Kontakt-Bringen einer proteinhaltigen Probe mit einer Färbeflüssigkeit, die ein Färbemittel, ein Tensid und eine Pufferlösung enthält. Der Elektrophoreseschritt beinhaltet das Durchführen einer Gel-Elektrophorese mit der proteinhaltigen Probe nach dem Färbeschritt.
Der Färbeschritt wird zuerst erläutert. Im Färbeschritt wird eine proteinhaltige Probe mit einer Färbeflüssigkeit in Kontakt gebracht, bevor man die proteinhaltige Probe auf einen Träger aufträgt. Als proteinhaltige Probe kann ein Extrakt einer biologischen Probe, die mehrere Arten von Proteinen enthält, verwendet werden. Als biologische Probe seien zum Beispiel biologische Zellen vom Menschen, von Haustieren und Geflügel, wie Rind, Pferd, Schwein, Schaf, Hund, Vogel und dergleichen, von Versuchstieren, wie Maus, Ratte und dergleichen, und dergleichen, Gewebe, die diese enthalten (z.B. Lebergewebe, Muskelgewebe, Hirngewebe, Herzgewebe, Blut, Plasma, Serum, Körperflüssigkeit, wie Lymphe und dergleichen, Lymphknoten), oder Sekrete (z.B. Urin) und dergleichen erwähnt. Wenn der Fleck oder die Bande eines Proteins nach der Gel-Elektrophorese die Nachweisgrenzen überschreitet, ist es wünschenswert, die proteinhaltige Probe im voraus einer Trennung und Reinigung, einer Fraktionierungsbehandlung und dergleichen zu unterziehen.
Als Träger können Gele, wie Polyacrylamid-Gel, Agarose-Gel und dergleichen, verwendet werden. Während die Gelkonzentration des Trägers zweckmäßigerweise zum Beispiel gemäß dem Molekulargewicht des zu trennenden Proteins ausgewählt werden kann, beträgt sie im Falle eines Polyacrylamid-Gels im Allgemeinen 3 bis 20%. Wenn das Molekulargewicht des zu trennenden Proteins unbekannt ist oder das Molekulargewicht über einen weiten Bereich variiert, kann zum Beispiel ein Gel mit einem Dichtegradienten von 5 bis 20% verwendet werden. Als das oben genannte Gel kann ein Gel mit einer gewünschten Konzentration hergestellt werden, zum Beispiel durch Polymerisation von Acrylamid und N,N-Methylenbisacrylamid. Alternativ dazu kann auch ein kommerziell erhältliches vorgegossenes Gel, wie SureBlot-Gel (hergestellt von Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.), Ready Gel (hergestellt von BIO-RAD), Immobiline-Dry-Strippgel, Ettan-DALT-Gel, Multiphor-II-Precast-Gel, Phasts-System-Precast-Gel und Genephor-Precast-Gel (die alle von Amersham Biosciences hergestellt werden), NuPAGE-Bis-Tris-Gel, NuPAGE-Tris-Acetate-Gel, Tris-Glycine-Gel, Tricine-Gel, IEF-Gel, E-GEL-Gel, TBE-Gel und TBE-Urea-Gel (die alle von Invitrogen hergestellt werden), PAG-Minigel (hergestellt von Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.), PAGEL und e-PAGEL (die beide von der ATTO CORPORATION hergestellt werden), XV-PANTERA-Gel und Perfect-NT-Gel (die beide von DRC hergestellt werden) und dergleichen, erhalten werden. In der vorliegenden Beschreibung bedeutet die Gelkonzentration (%) des Trägers w/v%.
Als Färbeflüssigkeit zum Färben einer proteinhaltigen Probe kann die proteinfärbende Flüssigkeit für die Gelelektrophorese in der vorliegenden Erfindung (im Folgenden einfach als "Färbeflüssigkeit" bezeichnet) verwendet werden. Die Färbeflüssigkeit der vorliegenden Erfindung enthält charakteristischerweise ein Färbemittel, ein Tensid und eine Pufferlösung.
Als Pufferlösung können verschiedene Pufferlösungen, die in der einschlägigen Technik bekannt sind, verwendet werden. Eine Pufferlösung, die die Reaktion einer funktionellen Gruppe der Färbeflüssigkeit mit der gegenüber der oben genannten funktionellen Gruppe reaktiven funktionellen Gruppe eines Proteins nicht hemmt, ist zu bevorzugen. Eine solche Pufferlösung kann zweckmäßigerweise im Hinblick auf die Art des zu verwendenden Färbemittels ausgewählt werden, und zum Beispiel seien Carbonat-Pufferlösung (die Na₂CO₃ und NaHCO₃ in Kombination enthält), Phosphat-Pufferlösung (die Na₂HPO₄ und NaH₂PO₄ in Kombination enthält), Clark-Lubs-Lösung (die KH₂PO₄ und NaOH in Kombination enthält), NaHCO₃-Pufferlösung (wobei der pH-Wert mit 5% CO₂ oder NaOH gesteuert wird), Imidazol-HCl-Pufferlösung (2,4,6-Trimethylpyridin-HCl-Pufferlösung), Morpholinopropansulfonsäure(MOPS)-KOH-Pufferlösung, Barbital-HCl-Pufferlösung (die Natrium-5,5-diethylbarbiturat und HCl in Kombination enthält), N-Ethylmorpholin-HCl-Pufferlösung, N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure(HEPES)-NaOH-Pufferlösung, N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-3-propansulfonsäure(EPPS)-NaOH-Pufferlösung, N,N-Bis(2-hydroxymethyl)glycin(BICIN)-NaOH-Pufferlösung, Tris-Glycin-Pufferlösung, Tris-HCl-Pufferlösung, Tris-Acetat-Pufferlösung, MES(2-Morpholinoethansulfonsäure)-Pufferlösung und TRICIN-Pufferlösung erwähnt. Wenn zum Beispiel ein aminogruppenmodifizierendes Färbemittel (z.B. Cy5, Cy7), wie eines aus der N-Hydroxysuccinimid-Reihe, verwendet wird, sind von den obigen eine Carbonat-Pufferlösung und eine NaHCO₃-Pufferlösung zu bevorzugen. Die Konzentration der Pufferlösung in der Färbeflüssigkeit beträgt vorzugsweise nicht mehr als 10 mM, besonders bevorzugt nicht mehr als 3 mM. Wenn die Konzentration 10 mM überschreitet, kommt es häufig zu einer Asymmetrie der Bande des durch Elektrophorese getrennten Proteins. Da die Asymmetrie der Bande auftreten kann, wenn die Konzentration der Pufferlösung zu gering ist, wird die Konzentration der Pufferlösung wünschenswerterweise auf nicht weniger als 0,3 mM eingestellt.
Als Färbemittel ist ein kovalent bindendes Färbemittel zu bevorzugen. Hier bezieht sich der Ausdruck "kovalent bindendes Färbemittel" auf ein Färbemittel, das in seiner Struktur eine reaktive Gruppe, die durch eine chemische Reaktion mit einer funktionellen Gruppe (z.B. NH₂-Gruppe, COOH-Gruppe, SH-Gruppe, OH-Gruppe und dergleichen), die in einer Struktur wie einer organischen Verbindung, einer Nucleinsäure, einem Protein und dergleichen vorhanden ist, eine kovalente Bindung bilden kann, wie eine Isothiocyanatgruppe, STP-Estergruppe, Sulfonylchloridgruppe, N-Hydroxysuccinimidyl(NHS)estergruppe, Alkylhalogenidgruppe, Maleinimidgruppe, symmetrische Disulfidgruppe und dergleichen, aufweist. Als Färbemittel seien zum Beispiel Cyaninpigmente (z.B. Cy5, Cy3, Cy2, Cy7 (hergestellt von Amersham Bioscience)), Alexa Fluors, Biotine, BODIPYs, Fluoresceine, Oregon Greens, Rhodamine, Texasrotfarbstoffe, Cumarine, NBDs (7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole) und dergleichen erwähnt. Von diesen kovalent bindenden Färbemitteln ist ein aminogruppen(NH₂)-modifizierendes Färbemittel zu bevorzugen, und Cyaninpigmente, insbesondere Cy5, Cy3 und Cy2 (hergestellt von Amersham Bioscience), sind zu bevorzugen. Die Konzentration des Färbemittels in der Färbeflüssigkeit beträgt vorzugsweise 100 bis 1000 μg/ml, besonders bevorzugt 200 bis 500 μg/ml. Wenn die Konzentration kleiner als 100 μg/ml ist, nimmt die Fluoreszenzempfindlichkeit häufig merklich ab, und wenn sie 1000 μg/ml überschreitet, ist die Fluoreszenzempfindlichkeit häufig gesättigt. Außerdem kann in der vorliegenden Erfindung auch ein nichtkovalent bindendes Färbemittel verwendet werden, und zum Beispiel können Sypro Orange und Sypro Red (die beide von Molecular Probes hergestellt werden) verwendet werden.
Als Tensid ist ein Tensid zu bevorzugen, das ein Protein negativ aufladen kann, und zum Beispiel sei ein anionisches Tensid erwähnt. Als Tensid sei zum Beispiel ein Alkalimetalldodecylsulfat-Salz erwähnt, und insbesondere seien Natriumdodecylsulfat (SDS), Lithiumdocecylsulfat (LDS) und dergleichen erwähnt. Während die Tenside, wie SDS und dergleichen, auch als Proteinlösungsvermittler fungieren, können die Färbung und die SDS-Denaturierung eines Proteins durch die gleichzeitige Anwesenheit von SDS und eines Färbemittels gleichzeitig durchgeführt werden. Als Ergebnis wird eine bequeme und schnelle Färbung einer proteinhaltigen Probe möglich. Die Konzentration des Tensids in der Färbeflüssigkeit beträgt im Falle eines Alkalimetalldodecylsulfat-Salzes zum Beispiel vorzugsweise 0,5 bis 10%, besonders bevorzugt 1,0 bis 5,0%, ganz besonders bevorzugt 1,0 bis 2,0%. Wenn die Konzentration kleiner als 0,5% ist, nimmt die Fluoreszenzempfindlichkeit häufig ab, und wenn sie 10% übersteigt, ist die Fluoreszenzempfindlichkeit häufig gesättigt. In der vorliegenden Beschreibung bedeutet die Konzentration (%) des Tensids w/v%.
Die Färbeflüssigkeit der vorliegenden Erfindung kann weiterhin Alkohol enthalten. Der enthaltene Alkohol kann die Proteinfärbeeffizienz verbessern. Während der Faktor, der zu dieser Wirkung beiträgt, noch nicht eindeutig aufgeklärt wurde, nehmen die Erfinder an, dass eine verbesserte Durchlässigkeit des Gels für die Färbeflüssigkeit einer der Faktoren ist. Der Alkohol ist vorzugsweise ein geradkettiger oder verzweigter Alkohol mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, und insbesondere seien Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, sek-Butanol und dergleichen erwähnt. Von diesen sind Methanol, Ethanol, Propanol und Butanol zu bevorzugen, und Methanol, Ethanol und Propanol sind besonders zu bevorzugen. Die Konzentration an Alkohol in der Färbeflüssigkeit beträgt vorzugsweise 0,5 bis 30%, besonders bevorzugt 0,5 bis 10%, ganz besonders bevorzugt 0,5 bis 1,0%. Wenn die Konzentration kleiner als 0,5% ist, wird die Wirkung der Alkoholzugabe häufig unzureichend, und wenn sie 30% übersteigt, nimmt die Färbeeffizienz häufig ab. In der vorliegenden Beschreibung bedeutet die Konzentration (%) an Alkohol v/v%.
Der pH-Wert der Färbeflüssigkeit in der vorliegenden Erfindung kann je nach dem zu verwendenden Färbemittel zweckmäßig gewählt werden, und wenn zum Beispiel ein aminogruppenmodifizierendes Färbemittel, wie N-Hydroxysuccinimid Typ Cy5, Cy3 und Cy2 verwendet wird, beträgt der pH-Wert der Färbeflüssigkeit vorzugsweise 9,5 bis 10,0.
Für den Kontakt einer proteinhaltigen Probe mit der Färbeflüssigkeit kann das Verfahren zum Färben von Protein bei der Gel-Elektrophorese in der vorliegenden Erfindung (im Folgenden einfach als "Färbeverfahren" bezeichnet) angewendet werden. Das Färbeverfahren der vorliegenden Erfindung umfasst charakteristischerweise das In-Kontakt-Bringen einer proteinhaltigen Probe mit der Färbeflüssigkeit vor der Gel-Elektrophorese und das gleichzeitige Durchführen einer Färbung und Tensidbehandlung (SDS-Denaturierung usw.) des Proteins. Wenn die Gel-Elektrophorese eine zweidimensionale Elektrophorese ist, wird eine proteinhaltige Probe nach der Elektrophorese in der ersten Dimension vor der Elektrophorese in der zweiten Dimension mit einer Färbeflüssigkeit in Kontakt gebracht.

Eine proteinhaltige Probe kann mit einem zweckmäßigen Mittel, wie tropfenweise Zugabe einer Färbeflüssigkeit unter Verwendung einer Pipette zu einem Gel, das eine proteinhaltige Probe trägt, Eintauchen eines Gels in eine Färbeflüssigkeit und dergleichen, mit einer Färbeflüssigkeit in Kontakt gebracht werden. Die Kontaktzeit der Färbeflüssigkeit und der proteinhaltigen Probe kann etwa 30 Minuten betragen. Auch wenn die Elektrophorese unmittelbar nach dem Kontakt durchgeführt wird, kann eine ausreichende Färbung erreicht werden. Da das Färbemittel und das Protein merklich verschiedene Molekulargewichte haben und das Verhältnis von negativer Ladung zu Molekulargewicht (negative Ladung/Molekulargewicht) zwischen diesen verblüffend unterschiedlich ist, ist die elektrophoretische Mobilität der beiden stark unterschiedlich. Da ein Überschuss des Färbemittels durch Elektrophorese vor dem Protein wandert, wird daher ein Nachweis des Proteins ohne Einfluss des überschüssigen Färbemittels möglich. Außerdem wird ein Waschschritt unnötig. Folglich kann das Protein zweckmäßig und schnell gefärbt werden. Dagegen erfordern herkömmliche Färbeverfahren eine Reaktion eines Färbemittels und eines Proteins während einer ausreichenden Zeit und erfordern auch einen Waschschritt, was wiederum zu dem Nachteil führt, dass der Färbeschritt kompliziert und zeitraubend ist. Ein Vergleich der Färbezeit durch das Färbeverfahren der vorliegenden Erfindung und herkömmlicherweise bekannte Proteinfärbeverfahren ist in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

Färbeverfahren	Zeitpunkt des Färbens	Schritte beim Färbevorgang (Arbeitszeit; min)	Färbezeit (min)
vorliegende Erfindung	Färben vor Elektrophorese	nur Färben	< 30
CCB	Färben nach Elektrophorese	Waschen (15) → Färben (60) → Waschen (30)	105
Silberfärbung	Färben nach Elektrophorese	Immobilisieren (20) → Waschen (20) → Färben (20) → Abbrechen (15)	75
Sypro Orange	Färben gleichzeitig mit Elektrophorese	Färben (40) → Waschen (15)	55
Sypro Red	Färben gleichzeitig mit Elektrophorese	Färben (40) → Waschen (15)	55
Sypro Ruby	Färben nach Elektrophorese	Waschen (30) → Färben (180) → Waschen (30)	240
Ettan-DIGE	Färben vor Elektrophorese	Reaktion (30) → Abbrechen (10)	40 + α

Der Elektrophoreseschritt wird im Folgenden erläutert. Im Elektrophoreseschritt wird eine proteinhaltige Probe, die im Färbeschritt der Proteinfärbe- und Tensidbehandlung (SDS-Denaturierung usw.) unterzogen wurde, auf eine Gel-Elektrophorese angewendet. In der vorliegenden Erfindung kann eine Elektrophorese nach einem herkömmlicherweise bekannten Verfahren durchgeführt werden. Die Gel-Elektrophorese unterliegt keiner besonderen Einschränkung, solange sie ein Protein trennen kann, und es seien isoelektrische Fokussierung, Natriumdodecylsulfat(SDS)-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE), Disk-Elektrophorese, Plattenelektrophorese und Gel-Isotachophorese erwähnt. Von diesen sind SDS-PAGE und isoelektrische Fokussierung im Falle einer eindimensionalen Elektrophorese zu bevorzugen. Im Falle einer zweidimensionalen Elektrophorese werden zum Beispiel zwei Elektrophoreseschritte, mit denen ein Protein auf der Basis der zwei verschiedenen Faktoren isoelektrischer Punkt und Molekulargewicht getrennt werden kann, vorzugsweise miteinander kombiniert. Insbesondere ist es zu bevorzugen, isoelektrische Fokussierung für die erste Dimension und SDS-PAGE für die zweite Dimension auszuwählen.
Die isoelektrische Fokussierung erfordert die Bildung eines Gelgradienten in dem Gel; der Gelgradient kann nach einem Verfahren, das die Zugabe von Trägerampholyten zu Polyacrylamidgel umfasst, um ein elektrisches Feld anzulegen, nach einem Verfahren, das die Bildung eines pH-Gradienten unter Verwendung von Acrylamid-Verbindungen mit verschiedenen isoelektrischen Punkten gleichzeitig mit der Herstellung des Gels umfasst, und dergleichen gebildet werden. Bei der zweidimensionalen Elektrophorese mit Hilfe von isoelektrischer Fokussierung und SDS-PAGE wird ein Gel, das ein durch isoelektrische Fokussierung getrenntes Protein enthält, auf das Ende des Gels der zweiten Dimension gelegt und in der Richtung senkrecht zur Entwicklungsrichtung der isoelektrischen Fokussierung wandern gelassen, wodurch das Protein getrennt wird. Die Spannungsbedingungen für die Gel-Elektrophorese können je nach der Art der Elektrophorese und dergleichen zweckmäßig eingestellt werden. Im Falle der isoelektrischen Fokussierung unter Verwendung eines ZOOM-IPG-Läufersystems (hergestellt von Invitrogen) können zum Beispiel Bedingungen eingesetzt werden, die die schrittweise erfolgende Erhöhung der Spannung beinhalten, wie 200 V 20 Minuten, 450 V 15 Minuten, 750 V 15 Minuten und 2000 V 30 Minuten. Im Falle von SDS-PAGE wird eine Elektrophorese unter Spannungsbedingungen von 200 V durchgeführt.
Das in dem oben genannten Elektrophoreseschritt getrennte Protein kann zum Beispiel dadurch nachgewiesen werden, dass man die Bande allein mit einem Einhandmesser usw. ausschneidet und die Fluoreszenzintensität bei einer bestimmten Wellenlänge mit Hilfe eines Fluoreszenz-Spektrometers misst. Das auf diese Weise nachgewiesene Protein wird gegebenenfalls entfärbt und durch Extraktion, Blotting-Übertragung auf eine Membran und dergleichen zurückgewonnen, was die Analyse des Proteins in Bezug auf Molekulargewicht, Reinheit, Identifizierung, Quantifizierung und dergleichen erlaubt.
Als Ausführungsform des Proteinfärbekits der vorliegenden Erfindung sei ein Kit erwähnt, der eine Zusammensetzung, die ein Färbemittel enthält, eine Zusammensetzung, die ein Tensid und gegebenenfalls eine Pufferlösung und/oder Alkohol enthält, in getrennten Behältern umfasst. Durch Mischen derselben, wenn ein Protein gefärbt werden soll, kann vorzugsweise eine Färbeflüssigkeit mit einer gewünschten Konzentration und einem gewünschten pH-Wert hergestellt werden. Als eine weitere Ausführungsform sei ein Proteinfärbekit erwähnt, der einen ersten Abschnitt zum Platzieren einer Zusammensetzung, die ein Färbemittel enthält, einen zweiten Abschnitt zum Platzieren einer Zusammensetzung, die ein Tensid enthält, gegebenenfalls einen dritten Abschnitt zum Platzieren einer Pufferlösung und/oder einen vierten Abschnitt zum Platzieren von Alkohol in einem Behälter umfasst, der in mehrere Kompartimente unterteilt ist. Außerdem kann der Proteinfärbekit der vorliegenden Erfindung weiterhin ein schriftliches Dokument mit einer Erläuterung bezüglich des oben genannten Trennverfahrens und Färbeverfahrens der vorliegenden Erfindung enthalten. Die Zusammensetzung, die ein Färbemittel enthält, und die Zusammensetzung, die ein Tensid enthält, werden vorzugsweise im voraus auf gewünschte Konzentrationen eingestellt.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden unter Bezugnahme auf Beispiele, die nicht als einschränkend anzusehen sind, erläutert.
Beispiel 1
Eine Lösung von Mäusehirn-Gewebeextrakt (5,2 mg Protein/ml 50 mM Tris-HCl (pH 7,6)/20% Glycerin/0,3 M Natriumchlorid/Protease-Inhibitor-Cocktail 1 Tab/10 ml (Roche Diagnostics)) wurde einer Trennung durch zweidimensionale Elektrophorese unterzogen. Genauer gesagt, der Extrakt (7,7 μl) wurde zu einer Quellflüssigkeit (6 M Harnstoff/2 M Thioharnstoff/2% CHAPS-Lösung 191 μl, Ampholyt (pH 3–10) 1 μl, 0,1% Bromphenolblau 4 μl, 1 M Dithiothreit 4 μl) gegeben und damit gemischt. Unter Verwendung der Lösung (155 μl) wurde ein Immobiline-pH-Gradienten(IPG)-Gelstreifen (Invitrogen) mit einem pH-Gradienten von pH 3–10 während 16 h quellen gelassen. Nach dem Quellen wurde die isoelektrische Fokussierung in der ersten Dimension (ZOOM IPG Runner System) unter den Bedingungen 200 V 20 min, 450 V 15 min, 750 V 15 min und 2000 V 30 min durchgeführt, während die Spannung schrittweise erhöht wurde.
Nach der Elektrophorese wurde eine Färbeflüssigkeit unter Verwendung eines fluoreszierenden Reagens (N-Hydroxysuccinimid Typ Cy5 (Amersham Biosciences)), das unter alkalischen Bedingungen kovalent an die Aminogruppe eines Proteins bindet (97–377 μg/ml 2% SDS/100 mM Na₂CO₃/NaHCO₃ (pH 9,9), 50 μl), mit einem Pipetman zum Färben tropfenweise zu dem IPG-Gelstreifen gegeben, und der Streifen wurde sofort auf das für die zweite Dimension verwendete 4–12%-Gradienten-SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese-Gel aufgetragen, und eine Elektrophorese wurde unter den Bedingungen 200 V 40 min durchgeführt. Da freies Cy5, das gegenüber dem Protein unreaktiv ist, ein niedriges Molekulargewicht hat, wandert es früher zur Anodenseite als eine sichtbare hellblaue Bande. Nach der Gel-Elektrophorese wurde die Hauptbande am Anodenende mit einem Einhandmesser usw. ausgeschnitten, und die Fluoreszenzintensität bei 680 nm wurde gemessen, wobei ein Fluoreszenz-Bildanalyzer ProExpress (Perkin-Elmer) mit einer Anregungswellenlänge von 625 nm verwendet wurde, auf deren Basis das Migrationsbild des Proteins beobachtet wurde. Wenn eine Cy5-Färbeflüssigkeit, die 2% SDS enthält, verwendet wurde, wurde daher bestätigt, dass die Proteinfärbung sich verbessert hatte, obwohl die Bande asymmetrisch war (1). Außerdem wurde dasselbe Migrationsmuster beobachtet, wie es nach dem Coomassie-Brillant-Blau(CBB)-Färbeverfahren erhalten wurde, bei dem ein Gel nach einer zweidimensionalen Elektrophorese etwa 105 min lang verarbeitet wird. Die Konzentration (%) an Glycerin ist in w/v% angegeben, was auch im Folgenden gilt.
Beispiel 2
In derselben Weise wie in Beispiel 1, außer dass die Natriumcarbonat-Pufferlösung gegen 3 mM Na₂CO₃/NaHCO₃ ausgetauscht wurde, wurde eine zweidi mensionale Elektrophorese durchgeführt, und das Migrationsbild des Proteins wurde beobachtet. Als Ergebnis wurde bestätigt, dass die Asymmetrie der Bande beseitigt werden konnte, während die Färbeeffizienz des Proteins aufrechterhalten wurde (2). Wie in Beispiel 1 wurde dasselbe Migrationsmuster erhalten, wie es auch nach dem CBB-Färbeverfahren erhalten wurde.
Beispiel 3
Eine Lösung von Mäusehirn-Gewebeextrakt (5 mg Protein/ml 50 mM Tris-HCl (pH 7,6)/20% Glycerin/0,3 M Natriumchlorid/Protease-Inhibitor-Cocktail 1 Tab/10 ml (Roche Diagnostics)) wurde einer Trennung durch SDS-PAGE unterzogen. Genauer gesagt, zu diesem Extrakt (10 μl) wurde ein N-Hydroxysuccinimid Typ Cy5 (hergestellt von Amersham Biosciences) als Färbeflüssigkeit (10 μl, 1 mg/ml 2% SDS/100 mM Na₂CO₃/NaHCO₃ (pH 9,9)) gegeben, und das Gemisch wurde zur Färbung 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Lösung (10 μl) wurde auf ein 10–20%-Gradienten-SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese-Gel (Sure Blot F1 Gel, hergestellt von Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.) aufgetragen, und eine Elektrophorese wurde unter den Bedingungen 240 V 15 min durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel 1 h lang mit 10% Methanol/7% wässriger Acetatlösung gewaschen, und die Fluoreszenzintensität bei 680 nm wurde gemessen, wobei ein Fluoreszenz-Bildanalyzer ProExpress (Perkin-Elmer) mit einer Anregungswellenlänge von 625 nm verwendet wurde, auf deren Basis das Migrationsbild des Proteins beobachtet wurde. Außerdem wurden die Färbung und Elektrophorese unter ähnlichen Bedingungen durchgeführt, wobei Färbeflüssigkeiten verwendet wurden, die durch Zugabe von jeweils 5% Methanol, Propanol bzw. Butanol zu Färbeflüssigkeiten erhalten wurden. Die Ergebnisse des alkoholfreien Extrakts sind in Spur 1 von 3 gezeigt, die Ergebnisse des mit Methanol versetzten Extrakts sind in Spur 2 von 3 gezeigt, die Ergebnisse des mit Propanol versetzten Extrakts sind in Spur 3 von 3 gezeigt, und die Ergebnisse des mit Butanol versetzten Extrakts sind in Spur 4 von 3 gezeigt. Ein Vergleich mit dem alkoholfreien Extrakt hat gezeigt, dass Proteinbanden mit hoher Empfindlichkeit nachgewiesen werden können, wenn Metha nol, Propanol und Butanol zu den Extrakten gegeben werden. Die Konzentration (%) von Acetat ist in v/v%, was auch im Folgenden gilt.
Beispiel 4
Eine Lösung von Mäusehirn-Gewebeextrakt (5 mg Protein/ml 50 mM Tris-HCl (pH 7,6)/20% Glycerin/0,3 M Natriumchlorid/Protease-Inhibitor-Cocktail 1 Tab/10 ml (Roche Diagnostics)) wurde einer Trennung durch SDS-PAGE unterzogen. Genauer gesagt, zu diesem Extrakt (10 μl) wurde ein N-Hydroxysuccinimid Typ Cy5 (hergestellt von Amersham Biosciences) als Färbeflüssigkeit (10 μl, 1 mg/ml 2% SDS/100 mM Na₂CO₃/NaHCO₃ (pH 9,9)) gegeben, und das Gemisch wurde zur Färbung 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Lösung (10 μl) wurde auf ein 10–20%-Gradienten-SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese-Gel (Sure Blot F1 Gel, hergestellt von Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.) aufgetragen, und eine Elektrophorese wurde unter den Bedingungen 240 V 15 mm durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel 1 h lang mit 10% Methanol/7% wässriger Acetatlösung gewaschen, und die Fluoreszenzintensität bei 680 nm wurde gemessen, wobei ein Fluoreszenz-Bildanalyzer ProExpress (Perkin-Elmer) mit einer Anregungswellenlänge von 625 nm verwendet wurde, auf deren Basis das Migrationsbild des Proteins beobachtet wurde. Anstelle von 2% SDS wurde 2% Lithiumdodecylsulfat (LDS) zu einer Färbeflüssigkeit gegeben, und das Gemisch wurde unter ähnlichen Bedingungen gefärbt. Die Migrationsergebnisse wurden miteinander verglichen. Als Ergebnis wurde geklärt, dass die Proteinbande im Falle der Zugabe von 2% LDS (4 Spur 3) mit höherer Empfindlichkeit nachgewiesen werden konnte als bei Zugabe von 2% SDS (4 Spur 2).
Vergleichsbeispiel 1
In derselben Weise wie in Beispiel 1, außer dass eine Färbeflüssigkeit ohne 2% SDS verwendet wurde und die Elektrophorese in der zweiten Dimension 30 min nach der Färbung durchgeführt wurde, wurde eine zweidimensionale Elektrophorese durchgeführt, und das Migrationsbild des Proteins wurde beobachtet. Wenn eine Färbeflüssigkeit ohne 2% SDS verwendet wurde, wurde als Ergebnis kaum ein gefärbtes Protein beobachtet (5).
Vergleichsbeispiel 2
Das Coomassie-Brillantblau(CBB)-Färbeverfahren, bei dem ein Gel nach der zweidimensionalen Elektrophorese etwa 105 Minuten lang verarbeitet wird, wurde durchgeführt. Für die CBB-Färbung wurde Biosafe-CBB (hergestellt von BIO-RAD) verwendet. Das heißt, das Gel nach der Elektrophorese wurde dreimal jeweils 5 min lang mit H₂O gewaschen, 60 min lang mit einer Biosafe-CBB-Lösung gefärbt und 30 min lang mit H₂O gewaschen, um die Färbung zu beenden. Das Migrationsmuster ist in 6 gezeigt.
Vergleichsbeispiel 3
Eine Extraktlösung von Mäuselebergewebe (66 mg Protein/ml 50 mM Tris-HCl (pH 8,5)/20% Glycerin/0,3 M Natriumchlorid/Protease-Inhibitor-Cocktail (hergestellt von Roche Diagnostics) 1 Tab/10 ml) wurde nach dem Färbeverfahren der vorliegenden Erfindung oder dem Ettan-DIGE-Verfahren gefärbt und durch zweidimensionale Elektrophorese getrennt. Das Ettan-DIGE-Verfahren wurde gemäß einem herkömmlichen Verfahren durchgeführt. Das heißt, zu diesem Extrakt (1,5 μl, entspricht 100 μg Proteinmenge) wurde eine 1 mM Lösung (2 μl) von CyDye-DIGE-Fluor-Minimalfarbstoff (hergestellt von Amersham Biosciences)/Dimethylformamid gegeben, und das Gemisch wurde 30 min lang bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Eine 10 mM wässrige Lysinlösung (2 μl) wurde hinzugefügt, und das Gemisch wurde 10 min lang auf Eis reagieren gelassen, um die Reaktion abzubrechen. Dazu wurden 7 M Harnstoff/2 M Thioharnstoff/4% CHAPS gegeben, so dass die Menge auf 100 μl zunahm, und das Gemisch wurde als Cy5-markierte Proteinlösung einer zweidimensionalen Elektrophorese unterzogen. Genauer gesagt, eine Cy5-markierte Proteinlösung (20 μl) wurde zu einer Quellflüssigkeit (6 M Harnstoff/2 M Thioharnstoff/2% CHAPS-Lösung 191 μl, Ampholyt (pH 3–10) 1 μl, 0,1% Bromphenolblau 4 μl, 1 M Dithiothreit 4 μl) gegeben und damit gemischt. Unter Verwendung dieser Lösung (155 μl) wurde ein Immobiline-pH-Gradienten(IPG)-Gelstreifen (Invitrogen) mit einem pH-Gradienten von pH 3–10 während 16 h quellen gelassen. Nach dem Quellen wurde die isoelektrische Fokussierung in der ersten Dimension (ZOOM IPG Runner System) unter den Bedingungen 200 V 20 min, 450 V 15 min, 750 V 15 min und 2000 V 30 min durchgeführt, während die Spannung schrittweise erhöht wurde.
Nach der Elektrophorese wurde der IPG-Gelstreifen 15 min lang in einer LDS-Äquilibrierungspufferlösung (1 ml, 4 × LDS (hergestellt von Invitrogen) 250 μl/H₂O 750 μl/2-Mercaptoethanol 10 μl) geschüttelt und auf das für die zweite Dimension verwendete 4–12%-Gradienten-SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese-Gel aufgetragen, und eine Elektrophorese wurde unter den Bedingungen 200 V 40 min durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurde die Fluoreszenzintensität bei 680 nm gemessen, wobei ein Fluoreszenz-Bildanalyzer ProExpress (Perkin-Elmer) mit einer Anregungswellenlänge von 625 nm verwendet wurde, auf deren Basis das Migrationsbild des Proteins beobachtet wurde. Andererseits wurde bei dem Färbeverfahren der vorliegenden Erfindung eine zweidimensionale Elektrophorese gemäß den oben genannten Beispielen durchgeführt, wobei dasselbe Gewicht eines Proteinextrakts verwendet wurde. Das Migrationsbild des Proteins wurde unter Verwendung eines Fluoreszenzbildanalysators beobachtet und mit dem Ettan-DIGE-Verfahren verglichen. Als Ergebnis wurde geklärt, dass das nach dem Färbeverfahren der vorliegenden Erfindung erhaltene Migrationsbild (7A) mit höherer Empfindlichkeit nachgewiesen werden konnte als das nach dem Ettan-DIGE-Verfahren erhaltene Migrationsbild (7B). Mit anderen Worten, es wurde geklärt, dass das Färbeverfahren der vorliegenden Erfindung eine Färbung durch einen Vorgang in einer kurzen Zeit im Vergleich zum Ettan-DIGE-Verfahren und einen Nachweis mit hoher Empfindlichkeit erlaubt.
Anhand der oben genannten Beispiele wurde geklärt, dass das Färbeverfahren der vorliegenden Erfindung, das eine zweidimensionale Elektrophorese umfasst, bei der ein Protein zwischen der ersten Dimension und der zweiten Dimension mit einer Färbeflüssigkeit in Kontakt gebracht wird, die Beobachtung eines Migrationsbilds des durch zweidimensionale Elektrophorese getrennten Proteins in kurzer Zeit ermöglicht.
Gewerbliche Anwendbarkeit
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung einer Färbeflüssigkeit, die ein Tensid wie SDS und dergleichen enthält, eine proteinhaltige Probe in kurzer Zeit gefärbt werden und kann mit hoher Empfindlichkeit eine Farbe entwickeln. Da überschüssiges Färbemittel außerdem in der Elektrophorese schneller wandert als Protein, ist kein Waschschritt notwendig. Weiterhin kann durch Färben mit einer Färbeflüssigkeit, die ein Tensid wie SDS und dergleichen enthält, nach der Elektrophorese der ersten Dimension sofort die Elektrophorese der zweiten Dimension durchgeführt werden. Als Ergebnis kann die Zahl der Schritte im Vergleich zu herkömmlichen Proteintrennverfahren reduziert werden, und der Trennvorgang kann vereinfacht werden. Somit kann ein Verfahren angegeben werden, mit dem ein Protein bequem und schnell durch Elektrophorese gefärbt und getrennt werden kann. Außerdem können eine proteinfärbende Flüssigkeit und ein Proteinfärbekit, die für die Proteinfärbe- und -trennverfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind, bereitgestellt werden.
Diese Anmeldung beruht auf einer in Japan eingereichten Patentanmeldung Nr. 2004-353395 , auf deren Inhalt hier ausdrücklich und vollumfänglich Bezug genommen wird.
Zusammenfassung
Verfahren zur Trennung eines Proteins durch Gel-Elektrophorese, umfassend einen Färbeschritt zum In-Kontakt-Bringen einer proteinhaltigen Probe mit einer Färbeflüssigkeit, die ein Färbemittel, ein Tensid und eine Pufferlösung enthält, und einen Elektrophoreseschritt zum Durchführen einer Gel-Elektrophorese mit der proteinhaltigen Probe nach dem Färbeschritt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann unter Verwendung einer Färbeflüssigkeit, die ein Tensid wie SDS und dergleichen enthält, eine proteinhaltige Probe in kurzer Zeit gefärbt werden und kann mit hoher Empfindlichkeit eine Farbe entwickeln. Da überschüssiges Färbemittel außerdem in der Elektrophorese schneller wandert als Protein, ist kein Waschschritt notwendig. Weiterhin kann durch Färben mit einer Färbeflüssigkeit, die ein Tensid wie SDS und dergleichen enthält, nach der Elektrophorese der ersten Dimension sofort die Elektrophorese der zweiten Dimension durchgeführt werden. Als Ergebnis kann die Zahl der Schritte im Vergleich zu herkömmlichen Proteintrennverfahren reduziert werden, und der Trennvorgang kann vereinfacht werden. Somit kann ein Verfahren angegeben werden, mit dem ein Protein bequem und schnell durch Elektrophorese gefärbt und getrennt werden kann.

Claims

Verfahren zur Trennung eines Proteins durch Gel-Elektrophorese, umfassend einen Färbeschritt zum In-Kontakt-Bringen einer proteinhaltigen Probe mit einer Färbeflüssigkeit, die ein Färbemittel, ein Tensid und eine Pufferlösung enthält, und einen Elektrophoreseschritt zum Durchführen einer Gel-Elektrophorese mit der proteinhaltigen Probe nach dem Färbeschritt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das Tensid ein Alkalimetalldodecylsulfat-Salz ist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei es sich bei dem Alkalimetalldodecylsulfat-Salz um Natriumdodecylsulfat oder Lithiumdocecylsulfat handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, wobei die Konzentration des Alkalimetalldodecylsulfat-Salzes in der Färbeflüssigkeit 0,5 bis 10% beträgt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Konzentration der Pufferlösung in der Färbeflüssigkeit nicht mehr als 10 mM beträgt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Färbemittel ein kovalent bindendes Färbemittel ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das kovalent bindende Färbemittel ein Aminogruppen-modifizierendes Färbemittel ist.
Verfahren gemäß Anspruch 7, wobei das Aminogruppen-modifizierende Färbemittel ein Cyaninpigment ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei es sich bei der Gel-Elektrophorese um SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese handelt.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, das weiterhin einen Schritt zur Durchführung einer Elektrophorese mit der proteinhaltigen Probe vor dem Färbeschritt umfasst, wobei es sich bei der proteinhaltigen Probe in dem Färbeschritt um die proteinhaltige Probe nach der Elektrophorese handelt.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei es sich bei der Elektrophorese um eine isoelektrische Fokussierung handelt.
Verfahren zum Färben eines Proteins in der Gel-Elektrophorese, das das In-Kontakt-Bringen einer proteinhaltigen Probe mit einer Färbeflüssigkeit, die ein Färbemittel, ein Tensid und eine Pufferlösung enthält, vor der Gel-Elektrophorese umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei es sich bei der Elektrophorese um eine zweidimensionale Elektrophorese handelt, die eine Elektrophorese in der ersten Dimension und eine Elektrophorese in der zweiten Dimension umfasst, und die proteinhaltige Probe nach der Beendigung der Elektrophorese in der ersten Dimension vor der Elektrophorese in der zweiten Dimension mit der Färbeflüssigkeit in Kontakt gebracht wird.
Proteinfärbekit für die Gel-Elektrophorese, der eine Pufferlösung, ein Färbemittel und ein Tensid umfasst.
Proteinfärbekit gemäß Anspruch 14, der weiterhin Alkohol umfasst.
Proteinfärbekit gemäß Anspruch 14 oder 15, der weiterhin ein schriftliches Dokument umfasst, das eine Erläuterung des Trennverfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11 oder des Färbeverfahrens gemäß Anspruch 12 oder 13 enthält.
Proteinfärbende Flüssigkeit für die Gel-Elektrophorese, die ein Färbemittel, ein Tensid und eine Pufferlösung umfasst.
Proteinfärbende Flüssigkeit gemäß Anspruch 17, die weiterhin Alkohol umfasst.