DE2137014A1

DE2137014A1 - Colouring electropherogams - with reactive dyestuffs

Info

Publication number: DE2137014A1
Application number: DE19712137014
Authority: DE
Inventors: Arved Prof Canngbah St Grotz Stephen Fazekas de Dr Pymble New South Wales Datyner, (Australien)
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Unisearch Ltd
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO; Unisearch Ltd
Priority date: 1970-07-28
Filing date: 1971-07-23
Publication date: 1972-02-03

Abstract

Zone or disc electropherograms of a substance carrying one or more functional gps. selected from NH2, monosubstd. amino, imino, SH and OH (e.g. proteins or carbohydrates) are coloured in such a way as to permit quantitative or qualitative determination of the substance by treating with a dye of the formula: S-D-X-R (I) (where S is a solubilizing gp. D is a chromophore, X is a bridging gp. separating the chromophore D and the gp. R, and R is a reactive gp. which gives the possibility of a covalent bond with the functional group(s) of the substance). The dye (I) has improved sensitivity and is taken up by the electropherogram in an amount which is directly proportional to the amount of electrophoretized substance. Electropherograms dyed with (I) have less tendency to fade than when conventional dyes are used.

Description

Verfahren zum Färben von Elektropherogrammen Die Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zum quantitativen und/oder qualitativen Färben von Zonen- und Scheibenelektro.plerogrammen. Methods of Staining Electropherograms The invention relates to an improved method for quantitative and / or qualitative coloring of zone and disk electroplerograms.

Bei manchen biochemischen Untersuchungen werden färbende Agenzien und Farbstoffe für die qualitative und quantitative Bestimmung bestimmter Substanzen, z. B. von Proteinen, benutzt. So ist z. B. ein Farbstoff (Coomassie Brilliant Blue R250) bekannt, der bei verschiedenen qualitativen Arbeiten benutzt wird und eine ausreichende Empfindlichkeit aufweist. Nachteilig ist jedoch, daß eine Anwendung nur in einem beschränkten Konzentrationsbereich beim quantitativen Arbeiten mit Proteinen möglich ist. Ein anderes Agens (Procion Brilliant Blue RS) kann für das quantitative Arbeiten mit Proteinen benutzt werden, wobei aber der Nachteil besteht, daß aufgrund einer niedrigen Farbintensität die erforderliche Empfindlichkeit nicht gegeben ist.In some biochemical studies, coloring agents are used and dyes for the qualitative and quantitative determination of certain Substances, z. B. of proteins used. So is z. B. a dye (Coomassie Brilliant Blue R250), which is used in various qualitative work and one has sufficient sensitivity. However, it is disadvantageous that an application only in a limited concentration range when working with quantitative Proteins is possible. Another agent (Procion Brilliant Blue RS) can be used for the quantitative work with proteins can be used, but there is the disadvantage that that, due to a low color intensity, does not have the required sensitivity given is.

Ausgehend hiervon soll deshalb erfindungsgemäß ein Verfahren in Vorschlag gebracht werden, bei dem Elektrkpherogramme qualitativ mit einer größeren Empfindlichkeit über einen größeren Konzentrationsbereich gefärbt werden können als mit bekannten Farbstoffen. Das erfindungsgemäße Verfahren, bei dem Zonen- oder Scheibenelektropherogramme von Substanzen gefärbt werden, die ene oder mehr Eun/ktionelle Gruppen (ausgewählt aus der Amino, monosubstituiertes Amino, Imino, Thiol und Hydroxyl aufweisenden Gruppe) tragen, ist dadurch gekennzeichnet, daß das Elektrophsogramm mit einem Farbstoff der allgemeinen Formel S - D - X - R gefärbt wird, bei der S eine lösende Gruppe, D ein Chromophor, X eine überbrückende Gruppe, die das Chromophor D und die Gruppe R trennt, und R eine reaktionsfShige Gruppe ist, die die Möglichkeit einer covalenten Bindung mit der funktionellen Gruppe bzw. Gruppen der Substanz bietet. Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Farbstoffe von den Elektrophfflogrammen in einer Menge aufgenommen werden, die direkt proportional ist der Menge der elektrophoretisierten Verbindung in den Elektröpherogrammen. Die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gefärbten Elektropheogramme neigen außerdem weniger zu einem Fading, als mit bekannten Farbstoffen gefärbte Elektrçherogramme.Based on this, a method should therefore be proposed according to the invention can be brought, in which the Elektrkpherogramme qualitatively with a greater sensitivity can be colored over a larger concentration range than with known ones Dyes. The method according to the invention, in which zone or disc electropherograms be colored by substances that have one or more eun / functional groups (selected from the group consisting of amino, monosubstituted amino, imino, thiol and hydroxyl Group) wear is characterized in that the electrophsogram with a dye the general formula S - D - X - R is colored, in which S is a dissolving group, D a chromophore, X a bridging group, the chromophore D and the group R separates, and R is a reactive group with the possibility of being covalent Binding with the functional group or groups of the substance offers. It has shown that the dyes according to the invention of the electrophoflograms in a Amount to be absorbed, which is directly proportional to the amount of electrophoresed Connection in the electröherograms. Those colored by the method according to the invention Electropheograms are also less prone to fading than with known dyes colored electrcherograms.

S ist vorzugsweise eine Sulfonatgruppe. D liefert die Farbe und ergibt die Affinität für die zu färbende Substanz. X ist vorzugsweise ein Imino-oder ein Iminoalkylradikal. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Gruppe R aus der Gruppe ausgewählt, die folgende Stoffe umfaßt: Vinylsulfon oder substituiertes Vinylsulfon Vinylsullonamid Monochlor otriazinyl Trichloropyrimidyl Difluorochlor opyrimidyl Epoxyd 2, 3-Dicbloroquinoaalin 4, 5-Dichloropyridazon Acrylamid ß -Chloropropionyl Methylsulfon pyrimidin 2-Chlorobenzthiazol l-Dichloro, 2- Chlor'oacrylamid 1, 4-DieMor ophthalazinyl Dimethylolmelamin Bro loacrylyl ß-Dibromopropionyl Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das Elektropherogramm entweder dadurch gefärbt werden, daß a) ein Zonenelektropherogramm auf einem Support mit einer Fixierungslösung in an sich bekannter Weise fixiert wird, daß der Support in eine verdiinnte saure Lösung des aktivierten Farbstoffes eingetaucht wird, worauf sodann der Support mit neutralem Alkohol abgespült wird oder b) daß ein Scheibenelektroferrogramm, welches auf einem polymerisierten Gelsubstrat angeordnet ist, in eine Lösung von aktiviertem Farbstoff in einer wässrigen Alkohol-Carbonsäuremischung eingetaucht wird, daß sodann das Substrat mit einer Carbonsäure abgespült wird, worauf sodann die elektrophoretische Entfärbung folgt, wobei das Elektroferrogramm quantitativ gefärbt wird.S is preferably a sulfonate group. D supplies the color and results the Affinity for the substance to be colored. X is preferably an imino or an iminoalkyl radical. According to a preferred embodiment of the invention, the group R is from the group selected, which includes the following substances: vinyl sulfone or substituted vinyl sulfone Vinylsullonamide Monochlorotriazinyl Trichloropyrimidyl Difluorochloropyrimidyl Epoxy 2, 3-dicbloroquinoaalin 4, 5-dichloropyridazone acrylamide ß-chloropropionyl Methylsulfon pyrimidine 2-chlorobenzothiazole 1-dichloro, 2-chloroacrylamide 1, 4-DieMor ophthalazinyl Dimethylolmelamine Bro loacrylyl ß-Dibromopropionyl When carrying out of the method according to the invention, the electropherogram can either be colored thereby that a) a zone electropherogram on a support with a fixative solution it is fixed in a manner known per se that the support is converted into a dilute acidic Solution of the activated dye is immersed, whereupon the support with rinsed off with neutral alcohol or b) that a disk electrics program, which is arranged on a polymerized gel substrate, into a solution of activated dye immersed in an aqueous alcohol-carboxylic acid mixture is that then the substrate is rinsed with a carboxylic acid, whereupon then the electrophoretic decolorization follows, the electroferrogram being quantitative is colored.

Erfindungsgemäß kann somit unter Verwendung eines einzigen Farbmittels eine qualitative Bestimmung neben einer quantitativen Bestimmung durchgeführt werden.According to the invention can thus using a single colorant a qualitative determination can be carried out in addition to a quantitative determination.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann eine beliebige Substanz gefärbt werden, die eine oder mehrere,zumindest aber eine der funktionellen Gruppen (Amino, monosubstituiertes Amino, Imino, Thio oder Hydroxyl) trägt. Bevorzugt kommt die Erfindung beim Färben von Protein oder Kohlehydratelektrçherogrammen in Anwendung.Any substance can be colored with the method according to the invention that contain one or more, but at least one of the functional groups (amino, monosubstituted amino, imino, thio or hydroxyl). Preferred comes the Invention applied to staining protein or carbohydrate electrcherograms.

Zur näheren Erläuterung der Erfindung dienen die nachstehenden Ausführungsbeisplele.The following exemplary embodiments serve to explain the invention in more detail.

Ein Beispiel eines erfindungsgemäß benutzten Farbstoffes ist ein reiner Farbstoff mit folgender Struktur: Ein anderer Farbstoff,der erfindungsgemäß benutzt werden kann, ist ein reiner Farbstoff mit folgender Formel: Beispiel a) Färben von Proteinen nach der Zonenelektrophorese.An example of a dye used according to the invention is a pure dye with the following structure: Another dye that can be used according to the invention is a pure dye with the following formula: Example a) Staining of proteins after zone electrophoresis.

Das als Träger bei der Zonenelektrophorese benutzte Material kann aus Zelluloseacetat, Papier, dünnen Schichten von Agarose oder Stärkegelen oder anderen ähnlichen Stoffen bestehen.The material used as a carrier in zone electrophoresis can from cellulose acetate, paper, thin layers of agarose or starch gels or other similar substances exist.

Nach der Elektrophorese wird eine Fixierung durch eine Behandlung mit 20i0iger Sulfosalicylsäure während einer Minute bei Raumtemperatur durchgeführt. Die fixierten nassen Träger werden in Längsrichtung in 60 x 6 mm Streifen geschnitten und während einer Minute eingetaucht in eine Lösung, enthaltend 0,2pro w/v des Farbstoffes I in Gegenwart von Salzsäure bis zu einer Konzentration von 0, 2 M HC1.After electrophoresis, fixation is done by treatment carried out with 20% sulfosalicylic acid for one minute at room temperature. The fixed wet supports are cut lengthways into 60 × 6 mm strips and immersed in a solution containing 0.2 per w / v of the dye for one minute I in the presence of hydrochloric acid up to a concentration of 0.2 M HC1.

Die Streifen werden sodann zweimal mit neutralem Methanol während ieweils einer Minute unter beständigem Rühren abgewaschen.The strips are then washed twice with neutral methanol during Washed off for a minute with constant stirring.

b) Färben von Proteinen nach der Scheibenelektrophorese.b) staining of proteins after disk electrophoresis.

Nach der Scheibenelektrophorese, wobei Substrate aus fest polymerisierten Gelen benutzt werden, werden die Substrate in einem Farbbad gefärbt, welches enthält 0, 6% des Farbstoffes 1, gelöst in einer Mischung von Methanol-Essigsäure -Wasser in einem Verhältnis von 5:1:4 (Volumenverhältnis). Das Färben findet während 40 Minuten bei Raumtemperatur statt. Nach dem Färben werden die Substrate in lO%iger Essigsäure abgespult und elektrophoretisch entfärbt.After disk electrophoresis, substrates made from solid polymerized Gels are used, the substrates are colored in a dye bath which contains 0, 6% of the dye 1, dissolved in a mixture of Methanol-acetic acid -Water in a ratio of 5: 1: 4 (volume ratio). The dyeing takes place during 40 minutes at room temperature. After dyeing, the substrates are 10% strength Acetic acid unwound and decolorized by electrophoresis.

Claims

0;) Method for staining zone or disk electropherograms of substances that carry one or more functional groups from the group are selected from amine, monosubstituted amine, imine, thiol and hydroxyl consists, characterized in that the electropherogram with a dye of general formula S - D - X - R is colored, where S is a dissolving group, D a Cromophore, X is a bridging group separating chromophore D and group R. and R is a reactive group that allows for covalent bonding with the functional group or groups of the substance, 2. the method according to Claim 1, characterized in that the reactive group R is selected from the group is selected, which includes the following materials: vinyl sulfone or substituted vinyl sulfone Vinylsulfonamide Monochlorotriazinyl Trichloropyrimidyl Difluorochloropyrimidyl Epoxy 2> 3-dichloroquinoxaline 4, 5- dichloropyridaz on acrylamide - chioropropionyl Methylsulfonpyrimidine 2-chlorobenzothiazole 1-dichloro, 2-chloroacrylamide 1, 4-dichloro ophthalazinyl dimethylol melamine Bromoacrylyl d, fi -dibromopropionyl.

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the group S is a sulfonate radical.

4. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that that the functional group-bearing substances are proteins.

5. The method according to any one of the preceding claims, characterized in, that X is selected from the group consisting of imino and iminoalkyl radicals.

6. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the dye has the following formula:

7. The method according to any one of the preceding claims 1 to 5, characterized in that the dye has the following formula: