DE2828179A1

DE2828179A1 - Vorrichtung zur elektrophoresetrennung

Info

Publication number: DE2828179A1
Application number: DE19782828179
Authority: DE
Inventors: Norman Leigh Anderson
Original assignee: US Department of Energy
Current assignee: US Department of Energy
Priority date: 1977-06-27
Filing date: 1978-06-27
Publication date: 1979-02-01
Also published as: JPS5412891A; JPS6052374B2; GB1577712A; CA1085772A; US4088561A; DE2828179C2

Description

PATENTANWALT DIPL.-ING. 8000 MÜNCHEN 22

KARL H. WAGNER 2EWÜRZMÜHLSRASSE 5

POSTFACH 246 2 8 2 8 1 7

27. Juni 19 78 78-R-313O

United States Department of Energy, Washington, D.C. 20545, V.St.A.

Vorrichtung zur Elektrophoresetrennung

Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur Elektrophoresetrennung von Material, wie beispielsweise Proteinen, Protein-Subeinheiten und Nukleinsäuren. Die Vorrichtung wird verwendet als die zweite Trennung in einem zweidimensionalen Trennsystem, welches mit der isoelektrischen Trennung von Arten (Spezies) längs eines dünnen, langgestreckten oder spagettiartigen Gel-Mediums beginnt. Bei der ursprünglichen Trennung wandern Proteine, Aminosäuren oder andere Probenmaterialien überlicherweise nach unten zu einem zuvor festgelegten pH-Punkt innerhalb des Gels, wo die Spezies der Probe elektrisch neutral ist, d.h. die Wanderung erfolgt zu ihrem isoelektrischen Punkt. Trennungen dieser Arten sind bekannt und bei Kombination mit einer zweidimensionalen Elektrophoresetrennung kann die bislang höchste Auflösung für Protein und Protein-Subeinheiten erreicht werden. In der zweiten Elektrophoresetrennung wandern Probenspezies durch ein als Sieb wirkendes Gel zu einem durch ihr Molekulargewicht bestimmten Punkt.

Die anfängliche isoelektrische Trennung wird in üblicher Wei-, se ausgeführt. Ein isoelektrisches Fokussiergel, beispiels-

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TELEFON: (ON) 281527 TELEQRAMM: PATLAW MÖNCHEN TELEX: 5-22038patwd

ikrylamid mit Katalysator, Fokussierverbindungen und Vernetzungsagentien werden ausgebildet und einem vorfokussierenden elektrischen Potential unterworfen, und zwar zwischen einer Alkali- und einer Säurepuffer-Lösung, beispielsweise NaOH und H-.PO.. Dadurch wird ein pH-Gradient entlang des spagettiartigen isoelektrischen Gels erzeugt. Das Probenmaterial wird in die Oberseite des Gelbehälterrohrs eingebrachte und kann unter dem Einfluß eines elektrischen Potentials zwischen den oberen und unteren Pufferlösungen wandern. Nach einer Periode von ungefähr 20 Stunden sind die verschiedenen Probenspezies zu isoelektrischen Punkten neutraler Ladung gewandet. Die Proben können sodann aus ihren Behältermaterialien entfernt werden, und zwar in Vorbereitung für eine zweidimensionale Elektrophoresetrennung.

Die Trennung in der zweiten Dimension erfolgt durch eine Natriumdodecylsulfat-Elektrophorese innerhalb eines zweidimensionalen Akrylamidgels. Die Gelzusammensetzungen sind bekannt und enthalten Polymerisations- und auch Vernetzungs-Agentien zusammen mit einem Gelpuffer. Gele dieser Art wurden bislang von Hand zwischen Glasplatten mit Laborklemmvorrichtungen angeordnet und elektric schem Strom zwischen getrennten oberen und unteren Pufferlösungen ausgesetzt. Eine derartige Vorrichtung und ein solches Verfahren reichen zur Durchführung gelegentlicher Elektrophoresetrennungen von Proteinproben, ist aber recht schwierig zu handhaben und auch zeitaufwendig, wenn eine große Anzahl von Proben verarbeitet werden soll, wie dies beispielsweise bei genetischen Untersuchungen und klinischen Diagnosen der Fall ist. Bekannte Vorrichtungen für Elektrophoresetrennungen sind begrenzt auf eine oder höchstens Form-Gel(slab-gel)-Medien für Probenauflösung. Bei diesen Vorrichtungen tritt häufig Pufferlösung an den mit Dichtungen versehenen Abdichtungen aus, wo die Formgelhalter aus dem oberen Pufferlösungsbehälter verlaufen. Wegen dieser Einschränkungen konnten nur wenige Formgele zugleich der Elektrophorese ausgesetzt werden und es war ein beträchtlicher Aufwand an Überwachungszeit durch Laboranten erforderlich.

Hinsichtlich des Standes der Technik sei auf die folgenden Literaturstellen hingewiesen, in denen Vorrichtungen zur Form- oder Slab-Gel-Elektrophorese und zweidimensionalen Elektrophorese für

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Proteine beschrieben werden.

Reid und Bieleski beschreiben in einem Artikel "A Simple Apparatus for Vertical Flat-Sheet Polyacrylamide Gel Electrophoresis" in Analytical Biochemistry, 22, 374-381 (1968), eine Vorrichtung zur Trennung komplizierter Mischungen mit Proteinen und Nukleinsäuren innerhalb eines Slab-Gel- oder Formstück-Gelmediums. Die Elektrophorese erfolgt zwischen einem oberen und einem unteren Puffertrog. Der Formgelhalter ist auf der Stirnfläche eines Vertikaltisches festgeklemmt, wobei sich eine Dichtung an ihrem Platz befindet, um das Lecken von Pufferlösung in den unteren Puffertrog zu verhindern. Da die Formgelanordnung an einem Vertikalglied und einer Dichtung festgeklemmt werden muß, kann jeweils nur eine Formgelprobe in einer solchen Vorrichtung in bequemer Weise gehandhabt werden. Studier beschreibt in "Analysis of Bacteriophage T7 Early RNAs and Proteins on Slab Gels" (Journal of Molecular Biology, 79, 237-248 (1973)) ein Verfahren zur Formgel-Elektrophoresetrennung zur Trennung und Identifizierung von RNA¹S und Proteinen der Bakteriophage T7 in einem Polyakrylamidgel. Auf Seite 240 dieser Veröffentlichung ist eine Elektrophoresevorrichtung gezeigt, welche der von Reid und Bieleski recht ähnlich ist. Es ist notwendig, eine Flüssigkeitsdichtung am Formgelhalter innerhalb der oberen Pufferkammer vorzusehen. Dies wird dadurcn erreicht, daß man geschmolzenes Agar in Ausnehmungen tropft, die an der Oberfläche des Glasplattenhalters und der Pufferkammer vorgesehen sind. Das Agar verfestigt sich zur Bildung einer Dichtung.

Ein Artikel von O'Farrel mit. dem Titel "High Resolution, Two-Dimensional Electrophoresis of Protein" (The Journal of Biological Chemistry, Band 250, Nr. 10, 4007-4021, May 1975)beschreibt ein Verfahren zur Durchführung einer zweidimensionalen Elektrophorese trennung in Polyakrylamidgel, um eine außerordentlich hohe Auflösung von Protein zu erhalten. Dabei wird eine Vorrichtung gemäß Reid und Bieleski modifiziert gemäß Studier verwendet.

Im Hinblick auf die Schwierigkeiten beim Stand der Technik hat sich die Erfindung zum Ziel gesetzt, eine Vorrichtung zur

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elektrophoretischen Trennung vorzusehen, die in bequemer Weise eine Vielzahl von Formgels oder Slab-Gels in einem einzigen Elektrophoresevorgang unterbringen kann. Weiterhin hat sich die Erfindung zum Ziel gesetzt, einf Elektrophoresevorrichtung vorzusehen, welche die schwierigen Probleme hinsichtlich des Pufferlösungslecks minimiert oder eliminiert. Ferner sieht die Erfindung eine Elektrophoresevorrichtung vor, in der eine große Anzahl von Formgelhaltern in einfacher Weise mit Proben zur Verarbeitung zusammengebaut werden kann. Die Erfindung sieht ferner eine Elektrophoresevorrichtung mit Formgelhaltern vor, die eine verbesserte Konsistenz bei der Formgeldicke gestatten.

Die Erfindung sieht eine Vorrichtung zur Elektrophoresetrennung · von Proben innerhalb eines Form- oder Slab-Gels vor. Die Vorrichtung weist ein Reservoir zum Enthalten einer Pufferlösung auf, und zwar aufgeteilt in eine innere und zwei äußere Kammern mit ersten und zweiten in Längsrichtung verlaufenden Unterteilungen. Jede dieser Unterteilungen weist ausgerichtete vertikale Spalten auf, die von den Oberseiten aus durch einen Teil ihrer Höhe hinweg verlaufen und einen kontinuierlichen Bodenrand übriglassen. Eine Vielzahl von Formgelhaltern ist in ausgerichteten Spaltenpaaren innerhalb der Unterteilungen angeordnet. Die Formgelhalter besitzen vertikale Kantenteile mit freiliegenden Gelkanten an ihren Seiten hinweisend in die äußeren zwei Reservoirkammern für die elektrische Kontaktierung der Pufferlösung. Die Elektrophoreseprobe wird in einem dieser vertikalen Kantenteile angeordnet. Die äußeren Hauptoberflächen der Formgelhalter berühren gleitend Klappen oder Oberflächen anderer Art aus elektrisch isolierendem Material innerhalb der Vertikalspalten, um einen hohen Widerstandswert gegenüber dem elektrischen Stromfluß durch die Pufferlösungen vorzusehen. Jeder der äußeren Pufferkammern ist mit Elektroden ausgestattet, um eine elektrische Potentialdifferenz zwischen den Pufferlösungen in den zwei äußeren Kammern aufzubauen. Auf diese Weise wird ein elektrischer Strom durch das Formgelmedium geleitet, und zwar zum Zwecke der Elektrophorese des Probenproteins, der Subprotein-Gruppen, der Aminosäuren, der Nukleinsäuren oder anderen Probenmaterials über das Formgel hinweg.

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Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die gleiche Pufferlösung in die drei Pufferkainmern auf das gleiche Niveau unterhalb der oberen Oberfläche des Formgelhalters eingefüllt. Dieser Formgelhalter kann auch zwei Platten aufweisen, die an einer Horizontalkante mit einem gegenseitig verbundenen Gelenk ausgestattet sind. Abstandsstreifen sind an den Innenoberflächen einer dieser Platten befestigt, wobei ein Band oder Streifen aus Klebematerial innerhalb einer unterhalb ausgebildeten Seitennut angeordnet ist. Derartige auf diese Weise befestigte Streifen sehen eine verbesserte Konsistenz für die Formgeldicken vor.

Weitere Vorteile, Ziele und Einzelheiten der Erfindung ergeben sich insbesondere aus den Ansprüchen sowie aus der Beschreibung von Ausführungsbeispielen anhand der Zeichnung; in der Zeichnung zeigt:

Fig. 1 eine perspektivische Ansicht einer erfindungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung mit einer Vielzahl von Formgels;

Fig. 2 einen Querschnitt durch die Vorrichtung der Fig. 1; Fig. 3 eine Schnitt-Endansicht der Vorrichtung gemäß Fig. 1;

Fig. 4 eine perspektivische Ansicht eines Formgelhalters mit an ihrem Platz befindlicher Probe und Gel;

Fig. 5 eine vergrößerte perspektivische Teilansicht der Probenhalter an ihrem Platz innerhalb der Vorrichtung;

Fig. 6 einen Teilschnitt der Probe innerhalb des Probenhalters.

Die Fig. 1, 2 und 3 zeigen ein Reservoir oder einen Behälter 11, der eine Pufferlösung 13 enthält. Aus Gründen der Klarheit ist die Pufferlösung 13 in Fig. 1 nicht dargestellt. Der Behälter ist in Längsrichtung in zwei äußere Kammern 15 und 17 auf jeder Seite einer Innenkammer 19 durch zwei parallele Unterteilungen oder Trennwände 20 und 21 unterteilt. Die Unterteilungen 20, 21

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sind abdichtend in den End- und Bodenwänden des Behälters befestigt.

Elektroden 23 und 24 aus Drahtverbindungen und Trägern oder anderen geeigneten Gebilden sind in Berührung mit der Pufferlösung innerhalb der Kammern 15 bzw. 17 vorgesehen. Der Behälter 11 und die Unterteilungen 20, 21 bestehen aus einem elektrisch isolierenden Material, wie beispielsweise Lucite, so daß ein von Leistungsversorgung 24 an die Elektroden 23 und 24 angelegtes elektrisches Potential eine Potentialdifferenz zwischen der Pufferlösung innerhalb der Kammern 15 und 17 erzeugt. Luciteglas und andere ähnliche Materialien sind als Baumaterialien gut geeignet, da sie sowohl elektrisch isolierend als auch transparent sind/ so daß während des Betriebs eine visuelle Beobachtung möglich ist. Die Unterteilungen 20 und 21 sind mit einer Vielzahl von Spalten (Schlitzen) 27 ausgestattet, die sich von der oberen Oberfläche der Unterteilungen aus zu einer Stelle kurz vor dem Unterteilungsboden erstrecken, wobei ein solider Teil 29 in Längsrichtung entlang des Bodens der Unterteilung übrigbleibt. Ein Bogen oder eine Tafel oder Platte aus flexiblem,elektrisch isolierendem Material, wie beispielsweise Gummi, Siliciumgummi oder Tygon, 31 wird über den nach innen weisenden Oberflächen der Unterteilungen, die die Innenkammer 19 bilden, durch geeignete Plastikstreifen 33 (Fig. 2) gehalten. Die Bogen 31 erstrecken sich über einen hinreichenden Teil der Unterteilungshöhe, um die volle Höhe der spalten 27 zu bedecken. Die nicht unterstützten Teile der Bogen 31, die direkt über die Spalten 27 verlaufen, sind mit mittig angeordneten Schlitzen 35 ausgestattet, damit sich diese Teile der Bogen in Klappen 37 (vgl. Fig. 5) innerhalb der Spalten 27 oder zwischen den Streifen 33 öffnen können. Die unteren Enden der Schlitze 35 können mit einem umgekehrten T-Schlitzteil 36 (vgl. Fig. 2) ausgestattet sein, um das öffnen der Klappen 37 zu erleichtern.

Eine Vielzahl von Probenhaltern 39 ist innerhalb entsprechender aufeinanderzuweisender Schlitze 27 der Unterteilungen 20 und 21 angeordnet. Die Klappen 37 können zur gleichen Seite hingelenkt werden, und zwar durch das Einsetzen der Probenhalter und durch

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deren Bewegung in seitlicher Richtung. Wenn sich sämtliche Probenhalter an ihrem Platz am Boden der Spalten 27 befinden, wobei die elektrisch isolierenden Klappen 37 eng an die Hauptoberflächen der Probenhalter gepreßt sind, so wird dem durch die Pufferlösung von Kammer 15 zur Kammer 17 fließenden elektrischen Strom ein beträchtlicher elektrischer Widerstandswert entgegengesetzt. Alle drei Kammern 15, 17 und 19 sind mit Pufferlösung 13 angefüllt, aber nur bis zu einem Niveau etwas unterhalb der oberen Oberfläche der Probenhalter 39, wie dies in Fig. 3 gezeigt ist.

Eine Kühlschlange 41 ist innerhalb der inneren Pufferkammer 19 vorgesehen, und zwar zusammen mit geeigneten Rührmitteln 43, ■ wie beispielsweise einem motorgetriebenen Propellerflügel oder einer Zxrkulationspumpe. Die sich durch den Stromfluß durch die Proben und durch die Pufferlösung an den abdichtenden und elektrisch isolierenden Klappen 37 ergebende Wärme kann aus der Pufferlösung innerhalb der Innenkammer 19 abgeführt werden.

Die im einzelnen in den Fig. 4, 5 und 6 gezeigten Probenhalter 39 weisen zwei starre Plattenglieder 45 aus Glas oder einem anderen geeigneten transparenten und elektrisch isolierenden Material auf. Die Platten 45 sind aneinander an einer Kantenoberfläche durch einen flexiblen Streifen 47 angelenkt, der sich über die Breite der Platten hinwegerstreckt. Der Streifen 47 besteht aus einem geeigneten zähen und elektrisch isolierenden Material, wie beispielsweise Gummi, Silikongummit oder einem anderen gummiartigen Material. Er kann durch einen festen SiIiciumgummikleber an den Glasplattenkanten befestigt werden. Wie deutlich in den Fig. 3 und 5 gezeigt ist, sieht der flexible Streifen 47 eine Flüssigkeits- und elektrisch isolierende Abdichtung an der Bodenoberfläche des Schlitzes 27 vor, wenn sich der Probenhalter 39 an seinem Platz befindet.

Ein oder mehrere Abstandsstreifen 49 sind an einer Innenoberfläche einer der Probenhalterplatten 45 befestigt. Die Streifen 49 erstrecken sich über die Breite der Platte hinweg und sehen ein Volumen konsistenter Dicke für das Formgel 51 vor. Die Streifen 49 bestehen aus einem starren harten Material, wie beispiels-

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weise Polyvinylchlorid und können durch Klebung an der Plattenoberfläche mittels eines Streifens oder einer Füllung 53 aus Klebematerial befestigt sein, welches in einer unterhalb verlaufenden Seitennut der Streifen 49 angeordnet ist. Ein im Handel verfügbarer, bei Raumtemperatur vulkanisierender Siliciumgummikleber reicht für diesen Zweck aus. Durch die Verwendung des Streifens 53 aus Kleber als Mittel zur Befestigung der Streifen an den Probenplatten wird eine Verbesserung hinsichtlich der Dickenkonsistenz für die verschiedenen Formgels erhalten.

,Ein langgestrecktes Muster oder eine Probe 55 ist in Fig. 4 und 6 gezeigt und erstreckt sich über eine Kantenoberfläche des Formgels zwischen den Abstandsgliedern 49. Beim Einbau in die Vorrichtung ist die Probe vertikal positioniert. Die Probe kann Proteine, Protein-Subeinheiten, Aminosäuren oder Nukleinsäuren enthalten, die durch Elektrophorese getrennt werden sollen. Die Probenmuster können innerhalb eines langgestreckten zylindrischen oder spagettiartigen Gels enthalten sein, und sie können in die Kantenoberfläche des Formgels mit beispielsweise Agarosegel abgedichtet sein. Alternativ können die Proben durch Pipette auf die obere Kante des Formgels aufgebracht werden und mit einem geeigneten Gel oder gelartigen Material abgedichtet werden, bevor der Probenhalter verdreht wird, um die Proben in einer Vertikalorientierung zu positionieren.

Eine hohe Auflösung der Proteine und anderer Probenmaterialien kann durch die Verwendung von zweidimensionalen Trennungen erhalten werden. In der ersten Trennung werden die Proteine entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt durch isoelektrische Fokussierung längs eines dünnen zylindrischen Gels innerhalb eines Rohrs mit kleinem Durchmesser getrennt. Das spagettiartige Gel, welches die verschiedenen entsprechend ihrem isoelektrischen Punkt getrennten Proteine enthält, kann aus dem Rohr herausgedrückt werden und längs der Kantenoberfläche von Formgel 51 angeordnet werden, wie dies bei 55 in den Fig. 4 und 6 dargestellt ist. Die Proteine können sodann längs einer zweiten Dimension über die Formbreite hinweg getrennt werden, um eine zusätzliche Auflösung

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gemäß ihrem Molekulargewicht vorzusehen.

Die Verfahren zur Ausführung derartiger zweidimensionaler isoelektrischer und elektrophoretischer Trennungen sind bekannt; vgl. dazu beispielsweise die oben genannte O'Farrell Literaturstelle. Die Gele für die isoelektrische Fokussierung werden in Glasrohren mit kleinem Durchmesser, beispielsweise mit einem Innendurchmesser von 1-3 mm, hergestellt, deren Böden anfangs mit Paraffin abgedichtet sind. Lediglich als Beispiel sei darauf hingewiesen, daß ein Fokussiergel für die Analyse menschlicher Serumproteine folgendes aufweisen kann: 8,25 Gramm Harnstoff; 750 Milliliter Ampholyte (amphotere Elektrolyte) (LKB), pH 3,5 bis 10; 2 Milliliter 30 Gewichtsprozent Akrylimid in Wasser plus 1,8 Gewichtsprozent Bisakrylamid in Wasser; 6 Milliliter Wasser; 300 Mikroliter Nonidet P-40 (NP-40 ist ein Detergenz der Fa. Particle Data Laboratories Ltd., Elmhurst, Illinois, USA); 30 Mikroliter Ammoniumpersulfat; und 20 Mikroliter Ν,Ν,Ν,Ν¹-Tetramethyläthylendiamin (TEMED). Dies würde als Ausbeute ein Volumen von ungefähr 15 ml ergeben, was für eine Batterie von ungefähr 25 isoelektrischen Fokussiergels ausreichen würde. Diese Lösung wird entgast, bevor der Katalysator TEMED hinzugefügt wird,und in die Gelrohre zur Polymerisation eingegeben. Die Gellösung kann mit Injektionsspritzen eingegeben werden, oder aber in bequemerer Weise durch Versetzung der Gellösung aus einem Behälter oder Vorrat um die Rohrboden herum in die Rohre hinein. Dieses letztgenannte Verfahren kann dadurch ausgeführt werden, daß man lediglich eine Batterie von Gelrohren absenkt, deren untere Enden in einen Vorrat aus nicht polymerisierten Gel untergetaucht waren, und zwar in ein Reservoir von Wasser oder einer anderen Flüssigkeit, die weniger dicht ist als die Gellösung. Sodann läßt man die Polymerisation für ungefähr 1 Stunde andauern.

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Bevor die Proben hinzugegeben werden, können die Gele vorfokussiert werden, um einen pH-Gradienten entlang ihrer Länge aufzubauen, während eine Potentxaldifferenz von ungefähr 200 V an die Gelendteile angelegt wird. Die Gelenden können in verdünnte Konzentrationen von ungefähr 0,02 M NaOH und 0,01 M H₃PO₄ an den entgegengesetzten Enden untergetaucht werden. Die Proben von Proteinen oder anderem Material in beispielsweise konzentriertem Harnstoff werden in das Alkaliende des isoelektrischen Fokussierrohrs eingeführt, welches sodann bei ungefähr 400 bis 800 V 1 bis 20 Stunden lang betrieben wird, wie dies zur Trennung der individuellen Proteine zu ihren isoelektrischen Punkten hin erforderlich ist.

Das isoelektrische Fokussiergel wird beispielsweise mit einer Injektionsspritze aus Wasser extrudiert, und zwar in eine Natriumdodecylsufat-Lösung (SDS) bis zum Gleichgewicht, um Ampholyte herauszuweichen. Die spagettiartigen Probengele sind sodann bereit für die Einbringung in die Forxngelprobenhalter 39, wie dies bei 55 in Fig. 4 gezeigt ist.

Die Zusammensetzungen der bei 51 in Fig. 4 gezeigten Formgele sind bekannt und sie sind in der obengenannten 0'Farrell Literaturstelle beschrieben. Es kann ein Akrylamidgel in gleichförmiger oder Gradienten-Konzentration über die Formbreite oder Formstückbreite hinweg verwendet werden. Die beste Trennung der Proteine erreicht man unter Verwendung eines exponentiellen Akrlyamidgradientengels.

Die Formgel-Lösungen in Monomerform werden in .die Probenhalter eingefüllt, und zwar aus einem üblichen und im Handel verfügbaren Gradientenmischer, beispielsweise einem Reeve-Angel-Gradientenformer. Die Gradientenmischung kann eine sich kontinuierlich ändernde Konzentration von beispielsweise Akrlyimid während des Füllvorgangs vorsehen. Zur Verhinderung des Mischens des Gradienten während der Füllung kann der Halter für die Einführung der Gellösung mit einer Ecke nach unten weisend gehaltert sein. Das Einfüllen kann mit einer gemäßigten Strömungsrate erfolgen, wobei das weniger dichte Material zuerst und die höher konzentrierte

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Akrylamidlösung zuletzt eingegeben wird. Wenn sich das Füllverfahren der Vollendung nähert, so kann der Formgelhalter langsam verdreht werden, so daß ein konsistenter Dichtegradient des Akrylamids über das Formgel hinweg erzeugt wird. Das Füllen kann auch in der gleichen Weise dadurch fortschreiten, daß man die Akrylamidlösung über die Bodenkantenoberfläche hinweg zuführt, von einem flachen V-förmigen Trichter aus, um das Mischen zu minimieren.

Eine typische Formgellösung enthält vor der Polymerisation folgendes: Von ungefähr 5 bis 22,5 Gew.- % Akrylamid, 0,1 Gew.-% Natriumdodecylsulfat, 0,375 M Tris (Hydroxymethy1)-Aminomethan-HCl, pH 8,8 und der Rest Wasser. Ebenfalls enthalten sind in kleinen Volumenanteilen Ammoniumpersulfat in Wasser und der Polymerisationskatalysator TEMED. Eine Glycerinlösung kann an Stelle von Wasser dort verwendet werden, wo hohe Konzentrationen von Akrylamid hergestellt werden. Nachdem man das Gel ungefähr 1 Stunde lang hat polymerisieren lassen, wird die restliche nicht polymerisierte Gelinischung und das Wasser von der Geloberfläche entfernt. In einigen Änwendungsfällen kann eine sekundäre Butanol-Wassermischung vor der Polymerisation der Geloberfläche hinzugegeben werden, um eine flache Oberfläche sicherzustellen. Das Formgel kann sodann vollendet werden durch Aufbringen eines Stapelgels mit einer niedrigeren Akrylamidkonzentratxon, beispielsweise 5 Gewichtsprozent oder weniger, auf der für die Probenaufbringung vorgesehenen Oberfläche. Die Verwendung des Stapelgels ist ein bekanntes Verfahren zum Schärfen der individuellen Proteinvolumina oder anderen zuvor entsprechend ihren isoelektrischen Punkten getrennten Probenmaterials auf eine refraktile Dicke.

Das in der zuvor beschriebenen Weise hergestellte langgestreckte Probengel wird auf einer geeigneten Oberfläche ausgelegt und auf die Oberseite des Stapelgels ausgerollt zwischen den zwei Glasplatten 45 des Probenhalters 39. Nach der Glättung am Platz wird eine darüberliegende Lage von Agarose verwendet, um das Probengel in seiner Position zu halten. Der zuvor zum Herausweichen der Ampholyte in dem isoelektrischen Fokussiergel verwende-

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te Gleichgewichtspuffer kann Bromphenol-Blau oder einen anderen geeigneten Farbstoff enthalten, um die Probe leicht sichtbar zu machen. Somit kann das Fortschreiten der Probe über das Formgel hinweg während der Elektrophorese leicht beobachtet werden.

Die Formgelhalter 39 mit den Formgelen 51 und den Proben 55 an ihrem Platz werden in die Position in Schlitzen 27 innerhalb der Unterteilungen 20 und 21 geschoben. Die elektrisch isolierenden Klappen 37 sind gegenüber den Hauptoberflächen der Probenhalter ausgerichtet. Wenn einige Paare der Spalten 27 nicht gefüllt sind, so schließen die flexiblen elektrisch isolierenden Bogen an den Schlitzen 35 und minimieren den elektrischen Kontakt und Strömungsmittelfluß zwischen den Pufferlösungen innerhalb der 3 Kammern 15, 17 und 19. Bei den meisten Anwendungsfällen sind die isoelektrisch fokussierten Proben ausgerichtet längs einer vertikalen Gelkante in Berührung mit der Pufferlösung der gleichen äußeren Kammer. Die Klappen 37 öffnen sich in ausreichender Weise, um die Probenhalter aufzunehmen, wenn sie eingesetzt werden, und sie dichten ab gegenüber den Halteroberflächen, um ein elektrisches Leck zu verhindern.

Das Reservoir 11 ist vorzugsweise mit einer einzigen Pufferlösung in allen drei Kammern 15, 17 und 19 gefüllt, und zwar bis zu einem Niveau unterhalb der oberen Oberfläche des Halters 39. Wenn Serumproteine untersucht werden, so kann diese Lösung typischerweise folgendes enthalten: Ungefähr 0,02 bis 0,2 M Tris(Hydroxymethyl)-Aminomerhanglycin (pH 8,3) in Wasser mit ungefähr 0,05 Gewichtsprozent SDS. Es können auch andere bekannte Pufferlösungen in einer oder mehreren der Kammern verwendet werden. Wenn jedoch unterschiedliche Pufferlösungen in unterschiedlichen Kammern verwendet werden, so kann eine gewisse Zwischendiffusion zwischen Klappen 37 und Halter 39 auftreten.

Die Leistungsversorgung 24 liefert ungefähr 200 bis 500 V Gleichspannung bei bis zu einem Ampere für 10 parallel betriebenen Probengels. Die Elektrophoresetrennung kann für ungefähr 4 bis 8 Stunden fortgesetzt werden, um eine zweite dimensionsmäßige Trennung der Probenproteine, Protein-Subeinheiten oder Nukleinsäuren entsprechend dem Molekulargewicht zu ergeben. Die Sieb-

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wirkung des ansteigenden Dichtegradienten des Akrylamid erreicht diese Trennung.

Bei dieser zweiten Dimensionstrennung heftet sich das Dodecylsulfat (SDS) an die Proteine und Protein-Subgruppen an, um die Ladung oder den isoelektrischen Effekt zu negieren, der andernfalls die Wanderung beeinflussen würde. Infolgedessen wandert jede molekulare Spezies zu einer durch ihre Größe oder Molekulargewicht bestimmten Stelle. In einem transparenten Tank aus Glas oder Lucite kann die Bewegung der Farbstoff-Front ohne weiteres für eine Vielzahl von Gelen beobachtet werden, und der Vorgang kann dann beendet werden, wenn der Farbstoff das entgegengesetzte Ende der Formgelbreite erreicht.

Das sich ergebende Formgel enthält ein Probenmaterial, welches entsprechend seinen isoelektrischen Eigenschaften in einer Dimension und entsprechend seinem Molekulargewicht in einer zweiten Dimension ausfgelöst ist. Die individuellen Probenspezies können durch geeignete und bekannte Färbe- und Entfärbe-Verfahren festgelegt werden, wie beispielsweise durch Coomassie-Blau in 12% Trichloressigsaure, gefolgt von einer Entfärbung mit mehrmaligen Wechsel von 7%-iger Essigsäure. Bei anderen Anwendungsfällen können Radioisotope in den verschiedenen Probenspezies enthalten sein und Autoradiographien werden hergestellt durch Anordnung der Formgele nahe einem geeigneten Film.

Die Form- oder Slab-Gele, deren Proteinspezies in zwei Dimensionen getrennt sind und deren Lage durch die oben erwähnten Verfahren identifiziert ist, können sodann mit Formgelen verglichen werden, die zuvor ermittelte Kontrollproben enthalten. In anderen Fällen können die Formgele mit anderen unbekannten Proben verglichen werden, die der zweidimensionalen Auflösung unterworfen wurden, um qualitative Ergebnisse zu erzielen. Fotografische und autoradiographische Bilder der aufgelösten Proben in zwei Dimensionen können durch Computerverfahren analysiert werden, um die Handhabung großer Anzahlen von Proben zu ermöglichen.

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Die erfindungsgemäße Vorrichtung gestattet die gleichzeitige Auflösung nach der zweiten Dimension von einer Vielzahl von Formgelen ohne Pufferlösungsleckprobleme, wodurch sich neue Möglichkeiten für die zweidimensionale Proteinauflösung ergeben. Beispielsweise bei der genetischen Untersuchung von Serumproben einer großen Anzahl von Einzelpersonen zur Feststellung von mutanten und anderen genetischen Änderungen kann die erfindungsgemäße Vorrichtung zweckmäßig verwendet werden. Oftmals werden Mutantenproteine durch Änderungen ihrer Ladung oder ihrer OH- und Η-Gruppen festgestellt. Die hier beschriebene Elektrophoresevorrichtung würde verwendet werden, um durch das Molekulargewicht ein Protein zu identifizieren, welches seinen isoelektrischen Punkt an einer neuen Stelle infolge seiner Mutations-Ladung gefunden hat. Untersuchungen dieser Art sind außerordentlich wichtig zur Bestimmung des Effekts von Umweltverunreinigungen von sowohl chemischer als auch radioaktiver Natur.

Die Erfindung kann auch klinische Anwendungen erfahren, beispielsweise bei der Identifizierung eines Verlustes an Transferin, was den Eisentransfer innerhalb Blutproben ausführt. Ferner könnte auch die Wilson'sehe Krankheit bestimmt werden durch Identifikation eines geringen oder fehlenden Ceruloplasmxngehalts. Durch Verwendung verschiedener Densitometer, die zur Quantifizierung von Farbmengen bekannt sind und somit auch für Proteinmengen, können weitere diagnostische Verfahren entwickelt werden, .die sich auf Herzschläge und Arteriosklerose beziehen. Beispielsweise könnten Blutproben untersucht werden, um die Mengen und Arten an Serumlipoproteinen zu vergleichen, und zwar zwischen normalen Blutproben und den Blutproben von Patienten, die möglicherweise diese Art von Problemen .haben. Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung können neue Verfahren zur Neubeschreibung und Neudefinition menschlicher Erkrankungen entwickelt werden, und zwar ausgedrückt in den Teilen,aus denen diese Zellen bestehen.

Es können verschiedene Lösungen und Gele verwendet werden, wobei diese bekannt sind und durch andere Materialien als die bereits genannten ersetzt werden können. Abwandlungen sind im Rahmen der Erfindung möglich.

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Zusammenfassend sieht die Erfindung somit eine Vorrichtung vor, um gleichzeitig elektrophoretische Trennungen an einer Vielzahl von Formgelen auszuführen, die Proben von Protein, Protein-Subeinheiten oder Nukleinsäuren enthalten. Ein Reservoir an Pufferlösung ist in drei Kammern durch zwei parallele Unterteilungen unterteilt, welche Vertikalspalten mit Abstand längs ihrer Länge angeordnet aufweisen. Ein Bogen aus flexiblem, elektrisch isolierendem Material ist an jeder der Unterteilungen befestigt und mit Vertikalschlitzen,ausgerichtet mit den Spalten versehen, Die Formgelhalter werden innerhalb der Spalte aufgenommen, wobei das flexible Material nach außen gefaltet wird in der Form von Klappen von den Schlitzen aus, um über Teilen der Halteroberflächen zu liegen und dadurch als elektrische und Flüssigkeits-Dichtungen zu dienen. Ein langgestrecktes spagettiartiges, die Proben enthaltendes Gel, was zuvor durch isoelektrische Fokussierverfahren getrennt wurde, wird vertikal längs eines Randkantenteils des Formgels positioniert. Beim Anlegen eines elektrischen Potentials zwischen den zwei äußeren Kammern der Pufferlösung wird eine zweite dimensionsmäßige elektrophoretische Trennung gemäß dem Molekulargewicht vorgenommen, wenn die Probenmoleküle über das Formgel hinwegwandern.

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Claims

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Patentansprü c h e

Vorrichtung zur Formgel-Elektrophorese mit einem Reservoir (11) für eine Pufferlösung (13) mit Elektroden (23) zur Erzeugung einer elektrischen Potentialdifferenz von einer Kante des eine Probe (55) enthaltenden Formgels (51) aus zu der entgegengesetzten Formgelkante hin, gekennzeichnet durch erste und zweite Unterteilungen (20, 21), deren jede entsprechende Vertikalspalte (27) aufweist, die von den oberen Oberflächen aus durch einen Teil ihrer Höhe verlaufen, und zwar abdichtend angeordnet parallel entlang der Länge des Behälters (11) zur Bildung von parallelen Kammern, und zwei äußeren Kammern (15, 17) und einer inneren Kammer (19), wobei die Vertikalspalte (27) jeder Unterteilung (20) sich in Ausrichtung befinden mit den Spalten der anderen Unterteilung zur Bildung einer Anordnung von entgegengesetztliegenden Paaren von entsprechenden Spalten (27), mit einer Vielzahl von Formgelhaltern (39), deren jeder angeordnet ist in einem Paar von Spalten (27) innerhalb der Unterteilungen (20, 21) und die Vertikalkantenteile mit freiliegenden Formgel(51)-Kanten aufweisen, welche in die äußeren zwei Behälterkammern (15, 17) zur Kontaktierung der Pufferlösung (13) weisen, und wobei ein elektrisch isolierendes Abdichtmaterial (31, 37) zwischen den Vertikalspalten der zwei Unterteilungen (20, 21) und dem Formhalter (39) angeordnet ist, und wobei ferner die Probe (55) für die Elektrophorese an einer der freiliegenden Formgel (51 ) -Kanten angeordnet ist und die Elektroden zur Erzeugung der elektrischen Potentialdifferenz innerhalb der zwei äußeren Kammern angeordnet sind, um den elektrischen Strom für die Elektrophorese der Probe (55) von einer vertikalen Kantenoberfläche des Formgels (51) aus zur entgegengesetzten vertikalen Kantenoberfläche zu leiten.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die gleiche Pufferlösung in die innere und die zwei äusseren Kammern eingefüllt ist, und zwar auf im wesentlichen das gleiche Niveau unterhalb der oberen Oberfläche der Formgelhalter.

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ORJGiNALfNSPECTED
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Reservoir, die Unterteilungen und die Formgelhalter aus elektrisch isolierendem Material bestehen.
4. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Formgelhalter ein Paar von starren Platten aus elektrisch isolierendem Material aufweist, die eine gegenseitige Gelenkverbindung an einer Kante besitzen, um die Schwenkpositionierung der nach innen weisenden Hauptoberflächen zur Aufnahme eines Formgels zu gestatten, und wobei auf einer der Platten auf einer nach innen weisenden Hauptoberfläche Abstandsmittel vorgesehen sind, um eine konsistente Dicke für das enthaltene Formgel vorzusehen.
5. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Abstandsmittel Horizontalstreifen von gleichförmiger Dicke sind, und zwar befestigt an der nach innen weisenden Oberfläche einer Halteplatte des Paares von Halteplatten, wobei jeder der Streifen eine Nut besitzt, die einen Füllkörper oder Streifen (35) aus Klebematerial an der darunterliegenden Oberfläche aufweist, und zwar angeordnet gegenüber der Plattenoberfläche, um die Dickenabweichungen zu minimieren, die sich durch üngleichmaßigkeiten im Klebematerial ergeben (vgl. Fig. 4 und 5).
6. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Formgelhalter in der Vorrichtung angeordnet sind mit der Gelenkverbindung an einer unteren Horizontalkante des Halters am Boden der Vertikalspalten innerhalb der ersten und zweiten Unterteilungen, wobei die Gelenkverbindung einen Streifen aus flexiblem gummiartigen Material aufweist, um eine elektrische und eine Flüssigkeits-Abdichtung zwischen der Pufferlösung in den äußeren und inneren Kammern vorzusehen.

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7. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Formgelhalter mit seiner freiliegenden Oberfläche vertikal angeordnete, langgestreckte, Gel enthaltende Probensubstanzen enthält, die entlang der Länge des langgestreckten Gels entsprechend ihren isoelektrischen Eigenschaften getrennt sind.
8. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Unterteilungen jeweils eine Spalten aufweisende Platte aufweisen, wobei ein Bogen aus flexiblem elektrisch leitenden Material an einer Hauptoberfläche befestigt ist, um eine
elektrische Abdichtung zwischen den inneren und äußeren Kammern vorzusehen, und wobei der Bogen Vertikalschlitze in Teilen besitzt, die innerhalb der Spalten zur Aufnahme der Formgelhalter freiliegen.
9. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Formgelhalter innerhalb der Vertikalschlitze derart
positioniert sind, daß die Klappenteile des elektrisch isolierenden Bogens über den Oberflächenteilen der Halter liegen und dadurch elektrisch isolierende Mittel zwischen den Pufferlösungen innerhalb der zwei äußeren Kammern und der inneren Kammern vorsehen.
10. Vorrichtung nach einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche, insbesondere nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, daß Mittel zum Kühlen und zum Rühren der Flüssigkeit innerhalb der Innenkammer vorgesehen sind.

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