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Die
vorliegende Erfindung betrifft Matrizes, Arrays, Systeme und Verfahren
zur Präparierung,
Sortierung, Konzentrierung oder Analyse von Biomolekülen auf
der Basis einer eindimensionalen Auftrennung nach ihren isoelektrischen
Punkten in einem elektrischen Feld, gegebenenfalls gefolgt von einer
zweiten Analysetechnik in einer zweiten Dimension, sowie Anwendungen
für diese.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Das
grundlegende Prinzip der isoelektrischen Fokussierung oder der Fokussierung
in einem pH-Gradienten besteht darin, dass ein geladenes Molekül in einem
elektrischen Feld immobilisiert wird, wenn es zu einer Position
im pH-Gradienten wandert, die seinem isoelektrischen Punkt (Nettoladung
Null) entspricht. Dieser Prozess läuft unabhängig von der anfänglichen
Position eines spezifischen Proteins in der Lösung ab. Er resultiert aus
dem Verschwinden einer effektiven elektrischen Ladung des Proteins,
wenn es in den Bereich wandert, wo der pH gleich dem pI ist.
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Es
sind verschiedene Techniken zur Bestimmung des isoelektrischen Punktes
eines Proteins beschrieben worden. Typischerweise wird das interessierende
Protein direkt in ein Gel, das einen pH-Gradienten enthält, injiziert
oder eingebracht, wobei der pH-Gradient parallel zur Richtung des
elektrischen Feldes verläuft, und
das Protein kann lediglich dadurch von anderen Proteinen abgetrennt
werden, dass es in einer Richtung durch viele verschiedene pH-Umgebungen wandert,
ehe es eine pH-Umgebung erreicht, die seinem isoelektrischen Punkt äquivalent
ist. Diese Techniken leiden unter den Nachteilen, dass 1) sie eine
relativ lange Zeit für
die Abtrennung des Proteins erfordern, da die Geschwindigkeit der
Fraktion dazu neigt, asymptotisch gegen null zu gehen, 2) sie relativ
hohe Spannungen erfordern (typischerweise 1000 V oder mehr) und
3) sie einen Kühlmechanismus
erfordern. Die herkömmlichen
IEF-Verfahren sind
arbeitsintensiv, zeitaufwendig, nicht standardisiert, teuer und
nicht empfindlich. Eine andere praktische Einschränkung herkömmlicher
Gele zur isoelektrischen Fokussierung besteht darin, dass es schwierig
ist, Gele herzustellen, die inkrementell kleine pH-Veränderungen
in einem pH-Gradienten zur Verbesserung der linearen Verteilung
der Proteine aufweisen.
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Die
zweidimensionale Analyse von Proteinen, die den oben beschriebenen
Schritt der isoelektrischen Fokussierung einsetzt, leidet unter
den gleichen Problemen. Zum Beispiel beschreiben Zuo et al. (2000),
Analytical Biochemistry 284: 266-278, die Auftrennung von Proteinen
auf der Basis ihrer isoelektrischen Punkte durch die unidirektionale
Wanderung durch einen pH-Bereich gefolgt von einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
(SDS-PAGE). Becker et al. (1998), J. Micromech. Microeng. 8: 24-28,
schlagen die unidirektionale Wanderung von Proteinen durch einen
pH-Bereich gefolgt von einer Auftrennung in der zweiten Dimension
auf einem planaren Chip vor. Siehe auch
US 6 254 754 (Ross).
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Aufgrund
dieser Einschränkungen
sind nur bestimmte Konstruktionen der Zellen, Spuren und der Matrix
sowie Orientierungen der Zellen, Spuren und Matrizes in einer Klammer
und bestimmte Systeme für
die ein- und zweidimensionale Analyse möglich, wodurch die Entwicklung
schnellerer, empfindlicherer, genauerer, flexiblerer und weniger
teurer Verfahren für
die ein- und zweidimensionale Analyse von Proben, einschließlich von
automatisierten Systemen für
eine High-Throughput-Analyse, eingeschränkt wird. Bessere Werkzeuge und
Verfahren für
die ein- und zweidimensionale Analyse von Biomolekülen sind
z. B. für
die Arzneimittelentwicklung, die medizinische Forschung und die
Früherkennung
und/oder Diagnose von Erkrankungen nützlich. Insbesondere werden
bessere Werkzeuge und Verfahren für die Proteomanalyse benötigt. Die
vorliegende Erfindung löst
diese und andere Probleme.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Es
sind Matrizes, Arrays, Systeme und Verfahren zur Analyse oder Präparierung
von Biomolekülen über ihren
elektrischen Punkt in einer Dimension und gegebenenfalls in Kombination
mit anderen Analyseverfahren entwickelt worden. Die Arrays enthalten
Kammern oder Zellen, in denen Biomoleküle über die Wanderung durch einen
und in einem Puffer für
die isoelektrische Fokussierung („IEF") isoliert werden können. Der pH-Bereich des IEF-Puffers
kann ultra-eng sein (z. B. 0,1 pH-Einheiten oder weniger, 0,02 pH-Einheiten
oder weniger oder 0,01 pH-Einheiten oder weniger abdecken). Gemäß einer
Ausführungsform
wandert ein Biomolekül
durch den Laufpuffer einer Kammer und wird in einem IEF-Puffer in
der Kammer oder in einer Zelle, die einen IEF-Puffer umfasst, gefangen.
Biomoleküle
mit pI-Werten, die nicht den pH-Werten des IEF-Puffers entsprechen,
werden durch das Wechseln der Richtung des elektrischen Feldes entfernt.
Wenn die Kammer oder die Zelle geschlossen ist, sodass der elektrische
Strom daran gehindert wird, aus dem Ende, das seinem Eintritt in
den IEF-Puffer oder in die Zelle gegenüberliegt, auszutreten, dann
ist das elektrische Feld gemäß einer bevorzugten
Ausführungsform
reversibel. Wenn die Kammer oder Zelle offen ist, dann kann das
elektrische Feld unidirektional sein.
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Die
Bewegung des Biomoleküls
im Laufpuffer kann durch die vom elektrischen Feld erzeugte Konvektionswärme erhöht werden.
Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
wird die Wanderung des Biomoleküls
im Laufpuffer durch eine Vorrichtung erhöht, die den Laufpuffer, der
die Biomoleküle
umfasst, quer zum IEF-Puffer zirkuliert (z. B. über einen Rührstab, eine Pumpe oder über die
Bewegung des IEF-Puffers relativ zum Laufpuffer).
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
umfasst die Kammer, die den Laufpuffer enthält, eine Vielzahl von IEF-Puffern
und/oder Zellen, die voneinander entweder über eine physikalische Trennung
oder durch ein Substrat, das die Wanderung von Biomolekülen direkt
aus einem IEF-Puffer/einer Zelle in einen anderen bzw. eine andere
statt über
den Laufpuffer im Wesentlichen verhindert, isoliert. Das Biomolekül wandert
in erster Linie durch den Laufpuffer, bis es einen anderen IEF-Puffer
oder eine andere Zelle erreicht. Bei einer weiteren Ausführungsform
haben die IEF-Puffer oder die Zellen den gleichen pH-Wert oder unterschiedliche
pH-Werte. Gemäß noch einer
weiteren Ausführungsform
umfasst die Vorrichtung eine Vielzahl diskreter isolierter IEF-Puffer
mit ultra-engen, im Wesentlichen nicht-überlappenden
pH-Bereichen, sodass das resultierende Bild des aufgetrennten Materials
bezüglich
der Positionen dem Bild eines herkömmlichen IEF-Gels entspricht,
aber eine bessere Auflösung,
als ein herkömmliches
IEF-Gel aufweist.
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Die
Biomoleküle
können
als einzelne Einheit oder als Teil eines Komplexes auf der Basis
ihres isoelektrischen Punktes aufgetrennt werden. Zum Beispiel kann
das Biomolekül
(„Zielbiomolekül") einen Komplex mit
einem anderen Molekül
bilden, das es spezifisch erkennt („Zielerkennungsmolekül"). Der Komplex kann von
anderen, nicht komplexierten Biomolekülen auf der Basis des isoelektrischen
Punktes des Komplexes abgetrennt werden. Es werden ein- oder zweidimensionale
Analyseverfahren, die eine Vielzahl diskreter isolierter IEF-Puffer
mit engen pH-Bereichen und -Stufen, zum Beispiel von 0,1 pH-Einheiten
oder weniger, bereitgestellt. Bevorzugter umfasst der pH-Bereich
oder die pH-Stufe 0,02 pH-Einheiten oder weniger für die Analyse von
Biomolekülen
mit pI-Werten, die 0,02 pH-Einheiten oder weniger auseinander liegen.
Das vermeidet die Diffusion des Biomoleküls aus einer Zelle in eine
angrenzende Zelle, z. B. zwischen Zellen, die IEF-Puffer mit leicht
unterschiedlichen pH-Werten umfassen, indem Membranen oder Materialien
verwendet werden, die für das
Biomolekül
impermeabel sind. Jeder IEF-Puffer oder jede Zelle, die den IEF-Puffer
umfasst, kann eine physikalisch abgetrennte, nicht-kontinuierliche
diskrete Einheit sein.
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Es
ist ein Analyseverfahren entwickelt worden, das den Einsatz eines
starken elektrischen Feldes bei einer niedrigen angelegten Spannung
ermöglicht,
gegebenenfalls unter Vermeidung des Einsatzes einer Stromversorgung
im kV-Bereich. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Vorrichtung
für das
reversible Lenken eines elektrischen Feldes in den IEF-Puffer in
den Zellen und aus diesen heraus sowie, gegebenenfalls, eine Vorrichtung
zur Umwälzung
des Puffers um eine Vielzahl von Zellen herum gleichzeitig in den Verfahren
und Systemen angesetzt. Es wird auch ein Analyseverfahren bereitgestellt,
das nur eine kleine oder gar keine Vorrichtung für das Kühlen der Kammer erfordert.
Die zweidimensionale Matrix erfordert nur eine minimale oder gar
keine Manipulation des Biomoleküls
während
der Auftrennungen in der ersten und der zweiten Dimension, wodurch
Zeit und Arbeit gespart werden und der Verlust an getestetem Biomolekül minimiert
wird.
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Eine
weitere Ausführungsform
stellt eine IEF-Technik bereit, die für den Einsatz in Kombination
mit einem zweiten Analyseverfahren (z. B. Hochdruck-Flüssigchromatografie
(HPLC), Massenspektrometrie, Affinitätschromatografie, Gelelektrophorese
etc.) geeignet ist.
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Die
Systeme und Verfahren sind für
die Auftrennung und/oder Reinigung kleiner oder großer Mengen eines
spezifischen Biomoleküls,
wie eines Protein- oder Nucleinsäuremoleküls, geeignet.
Es werden auch Verfahren zum Nachweis eines Zielbiomoleküls („ZB"), das durch ein
Zielerkennungsbiomolekül
(„ZEB") komplexiert ist,
bereitgestellt. Das Zielbiomolekül
kann einen Komplex mit dem ZB in Umgebungen bilden, die die Komplexbildung
fördern
oder behindern. Bei einer Ausführungsform
wird ein markiertes Zielerkennungs-Biomolekül direkt in die Zelle, die
Spur oder die Matrix mit dem IEF-Puffer gegeben, ehe die Probe,
die das Zielmolekül
enthält,
zugegeben wird.
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Diese
Systeme und/oder Verfahren für
die ein- oder zweidimensionale Analyse können miniaturisiert werden
und für
die High-Throughput-Analyse von Proben für ein Arzneimittelscreening,
die medizinische Forschung, wie die verbesserte Erkennung biologischer
Reaktionsmuster für
die Arzneimittelentwicklung, die Überwachung von Arzneimitteltherapien,
die genetische oder die Proteomanalyse und die klinische Diagnose sowie
für diagnostische
Zwecke, z. B. die Proteomanalyse, automatisiert werden. Das System
kann so konstruiert werden, dass es automatisch zusammenwirkende
Komponenten aufweist, zum Beispiel Titratoren zur Auffüllung der
Kanäle
mit pH-Lösungen
oder -Gelen (Immobilinen, Ampholyt-Mischungen etc.), Extraktoren zur Gewinnung
von Biomolekülen
aus den die IEF-Puffer enthaltenden Zellen, Vorrichtungen zur Färbung der Biomoleküle, Vorrichtungen
zum Nachweis und Scannen der Biomoleküle und Vorrichtungen zur Aufnahme und
Analyse der Bilder. Das System und/oder Verfahren kann für das High-Throughput-Screening
von Kandidaten, die für
eine gewünschte
Arzneimittelwirkung nützlich
sind, automatisiert werden.
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Das
System dieser Erfindung stellt Verfahren zur Verbesserung des Nachweises
von Biomolekülen
bei der Reaktion auf verschiedene Störungen und Stimuli, wie die
Reaktion auf ein Arzneimittel, einen Arzneimittelkandidaten oder
eine experimentelle Bedingung, die so gewählt ist, dass sie bestimmte
biologische Wege testet, sowie von Veränderungen, die einer bestimmten
Krankheit oder einem bestimmten Krankheitszustand oder einer Behandlung
einer bestimmten Krankheit oder eines bestimmten Krankheitszustands
entsprechen, in einem Tier oder Menschen bereit.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt (A) eine Zelle, die einen IEF-Puffer
enthält
und eine Protein- und Ionen-permeable
Membran an den gegenüberliegenden
Seiten der Zelle aufweist, und (B) eine Matrix, die eine Vielzahl
von Zellen umfasst.
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2 zeigt
eine Apparatur, die zwei Elektrodenplatten auf den beiden Seiten
einer Zelle umfasst, und eine Matrix, die eine Vielzahl von Zellen
zwischen den Elektroden umfasst. Die Kammer sitzt auf einem Magnetrührer. Die
Richtung des elektrischen Feldes ist reversibel.
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3 zeigt
eine Apparatur, die eine Matrix umfasst, die über der Unterseite der Kammer
zwischen zwei Elektrodenplatten gehalten wird, wobei der Laufpuffer
mithilfe des Rührstabs
um die Matrix herum fließen kann.
Die Richtung des elektrischen Feldes ist reversibel.
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4 zeigt
eine Apparatur, bei der die Matrix rotiert, um das Biomolekül im Laufpuffer über die Öffnungen
der Zelle zu verteilen. Gegebenenfalls kann die Kammer auch einen
Rührstab
für die
Umwälzung
des Laufpuffers aufweisen. Die Richtung des elektrischen Feldes
ist reversibel.
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5 zeigt drei Apparaturen: A, bei der eine
Vielzahl von Zellen einzeln und zufällig auf einem isolierten Träger im Laufpuffer
in der Kammer und zwischen zwei Elektrodenplatten montiert ist,
B, bei der eine Vielzahl von Zellen frei in der Kammer zwischen
zwei Elektrodenplatten schwimmt, und C, bei der eine Vielzahl von
Zellen aneinander befestigt ist und zwischen zwei Elektrodenplatten
rotiert. Ein Rührstab
wird zur Umwälzung
des Laufpuffers eingesetzt. Die Richtung des elektrischen Feldes
ist reversibel.
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6 zeigt eine Aufsicht auf eine Kammer,
die eine Vielzahl von Zellen umfasst, die in einer Reihe hintereinanderliegen,
getrennt von Membranen, die den in jeder Zelle vorliegenden pH-Bereich
im Wesentlichen aufrecht halten, und die A) parallel oder B) senkrecht
zur Richtung des elektrischen Feldes angeordnet sind. Ein Rührstab wird
zur Umwälzung
des Laufpuffers eingesetzt. Die Richtung des elektrischen Feldes
ist reversibel.
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7 zeigt,
wie ein Biomolekül
in den Zellen einer Matrix einer SDS-PAGE-Kapillarelektrophorese in einer zweiten
Dimension unterzogen wird.
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8 zeigt
eine Matrix, bei der die Zellen in einer linearen Reihe ausgerichtet
werden können,
sodass sie an einem SDS-Polyacrylamid-Gel für die Elektrophorese in einer
zweiten Dimension befestigt werden können.
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9 zeigt
eine Matrix, die aus einem Agarosegel mit Kanälen besteht, die eine Vielzahl
von IEF-Puffern umfassen. Jede vertikale Reihe aus Kanälen enthält den gleichen
IEF-Puffer, außer der
Reihe von Kanälen,
die keinen Puffer enthalten. Ferritin, Phycocyanin (erste Bande),
Phycocyanin (zweite Bande) und Hämoglobin
akkumulierten in der ersten, zweiten, dritten bzw. fünften senkrechten
Reihe.
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10 ist
ein Bild eines Chips, der für
die Analyse von drei Zielbiomolekülen in einer Probe konstruiert wurde.
Jeder IEF-Puffer in jeder Zelle des Chips in der ersten, zweiten
und dritten Reihe hat einen pH, der gleich dem pI der Komplexe ist,
die verschiedene ZBs/ZEMs umfassen, z. B. ZB1/ZEM1, ZB2/ZEM2 oder ZB3/ZEM3.
Die vierte Reihe umfasst Zellen, die so ausgelegt sind, dass sie
Moleküle,
die keine ZB sind und die dem Laufpuffer als Kontrolle, als Standard
oder als Datenpunkt für
die Erstellung einer Eichkurve zugesetzt wurden, aufnehmen. Demgemäß haben
die IEF-Puffer in der vierten Reihe einen pH-Wert, der gleich dem pI-Wert
des Biomoleküls
ist, das kein ZB ist.
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11 ist
ein Bild einer Kammer, die einen Chip mit mehreren Zellen umfasst,
der zwischen zwei Elektrodenplatten angeordnet ist. Die Kammer kann
an eine Stromversorgung angeschlossen werden, die in der Lage ist,
die Polarität
des elektrischen Feldes umzukehren. Die Kammer kann ferner einen
Mechanismus oder Mechanismen zum Rühren des Laufpuffers in beiden
Kompartimenten auf den beiden Seiten des Chips aus mehreren Zellen
umfassen.
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12 ist
ein Bild einer Nachweisvorrichtung für einen Chip aus mehreren Zellen.
Nachdem ein Komplex oder mehrere Komplexe in einer Vielzahl der
Zellen des Chips angekommen ist bzw. sind, kann der Chip in eine
Vorrichtung für
einen Nachweis gegeben werden. Fluoreszenzmarkierte Komplexe in
einem Chip mit mehreren Zellen können
für den
Nachweis durch eine Lichtquelle (zum Beispiel eine monochromatische
Lichtquelle) angeregt werden, dann kann das von der Markierung ausgesandte
Licht von einer Fotodiode registriert werden, in ein elektrisches
Signal (Ausgabeeinheit) umgewandelt werden und mittels eines Computers
analysiert werden. Der Chip kann in einer Halterung eingeschlossen
sein, deren Position bezüglich
der Lichtquelle oder der Diode verändert werden kann. Alternativ
kann die Position der Lichtquelle oder der Diode relativ zum Chip
verändert
werden.
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13 ist
eine grafische Darstellung der Extinktion des Hämoglobins bei 610 nm für unterschiedliche Konzentrationen.
Jeder Datenpunkt repräsentiert
einen Extinktionsmesswert, der mittels einer Standardküvette mit
rechteckiger Form erhalten wurde, die mit Lösungen mit unterschiedlichen
Hämoglobinkonzentrationen gefüllt war.
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14 ist
eine grafische Darstellung einer Eichkurve für eine Blutprobe, die auf Diabetes
getestet wurde. Die X-Achse ist das Verhältnis zwischen der molaren
Konzentration des glykierten Hämoglobins
und der Summe aus der molaren Konzentration des glykierten und des
nicht-glykierten Hämoglobins,
ausgedrückt
als Prozent. Die Y-Achse ist das Verhältnis zwischen der Absorption
des glykierten Hämoglobins
und der Summe aus der Absorption des glykierten und des nicht-glykierten
Hämoglobins,
ausgedrückt
als Prozent.
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15 zeigt Beispiele für Matrizes und einen Array. 15A zeigt Seitenansichten von vier Beispielen
von Matrizes, die alle einen IEF-Puffer enthalten („b"). Die Matrizes A
und D enthalten Rinnen, die den IEF-Puffer enthalten. Die Matrizes
B und C enthalten IEF-Puffer auf der Oberfläche der Matrix. Die Matrizes
C und D enthalten einen als „c" bezeichneten Bereich,
der eine Spur ist. Die Matrizes A-D können in Kombination mit einer
zweiten Schicht in dem System für
eine zweidimensionale Analyse eingesetzt werden. Die Richtung des
elektrischen Feldes für
den Schritt der isoelektrischen Fokussierung ist als „E1" bezeichnet.
Ein Teil von „b" in Matrix A und
B kann als eine Spur für
die Auftrennung in der zweiten Dimension dienen (z. B. über die Zugabe
von Natriumdodecylsulfat zum Laufpuffer während der Auftrennung in der
zweiten Dimension). Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
können
die Matrizes A-D während
des Schrittes der isoelektrischen Fokussierung im gleichen E1-Feld in jeder Richtung um 90 Grad gedreht
werden (nicht gezeigt). 15B zeigt einen
Array, bei dem eine zweite Schicht mit einer Perforation so auf
eine Matrix gegeben werden kann, dass der IEF-Puffer in der Matrix
in der Lage ist, während
der Trennung in der ersten Dimension mit einem Laufpuffer in Kontakt
zu treten.
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16 betrifft ein Beispiel für einen
Array. 16A ist eine Aufsicht auf ein
Beispiel für
eine zweite Schicht eines Array. Bei diesem Beispiel ist die zweite
Schicht aus einem Material hergestellt, das für biologische Moleküle impermeabel
ist, für
Ionen im Laufpuffer aber permeabel ist. 16B ist
eine Aufsicht auf ein Beispiel für
eine Matrix. Die Matrix umfasst eine rechteckige Rinne, die so mit
Gel gefüllt
ist, dass die Spur gebildet wird, und eine runde Vertiefung, die
mit IEF-Puffer gefüllt
ist. 16C ist eine Aufsicht auf die
zweite in der 16A gezeigte Schicht, die so
auf der Matrix der 16B ausgerichtet ist, dass der
IEF-Puffer durch die Perforation in der zweiten Schicht exponiert
ist. 16D ist eine Seitenansicht einer
der IEF-/Spur-Einheiten des Arrays aus der 16C. 16E ist eine Vergrößerung einer Seitenansicht
eines Teiles des Arrays aus der 16C (gestrichelter
Kreis). Die oberste Schicht ist die in der 16A gezeigte
zweite Schicht, und die untere Schicht ist die in der 16B gezeigte Matrix.
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17 zeigt
eine Aufsicht auf ein Beispiel für
ein System, das einen Array in einer Kammer, die einen Laufpuffer
umfasst, zeigt. In der Kammer befindet sich ein Rührstab,
um eine Umwälzung
des Biomoleküls quer
zum IEF-Puffer oder den IEF-Puffern oder Zellen in „b" zu ermöglichen.
Die Elektroden A1 und B1 erzeugen ein elektrisches Feld, das während des
Schrittes der isoelektrischen Fokussierung in regelmäßigen Abständen seine
Richtung umkehrt.
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18 ist
ein elektronischer Scan eines silbergefärbten Gels eines im Handel
erhältlichen
Proteinstandards, das wie im Beispiel 1 unten beschrieben hergestellt
wurde.
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19 ist
ein optischer Scan eines silbergefärbten Gels eines humanen Plasmas,
wobei das Gel wie in Beispiel 2 unten hergestellt wurde.
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20 ist
eine Aufsicht auf eine Matrix, die zu Auftrennung von humanen Plasma-Proteinen mit pI-Werten
von 7,5 bis 8,5 eingesetzt wurde. Die Matrix ist ein LUCITETM-Chip von 1 × 10 cm. Jede Linie auf der
Matrix wurde von einem modifizierten Tintenstrahldrucker gezogen,
der IEF-Puffer und Acrylamid-Mischungen so auftrug, dass parallele
Gelspuren gebildet wurden, wobei jede Spur eine gleichmäßige Breite
und Dicke von 100 μm
und eine Länge
von 1 cm, aber einen anderen pH-Wert hatte (d. h. fünfzig Spuren
von pH 7,50, 7,52, 7,54, 7,56, 7,58 etc. bis 8,50). Die Matrix wurde
so in etwas Laufpuffer in einer Kammer gegeben, dass jeweils eine
Spitze der Spuren in den Laufpuffer eingetaucht war. Eine menschliche
Plasmaprobe wurde im Laufpuffer quer zu den Spitzen der Spuren mit
einem Rührstab
umgewälzt,
während
ein elektrisches Feld, das in regelmäßigen Abständen seine Richtung umkehrte,
an den Laufpuffer angelegt wurde. Nach einigen Minuten wurde das
elektrische Feld abgeschaltet, eine 3%-ige SDS-Lösung wurde zum Laufpuffer gegeben, und
der gesamte Chip wurde in den Laufpuffer eingetaucht. Dann wurde
ein unidirektionales elektrisches Feld parallel zu den Spuren in
einer Richtung weg von der Spitze des beim Schritt der isoelektrischen
Fokussierung verwendeten IEF-Puffers und entlang der Länge der
Spuren angelegt. Der Chip wurde dann silbergefärbt. Die grauen und schwarzen
Flecken, die in der 20 zu sehen sind, sind silbergefärbte Proteine.
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21 ist ein Vergleich des menschlichen
Plasmas, der gemäß der zweidimensionalen
Analyse und gemäß einer
herkömmlichen
zweidimensionalen IEF-SDS-PAGE-Analyse erstellt wurde. 21A ist ein digitalisierter optischer Scan des
im Beispiel 3 eingesetzten und silbergefärbten Chips. Der Scan wurde
maßstabsgerecht
vergrößert, um
einen Vergleich mit dem Swiss-Protein-2D-Bild zu ermöglichen. 21B ist ein veröffentlichtes silbergefärbtes zweidimensionales
Gel von humanen Plasmaproteinen mit pI-Werten von 7,50 bis 8,50.
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22 ist ein Vergleich des humanen Plasmas,
der gemäß der zweidimensionalen
Analyse und gemäß einer
herkömmlichen
zweidimensionalen IEF-SDS-PAGE-Analyse erstellt wurde. 22A ist ein veröffentlichtes silbergefärbtes zweidimensionales
Gel humaner Plasmaproteine mit pI-Werten von 5,50 bis 6,00. 22B ist ein digitalisierter optischer Scan des
im Beispiel 4 eingesetzten und silbergefärbten Chips. Der Scan wurde
um den Faktor 10 vergrößert.
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23 ist
ein optischer Scan einer einzigen kapillaren SDS-PAGE-Spur. Die
dunkleren Bereiche in der Spur sind silbergefärbte humane Plasmaproteine
mit einem pI von ungefähr
7,0. Das humane Plasmaprotein wurde einer Trennung mit einem Array
unterzogen, der hergestellt wurde, wie es im Beispiel 5 beschrieben wird.
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24 ist
ein optischer Scan einer einzigen kapillaren SDS-PAGE-Spur. Die
dunkleren Bereiche in der Spur sind silbergefärbte humane Plasmaproteine
mit einem pI von ungefähr
7,0. Das humane Plasmaprotein wurde einer Trennung mittels eines
Arrays unterzogen, der hergestellt wurde, wie es im Beispiel 5 beschrieben wird,
und zwar in einem System mit drei Elektroden, wie es im Beispiel
6 beschrieben wird.
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25 ist
eine schematische Darstellung einer Apparatur, die auf einer Matrix
einen Bereich aus einem IEF-Puffer erzeugen kann. Eine Vorrichtung
wird zur Mischung einer sauren und einer basischen Lösung unter
Bildung eines Puffers verwendet, der den gewünschten pH-Wert hat („Titrator"). Der Puffer wird mit einem Monomer
(z. B. Acrylamid) und einem Polymerisationsmittel zusammengegeben
und in eine weitere Vorrichtung („Matrixdrucker") geladen, die den
IEF-Puffer in einer gewünschten
Position auf den Array aufbringt.
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26 ist
eine schematische Darstellung •einer
Apparatur, die die Spuren auf einer Matrix ziehen kann. Eine Acrylamidlösung und
ein Polymerisationsmittel werden in eine Vorrichtung („Matrixdrucker") geladen, die Spuren
in einer gewünschten
Position auf den Array aufbringt.
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27 ist
ein Schema eines Beispiels für
ein automatisches System. Das System stellt zum Beispiel eine Vorrichtung
zur Einspeisung einer Probe in die Kammer für die zweidimensionale elektrophoretische
Analyse („Probengeber") bereit, eine Vorrichtung
zur Entfernung von Abfall („Abfallentsorgung"), eine Vorrichtung für die Zugabe
von neuem Laufpuffer („Pufferzuleitung"), eine Vorrichtung
zur Färbung
der Matrix nach der zweidimensionalen Analyse („Färbereagenszugeber"), eine Vorrichtung
zur Verbringung des gefärbten
Chips in einen Scanner („System
zum Array-Handling"),
eine Vorrichtung zum Scannen des Chips („Scanner"), eine Vorrichtung für den Empfang
und die Aufzeichnung des gescannten Bildes („Computer"), eine Vorrichtung für die Analyse
des aufgezeichneten Bildes („Software") und eine Vorrichtung
für die
Wiedergabe des aufgezeichneten Bildes („Display").
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28 ist
eine schematische Darstellung eines Beispiels für ein System mit drei Elektroden.
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29 ist
ein Diagramm, das die Wirksamkeit der Auftrennung im IEF-System
durch das Plotten der kalibrierten Fluoreszenz, wie sie über die
Verteilung eines markierten Proteins in einem Gel bestimmt wurde, gegen
die beobachtete Fluoreszenz eines markierten Antikörpers nach
10-minütiger
isoelektrischer Fokussierung demonstriert. Die Zahlen geben die
Gesamtzahl der Proteinmoleküle
in der Probe an, wodurch eine nahezu 100%-ige Effizienz der Proteintrennung
gezeigt wird.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
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I. Das IEF-System
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Das
IEF-System schließt
die folgenden Elemente ein: einen oder mehrere IEF-Puffer, einen
Laufpuffer, eine Vorrichtung, die Kammern und/oder Zellen für die Aufnahme
des Puffers einschließt,
und eine Einrichtung zur Anlegung eines elektrischen Stroms an die
Vorrichtung. Das System kann auch eine Einrichtung zur Kühlung der
Vorrichtung und der Zielerkennungs-Biomoleküle („ZEB") enthalten.
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A. Der IEF-Puffer
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Ein
IEF-Puffer enthält
Komponenten, die eine Pufferkapazität um einen gegebenen pH-Wert herum aufweisen
(Puffersubstanzen), oder Komponenten, die sich unter Ausbildung
eines pH-Gradienten organisieren (z. B. Ampholyte, Immobiline oder
eine Kombination von Puffersubstanzen). Der IEF-Puffer liegt so
in Form einer Flüssigkeit
oder einer Aufschlämmung
oder eines Gels vor, dass ein Biomolekül durch den IEF-Puffer wandern
kann, es sei denn, der pI des Biomoleküls liegt im pH-Bereich des
IEF-Puffers. Ein IEF-Puffer kann, wenn es erforderlich ist, andere
Komponenten enthalten, wie Harnstoff, ein Detergens oder ein Reduktionsmittel.
Siehe z. B. Malloy et al., Anal. Biochem. 280: 1-10 (2000). Es ist
erwünscht,
dass die IEF-Puffer unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes
funktionell stabil sind.
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Der
IEF-Puffer oder die Zelle, die den IEF-Puffer umfasst, kann per
Hand oder mittels verschiedener Vorrichtungen gebildet werden. Zum
Beispiel kann der IEF-Puffer auf die Oberfläche eines Substrats oder in einer
Rinne oder in einem Kanal auf einem Substrat aufgebracht (z. B.
geschichtet, gedruckt oder aufgetupft) werden. Das Substrat kann
eine Matrix sein, wie es unten beschrieben wird, oder ein Kügelchen,
das aus dem gleichen Material wie die Matrix besteht. Gemäß einer
Ausführungsform
kann der IEF-Puffer mittels einer Vorrichtung hergestellt werden,
die eine saure und eine basische Lösung unter Bildung eines Puffers
mit dem gewünschten
pH-Wert mischt („Titrator"). Der Puffer wird
mit einem Monomer (z. B. Acrylamid) und einem Polymerisationsmittel
zusammengegeben und in eine weitere Vorrichtung („Matrixdrucker") gegeben, die den IEF-Puffer
in einer gewünschten
Position auf die Matrix aufbringt. Siehe z. B. 25.
Diese Vorrichtungen können
in ein automatisches System inkorporiert werden.
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Ampholine
sind eine Gruppe verschiedener Oligoamino- und/oder Oligocarbonsäuren, die
amphoter sind (d. h. in sauren Medien positiv geladen und in basischen
Medien negativ geladen sind), löslich
sind und M
r-Werte von ungefähr 300 bis
zu 1000 aufweisen. Ampholyte können
hergestellt oder gekauft werden. Zum Beispiel sind verschiedene
Trägerampholyte
in diesem Gebiet bekannt (z. B. Seiten 31-50, Righetti, P. G. (1983),
Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and Applications, Hrsg.
T. S. Work und R. H. Burdon, Elsevier Science Publishers B. V.,
Amsterdam;
US-Patent 3 485 736 ).
Alternativ gehören
zu im Handel erhältlichen Ampholyten
die Ampholine (LKB), Servalyte (Serva), Biolyte und Pharmalyte (Amersham
Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden).
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Immobiline
sind nicht-amphotere, bifunktionelle Acrylamidderivate mit der allgemeinen
Formel CH2=CH-CO-NH-R. Immobiline können hergestellt
oder gekauft werden. Zum Beispiel sind Verfahren zur Synthese von
Immobilinen in diesem Gebiet bekannt (Bjellquist et al. (1983),
J. Biochem. Biophys. Methods 6: 317). Die Immobiline können mit
dem Acrylamid unter Bildung von IPGs (immobilisierten pH-Gradienten)
copolymerisiert werden. IPGs können
mittels Verfahren, die in diesem Gebiet bekannt sind, hergestellt
werden, oder sie können
gekauft werden.
-
pH-Gradienten
können
durch das Mischen amphoterer oder nicht-amphoterer Puffer hergestellt
werden. Zum Beispiel werden derartige Pufferkombinationen bei R.
C. Allen et al., Gel Electrophoresis and Isoelectric Focusing of
Proteins: Selected. Technigues, Berlin: Walter de Gruyter & Co. (1984) und
im
US-Patent Nr. 5 447 612 (Bier)
beschrieben. Zu IEF-Pufferagenzien
gehören
50 mM Glycin und 14 mM NaOH, 50 mM HEPES und 12 mM NaOH, 50 mM THMA
und 44,6 mM HCl, 52 mM Zitronensäure
und 96 mM Na
2HPO
4,
50 mM BICIN und 18 mM NaOH sowie 50 mM DMGA und 40 mM NaOH.
-
Der
durch den IEF-Puffer in jeder Zelle gebildete pH-Gradient kann einen
engen oder einen weiten pH-Bereich aufweisen (z. B. pH 6,8-pH 7,8
bzw. pH 6,8-pH 12,8). Ein IEF-Puffer kann einen extrem engen pH-Bereich
aufweisen, z. B. 5,50-5,60 (0,1 pH-Einheiten oder weniger Unterschied)
oder einen ultra-engen pH-Bereich, z. B. 5,52-5,54 (0,02 pH-Einheiten
Unterschied oder weniger). Das ist möglich, da ein IEF-Puffer ein
Puffermittel sein kann, das auf einen bestimmten pH-Wert eingestellt
wurde. In diesem Falle ist der pH-Bereich des IEF-Puffers der Pufferkapazität der Puffersubstanz
um den pH-Wert herum, auf den die Puffersubstanz eingestellt wurde, äquivalent.
-
Der
Begriff „Intervall" bezieht sich auf
den inkrementellen Unterschied von pH-Werten innerhalb des durch
den IEF-Puffer gebildeten pH-Gradienten. Der Begriff „Stufe" bezieht sich auf
den inkrementellen Unterschied der pH-Werte zwischen zwei verschiedenen
IEF-Puffern. Zum Beispiel können
in einer Zelle die Intervalle lediglich 0,02 pH-Einheiten über den
vollen pH-Bereich
in dieser Zelle betragen (z. B. pH 6,8, pH 7,0, pH 7,2 etc. in dieser
Zelle). Bei einem weiteren Beispiel kann die pH-„Stufe" zwischen einem IEF-Puffer in der Zelle Nr.
1 und dem in der Zelle Nr. 2 0,1 pH-Einheiten betragen. Zum Beispiel
kann der IEF-Puffer in der Zelle Nr. 1 einen pH-Gradienten aufweisen,
der bei pH 6,8 beginnt und bei pH 7,8 endet, und der IEF-Puffer in der Zelle Nr.
2 kann einen pH-Gradienten aufweisen, der bei pH 7,9 beginnt und
bei pH 8,9 endet (d. h. pH 7,9 minus 7,8). Der „pH-Bereich" bezieht sich auf
den höchsten
und den niedrigsten pH-Wert in einem IEF-Puffer oder in einer Zelle,
die einen IEF-Puffer enthält
(z. B. pH 7,9-pH 8,9), oder auf den Unterschied zwischen dem höchsten und
dem niedrigsten pH-Wert
in einem IEF-Puffer oder in einer Zelle, die einen IEF-Puffer enthält (z. B.
1,0 pH-Einheiten).
Die Intervalle in einer Zelle müssen
nicht gleichmäßig sein.
Weiterhin müssen
die pH-Stufen zwischen zwei Zellen aus einer Vielzahl von Zellen
nicht gleichmäßig sein.
Gemäß einer
Ausführungsform
umfasst die Matrix IEF-Puffer oder Zellen mit IEF-Puffern, die einen
extrem engen oder ultra-engen pH-Bereich und kleine pH-Stufen zwischen
den einzelnen Zellen umfassen.
-
Gemäß einer
Ausführungsform
ist der pH-Bereich eines IEF-Puffers in einer Zelle ein enger pH-Gradient,
z. B. von weniger als einer pH-Einheit oder von bis zu wenigen pH-Einheiten. Gemäß einer
anderen Ausführungsform
erstreckt sich der pH-Gradient in der Zelle über mehrere pH-Einheiten. Gemäß einer
Ausführungsform
beträgt
das pH-Intervall eines IEF-Puffers
0,1 pH-Einheiten oder weniger. Bei einer weiteren Ausführungsform
beträgt
das pH-Intervall
eines IEF-Puffers 0,02 Einheiten oder weniger. Gemäß einer
Ausführungsform
liegen die pH-Stufen zwischen zwei oder mehr IEF-Puffern bei 0,01
Einheiten oder weniger. Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
liegen die pH-Stufen zwischen zwei oder mehr IEF-Puffern bei 0,02
Einheiten oder weniger.
-
B. Zellen
-
Eine
Zelle ist eine hohle Struktur, die einen IEF-Puffer in sich und/oder
in eine ihrer Wände
integriert enthält.
Die Zelle kann jede beliebige Form aufweisen, einschließlich einer
Kugel, eines Dreiecks, eines Quadrates, eines Rechtecks und eines
Zylinders. Eine Zelle kann, in Abhängigkeit von der Form der Struktur,
eine Wand oder mehrere Wände
aufweisen. Die Wände
der Zelle haben eine Innenseite, die in Richtung des Zentrums der
Struktur gerichtet ist, und eine Außenseite, die von den Zellen
gesehen nach außen
gerichtet ist. Siehe z. B. 1. In Abhängigkeit
von der gewünschten
Verwendung kann eine Wand der Zelle aus einer Membran, einem Netz
oder einem Feststoff bestehen, der für das Biomolekül permeabel,
impermeabel und/oder für
ein elektrisches Feld durchdringbar oder undurchdringbar ist.
-
Einige
der Wände
der Zelle können
für ein
elektrisches Feld undurchdringbar sein. Jedoch sollten die Wände der
Zelle so konstruiert sein, dass ein elektrischer Strom in die Zelle
eintreten kann. Ein IEF-Puffer kann in eine Wand der Zelle integriert
sein. Zum Beispiel kann ein GF/D-Glasfaserfilter von Whatman in
Acrylamid eingetaucht werden, das man zu einem Gel polymerisieren
lässt,
und dann in einem IEF-Puffer eingeweicht werden. Die Scheibe kann
dann zur Bildung einer Wand der Zelle eingesetzt werden. Somit kann
ein Biomolekül
in einer Zelle gefangen werden, die eine Wand aufweist, die in einem
IEF-Puffer eingeweicht ist, dessen pH-Wert gleich dem pI-Wert des Biomoleküls ist.
-
Wenn
eine Probe, die ein interessierendes Biomolekül oder interessierende Biomoleküle aufweist,
zu dem Laufpuffer im System gegeben wird, sollte wenigstens eine
Wand der Zelle für ein
interessierendes Biomolekül
oder für
mehrere interessierende Biomoleküle
durchlässig
sein. Bei einer Ausführungsform
sind alle Wände
der Zelle für
das interessierende Biomolekül
permeabel. Bei einer weiteren Ausführungsform sind alle Wände der
Zelle außer
einer impermeabel für
das Biomolekül
und/oder undurchdringbar für
ein elektrisches Feld. Bei einer Ausführungsform sind die Wände der
Zelle, die in der ersten Dimension in das elektrische Feld und in
die gleiche Richtung wie dieses gerichtet sind, für das interessierende
Biomolekül
permeabel. Gemäß einer
alternativen Ausführungsform
kann eine Wand oder können
die Wände
der Zelle im Wesentlichen impermeabel für das interessierende Biomolekül sein,
wenn das interessierende Biomolekül präpariert wird durch 1) Zugeben
einer Probe, die das interessierende Biomolekül umfasst, zu dem IEF-Puffer
in einer Zelle des Systems und 2) das Ermöglichen, dass Biomoleküle und/oder
Ionen, die uninteressant sind, aus der Zelle hinauswandern. Auf
diese Weise kann die Zelle im Schritt der ersten Dimension zusammen
mit den Matrizes, Arrays, Systemen und Verfahren eingesetzt werden.
-
Die
Zellen können
räumlich
auf verschiedene Weise angeordnet werden. Zum Beispiel können die
Zellen zusammenhängend
angeordnet werden, wobei z. B. ein Biomolekül-permeables oder Biomolekül-impermeables
Material zwei aneinander angrenzende Zellen voneinander trennt.
Siehe z. B. 6a und 6b. Gemäß einer
Ausführungsform
sind die IEF-Puffer
oder die Zellen so „isoliert", dass die Biomoleküle im Wesentlichen
von einem IEF-Puffer in einen anderen gelangen, indem sie durch
den Laufpuffer wandern, der um die IEF-Puffer oder die Zellen zirkuliert,
und nicht durch einen IEF-Puffer direkt in einen anderen IEF-Puffer oder
durch die Wand einer Zelle direkt in eine andere Zelle. Siehe z.
B. 5a, b oder 2. Gemäß einer Ausführungsform
grenzen die isolierten Zellen aneinander an, sind aber durch ein
Biomolekül-impermeables Material
getrennt. Siehe z. B. 6. Alternativ
grenzen die isolierten IEF-Puffer oder die Zellen nicht aneinander
an. Gemäß einer
Ausführungsform,
wenn die IEF-Puffer
oder die Zellen zusammenhängend
angeordnet sind, steht wenigstens eine der Wände der IEF-Puffer oder Zellen,
die nicht mit einem anderen IEF-Puffer oder einer anderen Zelle
in Kontakt steht, mit dem Laufpuffer in Kontakt und ist für das getestete
Biomolekül
permeabel. Die IEF-Puffer oder die Zellen können einen Teil einer Matrix
bilden. Die IEF-Puffer oder die Zellen müssen nicht in einer Reihe miteinander
verbunden sein, wenn die Zellen parallel zum elektrischen Feld der ersten
Dimension angeordnet sind.
-
Das
Biomolekül-permeable
oder Biomolekül-impermeable
Material kann in Abhängigkeit
vom gewünschten
Ergebnis eine Membran sein. Die Membran kann so hergestellt werden,
dass sie an den Poren der Membran im elektrischen Feld praktisch
keine Nettoladung aufweist. Bei einer alternativen Ausführungsform kann
der pH der Membran ein pH-Wert sein, der zwischen den pH-Werten
auf den beiden Seiten der Membran liegt. Das ist erwünscht, um
den Flüssigkeitsstrom
durch die Membranen, der durch das Vorliegen oder die Aneignung
einer elektrischen Ladung auf der Membran verursacht wird (Elektroendoosmose),
zu minimieren. In Abhängigkeit
vom gewünschten
Ergebnis gehören
zu nützlichen
Membranen diejenigen, die im
US-Patent Nr.
4 243 507 an Martin beschrieben werden. Alternativ können zu
den Membranen solche gehören,
an die kovalent Immobiline gebunden sind, wie es im
US-Patent Nr. 4 971 670 an Faupel
beschrieben wird.
-
Die
Zellen können
direkt oder indirekt an der Kammer befestigt sein, solange die Zellen
in der Lage sind, mit dem Laufpuffer in Kontakt zu treten. Zum Beispiel
können
die Zellen direkt an die Unterseite oder den Seiten der Kammer befestigt
sein oder mit einem isolierenden Träger an der Kammer befestigt
sein. Siehe z. B. 5a oder 5c. Alternativ
können
die Zellen in eine Matrix gegeben werden, die an der Kammer befestigt
ist, oder an einem Pflock befestigt sein, der an der Kammer befestigt
ist. Bei noch einer weiteren Ausführungsform können die
Zellen, die einen IEF-Puffer enthalten, der eine Puffersubstanz
ist, frei im Laufpuffer schwimmen, aber die Zellen sollten unterscheidbar
sein, sodass der pH-Bereich des IEF-Puffers in der Zelle erkenntlich ist.
Siehe z. B. 5b. Die Matrix oder die einzelne
Zelle kann so an der Kammer befestigt sein, dass sie in der Kammer
rotiert.
-
Die
Empfindlichkeit der Verfahren und Systeme steigt mit der Abnahme
der Größe der IEF-Puffer
oder der Zelle an. Gemäß einer
Ausführungsform
ist die Größe des IEF-Puffers
oder der Zelle, insbesondere die Länge des IEF-Puffers oder der
Zelle, so klein wie möglich.
Die Länge
des IEF-Puffers oder der Zelle bezieht sich auf den breitesten Querschnitt
des IEF-Puffers
oder der Zelle, der parallel zur Richtung des elektrischen Feldes
in der zweiten Dimension liegt. Die Breite des IEF-Puffers oder
der Zelle bezieht sich auf den breitesten Querschnitt des IEF-Puffers
oder der Zelle, der senkrecht zur Richtung des elektrischen Feldes
in der zweiten Dimension liegt. Bei einer Ausführungsform kann die Zelllänge beliebig
sein, zum Beispiel 10 μm
bis 5,0 mm. Bei einer weiteren Ausführungsform kann die Zellbreite
beliebig sein, z. B. 10 μm
bis 10,0 mm.
-
Die
Spur kann unterschiedliche Größen haben.
Gemäß einer
Ausführungsform
beträgt
die Breite der Spur 20 μm
bis 1 mm. Zum Beispiel kann die Breite der Spur bei 100 μm liegen.
Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
kann die Länge
aller Spuren bei 3-10 mm liegen.
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Die
Spur kann Materialien umfassen, die für Trenntechniken geeignet sind
(z. B. bezüglich
der Größe, der
Form, der Ladung, der Affinität
oder Kombinationen von diesen). Zu diesen Materialien können diejenigen gehören, die
für eine
Chromatografie, eine Elektrophorese wie die SDS-PAGE, eine Zonenelektrophorese, eine
Affinitätselektrophorese,
eine Kapillarelektrophorese und eine Elektrochromatografie geeignet
sind. Demgemäß kann bei
einer Ausführungsform
die Spur ein Kapillarröhrchen
sein, das mit chromatografischen Materialien (z. B. für die Flüssigkeitschromatografie)
oder Substanzen, die für
eine Elektrophorese (z. B. eine Kapillarzonenelektrophorese, Kapillargelelektrophorese
unter Verwendung vernetzter und unvernetzter Gele) und für eine kapillare
isoelektrische Fokussierung geeignet sind, gefüllt ist. Gemäß einer
Ausführungsform
ist die zweite Dimension eine von einem elektrischen Feld vermittelte
Trenntechnik.
-
Eine
Spur gemäß einer
Ausführungsform
kann ein gelartiges Material umfassen, das für eine elektrophoretische Trennung
geeignet ist, z. B.
US 6 197
173 (Kirpatrick). Das gelartige Material kann aus Monomeren,
die polymerisiert wurden, bestehen. Das Gel kann für das untersuchte
Biomolekül
denaturierend oder nicht-denaturierend sein. Das Gel kann unterschiedliche
Porengrößen aufweisen.
Demgemäß kann die
Spur je nach Bedarf zusätzliche
Komponenten, wie Harnstoff, ein Detergens und ein Reduktionsmittel,
umfassen. Siehe z. B. Malloy et al., Anal. Biochem. 280: 1-10 (2000).
Die Spur selbst kann einen IEF-Puffer für die weitere Trennung des
Biomoleküls
umfassen, das im IEF-Puffer der ersten Dimension akkumuliert wurde.
Alternativ kann eine Spur, die einen IEF-Puffer umfasst, durch die
Zugabe von SDS zum Laufpuffer in ein SDS-haltiges Gel umgewandelt
werden, und somit kann das Biomolekül in der zweiten Dimension
auf der Basis des Molekulargewichts aufgetrennt werden.
-
Gemäß einer
Ausführungsform
wird die Spur so hergestellt, dass sie Natriumdodecylsulfat (SDS)
und ein Polyacrylamidgel umfasst. Gemäß einer anderen Ausführungsform
ist die Spur über
ihre Länge
zwischen zwei für
das Biomolekül
impermeablen Schichten sandwichartig eingeschlossen. Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
kann die Spur, wenn sie SDS und ein Polyacrylamidgel umfasst, sandwichartig
zwischen einer Matrixschicht und einer weiteren Schicht eingeschlossen
sein, wobei beide Schichten impermeabel für das Biomolekül und impermeabel
für Ionen
sein können,
solange ein elektrisches Feld die Spur durchdringen und ein elektrisches
Feld entlang der Spur weg vom IEF-Puffer richten kann. Siehe z.
B. 16.
-
Die
Spur kann per Hand oder mittels verschiedener Vorrichtungen erzeugt
werden. Zum Beispiel können
eine Acrylamid-Lösung
und ein Polymerisationsmittel in eine Vorrichtung („Matrixdrucker") gegeben werden,
die Spuren in einer gewünschten
Position auf einen Array aufbringt. Siehe z. B. 26.
Ein modifizierter Büro-Tintenstrahldrucker
ist ein Beispiel. Derartige Vorrichtungen können in ein automatisches System
inkorporiert sein.
-
Es
können
verschiedene Monomere zusätzlich
zur herkömmlichen
Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung oder
zu Agarose-Lösungen
verwendet werden, um ein Geld für
den Einsatz in Schritten der ersten und/oder der zweiten Dimension
herzustellen. Es ist für
herkömmliche
chemisch polymerisierte Gele bekannt, Hydroxyethylmethacrylat und
andere niedermolekulare Verbindungen vom Acrylat-Typ als Monomere
zu verwenden. Sie werden als „Lone-Ranger"-Gele kommerzialisiert.
Die Verwendung von Polymeren, die mit einer Gruppe oder mit mehreren
Gruppen vom Acrylat-Typ substituiert sind, ist ebenfalls in der
Literatur beschrieben worden (Zewert und Harrington, Electrophoresis
13: 824-831 (1992)), und zwar als besonders geeignet für Trennungen
in gemischten Lösemitteln
aus Wasser und wassermischbaren organischen Lösemitteln, wie Alkohol oder Aceton.
Die gelbildenden Monomere können
ebenfalls beliebige, im Wesentlichen wasserlösliche Moleküle sein,
die eine mittels Licht polymerisierbare reaktive Gruppe enthalten,
in Kombination mit einem Material, das Vernetzungen ausbilden kann,
vorausgesetzt, dass die Kombination nach der Polymerisation ein
Gel bildet, das für
den jeweiligen Elektrophorese-Typ geeignet ist.
-
Zu
exemplarischen Materialien gehören
Acrylamid in Kombination mit Methylenbisacrylamid oder anderen bekannten
Vernetzungsmitteln; Hydroxyethylmethacrylat und andere niedermolekulare
(Molekulargewicht unter ungefähr
300 Dalton) Derivate der Acrylsäure,
Methacrylsäure
und alkylsubstituierte Derivate von diesen, wie Crotonsäure; Vinylpyrrolidon
und andere niedermolekulare Vinyl- und Allylverbindungen; Vinyl-,
Allyl-, Acryl- und
Methacryl-Derivate nichtionischer Polymere, einschließlich derartiger
Derivate von Agarose („Acrylaid"-Crosslinker, FMC
Corp.), Dextran und anderen Polysacchariden und Derivaten, wie Cellulosederivaten
einschließlich
von Hydroxyethylcellulose; Polyvinylalkohol; monomere, oligomere
und polymere Derivate von Glykolen, einschließlich der Polymere von Ethylenoxid,
Propylenoxid, Butylenoxid und Copolymeren von diesen; Acryl-, Vinyl-
und Allyl-Derivate anderer wasserkompatibler Polymere, wie polyHEMA
(Polyhydroxyethylacrylsäure),
polymeres N-Isopropylacrylamid (das temperaturempfindlich ist),
Maleinsäure-Polymere und
-Copolymere, partiell hydrolysiertes EVAC (Polymer von Ethylen mit
Vinylacetat), Ethylenimin, Polyaminosäuren, Polynucleotide und Copolymere
aus den Untereinheiten von diesen miteinander und mit hydrophoberen
Verbindungen, wie Pyridin, Pyrrolidin, Oxazolidin, Styrol und Hydroxysäuren. Die
polymerisierbaren Materialien müssen
nicht vollständig
wasserlöslich
sein, insbesondere wenn Lösemittel
oder Tenside in der gelbildenden Lösung enthalten sind.
-
Verfahren
zur Herstellung polymerisierbarer Derivate üblicher Polymere sind in diesem
Gebiet bekannt. Zum Beispiel kennt man die Zugabe von Allylglycidylether
zu Hydroxygruppen, wie auch die Veresterung von Hydroxylen mit Säuren, Anhydriden
oder Säurechloriden,
wie Acrylsäureanhydrid.
Amine können leicht
mit Acrylsäureanhydriden
oder -chloriden derivatisiert werden. Viele der oben beschriebenen
derivatisierten Polymere enthalten mehr als eine reaktive Gruppe
und sind somit selbstvernetzend. Die Zugabe eines Vernetzungsmittels,
das im Durchschnitt mehr als eine reaktive Gruppe pro Molekül enthält, ist
für die
Bildung von Gelen aus Monomeren erforderlich, die nur eine reaktive
Gruppe aufweisen, wie Acrylamid. Zu diesen gehören, zusätzlich zu mehrfach derivatisierten
Polymeren, Methylenbisacrylamid, Ethylenglykoldiacrylat und andere
kleine Moleküle
mit mehr als einer ethylenisch ungesättigten funktionellen Gruppe,
wie Acryl, Vinyl oder Allyl.
-
Zu
Kandidaten für
Monomere, bei denen es sich nicht um Acrylamid handelt, gehören z. B.
Allylalkohol, HEMA (Hydroxyethyl(meth)acrylat), Polyethylenglykolmonoacrylat, Polyethylenglykoldiacrylat,
Ethylenglykolmonoacrylat, Ethylenglykoldiacrylat, Vinylcaprolactam,
Vinylpyrrolidon, Allylglycidyldextran, Allylglycidyl-Derivate von
Polyvinylalkohol oder von Cellulose und Derivaten, Vinylacetat und
andere Moleküle,
die eine oder mehrere Acryl-, Vinyl- oder Allyl-Gruppen enthalten.
-
Eine
IEF/Spur-Einheit ist ein IEF-Puffer oder eine Zelle, die einen IEF-Puffer
zusammen mit einer Spur umfasst. Bei einer Ausführungsform ist die IEF/Spur-Einheit
so vorgefertigt, dass der IEF-Puffer mit der Spur in Kontakt steht.
Siehe z. B. 16D. Bei einer anderen Ausführungsform
kann die IEF/Spur-Einheit so vorgefertigt sein, dass der IEF-Puffer
und die Spur getrennt vorliegen, aber miteinander verbunden werden
können.
Zum Beispiel können
der IEF-Puffer und die Spur in der Matrix beweglich sein, sodass
sie zum gewünschten
Zeitpunkt zusammengebracht werden können. Bei einem anderen Beispiel
können
der IEF-Puffer und die Spur über
einen Gelpfropfen, der die beiden miteinander verbindet, zusammengebracht
werden. Wenn ein IEF-Puffer oder eine Zelle mit einer Spur verbunden
ist, muss die Verbindung zwischen dem IEF-Puffer oder der Zelle
und der Spur den Transfer des interessierenden oder gerade untersuchten
Biomoleküls
erlauben.
-
C. Matrizes
-
Eine
Matrix (oder Matrixschicht) ist ein festes Material oder ein halbfestes
Material, z. B. eine Keramik, ein Glas, Polystyrol, Poly(methylmethacrylat)
wie Lucit oder ein Gel, das eine Zelle oder eine Vielzahl von Zellen
und/oder IEF/Spur-Einheiten umfasst. Gemäß einer Ausführungsform
ist das Material, das die Matrix bildet, schlecht leitend. Gemäß einer
anderen Ausführungsform
besteht die Matrix teilweise oder vollständig aus einem Material, das
impermeabel für
das Biomolekül
und impermeabel für
Ionen (BIA) ist und über
die ganze Länge
mit der Spur in Kontakt steht. Eine IEF/Spur-Einheit kann auf die
Oberfläche
der Matrix gegeben werden, zum Beispiel in Form eines Gels, 15, Matrix B oder C, sie kann in eine
in die Matrixschicht geätzte Rinne
eingebracht werden kann, oder sie kann sich durch die Matrixschicht
erstrecken, solange der IEF-Puffer oder die Zelle mit dem Laufpuffer
in der ersten Dimension in Kontakt stehen kann. Gemäß einer
Ausführungsform
ist, wenn sich der IEF-Puffer,
die Zelle oder die Spur durch die Matrix erstreckt, dann eine der
Seiten des IEF-Puffers, der Zelle oder der Spur, die mit dem Laufpuffer
in Kontakt steht, mit einer für
das Biomolekül
impermeablen Schicht bedeckt. Die Matrix kann beweglich sein oder
sich in der Kammer befinden.
-
Die
Matrix kann beispielsweise durch das Bohren eines Loches oder von
Löchern
durch eine Seite der Matrix und hinaus durch die gegenüberliegende
Seite der Matrix, das Füllen
des Kanals mit einem IEF-Puffer und das Verschließen der Öffnungen
im Kanal mit einer Ionen-permeablen,
Protein-permeablen Membran hergestellt werden. Alternativ können die
Kanäle
mit einem Polymer gefüllt
werden, wie Agarose oder einem Polyacrylamidgel, das mit einem IEF- Puffer gemischt ist,
der sich zu einem Gel mit einem bestimmten pH-Bereich verfestigt.
Die Zellen in der Matrix können
auch durch das Erzeugen eines Rinne oder einer Vielzahl von Rinnen,
die sich nicht durch die gegenüberliegende
Seite der Matrix erstreckt bzw. erstrecken, erzeugt werden, z. B. 15, Matrix A oder D. Die Rinnen können an
einer beliebigen Seite der Matrix angebracht werden. Gemäß einer
Ausführungsform
befinden sich die Rinnen auf einer Seite der Matrix. Die Rinnen
können
mit einem IEF-Puffer oder mit einer Vielzahl von IEF-Puffern gefüllt werden.
-
Gemäß einer
Ausführungsform
sind die IEF-Puffer oder die Zellen isoliert, sodass die Biomoleküle im Wesentlichen
aus dem IEF-Puffer oder der Zelle in einen anderen IEF-Puffer oder
eine andere Zelle über
den Laufpuffer wandern, und nicht direkt von dem/der einen zum/zur
anderen. Wenn sich eine Zelle durch eine Seite der Matrix zur gegenüberliegenden
Seite der Matrix erstreckt, kann man sie als einen Kanal bezeichnen.
Die Kanäle
in der Matrix sind typischerweise parallel zueinander angeordnet.
Gemäß einer
Ausführungsform
umfasst die Matrixschicht eine Vielzahl identisch ausgerichteter
IEF/Spur-Einheiten. Gemäß einer
anderen Ausführungsform
kann die Vielzahl der identisch ausgerichteten IEF/Spur-Einheiten
parallel zueinander und/oder tandemartig ausgerichtet sein. Gemäß einer
anderen Ausführungsform
ist die Matrix oder der Chip so konstruiert, dass sie bzw. er eine
Untergruppe von Zellen mit IEF-Puffern
enthält,
die für
die Generierung einer Eichkurve eingesetzt werden können oder
einen Standard für
den Vergleich der Ergebnisse mit denen aus den anderen Zellen enthält, z. B. 15. Gemäß einer anderen Ausführungsform
ist die Matrix oder der Chip ein vorgefertigtes diagnostisches Werkzeug,
das eine ausgewählte
Gruppe von IEF-Puffern mit pH-Werten umfasst, die den pI-Werten
bekannter interessierender Biomoleküle (z. B. einem Biomolekül-Marker für einen
Krankheitszustand) oder einer Reihe von Biomolekülen, die einen Krankheitszustand
anzeigen, entsprechen.
-
Eichkurven
sind für
die Bestimmung der Menge eines Zielbiomoleküls („ZB") in einer Probe nützlich. Eine quantitative Eichkurve
kann durch das Zumischen bekannter Konzentrationen bekannter Biomoleküle oder
Komplexe, die bekannte Biomoleküle
umfassen, und das Bestimmen der Akkumulation des bekannten Biomoleküls oder
Komplexes in Zellen mit dem entsprechenden IEF-Puffer generiert
werden. Vorzugsweise wird, wenn das ZB und/oder Zielerkennungsmolekül („ZEM") kommerziell verfügbar oder
leicht erhältlich
ist, das kommerziell verfügbare
oder leicht erhältliche
ZB als das bekannte Biomolekül
verwendet oder mit dem kommerziell verfügbaren oder leicht erhältlichen
ZEM zur Bildung des Komplexes für
die Eichkurve in Kontakt gebracht. Das bekannte Biomolekül kann markiert
sein oder in einem Komplex vorliegen, der markiert ist. Vorzugsweise
wird die gleiche Markierung im Prozess der Generierung der Eichkurve
und bei der Testung der Probe eingesetzt. Die Konzentration des
bekannten Biomoleküls
oder Komplexes, das bzw. der zum Laufpuffer gegeben wurde, kann gegen
die Höhe
des Signals in der Zelle, in der es bzw. er akkumulierte, grafisch
aufgetragen werden. Das Diagramm kann als Mittel zur Extrapolation
der Konzentration des ZB in einer Probe basierend auf der Höhe des Signals
in der Zelle, in der es akkumulierte, verwendet werden. Siehe z.
B. 29.
-
Nachdem
sich die Komplexe in die einzelnen Zellen verteilt haben, kann der
Komplex einer Analyse in einer zweiten Dimension unterzogen werden,
d. h. einer Analyse außerhalb
der Zelle. Zum Beispiel gehören zu
Analysen in der zweiten Dimension Analyseverfahren wie eine SDS-PAGE,
eine Massenspektrometrie und eine HPLC-Chromatografie.
-
Das
elektrische Feld in der ersten Dimension sollte in der Lage sein,
in den IEF-Puffer einzutreten. Der Winkel zwischen der Richtung
des elektrischen Feldes und der Matrix kann zwischen +90 und -90
Grad liegen, solange das elektrische Feld in den IEF-Puffer in den
Kanälen
eintreten kann. Bei einer Ausführungsform
liegt der Winkel bei +90 Grad. Bei einer anderen Ausführungsform
ist der elektrische Strom nicht reversibel und fließt nur in
einer Richtung quer zu einem System, bei dem der IEF-Puffer und
die Zelle nicht aneinandergrenzen und die Wände, die für das fragliche Biomolekül permeabel
sind, senkrecht zur Richtung des elektrischen Stromes ausgerichtet
sind, wobei die Probe direkt zum Laufpuffer gegeben wird. Bei einer
anderen Ausführungsform
ist das genannte System mit einer Rührvorrichtung, zum Beispiel
einem magnetischen Rührstab, versehen.
Bei noch einer anderen Ausführungsform
ist der Konvektionsstrom, der während
des Experiments im Laufpuffer erzeugt wird, das einzige Mittel,
durch das das System gerührt
wird.
-
Bei
einer Ausführungsform
für das
High-Throughput-Screening von Proben ist es nützlich, wenn die Matrix, die
die Zellen umfasst, eine kleine Chip-artige Struktur ist. Der Chip
kann aus jedem beliebigen Material bestehen, das mikrofabriziert
werden kann, zum Beispiel trocken geätzt, nass geätzt, lasergeätzt oder
bearbeitet, geformt oder geprägt
sein kann, sodass es gewünschte
miniaturisierte Oberflächenstrukturen
aufweist. Der Chip kann ein Polymer, ein Keramikmaterial, ein Glas,
ein Verbundstoff aus diesen, ein Laminat aus diesen oder dergleichen
sein. Der Einsatz von Mikrofabrikationstechniken, wie zum Beispiel,
ohne jedoch auf diese beschränkt
zu sein, eines großflächigen Ätzens, einer
Oberflächenmikrobearbeitung,
einer Dickschichtprozessierung, einer Laserablation, eines Laserätzens, eines
Formens und Prägens,
ermöglicht
in der Praxis ein hohes Ausmaß an
Präzision
bei der Ausrichtung der Komponenten und Strukturen im Mikromaßstab, siehe
z. B. E. W. Becker et al. (1986), Microelectronic Engineering 4:
45-56. Bei einer Ausführungsform
umfasst der Chip eine Vielzahl von Zellen, wobei zwei oder mehr
Zellen unterschiedliche IEF-Puffer
enthalten. Siehe z. B. 11. Bei einer anderen Ausführungsform
sind die pH-Werte der IEF-Puffer der Untergruppe von Zellen nicht die
gleichen wie die pH-Werte der IEF-Puffer der Zellen, in denen die
Komplexe, die das ZB umfassen, akkumulieren.
-
Die
Abmessungen der Matrix können
zum Beispiel bei 1 × 1
cm bis 10 × 10
cm liegen. Gemäß einer Ausführungsform
ist die Matrix 5 × 5
cm oder 4 × 10
cm, in Abhängigkeit
von der Zahl der Spuren, der Länge dieser
Spuren und dem Abstand zwischen ihnen. Gemäß einer Ausführungsform
liegt die Dicke der Matrix bei 1 mm.
-
D. Arrays
-
Ein
Array ist eine Matrix, die zusätzlich
eine zweite Schicht umfasst. Die zweite Schicht hat generell die
Funktion, eine Seite der Spur abzudecken und zu verhindern, dass
erhebliche Mengen des Biomoleküls während des
Schrittes der IEF-Trennung in die Spur geraten, wobei sie es aber
gleichzeitig einem elektrischen Feld erlaubt, die Spur während des
Schrittes in der zweiten Dimension zu durchdringen. Dementsprechend umfasst
die zweite Schicht eine sog. Lane-Screening-Area (LSA), die die
gleiche Länge
und Breite wie die Spur hat oder größer ist, wobei die LSA impermeabel
für ein
Biomolekül
und permeabel für
Ionen ist. Die zweite Schicht kann vollständig aus dem LSA-Material bestehen,
oder sie kann so konstruiert sein, dass sie Abschnitte aus dem LSA-Material
mit den Abmessungen der Spur enthält. Gemäß einer Ausführungsform
ist die LSA nicht leitfähig.
Gemäß einer
anderen Ausführungsform
ist die Spur sandwichartig zwischen der Matrixschicht und der LSA
eingeschlossen.
-
Materialien,
die impermeabel für
Biomoleküle,
aber permeabel für
Ionen sind, sind in diesem Gebiet bekannt, z. B. Cellophan, Polyethersulfon,
Nylon, Celluloseacetat, Polyvinylidenfluorid (PVDF), Perfluorsulfonat-Kationenaustauschmembranen
(z. B. Nafion-Membranen)
und andere perfluorierte Ionenaustauschmembranen.
-
Eine
zweite Schicht kann gegebenenfalls zusätzlich eine Perforation durch
die Ebene der zweiten Schicht aufweisen. Die Perforation kann so
angeordnet sein, dass die Perforation über dem IEF-Puffer oder der
Zelle, die den IEF-Puffer umfasst, angeordnet ist. Die Funktion
der Perforation besteht darin, dem Biomolekül in der Probe während des
Schrittes der IEF-Trennung
den Zutritt zum IEF-Puffer oder zu der Zelle zu ermöglichen.
Siehe z. B. 16a und b. Die zweite Schicht
kann von der Matrix entfernbar sein, permanent an der Matrix befestigt
sein oder überhaupt
nicht mit der Matrix verbunden sein. Beispiele für Arrays kann man in 15B und 16C sehen
und die Kombination aus der „zweiten
Schicht" und der „Matrix" in 17.
-
E. Kammern
-
Eine
Kammer ist ein Behälter,
der einen Laufpuffer enthält.
Siehe z. B. 2. Gemäß einer Ausführungsform
ist die Kammer so konstruiert, dass sie ein kleines Volumen des
Laufpuffers enthält,
d. h. die minimale Menge, die benötigt wird, um einen Kontakt
mit den Zellen und den Elektroden herzustellen, sodass ein elektrisches
Feld in den IEF-Puffer oder die Zelle und die Spur eintreten kann.
Gemäß einer
anderen Ausführungsform
umfasst die Außenseite
der Kammer ferner Anschlüsse,
die es dem elektrischen Strom ermöglichen, durch sie hindurch
in die Kammer zu den Elektroden zu gelangen. Gemäß noch einer anderen Ausführungsform
ist die Kammer ein Einmalartikel.
-
F. Laufpuffer
-
Ein
Laufpuffer ist eine Lösung
in der Kammer, die einen elektrischen Strom tragen kann. Zum Beispiel kann
der Laufpuffer 0,01 M K2SO4 sein.
Der Laufpuffer kann andere Mittel umfassen, zum Beispiel solche,
die für
Aufrechterhaltung der Aktivität
und/oder der Stabilität
des Biomoleküls
nützlich
sind, wie Proteaseinhibitoren oder Detergenzien. Der in der ersten
Dimension eingesetzte Laufpuffer kann gegebenenfalls beim Schritt der
zweiten Dimension durch den gleichen oder einen anderen Puffer ersetzt
werden. Alternativ liegt beim Schritt der zweiten Dimension kein
Laufpuffer vor. Gemäß einer
Ausführungsform
ist der Laufpuffer bezüglich des
pH-Bereichs des IEF-Puffers und des interessierenden Biomoleküls optimiert,
sodass es den Komplexen möglich
ist, in den geeigneten Zellen zu akkumulieren. Ein Laufpuffer kann
auf einen pH-Wert eingestellt sein, der die Beweglichkeit eines
Biomoleküls,
das in einen IEF-Puffer oder eine Zelle eintritt, erhöht oder
erniedrigt.
-
G. Vorrichtungen zur Erzeugung und/oder
Lenkung eines elektrischen Feldes
-
Eine
Vorrichtung zur Lenkung eines elektrischen Feldes durch den IEF-Puffer
oder die Zelle kann z. B. den Einsatz einer Kathodenelektrode und
einer Anodenelektrode und einer Spannungsquelle einschließen. Gemäß einer
Ausführungsform
ist die Vorrichtung in der Lage, ein elektrisches Wechselfeld zu
erzeugen. Die Elektroden können
so an gegenüberliegenden
Seiten des IEF-Puffers oder der Zelle angeordnet sein, dass das
elektrische Feld durch den IEF-Puffer oder die Zelle gelenkt wird.
Gemäß einer
Ausführungsform
sind die Elektroden Drähte.
Gemäß einer
anderen Ausführungsform
sind die Elektroden parallele Gruppen von Drähten oder dünnen Platten. Siehe z. B. 2-6. Die Vorrichtung kann eine Wechselspannung
oder eine Gleichspannung bereitstellen. Wenn sich der IEF-Puffer
oder die Zelle in einem geschlossenen System befindet (z. B. das elektrische
Feld nicht durch eine Seite des IEF-Puffers oder der Zelle eintreten und
durch die gegenüberliegende
Seite des IEF-Puffers oder der Zelle austreten kann), dann ist es
vorteilhaft, dass die Vorrichtung in der Lage ist, ein elektrisches
Feld in den IEF-Puffer oder die Zelle, die den IEF-Puffer enthält, und
aus diesem bzw. dieser wieder hinauszulenken (d. h. ein elektrisches
Wechselfeld). Die Orientierung des Wechselfeldes muss nicht senkrecht
zur Ebene des Arrays oder der vorderen Ebene des IEF-Puffers oder der
Zelle sein. Sie kann zwischen +90 und -90 Grad bezüglich der
Ebene des Arrays liegen, wobei immer eine Feldkomponente parallel
zur Achse des IEF-Puffers oder der Zelle erhalten bleibt.
-
Gemäß einer
Ausführungsform
bestehen die Elektroden aus Platin oder Titan oder sind mit Platin
oder Titan beschichtet. Gemäß einer
Ausführungsform
haben die Elektroden einen Abstand zwischen 0,5 und 10 cm voneinander.
Gemäß einer
anderen Ausführungsform
sind die Elektroden in einem Abstand von 5 cm angeordnet. Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
ist der Abstand zwischen den Elektroden der minimale Abstand, der
es dem Laufpuffer noch erlaubt, quer zu den Zellen zu zirkulieren.
Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
entspricht der Abstand der Elektroden ungefähr der Länge der Matrix oder der Länge der
Zelle.
-
Die
auf den Laufpuffer einwirkende Spannung kann eine Gleichspannung
oder eine Wechselspannung sein. Wenn der IEF-Puffer oder die Zelle
geschlossen ist und die einwirkende Spannung eine Gleichspannung
ist, dann muss ein Weg zur Verfügung
stehen, die Richtung des elektrischen Feldes manuell oder automatisch
so alternieren zu lassen, dass das elektrische Feld in den IEF-Puffer
oder die Zelle und aus diesem bzw. aus dieser hinaus gerichtet ist.
Gemäß einer
Ausführungsform
kann die Richtung des elektrischen Feldes durch das manuelle oder
automatische Umschalten der Polarität der einwirkenden Spannung
oder durch das Rotieren des IEF-Puffers oder der Zelle um 180 Grad
in einem konstanten elektrischen Feld verändert werden. Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform
ist die Spannung eine Wechselspannung.
-
H. Vorrichtungen für die Umwälzung des Puffers
-
Eine
Vorrichtung für
die Umwälzung
des Laufpuffers quer zum IEF-Puffer oder zur Zelle umfasst gleichzeitig
z. B. ein Rührstäbchen, das
in der Kammer vorhanden ist und von einer magnetischen Platte gesteuert
wird, oder andere Vorrichtungen zur Umwälzung von Flüssigkeiten,
die in diesem Gebiet bekannt sind (z. B. Pumpen, Vibratoren, z.
B. Piezo-Vibratoren,
Rührer,
Kippvorrichtungen). Siehe 2. Bei einer
anderen Ausführungsform
kann die Vorrichtung zur Umwälzung
ein Mechanismus zur Bewegung des IEF-Puffers oder der Zelle relativ
zum Laufpuffer sein. Zum Beispiel kann der IEF-Puffer oder die Zelle
im Laufpuffer rotiert werden. Die Aktivität derartiger Vorrichtungen
ist während
des Schrittes der ersten Dimension (des IEF-Schrittes) in den Verfahren
und Systemen nützlich.
Die Zirkulation des Laufpuffers oder der Zellen relativ zum Laufpuffer fördert eine
gute Exposition der interessierenden Biomoleküle gegen ihre jeweiligen IEF-Puffer
oder Zellen. Alternativ können
die Verfahren und Systeme keinerlei derartige Umwälzvorrichtung
aufweisen. Bei einer anderen Ausführungsform wird die Umwälzung ausschließlich durch
die Konvektionsströme
bereitgestellt, die während
der isoelektrischen Fokussierung auf natürliche Weise erzeugt werden.
Gemäß einer
Ausführungsform liegt
die Konvektionsenergie, die für
die Umwälzung
des Biomoleküls
ausreicht, bei 10-10 Joule pro 1 cm3 des Laufpuffers.
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I. Vorrichtungen zur Lenkung eines elektrischen
Feldes
-
Eine
Vorrichtung zur Lenkung eines elektrischen Feldes längs der
Spur und weg vom IEF-Puffer oder der Zelle kann mehrere unterschiedliche
Anordnungen von Komponenten umfassen. Diese Vorrichtung bewirkt
die Bewegung der Biomoleküle
im IEF-Puffer in die Spur hinein und entlang der Spur. Demgemäß sollte die
Richtung des elektrischen Feldes in der zweiten Dimension, die eine
Auftrennung der Spur bewirkt, in erster Linie weg vom IEF-Puffer
und entlang der Spur gerichtet sein. Zum Beispiel kann eine Elektrode
an einem Ende der IEF/Spur-Einheit angeordnet sein (z. B. an der
Spitze des IEF-Puffers) und eine weitere am anderen Ende der IEF/Spur-Einheit
(zum Beispiel am Ende der Spur). Alternativ kann eine Elektrode
am Ende der Spur angeordnet sein, und die andere Elektrode kann
eine sein, die im vorhergehenden Schritt der IEF-Trennung eingesetzt
wurde. Siehe z. B. 28. Die bereitgestellte Spannung
kann eine Gleichspannung sein. Netzgeräte und Elektroden, die einen
Gleichstrom bereitstellen können,
sind im Handel erhältlich
und in diesem Gebiet bekannt.
-
J. Systeme oder Kits
-
Ein
System umfasst mehrere Komponenten, die als ein Kit, das zerlegt
oder zusammengebaut ist, verkauft werden können. Zu Komponenten des Kits
gehören
ein IEF-Puffer,
eine Zelle, eine Matrix oder ein Array und gegebenenfalls eine Vorrichtung
zur Lenkung eines elektrischen Feldes in den IEF-Puffer und die
Zelle hinein und heraus und/oder eine Kammer mit einem Laufpuffer.
Das System schließt
gegebenenfalls auch eine Vorrichtung zur Lenkung eines elektrischen
Feldes entlang einer Spur und weg vom IEF-Puffer oder der Zelle ein.
Das System schließt
gegebenenfalls ferner eine Vorrichtung zur Umwälzung des Laufpuffers quer
zum IEF-Puffer oder zu der Zelle ein. Beispiele für Systeme
sind in 17 und 28 gezeigt.
Gemäß einer
Ausführungsform
ist die Kammer ein Einmalartikel und weist Anschlüsse auf,
die für
eine Anbindung an die Spannungsquelle an der Unterseite oder an
der Seite der Kammer angebracht sind.
-
Ein
System kann ferner eine beliebige der folgenden Komponenten umfassen:
eine Vorrichtung zum Nachweis der Biomoleküle der Probe in einer Zelle
oder Spur, eine Vorrichtung zur Aufnahme der Daten aus der Nachweisvorrichtung
und eine Vorrichtung zur Verarbeitung der aufgenommenen Daten. Gemäß einer Ausführungsform
weist ein Scanning-Mikrodensitometer
das Signal aus der Zelle oder den Zellen oder der Spur oder den
Spuren nach, nimmt es auf und verarbeitet es.
-
Nachweisvorrichtungen
-
Es
kann eine der Vorrichtungen oder es können mehrere der Vorrichtungen,
die zum Nachweis der Biomoleküle
der Probe in der Zelle oder der Spur, zum Empfang der Daten aus
der Nachweisvorrichtung und zur Verarbeitung der empfangenen Daten
erforderlich ist bzw. sind, in einem Computer gebündelt vorliegen.
-
Eine
Nachweisvorrichtung kann so ausgelegt sein, dass sie elektromagnetische
Strahlung, das heißt, ein
Spektrum an Wellenlängen,
eine Vielzahl von Wellenlängen
oder eine Wellenlänge
gleichzeitig oder nacheinander auf eine Spur projiziert. Gemäß einer
Ausführungsform
ist die einstrahlende Lichtquelle monochromatisch. Zum Beispiel
kann die Nachweisvorrichtung ein speziell angefertigtes Fotometer
sein, das schnell und nacheinander die Extinktion eines jeden IEF-Puffers
einer jeden Zelle oder Spur bei einer spezifischen Wellenlänge aufzeichnet,
nachdem ein enges Lichtspektrum auf einen jeden IEF-Puffer, eine
jede Zelle oder Spur projiziert worden ist. Alternativ kann die
Nachweisvorrichtung so konstruiert sein, dass sie jeden IEF-Puffer,
jede Zelle oder Spur gleichzeitig vermisst und/oder bei verschiedenen
Wellenlängen
Messungen vornimmt, die die elektromagnetischen Strahlung betreffen,
die von einem jeden IEF-Puffer, einer jeden Zelle oder Spur emittiert
wird.
-
Zu
geeigneten Nachweisvorrichtungen gehören, ohne jedoch auf diese
beschränkt
zu sein, das bloße Auge,
Spektralfotometer, Instrumente, die Chemilumineszenz nachweisen,
fotometrische/densitometrische Instrumente, elektrochemische oder
radiochemische Instrumente, und zwar in Abhängigkeit davon, ob das Biomolekül markiert
ist, und in Abhängigkeit
vom Typ der Markierung. Die Markierung kann andere Komponenten zur
Erzeugung einer Reaktion erfordern, die ein Signal erzeugt oder
das Signal verstärkt,
das mittels der oben erwähnten
Verfahren nachweisbar ist. Eine detaillierte Diskussion geeigneter
signalerzeugender Systeme findet sich bei Ullman et al.,
US-Patent Nr. 5 185 243 ,
Spalten 11-13. Details
der Techniken zur Anbringung von Markierungen sind in diesem Gebiet
gut bekannt. Siehe z. B. Matthew et al., Anal. Biochem. (1985) 151: 205-209
und Engelhardt et al., Europäische
Patentanmeldung Nr. 0302175.
-
Anforderungen an den Computer
-
Gemäß einer
Ausführungsform
enthält
der Computer ein Modul, das in der Lage ist, die Durchführung der
folgenden Schritte durch den Computer zu bewirken: a) die Aufnahme
experimenteller Daten aus der Spur bzw. den Spuren und b) die Erzeugung
eines Profils, das für
die Biomoleküle
in der Probe und/oder die interessierenden Biomoleküle in der
Probe repräsentativ
ist. Ein derartiges Modul kann für
die schnelle Identifizierung, Sichtung und Auswahl weiterer funktionell
annotierter Arzneimittel-Targets bei Erkrankungen nützlich sein.
Gemäß einer
anderen Ausführungsform
enthält
der Computer ein Modul, das in der Lage ist die Durchführung der
folgenden Schritte durch den Computer zu bewirken: a) die Aufnahme
experimenteller Daten aus der Spur bzw. den Spuren und Erzeugung
eines Profils von Biomolekülen
in der Probe, b) die Aufnahme eines Vergleichsprofils und c) das
Berechnen einer objektiven Maßes
für die Ähnlichkeit
der beiden Profile. Die Vergleichsprofile können Werte umfassen, die in
diesem Gebiet bekannt sind oder Werte, die vom Forscher einprogrammiert
wurden.
-
Vernetzung
-
Der
Computer kann mit einem Netzwerk verbunden sein, das ein Teil einer
Ethernet-Verknüpfung mit anderen
lokalen Computersystemen, entfernten Computersystemen oder Großraum-Kommunikationsnetzwerken
wie dem Internet sein kann. Die Netzwerkanknüpfung ermöglicht es dem Computer, Daten
und Datenverarbeitungsaufgaben mit anderen Computerverknüpfungen
zu teilen. Der Zugriff auf gemeinsame Daten ist besonders für genetische
Analysen oder Proteomanalysen, für
diagnostische Zwecke, Früherkennungszwecke
oder generelle Forschungszwecke nützlich. Zum Beispiel kann der
Computer auf die Erkennung eines bestimmten Profils (z. B. eines
Protein- oder RNA-Expressionsmusters),
das einen bestimmten Krankheitszustand oder eine Anfälligkeit
gegenüber
einem bestimmten Krankheitszustand auf Basis bekannter Informationen
anzeigt, voreingestellt sein. Dann kann eine Probe eines Subjekts
mittels des Systems zur Bestimmung, ob die Biomoleküle in der
Probe das gleiche Profil aufweisen, getestet werden.
-
Handhabung der Probe und des Puffers
-
Weiterhin
kann das System zusätzlich
wenigstens eine, eine Kombination oder alle der folgenden Komponenten
umfassen: einen Probengeber, eine Abfallentsorgung, eine Pufferzuleitung,
einen Färbereagenszugeber,
ein System zum Array-Handling und ein Display. Ein Probengeber kann
so programmiert sein, dass er ein Aliquot einer Probe in die Kammer
gibt. Eine Abfallentsorgung kann so programmiert sein, dass sie Abfallmaterial
(z. B. Laufpuffer nach dessen Verwendung) zu einem beliebigen Zeitpunkt
während
der Analyse entfernt. Eine Pufferzuleitung kann so programmiert
sein, dass sie neuen oder einen anderen Puffer zu einem beliebigen
Zeitpunkt während
der Analyse abgibt. Ein Färbereagenszugeber
kann so programmiert sein, dass er die Biomoleküle für einen vorgewählten Zeitraum
für die
Färbung
abgibt und exponiert. Ein System zum Array-Handling kann so programmiert
sein, dass es die Matrix, den Array oder die Kammer nach Bedarf
während der
Analyse bewegt. Ein Display kann ein Bildschirm oder eine sonstige
Vorrichtung sein, die Informationen bezüglich der Ergebnisse der ein-
oder zweidimensionalen Analyse bereitstellt. Siehe z. B. 27.
-
Automatisierung
-
Gemäß einer
Ausführungsform
ist das System vollständig
oder teilweise automatisiert, sodass eine Probe oder mehrere Proben
mittels der Verfahren analysiert werden kann bzw. können. Zum
Beispiel könnte eine
Probe zu dem System gegeben werden, das so programmiert ist, dass
es alle Schritte der ein- oder zweidimensionalen Analyse durchführt, ein
Bild der Spuren aufnimmt und die Information empfängt, verarbeitet
und bestimmt, ob ein spezifisches Biomolekül oder Muster von Biomolekülen vorliegt.
-
Ein
System kann so konstruiert sein, dass es zusätzliche automatisierte, interagierende
Komponenten aufweist, zum Beispiel Titratoren zur Füllung der
Kanäle
mit pH-Lösungen
oder Gelen (Immobilinen, Ampholytmischungen etc.) und Extraktoren
zur Gewinnung von Biomolekülen
aus den IEF-Puffern, Zellen oder Spuren. Gemäß einer Ausführungsform
ist das System für
ein High-Throughput-Screening von Proben, Verbindungen oder Arzneimitteln
automatisiert.
-
II. Proben, die analysiert oder getrennt
werden sollen
-
A. Biomoleküle, die analysiert oder getrennt
werden sollen
-
Zu
Biomolekülen
gehören
beliebige organische Moleküle,
die in einer biologischen Probe vorhanden sind und die eine Ladung
aufweisen, wie Peptide, Proteine, Oligosaccharide, Lipide, Steroide,
Prostaglandine, Prostacycline und Nucleinsäuren (einschließlich von
DNA und RNA). So, wie er hier verwendet wird, schließt der Begriff „Biomolekül" unmodifizierte,
glykierte, nicht glykierte, phosphorylierte, unphosphorylierte und
auf sonstige Weise modifizierte Biomoleküle ein. Zum Beispiel kann ein
Biomolekül
vor der Trennung in der ersten Dimension markiert werden (zum Beispiel
durch eine Markierung mit 35S-Methionin
oder eine Markierung mit 32P). Gemäß einer
Ausführungsform
sind die Biomoleküle
Proteine, die vom Menschen hergestellt worden sein können oder
natürlich
vorkommen. Ein Protein ist ein Peptid, das eine Länge haben
kann, die aus der Gruppe ausgewählt
ist, die, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, aus weniger als
500 Resten, weniger als 300 Resten, weniger als 200 Resten, weniger
als 100 Resten, weniger als 50 Resten, weniger als 25 Resten und weniger
als 15 Resten besteht.
-
B. Ziel-Biomoleküle und Zielerkennungsmoleküle
-
Ein
Ziel-Biomolekül
(„ZB") ist ein interessierendes
Biomolekül,
das spezifisch von einem Zielerkennungsmolekül („ZEM") erkannt werden kann. Bei einer Ausführungsform
ist das Ziel-Biomolekül ein Marker
für eine
Krankheit oder einen Krankheitszustand. Das Ziel-Biomolekül kann ein
Biomolekül
sein, das bezüglich
der Probe endogen ist, oder das exogen ist, d. h. der Probe oder
dem Laufpuffer zugesetzt wurde. Das interessierende Biomolekül kann so
modifiziert sein, dass es ein ZB ist, das eine Affinität oder größere Affinität für ein ZEM
aufweist. Zum Beispiel kann das interessierende Biomolekül kovalent
modifiziert sein, sodass es zusätzlich
ein Peptid aufweist, das ein Epitop enthält, das spezifisch an ein ZEM,
wie einen Antikörper,
bindet.
-
Ein
ZEM ist ein Molekül,
das spezifisch einen Teil des ZB bindet. Das ZEM kann für die Bereitstellung oder
Verstärkung
eines Signals zum Nachweis und/oder zur Bereitstellung eines Signals,
das sich vom Hintergrund unterscheidet, nützlich sein. Zum Beispiel kann
ein ZEM ein markierter Antikörper
sein, der spezifisch das ZB erkennt, wie ein monovalenter (monoepitopischer)
oder ein polyvalenter (polyepitopischer) polyklonaler Antikörper, ein monoklonaler
Antikörper
oder ein Antikörperfragment
(z. B. Fab, Fv und F(ab')2,
Fab' und dergleichen).
Zusätzlich
können
gegebenenfalls Aggregate, Polymere und Konjugate von Immunglobulinen
oder deren Fragmente eingesetzt werden, solange die Bindungsaffinität für ein bestimmtes
Zielbiomolekül
erhalten bleibt. In dem Falle, in dem das Zielbiomolekül ein Antikörper ist,
können
Antikörper
eingesetzt werden, die spezifisch diesen Antikörper binden. Bei einem anderen
Beispiel kann das ZEM ein Ligand oder ein Rezeptor sein, der an
das ZB bindet, wenn das ZB ein Rezeptor bzw. ein Ligand ist. Bei
noch einem anderen Beispiel kann das ZEM ein einsträngiges Nucleinsäuremolekül sein,
das spezifisch an das ZB bindet oder mit ihm hybridisiert, wenn
das ZB ein Nucleinsäuremolekül ist. Alternativ
kann das ZEM ein Nucleinsäure-bindendes
Protein sein, wie ein Transkriptionsfaktor, ein Spleißfaktor,
ein Histon oder dergleichen, der bzw. das an ein Nucleinsäuremolekül bindet.
Bei noch einem anderen Beispiel kann ein ZEM ein Molekül sein,
das spezifisch an die aktive Stelle eines Enzyms bindet, wenn das
ZB dieses Enzym ist.
-
Dementsprechend
können
das ZB und das ZEM sm-RNA, r-RNA, t-RNA, DNA, DNA-RNA-Duplexe; an Polynucleotide
bindende Agenzien wie, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein,
Restriktionsenzyme, Aktivatoren, Repressoren, Nucleasen, Polymerasen,
Histone, Reparaturenzyme und Chemotherapeutika; Antigene und Antikörper; nicht-immunologische
Paare wie Avidin und Biotin; Rezeptoren und Liganden, einschließlich membrangebundener
Rezeptoren wie G-Protein-Rezeptoren (z. B. muscarinische und adrenerge Rezeptoren,
Prostaglandin- und Dopamin-Rezeptoren, wie der D2-Rezeptor), Tyrosinkinaserezeptoren
(für die Wachstumsfaktoren
IGF, EGF, NGF und FGF), Ionenkanäle
und T-Zell-Rezeptoren sein.
-
C. Markierungen oder Tags für die Biomoleküle
-
Die
Biomoleküle
können
vor dem Schritt der IEF-Trennung oder nach der Trennung in der zweiten
Dimension für
einen Nachweis markiert sein, z. B. mittels Verfahren mithilfe des
bloßen
Auges, mittels spektralfotometrischer Verfahren, mittels Chemilumineszenzverfahren,
fotometrischer/densitometrischer Verfahren, elektrochemischer oder
radiochemischer Verfahren oder mittels einer bildgebenden Darstellung
mithilfe der Oberflächenplasmonresonanz.
Die Markierung kann ein nachweisbares Molekül sein, wie eine Verbindung, eine
Nucleinsäure
oder ein Protein (z. B. ein Antikörper), die bzw. das markiert
ist oder endogen nachweisbar ist und spezifisch das Biomolekül erkennt.
In dem Falle, in dem das Biomolekül vor dem Schritt der IEF-Trennung
markiert wurde, wird sich der pI des Biomoleküls wahrscheinlich aufgrund
des Vorhandenseins der Markierung ändern, und somit werden sich
die für
das Fangen des Komplexes geeigneten pH-Werte der IEF-Puffer oder
der Zellen ändern.
Das Biomolekül
kann mittels Verfahren, die in diesem Gebiet gut bekannt sind, nach der
zweiten Dimension markiert werden, z. B. durch ein Western Blotting.
-
Es
sind verschiedene unspezifische Farbstoffe für Biomoleküle in diesem Gebiet bekannt
und für
die Markierung von Biomolekülen
nützlich,
z. B. Coomassie-Blue, eine Silberfärbung, der Hoechst-Farbstoff
und 4',6'-Diamidino-2-phenylindol
(DAPI). Die jeweils verwendeten Farbstoffe und Markierungen hängen vom
interessierenden Biomolekül
ab.
-
Zu
Markierungen, die für
den Nachweis von Biomolekülen
nützlich
sind, können
Fluorophore, Substrate, Elektronentransferagenzien, Coenzyme, Verstärker, Enzyme,
Substanzen, die mit Enzymprodukten reagieren, Katalysatoren, Aktivatoren,
Cofaktoren, Inhibitoren, Scavenger, Metallionen und eine spezifisch
bindende Substanz, die für
die Bindung der signalerzeugenden Substanzen erforderlich ist, gehören. Beispielen für Markierungen
sind Fluorophore wie Fluorescein, Cyaninfarbstoffe, Cumarine, Phycoerythrin,
Phycobiliproteine, Dansylchlorid, Isothiocyanat, Rhodamin-Verbindungen,
Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthalaldehyd und Fluorescamin und
Texasrot gehören.
Zu geeigneten Markierungen gehören,
und zwar zum Zwecke der Veranschaulichung und nicht als Einschränkung, Enzyme
wie die alkalische Phosphatase, die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase
(„G6PDH") und die Meerrettichperoxidase;
Promotoren; Farbstoffe; elektrolumineszierende Markierungen wie
Rutheniumchelate; chemilumineszierende Verbindungen wie Isoluminol; Sensitizer;
Coenzyme; Enzymsubstrate; radioaktive Markierungen wie
125I,
131I,
14C,
3H,
57Co und
75Se. Geeignete Enzyme und Coenzyme werden
im
US-Patent Nr. 4 275 149 an
Litman et al., Spalten 19-28, und im
US-Patent
Nr. 4 318 980 an Bogulaski, Spalten 10-14, offenbart. Geeignete
fluoreszierende und chemilumineszierende Substanzen werden bei Litman
et al. in den Spalten 30 und 31 offenbart.
-
Ein
gegen ein interessierendes Biomolekül generierter Antikörper kann
mit einem Fluorophor markiert sein. Das Fluorophor kann so ausgewählt werden,
dass es bei einer spezifischen Wellenlänge einen hohen Extinktionskoeffizienten
oder eine hohe Fluoreszenz-Ausbeute
zeigt.
-
Es
kann ein markierungsfreier Nachweis (z. B. eine Oberflächenplasmonresonanz)
zum Nachweis einzelner Biomoleküle
oder Komplexe eingesetzt werden. Zum Beispiel können die Zellen oder Matrizes
auf einem festen Träger
in der Kammer sitzen, der auf eine Weise biotinyliert wurde, dass
Zellen mit unterschiedlichen pH-Bereichen auf einem oder mehreren
Biotin-Molekül(en)
sitzen. Ziel-Biomoleküle
oder Zielerkennungsmoleküle
können
so modifiziert werden, dass sie vom Streptavidin gebunden werden,
und dann in die Zellen oder in den Laufpuffer eingebracht werden.
Komplexe mit dem passenden pI diffundieren in eine Zelle oder mehrere
Zellen mit dem passenden pH und bilden einen tertiären Komplex
mit den vorhandenen Biotinmolekülen.
Eine derartige Bindung kann mittels eines Oberflächenplasmonresonanz-Sensors
unterhalb des festen Trägers
nachgewiesen werden, wobei das Resonanzsignal mittels der besagten
Nachweiseinrichtung nachgewiesen und verarbeitet wird.
-
Ein
Komplex, der ein ZB und ein ZEM umfasst, wobei die Komponenten des
Komplexes kovalent oder nicht-kovalent aneinander gebunden sind,
kann lediglich ein ZB und ein ZEM umfassen, oder er kann zusätzlich weitere
Moleküle
umfassen, wie andere Biomoleküle,
Metallionen, Nachweisgruppen oder Markierungen. Der letztendliche
pI-Wert des Komplexes bestimmt, ob der Komplex in einer bestimmten
Zelle oder in keiner der Zellen der Apparatur akkumuliert. Wenn
in einer einzigen Probe mehrere interessierende Komplexe vorliegen,
die bestimmt werden sollen, ist es äußerst erwünscht, dass die Komplexe nicht
die gleichen pI-Werte aufweisen
oder die gleiche Markierung haben.
-
D. Proben
-
„Probe" bezieht sich auf
eine beliebige feste oder flüssige
Probe, die erhalten wird, ausgeschieden wird oder sezerniert wird
von einem beliebigen lebenden Organismus, einschließlich einzelliger
Mikroorganismen (wie von Bakterien und Hefen) und vielzelliger Organismen
(wie von Pflanzen und Tieren, zum Beispiel eines Wirbeltiers oder
eines Säugetiers,
und insbesondere eines gesunden oder anscheinend gesunden Menschen
oder eines menschlichen Patienten, der unter einer Erkrankung oder
Krankheit leidet, die diagnostiziert oder untersucht werden soll).
Eine biologische Probe kann eine biologische Flüssigkeit sein, die von einem
beliebigen Ort stammt (z. B. Blut, Plasma, Serum, Urin, Galle, Synovialflüssigkeit,
Zerebrospinalflüssigkeit, Fruchtwasser,
Samen, Zervixschleim, Sputum, Speichel, Gingivalflüssigkeit,
Kammerwasser oder Glaskörperflüssigkeit
oder eine beliebige Absonderung des Körpers), ein Transsudat, ein
Exsudat (z. B. eine Flüssigkeit, die
aus einem Abszess oder einer anderen infizierten oder entzündeten Stelle
erhalten wurde), oder eine Flüssigkeit,
die aus einem Gelenk erhalten wurde (z. B. einem normalen Gelenk
oder einem Gelenk, das unter einer Erkrankung wie rheumatoider Arthritis,
Osteoarthritis, Gicht oder einer septischen Arthritis leidet).
-
Alternativ
kann eine Probe von jedem beliebigen Organ oder Gewebe (einschließlich einer
Biopsie- oder eine Autopsieprobe) erhalten werden, oder sie kann
Zellen umfassen (seien es primäre
Zellen oder kultivierte Zellen) oder Medium, das von einer beliebigen
Zelle, einem beliebigen Gewebe oder Organ konditioniert wurde. Wenn
es gewünscht
ist, kann die biologische Probe einer vorläufigen Bearbeitung, einschließlich einer
Vortrennung, unterzogen werden. Zum Beispiel können Zellen oder Gewebe extrahiert
und einer subzellulären
Fraktionierung unterzogen werden, damit Biomoleküle in verschiedenen subzellulären Fraktionen
separat analysiert werden können,
zum Beispiel Proteine oder Arzneimittel, die in unterschiedlichen
Teilen der Zelle vorkommen. Siehe Deutscher (Hrsg.), Methods in
Enzymology, Bd. 182, S. 147-238 (1990).
-
III. Anwendungsverfahren
-
A. Analyse
-
Die
Matrix, Arrays, Systeme und Verfahren sind für die schnelle Bestimmung des
pI eines Biomoleküls nützlich,
indem sie es dem Forscher ermöglichen,
unterschiedliche breite oder enge pH-Wert-Bereiche zu testen. Bei
einer Ausführungsform
kann ein interessierendes Biomolekül in einer Probe direkt in
eine Vielzahl von Zellen mit unterschiedlichen pH-Bereichen gegeben
und manuell oder automatisch mittels der zuvor erwähnten Nachweisvorrichtungen
und -systeme analysiert werden. Bei einer anderen Ausführungsform
kann ein interessierendes Biomolekül in einer Probe direkt in
den Laufpuffer gegeben werden, wobei die IEF-Puffer/Zellen oder
Spuren manuell oder automatisch mittels der zuvor erwähnten Nachweiseinrichtungen
und -systeme analysiert werden.
-
Ein
Biomolekül,
das sortiert, abgetrennt, charakterisiert, quantifiziert und/oder
mit anderen Molekülen verglichen
worden ist, kann mittels Verfahren und kommerzieller Systeme weiter
untersucht werden, die in diesem Fachgebiet bekannt sind (z. B.
eine Silberfärbung,
Immunfärbung,
Hochdruckflüssigchromatografie (HPLC),
Affinitätschromatografie,
Kapillarelektrophorese, Polyacrylamidelektrophorese, SDS-PAGE, Zentrifugation,
Gradientengelelektrophorese, Techniken einer isoelektrischen Fokussierung,
Ausschneiden des proteinhaltigen Bereiches gefolgt von anderen Analyseverfahren,
die in diesem Fachgebiet bekannt sind, z. B. einer Massenspektrometrie
(PE Biosystems, PerSeptive-DE-STR-MALDI-TOF-MS und Bruker-Esquire-Ion-Trap-MS).
Im Gegensatz zur herkömmlichen
IEF-Fokussierung
gefolgt von einer MALDI-TOF-Spektrometrie ermöglicht das System den Nachweis
kleiner Mengen an Biomolekülen.
Zum Beispiel ist das System in der Lage, bei Einsatz einer Silberfärbung Femtomol-Mengen
an Protein nachzuweisen, hohe Attomol-Mengen an Protein oder 1-200 pg Protein
im Standardbereich von 10-200 kDa.
-
Das
kann erreicht werden, indem eine zweidimensionale Analyse im kleinen
Maßstab
unter Verwendung einer Matrix von 5 cm × 5 cm oder kleiner, die Einheiten
aus IEF-Puffern/Spuren
umfasst, durchgeführt wird,
die aufgetrennten Biomoleküle
mit Biomolekülen
verglichen werden, die auf einem herkömmlichen, größeren IEF-Fokussierungsgel
aufgetrennt wurden, und die Analyse im kleineren Maßstab zur
Bestimmung der Lage des entsprechenden Bereiches auf dem herkömmlichen
IEF-Fokussierungsgel, der für
die weitere Analyse mit einer anderen Technik (z. B. Massenspektrometrie)
ausgeschnitten werden soll, eingesetzt wird. Eine spezielle Halterung
mit einem Vergrößerungsglas
und einer speziell angefertigten Schneidevorrichtung kann das Ausschneiden
der Stelle, die das interessierende Biomolekül enthält, erleichtern. Die Menge
des Proteins in dem ausgeschnittenen Stück kann zum Beispiel über eine
Eichskala für
die optische Dichte bestimmt werden, die durch das Färben bekannter
Mengen des mittels der Verfahren aufgetrennten Biomoleküls erstellt wird.
-
Somit
erweitert das System den Bereich der mittels Massenspektrometrie
nachweisbaren Biomoleküle und
ermöglicht
die Analyse von Proteinen, die dazu tendieren, in der Zelle in sehr
geringen Mengen exprimiert zu werden. Demgemäß kann ein Protein im Bereich
von Subpicogrammmengen nachgewiesen und mittels Massenspektrometrie
sichtbar gemacht werden. Das System stellt ein genaues und reproduzierbares
Verfahren zur Ermittlung des pI-Wertes und der Masse eines Biomoleküls bereit.
-
Wenn
das Protein in der Probe aus dem Blut oder aus einer Gewebeprobe
stammt, können
krankheitsspezifische Proteine in einer oder zwei Dimension(en)
aufgetrennt werden, und diese Proteine in den Spuren können mittels
in diesem Gebiet bekannter Verfahren bestimmt werden (z. B. Silberfärbung, Immunfärbung, Hochdruckflüssigchromatografie
(HPLC), Affinitätschromatografie,
Kapillarelektrophorese, Polyacrylamidelektrophorese, SDS-PAGE, Zentrifugation,
Gradientengelelektrophorese, Techniken der isoelektrischen Fokussierung,
Ausschneiden des proteinhaltigen Bereichs gefolgt von anderen in
diesem Gebiet bekannten Analyseverfahren, z. B. einer Massenspektrometrie
etc.).
-
Es
kann ein Biomolekül
oder es können
mehrere Biomoleküle
entsprechend seinem bzw. ihres pI fokussiert, sortiert, abgetrennt,
gereinigt, charakterisiert, quantifiziert und/oder mit anderen Biomolekülen verglichen
werden. Die Konzentration der Biomoleküle kann in einer Probe zunehmen
oder abnehmen, oder sie können
als Reaktion auf ein Ereignis physikalisch modifiziert werden. Zum
Beispiel können
die Verfahren und Systeme quantitativ und/oder qualitativ eine Veränderung
eines Biomoleküls
als Reaktion auf eine Erkrankung, eine Behandlung mit einem Arzneimittel,
den Lebenszyklus oder einen anderen Stimulus verfolgen. Zum Beispiel
kann die Modifikation eines Proteins mit Phosphat oder ein Proteinspiegel
vor und nach der Behandlung des Proteins oder der Umgebung um das
Protein herum mit einem Stimulus verfolgt werden. Das System und die
Verfahren können
dazu eingesetzt werden, die Akkumulation des Proteins in einer Zelle
zu beobachten, deren pH-Wert sich nach der Behandlung mit dem Stimulus
von dem vorherigen pH-Wert unterscheidet.
-
Die
anormale Expression von Proteinen in der Probe aus einem Tier oder
aus einer Pflanze im Vergleich zu einem nicht erkrankten Tier oder
einer nicht erkrankten Pflanze kann das charakteristische Kennzeichen
einer spezifischen Erkrankung sein. Die relative Häufigkeit
von Biomolekülen
kann für
eine Diagnose oder Früherkennung
einer Erkrankung (z. B. Krebs) mit einem normalen Muster verglichen
werden. Die relative Häufigkeit
eines Biomoleküls
in Zellen kann durch die Zugabe einer bekannten Menge eines spezifischen
Proteins in die Probe vor der Trennung und den Vergleich der Messungen
der optischen Dichte mit der optischen Dichte des zugefügten Proteins
normalisiert werden. Bei einer alternativen Ausführungsform kann das Auftreten
oder das Verschwinden oder die Veränderung der physikalischen
Eigenschaften eines Biomoleküls
im getesteten Tier oder in der getesteten Pflanze im Vergleich zu
einem normalen Tier oder einer normalen Pflanze zur Diagnose oder
Früherkennung
einer Erkrankung eingesetzt werden. Bei noch einer anderen Ausführungsform
kann die Modifikation eines Biomoleküls im getesteten Tier oder
in der getesteten Pflanze im Vergleich zu einem normalen Tier oder
einer normalen Pflanze zur Diagnose oder Früherkennung einer Erkrankung
herangezogen werden.
-
Ein
Krankheitszustand ist eine beliebige Erkrankung, die über eine
Veränderung
eines Biomoleküls
in einer Probe (z. B. des Hämoglobins
bei Diabetikern) oder über
das Fehlen oder das Neuvorhandensein eines Biomoleküls (z. B.
Proteinen aus bakteriellen Infektionen) nachgewiesen werden kann.
Zum Beispiel können die
folgenden genetischen Erkrankungen über eine Veränderung
der DNA- oder Proteinspiegel diagnostiziert werden: die Huntington-Krankheit, Prostatakrebs,
das Fragile-X-Syndrom vom Typ A, die Myotone Dystrophie vom Typ
I, Kennedys Krankheit, die Machado-Joseph-Krankheit, die Dentato-Rubro-Pallido-Luysische
Atrophie und die Spinobulbäre
Muskelatrophie. Die Krankheit oder die Erkrankung kann auch mit
einem Gen assoziiert sein, wie Genen, die für BRCA1, BRCA2 oder APC codieren,
einem Gen, das für
Dystrophin, Beta-Globin, den Faktor IX, den Faktor VIIc, die Ornithin-d-Aminotransferase,
die Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase oder den Cystic
Fibrosis Transmembrane Receptor (CFTR) oder ein Protoonkogen codiert.
Beispiele für
Proteine, die bestimmt werden können,
sind die Prostata-spezifischen Antigene (PSA) beim Prostatakrebs
und Herzenzyme bei Herzerkrankungen. Alternativ kann eine Gruppe
von Proteinen bestimmt werden. Bei noch einer anderen Ausführungsform
können
die Konzentrationsprofile spezifischer mRNAs zur Ermittlung eines
potenziellen Krankheitszustandes analysiert werden.
-
Bei
noch einer anderen alternativen Ausführungsform kann die Probe aus
einer Zellkultur oder einem zellfreien In-vitro-Test erhalten werden.
Zum Beispiel können
Proben aus Tests, die die Verwendung von Zellfraktionen umfassen,
der ein- oder zweidimensionalen Analyse unterzogen werden, bevor
und nachdem die Zellfraktion von einem Arzneimittel oder einem anderen
Stimulus beeinflusst worden ist. Bei einer anderen Ausführungsform
können
Extrakte aus einem sich entwickelnden Organismus oder aus dem Gewebe
eines Subjekts analysiert werden, um die Veränderungen zu verstehen, die
im Organismus oder im Tier während
seines Lebenszyklus ablaufen. Zum Beispiel können Verbindungen, die Inhibitoren,
Verstärker
oder Auslöser
eines biologischen Ereignisses sind, identifiziert werden. In allen
diesen Tests können
das ZB und das ZEM zu dem Extrakt gegeben werden, nachdem ein Stimulus
auf den Extrakt, auf das Subjekt oder auf den Organismus, der/das
getestet werden soll, eingewirkt hat. Bei einer Ausführungsform
stellt man sich ein Verfahren für das
High-Throughput-Screening
von Kandidatenmolekülen,
einschließlich
von Proteinen und Verbindungen, die zu einer biologischen Reaktion
führen,
vor, das den Schritt des Nachweises eines ZB oder von ZBs in einer Probe
mittels eines Systems oder Verfahrens umfasst.
-
Gemäß einer
Ausführungsform
kann das ZEM zu der Probe gegeben werden, bevor oder nachdem die
Probe, die das ZB umfasst, zu dem Laufpuffer gegeben worden ist.
Gemäß einer
Ausführungsform
wird das ZEM zu der Probe, die das ZB umfasst, gegeben, bevor die
Probe zum Laufpuffer gegeben wird. In allen Fällen ist es äußerst erwünscht, das
ZB und das ZEM unter Bedingungen gegeneinander zu exponieren, die ihre
Bindung aneinander nicht hemmen oder aufheben.
-
Der
Begriff Proteom bezieht sich auf alle von einem Genom exprimierten
Proteine. Proteomics umfasst die Identifizierung und Untersuchung
von Proteinen im Körper
und die Bestimmung ihrer Rolle bei physiologischen und pathophysiologischen
Funktionen. Die Verfahren, Matrizes, Arrays und Systeme ermöglichen schnellere,
empfindlichere Techniken zur Untersuchung des Proteoms. Mit dieser
Erfindung können
detailliertere und genauere funktionelle Proteomkarten der zellulären Aktivität entwickelt
werden, was zu einem besseren Verständnis von Krankheiten und der
Entdeckung neuer Arzneimittel führt.
-
Der
Begriff „Verfolgen", wie er hier verwendet
wird, soll sowohl kontinuierliche Messungen als auch Endpunktsbestimmungen
einschließen.
Bei einigen Ausführungsformen
werden die Biomoleküle
der Proben kontinuierlich gemessen. Bei anderen Ausführungsformen
werden die Biomoleküle
analysiert, bevor und nachdem eine Zelle oder ein Subjekt stimuliert
oder auf sonstige Weise gestört
worden ist (z. B. durch die Gabe eines Arzneimittels oder eine Veränderung
der Umgebung um die Zelle oder um das Subjekt herum). Bei noch anderen
Ausführungsformen
werden die Biomoleküle
in einer Kontrollgruppe von Proben gemessen, die nicht gestört wurden,
und die zellulären
Bestandteile verschiedener experimenteller Gruppen werden gemessen und
mit denen der Kontrollgruppe verglichen. Es ist Fachleuten auf diesem
Gebiet klar, dass andere experimentelle Designs ebenfalls für das Verfahren
zum Nachweis der Veränderung
von Biomolekülen
als Reaktion auf Störungen
geeignet sind.
-
B. Trennungen
-
Das
System stellt ein Verfahren zur Auseinandersortierung von Biomolekülen in einer
Probe bereit. Gemäß einer
Ausführungsform
dieses Verfahrens wird eine Probe, die die Biomoleküle umfasst,
zu einem System gegeben und quer zu einem IEF-Puffer oder einer
Zelle zirkuliert, einem in den IEF-Puffer oder die Zelle hinein
und heraus gerichteten reversiblen elektrischen Wechselfeld exponiert
und dann gegebenenfalls in einer zweiten Dimension aufgetrennt,
zum Beispiel durch das Exponieren der Biomoleküle gegen ein elektrisches Feld,
das entlang der Spur und weg vom IEF-Puffer oder von der Zelle gerichtet
ist.
-
Das
System stellt ein Verfahren zur Charakterisierung eines Biomoleküls in einer
Probe bereit. Gemäß einer
Ausführungsform
kann das interessierende Biomolekül oder können die interessierenden Biomoleküle getrennt,
isoliert und/oder in einer Dimension analysiert werden, indem die
Probe zum Laufpuffer in einer IEF-Apparatur gegeben wird, das elektrische
Feld erzeugt wird, der Laufpuffer zirkuliert wird und die Richtung des
elektrischen Feldes in regelmäßigen Abständen umgekehrt
wird. Alternativ könnte
die Probe direkt zur Zelle, zum Kanal oder zu der Spur gegeben werden.
Gemäß einer
anderen Ausführungsform
des Verfahrens wird eine Probe, die das Biomolekül umfasst, zu einem System
gegeben und quer zu einem IEF-Puffer oder einer Zelle zirkuliert,
einem in den IEF-Puffer oder die Zelle hinein und heraus gerichteten
elektrischen Wechselfeld exponiert, in einer zweiten Dimension aufgetrennt,
zum Beispiel durch das Exponieren der Biomoleküle gegen ein elektrisches Feld,
das entlang der Spur und weg vom IEF-Puffer oder der Zelle gerichtet
ist, und anschließend
werden die Position und die Menge des Biomoleküls in der Spur bestimmt. Die
Identifizierung der Position oder der Menge des Biomoleküls in der
Spur kann für
die Bestimmung des pI des Biomoleküls, des Molekulargewichts des
Biomoleküls
und/oder seines Modifizierungszustandes nützlich sein. Eine Veränderung
der Position eines Biomoleküls
in einer Testprobe im Vergleich zum gleichen Biomolekül in einer
Kontrollprobe kann eine Modifikation des Biomoleküls anzeigen
(z. B. eine Phosphorylierung etc.). Eine Veränderung der Menge eines Biomoleküls in einer
Testprobe im Vergleich zum gleichen Biomolekül in einer Kontrollprobe kann ein
Ansteigen oder eine Abnahme der Menge des getesteten Biomoleküls aufgrund
zum Beispiel einer Veränderung
der Expression des Biomoleküls
oder der Stabilität
des Biomoleküls
anzeigen.
-
Das
System stellt ein Verfahren zur Quantifizierung der Menge eines
Biomoleküls
in einer Probe unter Verwendung einer Matrix, eines Arrays oder
eines Systems bereit. Die Menge eines Biomoleküls in einer Spur kann mit Instrumenten
bestimmt werden, die in diesem Gebiet bekannt sind und oben diskutiert
wurden. Alternativ kann das Biomolekül in der Spur von einem anderen
Molekül
gebunden werden, das mit Instrumenten, die in diesem Gebiet bekannt
sind, nachgewiesen werden kann. Die Menge des Biomoleküls kann
aus einer Standardkurve mit bekannten Mengen des gleichen Biomoleküls oder ähnlicher
Typen von Biomolekülen
(BSA für
die Proteinbestimmung) extrapoliert werden. Das Biomolekül in der
Spur kann auch für
die Analyse und Quantifizierung aus der Spur ausgeschnitten werden.
-
Gemäß einer
Ausführungsform
dieses Verfahrens wird ein Biomolekül gemessen. Gemäß einer
anderen Ausführungsform
dieses Verfahrens wird eine Vielzahl von Biomolekülen mithilfe
eines Computers gemessen. Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
werden die Daten, die dem interessierenden Biomolekül oder der Vielzahl
interessierender Biomoleküle
in der Testprobe entsprechen, mit den Daten verglichen, die dem
interessierenden Biomolekül
oder der Vielzahl interessierender Biomoleküle aus einem Subjekt, das die
Krankheit nicht hat oder nicht für
diese Erkrankung prädisponiert
ist (d. h. aus einem normalen Subjekt), verglichen. Es ist erwünscht, dass
der Computer imstande ist, die Ähnlichkeiten
und die Unterschiede zwischen den beiden Datensets zu vergleichen
und zu berechnen. Die Parameter des Computers können so eingestellt sein, dass eine
Schwelle erreicht wird, oberhalb der ein Ergebnis als positiv oder
negativ erachtet wird.
-
Gemäß einer
anderen Ausführungsform
kann ein System zur Abtrennung von Biomolekülen und/oder Ionen in einer
Probe von einem interessierenden Biomolekül durch die Zugabe der das
interessierende Biomolekül
umfassenden Probe zu einer Zelle im System verwendet werden. In
diesem Falle hätte
der IEF-Puffer in der Zelle einen pH-Wert oder pH-Werte, der bzw. die
den pI des interessierenden Biomoleküls einschließt bzw.
einschließen.
Somit würden,
wenn das reversible elektrische Feld und die Umwälzvorrichtung im System eingesetzt
werden, andere Biomoleküle
oder Ionen aus der Zelle hinauswandern, aber das interessierende
Biomolekül
würde in
der Zelle verbleiben. Das interessierende Biomolekül kann aus
dem IEF-Puffer oder aus der Zelle gewonnen werden. Alternativ kann
eine Probe in eine Zelle gegeben werden und ein elektrischer Strom durch
den IEF-Puffer oder die Zelle in nur einer Richtung senkrecht zur
Ebene der für
das Biomolekül
permeablen Wände
des Puffers oder der Zelle gelenkt werden.
-
In
der gesamten vorliegenden Beschreibung soll das Wort „umfassen" oder sollen Varianten
wie „umfasst" oder „umfassend" so verstanden werden,
dass es bzw. sie den Einschluss einer genannten ganzen Zahl oder
einer Gruppe ganzer Zahlen impliziert bzw. implizieren, aber nicht
den Ausschluss einer beliebigen anderen ganzen Zahl oder einer beliebigen
Gruppe ganzer Zahlen.
-
Es
sind zwar verschiedene Ausführungsformen
vorgestellt worden, aber es ist offensichtlich, dass die grundlegende
Konstruktion zur Bereitstellung anderer Ausführungsformen abgeändert werden
kann, die die Zusammensetzungen und Verfahren einsetzen. Somit dürfte klar
sein, dass der Umfang der Erfindung durch die Ausführungsformen
der Erfindungen, die hier vorgestellt werden, und durch die Beschreibung
abgesteckt wird und nicht durch die spezifischen Beispiele, die
im Folgenden vorgestellt werden.
-
BEISPIEL 1
-
Molekulargewichtsstandards
-
Eine
Rinne mit den Maßen
0,1 × 0,1 × 3,0 mm
wurde in ein dünnes
Plättchen
aus para-Methoxymethylamphetamin
(PMMA) eingraviert. Die Rinne wurde mit einem 10%-igen SDS-Polyacrylamid-Gel
gefüllt.
An dem einen Ende der Spur wurde ein Fleck mit IEF-Puffer mit einem
immobilisierten pH von 8,80 (willkürlich gewählt) aufgebracht. Es wurden
100 ng des Proteinleiter-Markers RPN 800 von Amersham Pharmacia
Biotech (Molekulargewichte 10 bis 250 kDa) in den Fleck injiziert.
Eine Metallelektrode wurde mit dem Gel mit dem immobilisierten pH-Gradienten
verbunden, und eine weitere Metallelektrode wurde mit dem Ende der
Spur, das am weitesten entfernt war, verbunden.
-
Das
Plättchen
wurde in einen Puffer aus 50 mM Tris-Glycin (pH 8,3) mit 1% SDS
getaucht. Es wurde eine Spannung von 36 Volt (Feld ~100 V/cm) 5
Minuten an die Elektroden angelegt. Als Nächstes wurde die Spur silbergefärbt und
fixiert. 18 ist ein optischer Scan der
getrennten Banden, wie sie unter einem Mikroskop aussehen.
-
BEISPIEL 2
-
Zweidimensionale Analyse der Proteine
des Blutplasmas bei pH 8,65 ± 0,05
-
Ein
Fleck von 100 μm
Durchmesser aus einem pH-Gel mit einem pH-Wert von 8,65 ± 0,05
(mit einer Pufferlösung
gemischtes Polyacrylamidgel) wurde auf einen Polymer-Wafer, wie aus PMMA,
von 1 cm × 1
cm × 0,3
mm aufgebracht. Der Wafer wurde in eine kleine Kammer gegeben, die
ein Rührstäbchen enthielt
und mit 1 M Natriumsulfat-Puffer als Laufpuffer gefüllt war.
100 ng einer Blutplasmaprobe wurden in die Kammer gegeben (1 cm × 1 cm × 0,2 cm),
die 200 μl
Laufpuffer enthielt. Es wurde eine Spannung von 50 V senkrecht zur
Ebene des Wafers für
5 Minuten angelegt, wobei alle 0,5 Minuten die Richtung des Stromes
um 180 Grad gedreht wurde. Als Nächstes
wurde der Wafer aus dem Laufpuffer entnommen und in destilliertem
Wasser gespült.
Der Gelfleck wurde vom Wafer entfernt und an ein Ende einer Spur
(10% SDS-PAGE) auf einem Plättchen,
wie es im Beispiel 1 beschrieben wurde, gebracht.
-
Das
Plättchen
wurde in einen Puffer aus 50 mM Tris-Glycin (pH 8,3) mit 1% SDS
getaucht. Es wurde eine Spannung von 36 Volt (Feld ~100 V/cm) 5
Minuten an die Elektroden angelegt. Als nächstes wurde die Spur silbergefärbt und
fixiert. 19 ist ein optischer Scan der
Proteine in der Plasmaprobe, die einen isoelektrischen Punkt von
ungefähr
8,65 ± 0,05
haben und durch die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese in der Spur
getrennt wurden. Die Spur sieht aus, wie sie unter einem Mikroskop
erscheinen würde.
-
BEISPIEL 3
-
Zweidimensionale Analyse von Blutplasma
bei pH 7,50 bis 8,50
-
1) Die IEF-Puffer
-
Es
wurden fünfzig
IEF-Puffer mit pH-Werten von 7,50 bis 8,50 in Schritten von 0,02
pH-Einheiten hergestellt.
-
a. IEF-Puffer mit pH 7,50-7,68, 10% Polyacrylamid
-
25
ml 0,1 M N-2-Hydroxyethylpiperidin-N-3-propansulfonsäure (EPPS)
(25,232 g/l) wurden mit 5 Gramm Polyacrylamid (BioRad) und dem unten
angegebenen Volumen an 0,1 M NaOH gemischt. Das Volumen der Mischung
wurde mit Wasser von 25°C
auf 50 ml gebracht.
pH
= 7,50 | 0,1
M NaOH 5,9 ml |
pH
= 7,52 | 0,1
M NaOH 6,1 ml |
pH
= 7,54 | 0,1
M NaOH 6,3 ml |
pH
= 7,56 | 0,1
M NaOH 6,7 ml |
pH
= 7,58 | 0,1
M NaOH 6,9 ml |
pH
= 7,60 | 0,1
M NaOH 7,0 ml |
pH
= 7,62 | 0,1
M NaOH 7,2 ml |
pH
= 7,64 | 0,1
M NaOH 7,3 ml |
pH
= 7,66 | 0,1
M NaOH 7,4 ml |
pH
= 7,68 | 0,1
M NaOH 7,5 ml |
-
b. IEF-Puffer mit pH 7,70-7,88, 7% Polyacrylamid
-
25
ml 0,1 M N,N-Bis(2-hydroxymethyl)glycin (BICIN) (16,317 g/l) wurden
mit 3,5 Gramm Polyacrylamidgel (BioRad) und dem unten angegebenen
Volumen an 0,1 M NaOH gemischt. Das Volumen der Mischung wurde mit
Wasser von 25°C
auf 50 ml gebracht.
pH
= 7,70 | 0,1
M NaOH 6,5 ml |
pH
= 7,72 | 0,1
M NaOH 6,6 ml |
pH
= 7,74 | 0,1
M NaOH 6,7 ml |
pH
= 7,76 | 0,1
M NaOH 7,9 ml |
pH
= 7,78 | 0,1
M NaOH 7,2 ml |
pH
= 7,80 | 0,1
M NaOH 7,5 ml |
pH
= 7,82 | 0,1
M NaOH 7,7 ml |
pH
= 7,84 | 0,1
M NaOH 8,0 ml |
pH
= 7,86 | 0,1
M NaOH 8,2 ml |
pH
= 7,88 | 0,1
M NaOH 8,6 ml |
-
c. IEF-Puffer mit pH 7,90-8,26, 10% Polyacrylamid
-
50
ml 0,1 M Trisaminomethan (Tris) (12,114 g/l) wurden mit 7,0 Gramm
Polyacrylamidgel (BioRad) und dem unten angegebenen Volumen an 0,1
M HCl gemischt. Das Volumen der Mischung wurde mit Wasser auf 100
ml gebracht.
pH
= 7,90 | 0,1
M HCl 34,5 ml |
pH
= 7,92 | 0,1
M HCl 34,3 ml |
pH
= 7,94 | 0,1
M HCl 34,1 ml |
pH
= 7,96 | 0,1
M HCl 34,0 ml |
pH
= 7,98 | 0,1
M HCl 33,6 ml |
pH
= 8,00 | 0,1
M HCl 33,5 ml |
pH
= 8,02 | 0,1
M HCl 33,2 ml |
pH
= 8,04 | 0,1
M HCl 33,0 ml |
pH
= 8,06 | 0,1
M HCl 32,9 ml |
pH
= 8,08 | 0,1
M HCl 32,7 ml |
pH
= 8,10 | 0,1
M HCl 32,5 ml |
pH
= 8,12 | 0,1
M HCl 32,2 ml |
pH
= 8,14 | 0,1
M HCl 32,0 ml |
pH
= 8,16 | 0,1
M HCl 31,8 ml |
pH
= 8,18 | 0,1
M HCl 31,7 ml |
pH
= 8,20 | 0,1
M HCl 31,5 ml |
pH
= 8,22 | 0,1
M HCl 31,3 ml |
pH
= 8,24 | 0,1
M HCl 31,2 ml |
pH
= 8,26 | 0,1
M HCl 31,1 ml |
pH
= 8,26 | 0,1
M HCl 30,8 ml |
-
d. IEF-Puffer mit pH 8,30-8,50, 8% Polyacrylamid
-
100
ml 0,04 M 5,5-Diethylbarbitural-Na (Veronal-Na) wurden mit 8,9 Gramm
Polyacrylamidgel (BioRad) und dem unten angegebenen Volumen an 0,2
M HCl gemischt.
pH
= 8,30 | 0,2
M HCl 13,4 ml |
pH
= 8,32 | 0,2
M HCl 13,1 ml |
pH
= 8,34 | 0,2
M HCl 12,9 ml |
pH
= 8,36 | 0,2
M HCl 12,7 ml |
pH
= 8,38 | 0,2
M HCl 12,5 ml |
pH
= 8,40 | 0,2
M HCl 12,1 ml |
pH
= 8,42 | 0,2
M HCl 11,7 ml |
pH
= 8,44 | 0,2
M HCl 11,2 ml |
pH
= 8,46 | 0,2
M HCl 11,0 ml |
pH
= 8,50 | 0,2
M HCl 10,74 ml |
-
Die
IEF-Puffer wurden einzeln mit Ammoniumpersulfat gemischt und in
parallelen Linien auf einen dünnen
Lucit-Chip aufgebracht, wobei jede Linie eine Breite und Dicke von
100 μm und
eine Länge
von 1 cm und einen anderen pH hatte. Die Abmessungen des Chips,
auf dem die IEF-Puffer aufgetragen wurden, lagen bei 1,2 cm × 1,2 cm.
-
2) Der Laufpuffer
-
Fünf ml einer
Lösung
mit 7 M Harnstoff, 2,2 M Thioharnstoff 1,1% (Gew./Vol.) Tetradecanoylamidopropyldimethylammoniopropansulfonat
(ASB14), 10% (Gew./Vol.) Dimethylacetamid (DMAc), 0,55 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
in entionisiertem und destilliertem Wasser (ddH2O) wurden
bei 30°C
auf einer rotierenden Plattform 30 Minuten gemischt, bis sich alles
gelöst
hatte. Es wurden bei Bedarf 5 ml ddH2O zum
Auflösen
zugegeben. Als Nächstes
wurden 0,4 g Amberlit zugegeben, und die Lösung wurde 10 Minuten bei 32°C rotiert.
Die Lösung
wurde dann durch einen Spritzenfilter von 0,45 μm geleitet, ohne dass dabei
ein Schaum gebildet wurde. Als Nächstes
wurden die folgenden Bestandteile in Wasser zugegeben (Endkonzentrationen):
2% (Gew./Vol.) Zitronensäure-Na-Citrat-Puffer
(pH 4,0), 2 mM Tri(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid (TCEP), 2
mM Acrylamid, 1% Glycerin. Endvolumen: 10 ml. Die Endkonzentrationen
einiger Komponenten des Laufpuffers sahen folgendermaßen aus:
7,7 M Harnstoff, 2,2 M Thioharnstoff, 1,1% ASB14, 11% DMAc, 0,55
mM EDTA. Der pH des Laufpuffers wurde mit Salzsäure auf 4,0 eingestellt.
-
3) Die Trennung in der ersten Dimension:
Schritt der isoelektrischen Fokussierung
-
Zur
Durchführung
der Trennung in der ersten Dimension (IEF) wurde der Chip mit den
oben beschriebenen aufgetragenen IEF-Puffern in eine Kammer zwischen
zwei Elektroden, die einen Abstand von 1 cm hatten, gegeben. Die
Kammer hatte ein Volumen von 2 ml. Bei diesem Schritt war sie jedoch
nur mit einer solchen Menge an Laufpuffer gefüllt, dass ein Ende des Lucit-Chips
bis zu einer Tiefe von 0,2 mm im Laufpuffer eingetaucht war. Als
Ergebnis davon war ein kleiner Bereich an den Enden der einzelnen
Spuren, aber nicht die gesamte Fläche der Spuren, im Laufpuffer
untergetaucht. Es wurde ein Mikrogramm einer humanen Plasmaproteinmischung
zum Laufpuffer gegeben. Es wurde ein elektrisches Feld an den Chip
angelegt. Das Feld wurde in Form einer Rechteckfunktion von +80
V bis -80 V mit einer Frequenz von 1 Hz generiert. Während der
10 Minuten wurde ein Rührstäbchen zur
Umwälzung
der Plasmaproteine um die Kammer herum und in Richtung der IEF-Puffer
eingesetzt.
-
4) Die Trennung in der zweiten Dimension:
SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese
-
Nach
der Durchführung
der Trennung in der ersten Dimension wurde der Chip in der Kammer
zwischen zwei Elektroden, die einen Abstand von 1,3 cm hatten, neu
orientiert und im gleichen Laufpuffer so untergetaucht, dass ein
zwischen den Elektroden generiertes elektrisches Feld parallel zu
den Spuren und weg von dem Bereich der Spuren, wo die Proteine im
IEF-Schritt akkumuliert waren, in Richtung der gegenüberliegenden
Enden der Spuren verlief. Eine 3%-ige SDS-Lösung wurde zum Laufpuffer gegeben,
sodass eine Endkonzentration von 2% SDS im Laufpuffer erhalten wurde.
Unmittelbar nach der Zugabe des SDS wurde ungefähr 5 Minuten lang das elektrische
Feld mit 100 V generiert.
-
Nach
der Trennung in der zweiten Dimension wurde der Chip in eine Silbernitritlösung getaucht
und für
eine schnelle Silberfärbung
gegen UV-Licht exponiert. Nach der Silberfärbung wurde der Chip mit einem kommerziellen
Büroscanner
(UMAX ASTRA 2200) gescannt. Das gescannte Bild wurde digitalisiert
und 10-fach vergrößert (7A). 7B ist
ein optischer Scan eines mittels eines herkömmlichen Verfahrens der isoelektrischen
Fokussierung erhaltenen, silbergefärbten Gels von humanem Plasma
mit einem pI von 7,50-8,50 (aus der Swiss Data Base). Die Positionen
vieler der Proteine in 21A und 21B sind gleich. Die 21A veranschaulicht,
dass die Verwendung der Matrizes, Arrays, Systeme und Verfahren
viel bessere Ergebnisse als herkömmliche
Verfahren liefert. Die Auflösung
und die Empfindlichkeit der zweidimensionalen IEF-SDS-Analyse sind
stark verbessert.
-
BEISPIEL 4
-
Zweidimensionale Analyse von Blutplasma
bei pH 5,50 bis 6,00
-
1) Die IEF-Puffer
-
Es
wurden fünfundzwanzig
IEF-Puffer mit pH-Werten von 5,50 bis 6,00 in Stufen von 0,02 pH-Einheiten
hergestellt.
-
a. IEF-Puffer mit pH 5,50-5,72, 7% Polyacrylamid
-
25
ml 0,1 M 2-(N-Morpholin)ethanolsulfonsäure (MES) wurden mit 3,5 Gramm
Polyacrylamidgel (BioRad) und dem unten angegebenen Volumen an 0,1
M NaOH gemischt. Das Volumen der Mischung wurde mit Wasser auf 50
ml gebracht.
pH
= 5,50 | 4,4
ml 0,1 M NaOH |
pH
= 5,52 | 4,8
ml 0,1 M NaOH |
pH
= 5,54 | 5,1
ml 0,1 M NaOH |
pH
= 5,56 | 5,3
ml 0,1 M NaOH |
pH
= 5,58 | 5,5
ml 0,1 M NaOH |
pH
= 5,60 | 5,7
ml 0,1 M NaOH |
pH
= 5,62 | 5,9
ml 0,1 M NaOH |
pH
= 5,64 | 6,0
ml 0,1 M NaOH |
pH
= 5,66 | 6,4
ml 0,1 M NaOH |
pH
= 5,68 | 6,5
ml 0,1 M NaOH |
pH
= 5,70 | 6,7
ml 0,1 M NaOH |
pH
= 5,72 | 6,8
ml 0,1 M NaOH |
-
b. IEF-Puffer mit pH 5,74-5,98, 9% Polyacrylamid
-
25
ml 0,1 M Tris(hydroxymethyl)aminomethanmaleat (Tris-Maleat) wurden
mit 9 Gramm Polyacrylamid (BioRad) und dem unten angegebenen Volumen
an 0,2 M NaOH gemischt. Das Volumen der Mischung wurde mit Wasser
auf 100 ml gebracht.
pH
= 5,74 | 7,8
ml 0,2 M NaOH |
pH
= 5,76 | 7,9
ml 0,2 M NaOH |
pH
= 5,78 | 8,1
ml 0,2 M NaOH |
pH
= 5,80 | 8,2
ml 0,2 M NaOH |
pH
= 5,82 | 8,4
ml 0,2 M NaOH |
pH
= 5,84 | 8,8
ml 0,2 M NaOH |
pH
= 5,86 | 9,3
ml 0,2 M NaOH |
pH
= 5,88 | 9,8
ml 0,2 M NaOH |
pH
= 5,90 | 10,5
ml 0,2 M NaOH |
pH
= 5,92 | 11,6
ml 0,2 M NaOH |
pH
= 5,94 | 12,0
ml 0,2 M NaOH |
pH
= 5,96 | 12,5
ml 0,2 M NaOH |
pH
= 5,98 | 12,97
ml 0,2 M NaOH |
-
Die
IEF-Puffer wurden einzeln mit Ammoniumpersulfat gemischt und in
parallelen Linien auf einem dünnen
Lucit-Chip aufgebracht, wobei jede Linie eine Breite und Dicke von
100 μm und
eine Länge
von 1 cm und einen anderen pH hatte. Die Abmessungen des Chips,
auf dem die IEF-Puffer aufgetragen wurden, lagen bei 1,2 cm × 1,2 cm.
-
2) Der Laufpuffer
-
Der
Laufpuffer war der gleiche wie im Beispiel 3.
-
3) Die Trennung in der ersten Dimension:
Schritt der isoelektrischen Fokussierung
-
Zur
Durchführung
der Trennung in der ersten Dimension (IEF) wurde der Chip mit den
oben beschriebenen aufgetragenen IEF-Puffern in eine Kammer zwischen
zwei Elektroden, die einen Abstand von 1 cm hatten, gegeben. Die
Kammer hatte ein Volumen von 2 ml. Bei diesem Schritt war sie jedoch
nur mit einer solchen Menge an Laufpuffer gefüllt, dass ein Ende des Lucit-Chips
bis zu einer Tiefe von 0,2 mm im Laufpuffer eingetaucht war. Als
Ergebnis davon war ein kleiner Bereich an den Enden der einzelnen
Spuren, aber nicht die gesamte Fläche der Spuren, im Laufpuffer
untergetaucht. Es wurde ein Mikrogramm einer humanen Plasmaproteinmischung
zum Laufpuffer gegeben. Es wurde ein elektrisches Feld an den Chip angelegt.
Das Feld wurde in Form einer Rechteckfunktion von +80 V bis -80
V mit einer Frequenz von 1 Hz generiert. Während der 10 Minuten wurde
ein Rührstäbchen zur
Umwälzung
der Plasmaproteine um die Kammer herum und in Richtung der IEF-Puffer
eingesetzt.
-
4) Die Trennung in der zweiten Dimension:
SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese
-
Nach
der Durchführung
der Trennung in der ersten Dimension wurde der Chip in der Kammer
zwischen zwei Elektroden, die einen Abstand von 1,3 cm hatten, neu
orientiert und im gleichen Laufpuffer so untergetaucht, dass ein
zwischen den Elektroden generiertes elektrisches Feld parallel zu
den Spuren und weg von dem Bereich der Spuren, wo die Proteine im
IEF-Schritt akkumuliert waren, in Richtung der gegenüberliegenden
Enden der Spuren verlief. Eine 3%-ige SDS-Lösung wurde zum Laufpuffer gegeben,
sodass eine Endkonzentration von 2% SDS im Laufpuffer erhalten wurde.
Unmittelbar nach der Zugabe des SDS wurde ungefähr 5 Minuten lang das elektrische
Feld mit 100 V generiert.
-
Nach
der Trennung in der zweiten Dimension wurde der Chip in eine Silbernitritlösung getaucht
und für
eine schnelle Silberfärbung
gegen UV-Licht exponiert. Nach der Silberfärbung wurde der Chip mit einem kommerziellen
Büroscanner
(UMAX ASTRA 2200) gescannt. Das gescannte Bild wurde digitalisiert
und 10-fach vergrößert (22B). 22A ist
ein optischer Scan eines mittels eines herkömmlichen Verfahrens der isoelektrischen
Fokussierung erhaltenen, silbergefärbten Gels von humanem Plasma
mit einem pI von 5,50-6,00 (aus der Swiss Data Base).
-
Die
Positionen vieler der Proteine in 22A und 22B sind gleich. Die 22B veranschaulicht, dass
die Verwendung der Matrizes, Arrays, Systeme und Verfahren viel
bessere Ergebnisse als herkömmliche Verfahren
liefert. Die Auflösung
und die Empfindlichkeit der zweidimensionalen IEF-SDS-Analyse sind
stark verbessert.
-
BEISPIEL 5
-
Zweidimensionale Analyse unter Verwendung
eines Arrays
-
Es
wurde ein Array, der eine IEF-Einheit/Spur enthielt, konstruiert
und in einer zweidimensionalen Trennung eingesetzt.
-
1) Der Array
-
Ein
10%-iges Polyacrylamidgel mit 2% SDS wurde als schmale Spur auf
einem 1 mm dicken Acrylglasplättchen
aufgetragen. Die Abmessungen der Spur lagen bei 10 mm Länge, 0,1
mm Breite und 50 Mikrometer Dicke. Die Spur wurde dann mit einer
100 Mikrometer dicken Cellophanschicht bedeckt, die eine kreisrunde
Perforation von 200 Mikrometer Durchmesser aufwies. Die Cellophanschicht
wurde so mit der Spur ausgerichtet, dass die kreisrunde Perforation
an einem Ende der Spur zu liegen kam.
-
Es
wurde ein IEF-Puffer durch das Mischen von Polyacrylamidgel, Puffer
von pH 7,00 und Ammoniumpersulfat unter Bildung eines 7%-igen Polyacrylamidgels
hergestellt. Der Puffer von pH 7,00 wurde durch das Mischen von
50 ml N-Ethylmorpholin-HCl (Sigma) mit 8 ml 1 M HCl und 42 ml Wasser
hergestellt. Ein Tropfen des IEF-Puffers wurde in die Perforation
gegeben, und dann ließ man
in fest werden.
-
2) Die Trennung in der ersten Dimension:
Isoelektrische Fokussierung
-
Der
wie oben beschrieben hergestellte Array wurde in eine Kammer gegeben,
die Laufpuffer (pH 6,9), ein Rührstäbchen und
Elektroden enthielt. Der Laufpuffer bestand aus mit HCl gemischtem
1 μM K2SO4. Es wurde eine
Probe, die 1 Mikrogramm humane Plasmaproteine umfasste, zu dem Laufpuffer
gegeben. Es wurde eine Spannung in Form einer Rechteckfunktion von
+30 V bis -30 V und einer Frequenz von 1 Hz über einen Zeitraum von 8 Minuten
generiert, während
dessen der Laufpuffer zirkuliert wurde.
-
3) Die Trennung in der zweiten Dimension:
SDS-PAGE
-
Für die Trennung
in der zweiten Dimension wurde eine Gleichspannung von 30 V 5 Minuten
entlang der Spur angelegt.
-
Nach
der Trennung in der zweiten Dimension wurde der Array zur Färbung der
Spur in eine Silbernitratlösung
getaucht. Die Spur wurde unter Bestrahlung mit UV-Licht drei Minuten
silbergefärbt.
-
23 zeigt
einen vergrößerten,
optischen Scan des silbergefärbten
Plättchens.
Die dunklen Bereiche sind gefärbte
humane Plasmaproteine mit pI-Werten von ungefähr 7,0.
-
BEISPIEL 6
-
Zweidimensionale Analyse unter Verwendung
von drei Elektroden
-
Es
wurde ein Array wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt.
-
1) Die Trennung in der ersten Dimension:
Isoelektrische Fokussierung
-
Der
Array wurde in eine Kammer gegeben, die Laufpuffer (pH 6,9), ein
Rührstäbchen und
drei Elektroden enthielt. Der Laufpuffer bestand aus mit HCl gemischtem
1 μM K2SO4. Es wurde eine
Probe, die 1 Mikrogramm humane Plasmaproteine umfasste, zu dem Laufpuffer
gegeben. Mittels zweier Elektroden, die parallel zur Ebene des Arrays
angeordnet waren, wurde eine Spannung in Form einer Rechteckfunktion
von +30 V bis -30 V und einer Frequenz von 1 Hz 8 Minuten generiert,
während
der der Laufpuffer zirkuliert wurde.
-
2) Die Trennung in der zweiten Dimension:
SDS-PAGE
-
Für die Trennung
in der zweiten Dimension wurde eine Gleichspannung von 30 V 5 Minuten
entlang der Spur angelegt. Das wurde erreicht, indem eine der Elektroden
im IEF-Schritt eingesetzten
Elektroden von der Stromversorgung getrennt wurde, wieder an dem
Ende der Spur befestigt wurde, das am weitesten vom IEF-Puffer entfernt
war, und das elektrische Feld aktiviert wurde etc., 28.
In diesem Fall ist, obwohl eine kleine, unerwünschte elektrische Kraft, die
nicht parallel zur Spur gerichtet ist, vorliegt, eine signifikant
größere elektrische
Kraft entlang der Spur in Richtung weg vom IEF-Puffer angelegt,
die eine signifikante und effiziente Auftrennung der Proteine in
der Spur ermöglicht.
-
Nach
der Trennung in der zweiten Dimension wurde der Array zur Färbung der
Spur in eine Silbernitratlösung
getaucht. Die Spur wurde unter Bestrahlung mit UV-Licht drei Minuten
silbergefärbt.
-
24 zeigt
einen vergrößerten,
optischen Scan des silbergefärbten
Plättchens.
Die dunklen Bereiche sind gefärbte
humane Plasmaproteine mit pI-Werten von ungefähr 7,0.
-
BEISPIEL 7
-
Auftrennung der Komponenten der Proteinmischung
unter Verwendung einer Acrylglasmatrix
-
Es
wurden fünfundzwanzig
Löcher
mit einem Durchmesser von 1 mm und einer Tiefe von 2 mm in die Oberfläche eines
rechteckigen Plättchens
aus Kunststoff (Acrylglas) gebohrt und mit einem 2%-igen Agarosegel
gefüllt.
Die Löcher
(hier im Folgenden „Kanäle" genannt) wurden
in Art eines Gitternetzes in einem Abstand von ungefähr 3 mm
voneinander angeordnet. Eine Seite eines jeden Kanals wurde mit
einer für
Proteinionen durchlässigen
Membran verschlossen, die aus einer im Handel erhältlichen
Nylonmembran (ICN, Irvine, Kalifornien) hergestellt worden war.
-
Es
wurden Puffer für
die isoelektrische Fokussierung mit pH-Werten, die den isoelektrischen
Punkten (pI) von Cytochrom c, Desoxyhämoglobin, Hämoglobin α
2β
2,
C-Phycocyanin, Linsenlektin und Ferritin (BioRad) entsprachen, hergestellt.
Die Puffer für
die Kanäle
(hier im Folgenden „IEF-Puffer") wurden durch das
Mischen von entweder Glycin, HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-ethansulfonsäure), Tris(hydroxymethyl)aminomethan
(THMAM), Zitronensäure,
BICIN (N,N-Bis(2-hydroxymethylglycin oder β,β-Dimethylglutarsäure (DMGA)
mit Wasser und das Titrieren eines jeden IEF-Puffers auf einen anderen
pH mit Natriumhydroxid, Salzsäure
oder Na
2HPO
4 hergestellt.
Siehe Tabelle 1 unten. Tabelle 1. IEF-Puffer und entsprechende
Proteine
Puffer-Nr. | IEF-Puffer,
Konzentration
(in H2O) | Protein | pI
des Proteins | Farbe
des Proteins im Puffer |
1 | 50
mM Glycin,
14 mM NaOH | Cytochrom
c | 9,28 ± 0,02 | rot |
2 | 50
mM HEPES,
12 mM NaOH | Desoxyhämoglobin | 7,07 ± 0,02 | braunrot |
3 | 50
mM THMAM,
44,6 mM HCl | Hämoglobin α+ 2β+ 2 | 7,2 ± 0,04 | rot |
4 | 52
mM Zitronensäure,
96
mM Na2HPO4 | C-Phycocyanin | 4,65 ± 0,02 | blau |
5 | 50
mM BICIN,
18 mM NaOH | Linsenlektin | 8,2 ± 0,07 | farblos |
6 | 50
mM DMGA,
40 mM NaOH | Ferritin | 4,6 ± 0,05 | rot |
-
Jede
senkrechte Reihe der Kanäle
in der Matrix wurde mit 3 μl
eines IEF-Puffer-Typs aus der Tabelle 1 gefüllt. Die gefüllten Kanäle wurden
mit einer für
Proteinionen durchlässigen
Membran (der gleichen, wie oben beschrieben) verschlossen.
-
Die
die Kanäle
und die IEF-Puffer umfassende Matrix wurde zwischen zwei Platinelektroden
in einer Kammer mit den Innenmaßen
50 mm Breite, 100 mm Höhe
und 50 mm Länge
gegeben. Die beiden Elektroden hatten ungefähr die gleichen Abmessungen
wie die Matrix und wurden parallel zueinander in einem Abstand von
ungefähr
5 cm angeordnet. Die Kammer umfasste ferner 50 ml eines Laufpuffers
aus 0,01 M K2SO4,
sodass die Matrix und die Elektroden im Laufpuffer eingetaucht waren.
Ein Rührstäbchen war
in der Kammer vorhanden, um die Umwälzung des Laufpuffers quer
zu den Kanälen
zu gewährleisten.
Die Kammer wurde auf einen Magnetrührer gesetzt.
-
Es
wurde ein Mikrogramm von jedem der folgenden Proteine zu dem Laufpuffer
in der Kammer gegeben: Cytochrom c, Desoxyhämoglobin, Hämoglobin α+ 2β+ 2, C-Phycocyanin,
Linsenlektin und Ferritin (BioRad). Während die Proteine in der Kammer
bei 25°C
gerührt
wurden, wurde eine Gleichspannung von 100 V (E = 20 V/cm) für 2 Minuten
an die Elektroden angelegt. Danach wurde die Richtung des elektrischen
Feldes für
weitere 2 Minuten umgekehrt. Dieser Prozess wurde fünfmal wiederholt.
-
Die
Sortierung der einzelnen Proteine wurde durch das Beobachten der
Akkumulation der Proteine in den vertikalen Reihen (Säulen) der
Kanäle
verfolgt. Generell war die Auftrennung der Proteine nach 10 Minuten
abgeschlossen.
-
BEISPIEL 8
-
Eine
Matrix mit 25 Kanälen
wurde wie im Beispiel 7 beschrieben hergestellt, außer dass
jede der fünf vertikalen
Kanalreihen mit dem Folgenden gefüllt wurde: Puffer Nr. 6, Puffer
Nr. 4 und Puffer Nr. 3 aus Tabelle 1. Siehe 9, von links
nach rechts. Die Matrix wurde dann in eine Kammer mit Laufpuffer,
wie sie im Beispiel 7 beschrieben wurde, gegeben. Ein Mikrogramm
Ferritin, Phycocyanin (erste Bande des IEF-Standards von BioRad,
Kat.-Nr. 161-0310),
Phycocyanin (zweite Bande des IEF-Standards von BioRad, Kat.-Nr.
161-0310) und Hämoglobin α+ 2β+ 2 wurden zu dem
Laufpuffer gegeben. Während
die Proteine in der Kammer bei 25°C gerührt wurden,
wurde eine Gleichspannung von 100 V (E = 20 V/cm) für 2 Minuten
an die Elektroden angelegt. Danach wurde die Richtung des elektrischen
Feldes für
weitere 2 Minuten umgekehrt. Dieser Prozess wurde fünfmal wiederholt.
-
Die
Sortierung der einzelnen Proteine wurde durch das Beobachten der
Akkumulation des Ferritins in der ersten vertikalen Reihe der Kanäle, des
Phycocyanins (erste Bande) in der zweiten vertikalen Reihe der Kanäle, des
Phycocyanins (zweite Bande) in der dritten vertikalen Reihe der
Kanäle
und des Hämoglobins α+ 2β+ 2 in der fünften vertikalen
Reihe der Kanäle
verfolgt. Siehe 9. Die Negativkontrolle, d.
h. die vierte vertikale Reihe der Kanäle, zeigte keine Akkumulation
irgendeines der Proteine. Weiter wurde eine geringe oder keine Akkumulation
von Proteinen in Kanälen
beobachtet, die IEF-Puffer mit pH-Werten enthielten, die nicht den
isoelektrischen Punkten der Proteine entsprachen. Generell war die
Auftrennung der Proteine nach 10 Minuten abgeschlossen.
-
BEISPIEL 9
-
Verfahren zur Diagnostizierung von Diabetes
-
Ein
charakteristisches Kennzeichen für
die Diagnose von Diabetes ist ein Anstieg der Menge an glykiertem
Hämoglobin
im Blut des untersuchten Patienten. Die Menge des glykierten Hämoglobins
im Blut kann als das prozentuale Verhältnis des glykierten Hämoglobins
zum Gesamthämoglobin
ausgedrückt
werden. Dementsprechend sollten die Konzentrationen des glykierten
Hämoglobins
(HbA1c) und des nicht-glykierten Hämoglobins (HbA1) für die Diagnostizierung
von Diabetes gemessen werden.
-
Mittels
herkömmlicher
IEF-Gelelektrophorese wurde bestimmt, dass die pI-Werte von glykiertem
und nicht-glykiertem Hämoglobin
bei pH 6,95 bzw. pH 7,22 liegen. Dementsprechend wurde ein diagnostischer Chip
mit zwei pH-Kompartimenten, d. h. von pH 6,95 und pH 7,22, hergestellt.
-
Der
Chip wurde durch das Bohren von zwei Löchern von 2 mm Durchmesser
und 1 mm Tiefe in die Oberseite eines rechteckigen Plättchens
aus Kunststoff (Acrylglas) und das Füllen der Löcher mit einem 3%-igen Polyacrylamidgel
hergestellt. Die Löcher
(hier im Folgenden „Kanäle") wurden in einem
Abstand von ungefähr
3 mm voneinander angeordnet. Eine Seite eines jeden Kanals wurde
mit einer für
Proteinionen durchlässigen
Membran verschlossen, die aus einer im Handel erhältlichen
Nylonmembran (ICN, Irvine, Kalifornien) hergestellt worden war.
-
Ein
Puffer für
die isoelektrische Fokussierung mit einem pH-Wert von 6,95 wurde
durch das Mischen von 22,4 ml 0,1 M NaOH mit 50 ml 0,1 M KH2PO4 und die Zugabe
von H2O bis zu einem Gesamtvolumen von 100
ml hergestellt. Ein Puffer für
die isoelektrische Fokussierung mit einem pH-Wert von pH 7,22 wurde
durch das Mischen von 36 ml of 0,2 M Na2HPO4 mit 14 ml 0,2 M NaH2PO4 und die Zugabe von H2O
bis zu einem Gesamtvolumen von 100 ml hergestellt. Die IEF-Puffer
wurden mit Acrylamid und Persulfat gemischt. Die Mischungen wurden
in separate Kanäle
gegeben und in diesen polymerisiert. Die gefüllten Kanäle wurden mit einer für Proteinionen
durchlässigen
Membran (der gleichen wie der oben beschriebenen) verschlossen.
-
Der
Chip wurde in eine Trennkammer zwischen zwei Platinelektroden gegeben,
wie es in der 2 gezeigt ist. Die Innenmaße der Trennkammer
lagen bei 50 mm Breite, 100 mm Höhe
und 50 mm Länge.
Die Elektroden hatten ungefähr
die gleichen Abmessungen wie die Matrix und wurden parallel zueinander
in einem Abstand von ungefähr
5 cm voneinander angeordnet. Die Kammer umfasste ferner 10 ml Laufpuffer
aus 10%-igem HEPES-Puffer (pH 7,44), sodass die Matrix und die Elektroden
im Laufpuffer eingetaucht waren. Ein Rührstäbchen war in der Kammer vorhanden,
um die Umwälzung
des Laufpuffers quer zu den Kanälen
zu gewährleisten.
Die Kammer wurde auf einen Magnetrührer gesetzt. Die Elektroden
wurden an eine Stromversorgung, die die Polarität umkehren konnte, angeschlossen.
-
Glykiertes
Hämoglobin
wurde von Abbot [N1A86-10] gekauft. Nicht-glykiertes Hämoglobin,
H-3883 und 9008-02-0, wurde von Sigma für die Verwendung zur Erstellung
von Eichkurven gekauft. Vor dem Herstellen der Mischungen aus beiden
für eine
Eichkurve wurden die Extinktionskoeffizienten von glykiertem und nicht-glykiertem
Hämoglobin
bei verschiedenen Konzentrationen gemessen, um zu bestätigen, dass
sie in dem für
die Eichkurve eingesetzten Bereich konstant waren. Siehe z. B. Tabelle
1 unten und
13. Der Extinktionskoeffizient
war für
beide über
zwei Größenordnungen
der Konzentration konstant. Die Messung erfolgte mittels des im
Handel erhältlichen
Spektralfotometers LKB 2202 von Pharmacia.
C
(mol/l) | Extinktion
(willkürliche
Einheiten |
1 × 10-6 | 0,015 |
3 × 10-6 | 0,044 |
4 × 10-6 | 0,063 |
5 × 10-6 | 0,077 |
6 × 10-6 | 0,092 |
7 × 10-6 | 0,107 |
8 × 10-6 | 0,121 |
9 × 10-6 | 0,138 |
1 × 10-5 | 0,151 |
2 × 10-5 | 0,317 |
3 × 10-5 | 0,456 |
4 × 10-5 | 0,611 |
5 × 10-5 | 0,748 |
6 × 10-5 | 0,901 |
7 × 10-5 | 1,06 |
8 × 10-5 | 1,196 |
9 × 10-5 | 1,377 |
1 × 10-4 | 1,497 |
-
Für die Erstellung
der Eichkurve wurden sechs mehrzellige Chips mit jeweils zwei Zellen – eine Zelle mit
pH 6,95 und eine mit pH 7,22 – gegen
Mischungen mit unterschiedlichen Verhältnissen von im Handel erhältlichem
Hämoglobin
und glykiertem Hämoglobin
exponiert. Zum Beispiel wurden Mischungen von glykiertem Hb und
nicht-glykiertem Hb in einem konstanten Volumen HEPES-NaOH (pH 7,5)
resuspendiert. Siehe Tabelle 2. Für jede Zelle wurde die Extinktion
bei 610 nm bestimmt. Die prozentuale Extinktion wurde durch das
Teilen des Extinktionswertes für
das glykierte Hämoglobin
durch die Summe der Extinktionswerte für das glykierte Hämoglobin
und das Hämoglobin
berechnet. Die prozentuale Konzentration an glykiertem Hämoglobin
für jede
Mischung (x-Achse) wurde durch das Teilen der bekannten molaren
Konzentration des glykierten Hämoglobins
in jeder Mischung durch die Summe der bekannten molaren Gesamtkonzentration
an glykiertem Hämoglobin
und nicht-glykiertem Hämoglobin
in jeder Mischung berechnet. Eine wurde dann eine Linie, die die
Korrelation der prozentualen Extinktion mit der prozentualen Konzentration
des glykierten Hämoglobins darstellt,
anhand der berechneten Daten gezogen. Das „x" gibt an, wo die aus den Extinktionswerten
für die Probe
bei pH 6,95 und pH 7,22 berechnete prozentuale Extinktion auf der
Eichkurve liegt. Der prozentuale Anteil des glykierten Hämoglobins
am Gesamthämoglobin
in der Probe wurde aus der Eichkurve extrapoliert. Siehe Tabelle
2. Tabelle 2. Eichung mit verschiedenen Konzentrationen
von HbA1c und HbA1
Konz.
C1 HbA1c (mol/l) | Extinktion
(willkürliche
Einheiten) | Konz.
C2 HbA1 (mol/l) | Extinktion
(willkürliche
Einheiten) | C1/(C1
+ C2) (%) | A1/(A1
+ A2) (%) |
1 × 10-6 | 0,0157 | 1 × 10-4 | 1,495 | 0,99 | 1,03 |
2 × 10-6 | 0,037 | 7 × 10-5 | 1,090 | 2,77 | 3,28 |
4 × 10-6 | 0,661 | 1 × 10-4 | 1,5 | 3,8 | 4,22 |
5 × 10-6 | 0,070 | 1 × 10-4 | 1,461 | 4,76 | 4,57 |
7 × 10-6 | 0,111 | 9 × 10-5 | 1,333 | 7,2 | 7,69 |
9 × 10-6 | 0,141 | 1 × 10-4 | 1,421 | 8,25 | 9,02 |
-
Von
jeder Mischung wurde eine Probe von 10 μl in eine Kammer gegeben, die
einen Chip, wie er oben beschrieben wurde, enthielt, und 10 Minuten
150 Volt ausgesetzt. Die Richtung des elektrischen Feldes wurde einmal
pro Minute umgekehrt. Hämoglobin
zeigt eine starke Absorption bei 610 nm, die in diesem Assay nachgewiesen
werden konnte. Deshalb musste kein ZEM oder keine Markierung für den Nachweis
des glykierten oder nicht-glykierten Hämoglobins zugegeben werden.
-
Die
Extinktion des glykierten und des nicht-glykierten Hämoglobins,
das in den Kompartimenten von pH 6,95 bzw. pH 7,22 akkumulierte,
wurde mittels eines Spektralfotometers gemessen. Die Ergebnisse
wurden als prozentuale Konzentration in Abhängigkeit von der prozentualen
Extinktion des glykierten Hämoglobins
bezogen auf das Gesamthämoglobin
(X- gegen Y-Achse) ausgedrückt.
Siehe 14. Im Einzelnen wurde die prozentuale
Extinktion des glykierten Hämoglobins
in der getesteten Mischung durch das Teilen des Extinktionswertes
des Kompartiments mit pH 6,95 durch die Summe der Extinktionswerte
der Kompartimente mit pH 6,95 und pH 7,22 und das Multiplizieren
mit 100 berechnet. Die prozentuale Konzentration des glykierten
Hämoglobins
in jeder Mischung wurde durch das Teilen der bekannten Konzentration
des glykierten Hämoglobins in
jeder Mischung durch die Summe aus den bekannten Konzentrationen
des glykierten Hämoglobins
und des nicht-glykierten
Hämoglobins
in jeder Mischung berechnet. Mit den berechneten Daten konnte eine
Linie gezogen werden, die die Korrelation der prozentualen Extinktion
mit der prozentualen Konzentration des glykierten Hämoglobins
darstellt. Siehe 14.
-
Als
Nächstes
wurde einem Patienten eine Blutprobe abgenommen. Das Blut wurde
bei 500 g zentrifugiert. Ein Aliquot des Überstands von 10 μl wurde in
eine Kammer gegeben, die einen Chip, wie er oben beschrieben wurde,
enthielt, und 10 Minuten 150 Volt ausgesetzt. Die prozentuale Extinktion
des glykierten Hämoglobins
in the Probe wurde wie oben beschrieben berechnet („Y"-Wert). Die prozentuale
Konzentration des glykierten Hämoglobins
in der Probe lag bei ungefähr
5,2% auf der Basis der Extrapolation mithilfe der Linie aus 14.
Dieses Ergebnis zeigt, dass die getestete Person Diabetes hat. Der
Prozentsatz ist typisch für
Personen mit kontrolliertem Diabetes, liegt aber über dem
Normalbereich von of 3-4%.
-
BEISPIEL 10
-
Verfahren zur Bestimmung der Sammeleffizienz
der isoelektrischen Fokussierung
-
Zur
Bestimmung der Effizienz, mit der Proteine durch den Prozess der
isoelektrischen Fokussierung voneinander getrennt werden, wurde
bekannte Mengen an Alexa-Fluor-594-Ziege-anti-Maus-IgG (schwere und leichte
Ketten, Jackson Immuno Research Laboratories, pI = 8,2) in den Laufpuffer
eines Systems gegeben. Die Kammer enthielt einen „Trennchip", d. h. einen einzelnen
Kanal mit einem Durchmesser von 100 Mikrometer und einem Gesamtvolumen
von 1 nl. Jeder Kanal enthielt einen IEF-Puffer mit einem pH-Bereich
von pH 8,2 ± 0,05
pH-Einheiten. Der
IEF-Puffer wurde durch das Mischen von Tris-Glycin (pH 8,20 ± 0,05,
BioRad, Katalognummer 161-0771) mit einem Standard-Polyacrylamidgel
hergestellt.
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Zur
Eichung des Systems wurden 10 000, 50 000, 100 000, 300 000, 700
000 und 1 000 000 Moleküle des
obigen IgG zu dem Acrylamid gegeben und in einzelnen Kanälen von
pH 8,2 polymerisiert. Ihre Fluoreszenz wurde mit dem Fluoreszenzmikroskop
Zeiss Axiovert 200 unter Verwendung von AxioVision 2.05 zur Quantifizierung
der Fluoreszenzintensität
gemessen. Es wurde eine Eichkurve aus der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit
von der Konzentration des fluoreszierenden Markers für den Vergleich
mit den experimentellen Fluoreszenzintensitäten erstellt.
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Als
Nächstes
wurden 50 000, 100 000 und 1 000 000 Moleküle des obigen IgG im obigen
System getestet. Die einzelnen Mengen wurden einzeln in einen Laufpuffer
in einer Kammer gegeben. Die isoelektrische Fokussierung wurde für jede Menge
unter festen Trennbedingungen unter Einsatz identischer Trennchips
wie oben beschrieben durchgeführt
(10 Minuten durch die engen pH-Kanäle in 0,1 ml eines Tris-Glycin-Puffers
(pH 4,8) bei 30 V Gleichspannung). Nach jedem Experiment wurde die
Fluoreszenzintensität
mit dem Fluoreszenzmikroskop Zeiss Axiovert 200 gemessen und mit
der Eichkurve verglichen.
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Die
Ergebnisse zeigen, dass die Sammeleffizienz des Prozesses nahe bei
100% liegt, mit einem Korrelationskoeffizienten von r = 0,9999,
was zeigt, dass fast alle Proteine während der 10-minütigen Dauer
des Experiments in ihre pH-Kammern verteilt werden. Siehe 29.
Der S-Wert der Anpassung lag bei 45,85. Die Abszisse repräsentiert
den im Eichdurchgang gemessenen Fluoreszenzwert, während die
Ordinate die Fluoreszenz repräsentiert,
die nach den isoelektrischen Fokussierungen erhalten wurde. Die
Zahlen repräsentieren die
Gesamtzahl der Proteinmoleküle
in der Probe, und sie demonstrieren die hohe Empfindlichkeit der
isoelektrischen Fokussierung in Kanälen mit engem pH.