DE1243647B - Geraet fuer die in senkrechter Richtung erfolgende Gel-Elektrophorese - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

BOld

DeutscheKl.: 12 d-1/05

Nummer: 1 243 647

Aktenzeichen: R 39151IV a/12 d

Anmeldetag: 31. Oktober 1964

Auslegetag: 6. Juli 1967

Die Erfindung bezieht sich auf die Technik der Elektrophorese und insbesondere auf Verbesserungen an Geräten zur Durchführung einer in senkrechter Richtung erfolgende Gel-Elektrophorese.

Die Elektrophorese bezieht sich allgemein auf die Trennung einer zusammengesetzten bzw. komplexen Substanz in ihre Fraktion durch Verfahren, die auf der Wanderung oder Beweglichkeit elektrisch geladener Fraktionen in einem elektrischen Gleichstromfeld basieren. Wenn zwischen zwei im Abstand voneinander liegenden Elektroden ein elektrisches Feld erzeugt und in diesem Feld eine Substanz angeordnet wird, dann wandern die verschieden geladenen Komponenten oder Bestandteile der Substanz gegen die betreffenden Elektroden entgegengesetzter Ladung, und die entsprechenden Bestandteile bewegen sich mit verschiedenen Bewegungsgrößen, d. h. mit verschiedenen Geschwindigkeiten. Auf diese Weise kann die Trennung der verschiedenen Fraktionen durchgeführt werden. Diese Trennung kann auf einem ao zweckentsprechenden Tragmedium, wie z. B. einem Acrylamidgel, das mit einer Pufferlösung gesättigt ist, stattfinden, jeder durch den Elektrophoresevorgang getrennte Bestandteil wird einer qualitativen und einer quantitativen Analyse unterworfen und bildet daher ein brauchbares Hilfsmittel für die Laboratoriumsanalyse verschiedener Substanzen, wie z. B. Eiweißkörpern, Enzymen, Hämoglobin, Kohlehydraten, Blutserum usw., sowie verschiedener anorganischer Ionen.

Die senkrechte Gel-Elektrophorese ist eine Elektrophorese, bei welcher die Fraktionen unter dem Einfluß eines elektrischen Feldes auf einem Gel und in senkrechter Richtung wandern. Die in senkrechter Richtung erfolgende Gel-Elektrophorese ist in der Technik bekannt und beispielsweise in der USA.-Patentschrift 3 129 158 aufgezeigt.

Die Erfindung bezieht sich auf Verbesserungen an bekannten Geräten für die in senkrechter Richtung erfolgende Gel-Elektrophorese.

Es ist erwünscht, in einer Elektrophoresezelle gleichförmige Muster der getrennten Bestandteile zu erhalten, die leicht deutbar sind, und dies hängt wiederum von den gleichen Bedingungen ab, die in der Zelle vorhanden sind. Eine dieser Bedingungen ist die Stärke und Eigenschaft der Pufferlösung. Falls sich die Stärke, die Zusammensetzung oder der pH-Wert der Pufferlösung während der Elektrophorese ändert, sind die Ergebnisse nicht so gleichförmig wie es erwünscht sein würde.

Solche Änderungen können vermieden werden, indem

Gerät für die in senkrechter Richtung erfolgende Gel-Elektrophorese

Anmelder:

Samuel Raymond, Philadelphia, Pa. (V. St. A.)
Vertreter:

Dr. E. Wiegand und Dipl.-Ing. W. Niemann,
Patentanwälte, Hamburg 1, Ballindamm 26

Als Erfinder benannt:

Samuel Raymond, Philadelphia, Pa. (V. St. A.)

Beanspruchte Priorität:

Großbritannien vom 24. September 1964 (38 461)

a) die Pufferkammern sehr groß gemacht und mit einem großen Volumen des Puffers gefüllt werden,

b) der teilweise geänderte Puffer aus den Pufferkammern periodisch entfernt und durch frischen Puffer ersetzt wird,

c) der Puffer mit genügend hoher Strömungsgeschwindigkeit kontinuierlich aus einer Pufferkammer in die andere umlaufen gelassen wird,

d) Diffusionsplatten angeordnet werden, um die Elektrodenladungen von der Elektrophorese-Matrize wegzuhalten, oder

e) elektro-chemisch umkehrbare Elektroden verwendet werden.

Die Erfindung schafft Verbesserungen an Elektrophoresegeräten, indem Mittel vorgesehen sind, welche während der Elektrophorese Pufferlösung aus der oberen Kammer in die untere Kammer umlaufen lassen, um die Stärke, die Zusammensetzung und den ph-Wert des Puffers in beiden Pufferlösung enthaltenden Kammern während der Elektrophoresetrennung im wesentlichen gleichförmig zu halten. Auf diese Weise kann die Elektrophoresezelle mit kleineren Puffervolumen betrieben werden, und es ist ein viel kompakteres und besser arbeitendes Gerät geschaffen, welches weit gleichförmigere und besser reduzierbare Ergebnisse als bekannte Geräte liefert.

Das erfindungsgemäße Gerät ist gekennzeichnet durch ein inneres Überlaufrohr 72, das sich vom Boden 70 des oberen Behälters 18 über eine Länge nach oben erstreckt, die gleich einem gewünschten Spiegel der Pufferlösung in dem oberen Behälter 18

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ist und äußere Rohrleitungen 36, 66 zum Verbinden des oberen Behälters 18 und des unteren Behälters 16 mit einer Pumpe 74 zum Umlaufenlassen der Pufferlösung aus dem unteren Behälter 16 über die äußeren Rohrleitungen in den oberen Behälter 18 und zurück in den unteren Behälter 16.

Bei den bekannten Geräten sind Elektroden vorgesehen, die getrennt voneinander angeordnet und mit zwei trennbaren Teilen des Gerätes verbunden sind, so daß, wenn eine Vereinigung der Teile vorgenommen wird, jede falsche Anordnung der Teile oder jedes Nichtpassen der Teile zu einer veränderlichen räumlichen Beziehung der Elektroden und demzufolge zu einer veränderlichen Intensität und Verteilung des elektrischen Feldes zwischen ihnen führt. Weiterhin erfordert die Verbindung der beiden Elektroden mit trennbaren Teilen der Zelle eine trennbare elektrische Verbindung zu jeder dieser Elektroden mit einer sich daraus ergebenden Erhöhung der Ungewißheit der richtigen elektrischen Verbindung und einer tatsächlichen Gefahr beim Arbeiten der Zelle wegen der angelegten hohen Spannungen.

Die Erfindung sieht daher ferner vor, beide Elektroden an einem einzigen starren Aufbauteil der Zelle anzubringen und eine einzige zweipolige Vorrichtung zu verwenden, welche die elektrische Verbindung zu beiden Elektroden gleichzeitig herstellt. Es wurde gefunden, daß das Anbringen der beiden Elektroden an dem Außenteil der Zelle unzweckmäßig ist, um eine feste und konstante Intensität und Verteilung des elektrischen Feldes zu schaffen, da dieses in weitem Maß durch die Lage des Innenteiles der Zelle bestimmt wird. Es ist daher vorzuziehen, beide Elektroden an dem Innenteil der Zelle anzubringen.

Bei bekannten Ausführungen von Zellen für die in senkrechter Richtung erfolgende Gel-Elektrophorese weist der Raum, in welchen das Gel eingegossen wird, häufig Leckwege auf, welche zu einem Verlust an gelbildender Lösung führen. Bei vielen Zellenausführungen ist nicht ersichtlich, wie diese Lösung entweicht, da die Wandungen des Gelraumes sich über den Spiegel der Lösung erstrecken. Es wurde nun gefunden, daß Kapillarräume zwischen Aufbauteilen solcher Zellen, insbesondere längs der Kanten von Dichtungen, ein solches Lecken ermöglichen. Die gemäß der Erfindung verbesserte Ausführung hat den Zweck, ein solchen Lecken zu beseitigen. Es ist ein innerer Teil vorgesehen, der vollständig in die Wandungen des äußeren Teiles hineinpaßt, wobei der Abstand zwischen beiden Teilen genügend groß ist, um alle Kapillarwege zu beseitigen. Diese Ausführung erfordert daher keinerlei Dichtungen mehr, um sie leckfrei zu machen.

Bei bekannten Ausführungen von Elektrophoresezellen haben die Kühlplatten, die aus elektrisch nichtleitendem Material bestehen müssen, zufolge der solchen Materialien eigenen geringen Festigkeit im Vergleich mit z.B. Stahl die Neigung, sich zu verwerfen oder zu verbiegen. Es wurde gefunden, daß Versteifungsteile zweckentsprechender Form für praktische Zwecke dieses Biegen oder Verwerf en vollständig beseitigen können.

Ein weiteres Merkmal der Erfindung besteht in der Schaffung von Mitteln, welche in die Gelschicht in einem Abstand von ihrem freiliegenden Ende Proben einzuführen gestatten.

Weitere Zwecke der Erfindung gehen aus der nachfolgenden Beschreibung hervor, in welcher an einem Ausführungsbeispiel das Prinzip der Erfindung und die beste Art der Anwendung dieses Prinzips erläutert werden.

F i g. 1 ist eine auseinandergezogene schaubildliche Ansicht eines senkrecht arbeitenden Gelgerätes gemäß der Erfindung, und sie zeigt die beiden Aufbauteile;

ίο F i g. 2 ist eine Schnittansicht des Gerätes, das aus den beiden Aufbauteilen zusammengesetzt ist.

Ein senkrecht arbeitendes Gelgerät 10 weist einen äußeren Aufbauteil 12 und einen inneren Aufbauteil 14 auf, die aus einem geeigneten elektrisch isolierenden Material, z.B. einem maschinell bearbeiteten Kunststoff, bestehen. Wenn diese beiden Aufbauteile, die in F i g. 1 dargestellt sind, auf die in F i g. 2 dargestellte Weise zusammengesetzt werden, begrenzen sie einen unteren Behälter 16 und einen oberen Behälter 18, die beide eine Pufferlösung enthalten. Innerhalb der Pufferlösung in jedem Behälter sind Elektroden 20 bzw. 22 angeordnet. Die Elektroden 20 und 22 sind allein an dem inneren Aufbauteil 14 angebracht, und isolierte Verbindungsleitungen 21 und 23 führen, wie aus F i g. 1 ersichtlich ist, zu einem zweipoligen Anschluß 25. Wenn die beiden Aufbauteile zusammengesetzt sind, begrenzen sie weiterhin zwischen sich einen senkrechten Durchgang 24, der ein aus einem Gel bestehendes Tragmedium für die Elektrophorese aufnehmen kann. Dieses Gel kann zu Beginn ausgegossen werden, während der äußere Aufbauteil 12 sich in einer waagerechten Lage befindet, wie dies in der USA.-Patentschrift 3 129 158 aufgezeigt ist.

Der äußere Aufbauteil 12 weist eine Rückwand 26 auf, in der ein Kühlmittelkanal 28 ausgebildet ist, der mit Rohrleitungen 30 und 32 verbunden ist, und seine Vorderwand 34 ist mit einem Leitungsanschluß 36 versehen. Auf einem Boden 37 sind die Vorderwand 34 und die Rückwand 26 sowie Seitenwände 38 und 40 abgestützt. Die Seitenwände haben dreieckförmig gestaltete obere Abschnitte 42 bzw. 44, die zur Festigkeit und Starrheit des Aufbaus beitragen und die die Kühlmitteldurchgänge 28 enthaltende Rückwand 26 in ebenem Zustand zu halten. In der Mitte des äußeren Aufbauteiles 12 sind Klemmstreifen 46 und 48 vorgesehen. Eine kurze Oberwand 45 wird verwendet, um das Gel während seines Angießens zu halten. In der Rückwand 26 ist zwischen benachbarten Teilen des Kühlmittelkanals 28 ein Schlitz 25 vorgesehen, der gestattet, eine Probe einer komplexen Substanz in das Gel zwischen seinen Enden einzuführen. Zum Verschließen des Schlitzes 25 ist ein dichtpassender Stopfen 27 vorgesehen, der von außen entfernbar ist.

Der innere Aufbauteil 14 weist eine Rückwand 50 auf, in welcher ein Kühlmittelkanal 52 ausgebildet ist, der durch zweckentsprechende Rohre 53 und 55 mit einer Kühlmittelquelle verbunden ist. Seitenwände 54 und 56 erstrecken sich über die gekühlte Rückwand 50 hinaus, um eine vertiefte Zone 58 zu schaffen, die sich in dem zusammengesetzten Gerät senkrecht erstreckt und den Geldurchgang 24 bildet. Daher wird der Geldurchgang 24 von den beiden Seitenwänden 54, 56 und der Rückwand 26 des äußeren Aufbauteiles und von der Rückwand 50 des inneren Aufbauteiles begrenzt. Diese Ausführung verhindert ein unerwünschtes Auslecken des in dem Durch-

Claims (7)

gang 24 zu gießenden oder zu bildenden Gels, da sie stumpfe Verbindungsstellen an der Kante der Rückwand 50 vermeidet. Die Seitenwände 54 und 56 sind mit dreieckigen unteren Abschnitten 60 bzw. 62 für den gleichen Zweck wie die dreieckigen oberen Abschnitte 40 und 42 der Seitenwände 38, 40 versehen. Die Vorderwand 64 des inneren Aufbauteiles 14 hat einen äußeren Rohranschluß 66 und einen an ihr befestigten Klemmstreifen 68, der mit den Klemmstreifen 46 und 48 des äußeren Aufbauteiles 12 zusammenarbeiten kann und ermöglicht, die Aufbauteile 12 und 14 mittels einer geeigneten Klammer zusammenzuhalten. Ein flüssigkeitsdichter Boden 70 hält die Pufferlösung in dem oberen Behälter 18. Zwischen dem Boden 37 des äußeren Aufbauteiles 12 und der Unterkante der Rückwand 50 des inneren Aufbauteiles 14 muß ein Zwischenraum vorhanden sein. Um diesen Zwischenraum zu bilden, ist die Rückwand 50 mit zwei Abstandhaltestücken 49 und 51, eines an jedem Ende der Unterkante, versehen, ao Vom Boden 70 erstreckt sich ein PufferlösungsAblaßrohr 72 über eine Strecke nach oben, die gleich der gewünschten Höhe der Pufferlösung in dem Behälter 18 ist. Das Rohr 72 schafft einen Verbindungsweg über eine in dem Boden 70 vorgesehene Öffnung 73 zu dem unteren Behälter 16, der ebenfalls Pufferlösung enthält. Der äußere Leitungsanschluß 36 des unteren Behälters 16 und ein äußerer Leitungsanschluß 66 des oberen Behälters 18 sind mit einer Pumpe 74 zum Umlaufenlassen von Pufferlösung verbunden. Der Umlauf der Pufferlösung erfolgt aus dem unteren Behälter 16 in den oberen Behälter 18, wo sie in das Ablaßrohr 72 überläuft und so kontinuierlich zirkuliert. Dieses kontinuierliche Zirkulieren der Pufferlösung während eines Elektrophoresevorganges verhindert Änderungen der Stärke, der Zusammensetzung oder des pH-Wertes der Pufferlösung, so daß in der Elektrophorese-Zelle gleichförmigere Bedingungen aufrechterhalten werden und ein gleichförmigeres und leicht deutbares Muster erhalten wird, als es bisher möglich war. Für den Betrieb wird das Gerät zunächst in eine Stellung gebracht, in welcher die Rückwände 26 und 50 waagerecht verlaufen, und ein Gel in den Durchgang 24 eingegossen. Danach wird das Gerät in die in F i g. 2 dargestellte aufrechte Stellung gedreht, und die Behälter 16 und 18 werden mit Pufferlösung gefüllt. Eine zu trennende Substanz wird an einer zweckentsprechenden Stelle quer über das Gel aufgebracht. Die Elektroden 20 und 22 werden mit einer Gleichstromquelle verbunden, und die Pumpe 74 wird in Betrieb gesetzt, um die Pufferlösung umlaufen zu lassen. Unter dem Einfluß des elektrischen Feldes wandern die Bestandteile der zu trennenden Substanz längs des Gels mit verschiedenen Geschwindigkeiten, und nach einer geeigneten Zeitdauer kann die Elektrophorese unterbrochen, und das Gel mit den auf ihm verschieden schnell gewanderten, getrennten Bestandteilen herausgenommen und dann analysiert oder gedeutet werden. Patentansprüche:

1. Gerät für die in senkrechter Richtung erfolgende Gel-Elektrophorese, mit einem oberen und einem unteren Behälter, die eine Pufferlösung aufnehmen können und in senkrechter Richtung benachbart zueinander angeordnet sind, einem Durchgang, der zur Aufnahme eines für die Pufferlösung undurchlässigen Gels dient und mit jedem Pufferlösung enthaltenden Behälter in Verbindung steht, und einer Elektrode in jedem Behälter, gekennzeichnet durch ein inneres Überlaufrohr (72), das sich vom Boden (70) des oberen Behälters (18) über eine Länge nach oben erstreckt, die gleich einem gewünschten Spiegel der Pufferlösung in dem oberen Behälter (18) ist, und äußere Rohrleitungen (36, 66) zum Verbinden des oberen Behälters (18) und des unteren Behälters (16) mit einer Pumpe (74) zum Umlaufenlassen der Pufferlösung aus dem unteren Behälter (16) über die äußeren Rohrleitungen in den oberen Behälter (18) und zurück in den unteren Behälter (16).

2. Gerät nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Pufferlösung enthaltenden Behälter (16,18) und der Gel enthaltende Durchgang (24) von einem äußeren Aufbauteil (12) und einem inneren Aufbauteil (14) gebildet sind und daß die Elektroden (20, 22) für die beiden Pufferlösung enthaltenden Behälter (16,18) von einem der Auf bauteile (12,14) getragen sind.

3. Gerät nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Aufbauteil, der die beiden Elektroden trägt, der innere Aufbauteil (14) ist.

4. Gerät nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß in der Mitte des äußeren und des inneren Aufbauteiles Klemmstreifen (46, 48 bzw. 68) zum Zusammenklemmen des äußeren und des inneren Aufbauteiles in der richtig vereinigten Lage vorgesehen sind.

5. Gerät nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Wände (26 bzw. 50) der beiden Aufbauteile (12,14), welche zwei Seiten des das Gel aufnehmenden Durchgangs (24) begrenzen, mit Kanälen (28 bzw. 52) zum Umlaufenlassen eines Kühlmittels versehen sind und daß der innere der beiden Aufbauteile außerdem die beiden anderen Seiten des das Gel aufnehmenden Durchgangs (24) begrenzt.

6. Gerät nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Seitenwände des äußeren und des inneren Aufbauteiles dreieckförmig gestaltete Teile (42, 44 bzw. 60, 62) aufweisen.

7. Gerät nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die eine Außenwand (26) des äußeren Aufbauteils (12) zwischen benachbarten Abschnitten ihres Kühlmittelkanals (28) mit einem Schlitz (25) zum Einführen von Proben in das Gel an einer im Abstand von seinem einen Ende liegenden Stelle versehen ist.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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