DE1648828A1 - Vorrichtung fuer kontinuierliche Teilchen-Elektrophorese - Google Patents

Description

Priorität; IJ.O.A.; 3. November 1966; üerial ITo. 591 733.

Die Erfindung besieht sich allgemein auf eine Vorrichtung für kontinuierliche Soilclien-ülektrophorese, bei der ein elektrischer Potentia!gradient quer an einem elektrophoretischen Raum angelegt wird, welcher einen fließenden Elektrolyt-Vorhang enthält, in den eine Probe als Suspension eingeführt wird und dort elektrophoretisch in ihre Komponenten zerlegt wird.

^lektiophorese ist allgemein das Phänomen der Wanderung geladener T ei Ionen oder Ionen in einem elektrolytischen l'rägermedium unter dem Uini'luid eines elektrischen Feldes. Dieses Phänomen kann verwendet werden, um kleine Seilchen voneinander zu trennen, die inxüige verschiedener Oberflächeneigenscliaften in dem ,-;; eg ebenen Hodium verscniedene Konzentrationen der Oberflächen-

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ladung zeilen. Als Resultat dieser verschiedenen Oberfläciieiieigenacnaften sind die Beweglichkeiten verschiedener Klassen geladener Teilcnen im Trägermedium unter dem Einfluß oines elektrischen Feldes verschieden»

Sine Methode, eine elektrophoretische i'rennung zu erreionen,

kont inui er Ii eh
wird !Elektrophorese mit/frei fließenden 'leuchen genannt,

fc bei der ein Elektrolyt dazu gebracht wird, daß er in einer gleichförmigen Schicht oder als Vorhang frei innerhalb den Grenzen eines elektrophoretischen Raumes flieidt. An dem Vorhang wird ein elektrischer Potentialgradient unter einem bestimmten Winkel zur ütrömungsrichtung angelegt, typisoheiv/eise senkrecht dazu. Eine Probe, die kontinuierlich an irgendeinem Punkt in den Blektrolyt-Vornang eingerührt v/ira, fließt dann als schmales Band, wenn kein Potentialgradient angelegt ist. Wenn hingegen der Potentialgradient an dem

^ Vorhang angelegt v/ird, werden die Teilchen der Probe unter dem Einfluß des elektrischen Feldes in verschiedene Seiiehcngruppen oder Komponenten in Abhängigkeit von der elektrophoretischen Bewegliclilceit der jev/eiligen Seilcnen, der feldstärke und der Mnge der Zeit, weicne die Teilcnen im i'eld verbleiben, aufgeteilt. Teilchen verschiedener Bev/eglichkei'c v/erden dann in unterschiedlichen Zonen oder Komponentenbändern konzentriert, die sich fächerartig vom Punkt der Probeneinbringung aus erstrecken.

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Jer l-Otentialgiadieirc kann an dem Elektrolj/ten in dem elektro- 1-ΛΟ2. otiaciien Iiaum durcn verschiedene wohlbekannte Techniken angeregt werden. In einem Pall wird eine Pufferlösung verwendet, die in einem ülektrodenkanal an jeder Seite des elektro- ]jlioz etiucheu liaumes fließt und einen ionisch leitfähigen Kontakt i.iiT; aera in den liaara fließenden Yorhang aufrecht erhält. In der in aon ülek'aioüenlcanälen fließenden Pufferlösung sind drahtxüxuige lilektxoden eingetaucht und koppeln den Elektrolyten in aera elekti οpnoretischen üaum an eine elektrische Gleichstromquelle. Der Dlektr ο denkanal und der elektrophoretisciie .-iaun sinci voneinander durch eine Barriere oder Mem or an getrennt, die ioiien-uuxcnlässig ist, jedoch keinen ernsthaften Hassenfluß dos Elektrolyten oder der Pufferlösung zwischen dem Slektxodenkanal und den elektrophoretischen Rauin zuläßt.

IiGi der oLon beselnielDenen Yorrichtung "besteht ein Problem uuJn, daij eventuell solche Ionen, wie H und 0H~, in den ele^tiulytiscaen Vox^hang eindringen, welche an der positiven -.-T..·. negativen ^ilektiode erzeugt werden. Diese Ionen ändern die jjeitfänigkeit und den pli-!7ert des IllektrOljrteii, v/as zu einei:i Verlust an seitlicher Stabilität dex^ Teilchen_bänder j-iliiit. iline V-oxiicrroung, miT; der man das erwähnte Px^oblem neistexn kann, ist in der ältex^en Anmeldung B 07 23y Ιαο/42 vom 21. Hai 19bb (2rfinaer A. Strickler·) beschrieben.

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Bei einer Ausführungsform der Vorrichtung der genannten älteren Anmeldung, v/elche in den Figuren 3 und 4 ■ beschrieben ist, ist ein Elektrodenaggregat an jeder Seite des elektropiioretischen Raumes vorgesehen. Das Elektrodenaggregat enthält einen Zv/ischen- oder Überbrückungskanal, der zwiscnen der Außenfläche der ionendurchlässigen Membran und dem Elektrodenkanal angeordnet ist. Die Kanäle sind durch eine Trennwand voneinander getrennt, die mit einer Reihe von'Verbindungslöchern versehen iat, die dazu dienen, die Kanäle in Verbindung mit dem Fluid su bringen^ Die Pufferlösung tritt in den Überbrückungskanal an dessen unterem Ende ein und teilt sich in zwei ütröme auf, ύοά denen einer an oberen Ende des Überbrückungskanals austritt und der andere durch die Löcher mit einer= Geschwindigkeit gelangt, die ausreicht, um eine 'Wanderung dei Ionen nach innen abzuwehren und die Zelle am oberen Ende des Elektrod.enkanals zu verlassen. Diese Vorrichtung vernütet wirksam die Übertragung von Elektrolyse-Produkten in den Elektrophoreseraum und verbessert so die Teilchenbandstabilität.

Um den Fluid der Pufferlösung in bezug auf Gleichförmigkeit der Strömung quer über die ganze Länge der Meiner auf la cne zu verbessern und dabei eine homogene elektrische Feldstärke quer zum Blektrophoreseraum aufrechtzuerhalten, wurde die frühere ■ Technik der Ausführung einer elektrophoretischen Trennung nach Jer Erfindung folgendermaßen modifiziert:

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i;a werden Mittel vorgesehen, am die Pufferlösung eiaerseita uinca die lülektrodenkanäle uncl andererseits- durch die Über brückungskanäle jedes Gehäuses in der-seITden. Richtung mit Besag auf die Richtung des Elektrolytflusses durch den elektrophoretischen Raum fließen zu lassen, und. zwar nacheinander durch den Überbrückungskanal und. dann durch den Ulektrodenkanal mit Querfluß der Pufferlösung durch die perforierte Trennwand. Dadurchwird eine gleichförmige Querstromgeschwindigkeit durch die Perforationen unabhängig von ihrer relativen Abmessung erreicht.

Als eine Hauptaufgabe der Erfindung ist dabei anzusehen, daß die elektrophoretisch^ !Componentenbandstabilität weiter veroessert v/erden soll, indem man die Notwendigkeit vermeidet, daß die Verbindungslöcher mit geringeren Toleranzen hergestellt werden müssen und indem man die Spulgeschwindigkeit am allerobersten Abschnitt der ionenempfindlichen Membran erhöht.

■^ie Erfindung wird im folgenden an Hand, schematischer Zeichnungen an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert, wobei weitere Aufgabenstellungen, Merkmale und Vorteile der Erfindung deutlich werden.

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Figur 1 sclgt eine rcfccnaticcho Ansicht einer

cur kontinuierlichen L'cllchonelclrfcropiiorcDo mit einor cooci-.-'j/irucii de^ccotcllten ElcktrophoreDoncllo und einen Lirlralaüicaocyotcia für den Elektrolyten gemäß dor Erfindung; und

Figur 2 einen QuernGhnitt der Zolle gemäß Fig· 1 ltinsa der Ebene 2-2·

Die dargcotollte Elektrophorecosello 10 v/elot ein Paar flclior, lanngeatrocktor, durchoichtiecr Platten 12 und 14 auf» die mit GC-ßcnaeitißGa Abstand parallel sueinander montiert sind. Die Platten 12 und 14 bilden in Verbindung iait oborea und unteren Endabdiclitun^en 16 und 18 und einem Paar ionendurchlüoaigor Ilonbrane 20 einen eloktrophoretischen baw» Elektrophoroooraum 22. DIo Abdichtungen bsv/. Einaatcdichtunßen 16 und 16 oind vorsugcv7elae oyisnetriccli und mit Y-förraigen Konturen aucsebildot» co daß dor Elektrolytvoritang einen runigen laminaren Pluß erhält* Die Vorteile einer oolchen Zellenforni sind mit nähr Einsolheiten in der bereit3 erwähnton älteren Anmeldung B C7 239 IXb/42 1 der Anmolderin beaehriobcn»

Der Eloktrolytvorhang v/ird von einem Reservoir 24 konstanten Drucko über eine Loitmig 26, einem Einlaß 28 an der Oberoeito des von dem Diehteinoata 16 gebildeten umgekehrten Y zugeführt· Der Voraai)£ tritt dann wieder auo einem Auüaß 30 am unteren Ende doo Y~fÖrmigen Aboclmittoo, dor durch dan Dichtcincata 10 gebildet wird» in atiaoophtireZi Druck an einem bestimmten Iliveau unterhalb der Zelle 10 auo*

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Das Strunimsocyotein für dia Probe kann, in ährSicher Weise wie in dor bereits erwähnten älteren Anmeldung B 8? 239 IXb/42 1 verwendet werden. Eine Protscnauopciioion aus einem Probenrosorvoir 32 wird in den coä&licli im Raum 22 fließenden Vorhang durch, ein seitlich ansocr&iiotea Probenin;jektionarohr 34 eingeführt· Die ocitlichs Einotellbarkeit dos Injektionsrohreo 34 erlaub·« ca, oolclio Proben, die nach den Grad und der Polarität variieren, cnsupasaen· Eino tililielio Anordnuns ist innerhalb deo 'unteren ϊ-iürL^cn /Jbcohnitiea des Elektrophoreae-Eaumo 22 getroffen·. An der Seite kara ein Itohr 36 anseordnet und at) eioöeatellt werden, daß oo ireendoinon auDßGwUhlten Abaclinitt doa olektropIioretiDchen Seilclienbandmuotero aufnehmen und an ein üußeroa Gefüß 33 abgeben tana». Eine andere Betriebsweise be at ent darin, dao Ceilclicnbandmuater absutaaton, indem man das Rolir 36 aeitlioli do bewegt» daß eo nacheinander verschiedene Praktionen on eins Eeihö von öacaolGGfilßen abgibt« Hioht ßoaaamo te !Coilchenfraktionen worden Buoacmien mit dea Elektrolyten doa Vorhänge am Boden deo unteren Y über den Auslaß 30 abgeführt, HormalerweioG wird dieser Elektrolyt außer Gebrauch gesetatf er kann jedoch auch wieder in den. Kreislauf surückgefUhrt werden, indem man ihn durch einen geeigneten Pilter laufen läßt und wieder in den VorratsbehültGr 24 surüokbringt.

Die Außenfläche jeder ionondurchlücsigen Hombran 20 ißt durch ein Gehäuse 42 abgoatütat, welches einen Elektrodenkanal 44 und

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einen Üborbrüekuiisakcinal 46 bildet. Dor Überbrückungckanal 46 iot cv/locliGii den Elcktrodcnkanal .44 und dio Außenfläche der Ilcmbran 20 $cxraXla_ EWiachoii£ccchaltet, Die Kanäle 44 und 46 laufen la wesentlichen ü"bcr die tiüago dO3 Elektrophorese-· raumca 22 und cind voneinander durch eine Einrichtung zvcq. , Richten dor Strömung getrennt, dorezt Funktion v/eiter unto^ "beschrieben werden wird· Dieoe Einrichtung sum Richten der Strömung kann die Formt einer trennwand AQ mit oincr Reihe horizontaler Löcher 50 haben. Die Löcher 50 oind Iöns3 der ganzen Kinse der Erenn-,7an.& 43 vorcocölica und bringen die Kanäle 44 und 46 uitoinandor in i?luidverbindung·

In jedem Eloktrodonkanal 44 ist eino Drahtelektrode 52 aua Platin odor dgl. ansoordnot» die durch daa Gehäuse 42 unterstützt wird* Die Elektroden Dind miteinander über eine geeic-

wo nete Gleichatrociiiuollo (nicht gesoigt) verbunden »/durch eina

Elektrode als die Anode und di© Andere als dio Kathode dient»

Eine bevorzugte Anordnung für äea Fluß der Pufferlösung in den Kanälen 44 und 46 gemäß dor Erfindung iot in Fig. t gezeigt· Die Pufferlösung kann jede geeignete ZusamensetEUttg habenj ea können solche !»ijoun^cn vorwendet werden» welche dieselbe Zuaamnienoctcung wie der Elolctrolytvorhang haben, so daß der pH-tfert, die Leitfähigkeit _t die Vickoaltät uad daa Crov/icht einander angepaßt eixnl» Jeder Elektrodett-

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kanal 44 ist nalxo on seinem Boden mit einer Einlaßöffnung 54 für die Pufferlösung und cn seinem oboren Ende mit einer Auslaßöffnung 56 für die Pufferlösung vorsehen} in ähnlicher Weis© besitzt Jeder üborbrüekungsfcanal 46 eine Einlaßöffnung 58 für die Pufferlösung an eeinea unteren Ende und eine Auslaßöffnung 66 für dio Pufferlösung naho cn seinem oberen Ende. An jeder Seite der Zelle 10 verbindet eine leitung 62 die Auslaßöffnung 60 deo Üborbrüokungskanala mit der Einlaßöffnung 54 des Ebktrodenlranals. Ein, Vorratsbehälter 64 für die Pufferlösung ist über Leitungen 66, 68, md 70 mit den Einlaßöffnungen 58 verbunden, die zu den Überbrüclrungokanälen 46 führen. Die Pufferlösung, welche dio Aualaßöffnungen 56 des Elektrodenkanala verläßt, fließt duron die leitungen 72, 74 und 76 und wird in einem Gefüß 78 gesanmolt· Hier werden Elektrolysegasö abgelassen, und ßäure und Ease, die ^ov/eilo an der Anode und an der Kathode gebildet wurden, neutralisieren sich, gegenseitige Die in dem Gefäß 78 gesammelte liLschung wird dann über Leitungen 80 und 02 durch eine geeignete Pumpe 84 sum Vorratsbehälter zurückgeführt·

Im Betrieb i7ird die in den Vorhang eingeführte Probe elektrophoretisch, beispielsweise in die Komponenten A, B und C aufgetrennt, wenn ein Potential quer eum Vorhang über die Elektroden 52 angelegt wird, um die Pufferlösung innerhalb der Kanüle 44 un

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46 fließt. Ein ΐβϊΐ der Pufferlösung, die in jedem lfberbrüc3:un-.;3-kanal 46 durch die Öffnung^ 56 eintritt, fließt durch die Gffnungen 55 in der !rennwand 4o sum Slektroüenkanal 44 'und tritt darm, durch die Auslaßöffnung 56 aus. Die Querströmungsgeschwindigkeit durch d.ie Löcher 50 ist mehr als ausreichend, um eine Wanderung der elektrolytisch erzeugten Ionen, wie H und 0H~, nach innen entgegenzuwirken. Dies trägt zu eitlen stabilen Betriebsbedingungen im Vorhang bei. Der Rest der in den Überbriickungskanal 46 eingeführten Pufferlösung flieijt in diesem Kanal nach oben zur.Auslaßöffnung 60 und. von dort zu dem Einlaß 54 des Elektrodenkanals über die äußere leitung 62. Diese Pufferlösung wäscht zusammen mit der durch die löcher 50 hinzutretenden Pufferlösung Elektrolyse-Produkte von der Elektrode 52 fort. Alternativ können ebenso befriedigende Resultate erhalten werden, indem man Pufferlösung durch die öffnung 60 einführt und sie aus der Öffnung 54 wieder entfernt, wobei die Öffnungen 56 und 56 durch eine äußere leitung miteinander verbunden sind.

Der totale Pufferströmungsdürehsata durch die Kanäle 44 und 46 ist natürlich durch den äußeren Druck, der an dem Puffer angelegt wira, und die Einschnürungen der ötrömung in dem otrömungokreis bestimmt. Der Anteil des Puffers, der von der öffnung 60 zur Öffnung 54 fließt, hängt voa relaTiven btrönungsy/ider stand des Weges von 58 nach 60 nach 54 gegenüber dem ',Teg von den . Überbrückungskanal 46 zu dem Slektrοdenkanal 44 durch die

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Öffnungen 50 c,b· Ilit einen in geeignet er T/eise dimensionierten äußeren Verbinduiigcrohr 62 wird dieses Verhältnis in erster Linie durch die Abncccuiig und ZoJiI der Verbindungslöeher bcstin'ifc· Ein befriedigender Betrieb kann erreicht werden, indcra v.ia. ¹J bis 500 Vcrbiadungslüehor verwendet, deren Eurciimcsser bei einer Zelle von otv/a 20 cn länge im Bereich swisehen 0,0025 bis 0,25 cm rangieren· Wenn, die Kanäle 44 und 46 0,3 cEr-Cuerschnitte besitzen, erlauben 50 0,025 cni-VerbinuuaGolöeiier in 3eO.cn Elektrodeaacgregat, annähernd gleichs Anteile do3 PufforlUsiüagsstromos direkt vom Eanal 46 zum Kanal 44 und von der öffnung 60 zur Öffnung 54 f liefen nu la α ο ca· Bai dieser Anordnung ist die !Druckdifferenz längs jedes beliebigen Loches 50 in der trennwand 40 dieselbe wie dio Druckdifferenz längs jedes anderen Loches, unabhängig von den relativen Abmessungen der Löcher* Bsmentsprechend wird annähernd dieselbe Stromgeschwindigkeit längs jedes Verbindungsloches unabhängig von Darchmesseruttteruehieden erreicht· Diese Eonstanz der seitlichen Geschwindigkeit ergibt optimale Bedingungen, wenn man verhüten will, daß elektrolytische Produkte von dem Elektrodenkanal 44 sum tiberbrüekungskanal diffundieren* \7enn ferner ein merklicher Anteil des PufferlücungsstrßEiungsdurchsataes (10 bis 1000 ml pro Minute) an einem merklichen PIuS zwischen dea öffnungen 60 und 54 gekoppelt ist (5 fa bis 99 5$ dö3 Cotalflussea}» wird sichergestellt _f daß alle Eoilo der llembraa 20 in angemessener Woieo

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"bespült werden. Dies führt au einer großen Verbesserung der Homogenität des elektrischen Feldes und ergibt bessere elektrophoretisch^ Stabilität.

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Claims (2)

Pat entanspräche

1. Vorrichtung zur kontinuierlichen Teilchenelektrophorese mit einem Eiektrophoreseraum zum Leiten eines fließenden Elektrolytvorhangs und einer längs jeder Seite des Elektrophoreseraums jeweils angeordneten Elektrode, von denen eine als Anode und die andere als Kathode dient und die in einem Kanal unterstützt sind, der eine fließende Pufferlösung aufnimmt, wo "bei jeder Elektrodenkanal von dem Elektrophoreseraum duDh einen Überbrückungskanal und eine ionendurchlässige Membran getrennt sind, deren Innenfläche in Kontakt mit dem Elektrolyten im Elektrophoreseraum und deren Außenfläche in Kontakt mit der Pufferlösung im Überbrückungskanal steht, die Überbrückungskanäle und die Elektrodenkanäle an einer gegebenen Seite des Elektrophoreseraums ein G-ehäuse aufweisen, welches die Außenfläche der Membran abstützt, und der Elektrodenkanal von dem Überbrückungskanal durch eine perforierte Trennwand abgeteilt ist, ge kenn ζ eichnet durch eine Einrichtung (62), mit der der Fluß der Pufferlösung durch die Elektrodenkanäle (44) einerseits und durch die Überbrückungskanäle (46) andererseits in jedem Gehäuse (42) in derselben Richtung mit Bezug auf die Richtung des Elektrolytflusses durch den Elektrophoreseraum (22) geleitet wird, und zwar nacheinander zuerst durch den Über-

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brückungskanal (46) und dann durch den Elektrodenkanal (44) mit Querströmung der Pufferlösung durch die perforierte (50)
Trennwand (48).

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Einfülrungs-(58) und Ableitungsmittel (56) für die Strömung der Pufferlösung durch die Gehäuse (42) an beiden Seiten des Elektrophöreseraums (22) parallel geschaltet (an 66, 76) sind.

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