DE19729248C1 - Standardprotein - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Standardprotein sowie Mischung von Standardproteinen, einen Expressionsvektor zur Expression des Standardproteins und ein Verfahren zur Herstellung des Standard­ proteins.

In der Analytik von Proteinen besitzt insbesondere die Bestimmung des Molekulargewichts und des isoelektrischen Punktes einen großen Stellenwert. Die Analyse erfolgt allgemein durch die Bestimmung der Wanderungsgeschwindigkeit oder -strecke des Proteins unter chromatographischen oder elektrophoretischen Bedingungen. Da diese Verfahren keine Absolutwerte geben und eine große Schwankungs­ breite aufweisen, ist es erforderlich, die Eigenschaften im Vergleich zu einem Standardprotein zu bestimmen, dessen Eigen­ schaften bekannt sind.

Eine übliche Methode zur Bestimmung der Eigenschaften eines Proteins in einer Mischung von Proteinen ist z. B. der Western-Blot (Bumette, W.N.: "Western Blotting": Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate polyacrylamid gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody andradiolabelledprotein, A. Anal. Biochem. 112 (1981) 195-203). Dazu wird ein Proteingemisch z. B. durch Polyacrylamidgel­ elektrophorese (Laemmli, U.K. "Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of the Bacteriophage T4", Nature 227 (1970) 680-685) aufgetrennt. Nach einer eventuellen Färbung wird das Gel auf eine proteinbindende Membran (z. B. aus Nitro­ cellulose oder Polyvinyldifluorid (PVDF)) gelegt und in einer Blotkammer elektroeluiert, wobei die Proteine aus dem Gel heraus auf die Membran wandern. Restliche freie Proteinbindungsstellen auf der Membran werden mit einem Blockierungsreagenz, das z. B. Albumin enthalten kann, abgesättigt.

Der Nachweis des zu analysierenden Proteins erfolgt durch In­ kubation mit einem gegen dieses Protein gerichteten sogenannten primären Antikörper, der mit möglichst hoher Affinität und Spezifität an das Protein bindet. In einem zweiten Schritt wird mit einem gegen den F_c-Teil des primären Antikörpers gerichteten sogenannten sekundären Antikörper inkubiert, an dem ein Marker, üblicherweise ein Enzym, konjugiert ist. Im Fall des Enzyms ist dieses in der Lage, in einem weiteren Schritt ein zugesetztes Substrat in ein farbiges, unlösliches Produkt umzusetzen und damit im Endeffekt die Position des entsprechenden Proteins spezifisch zu bestimmen.

Problematisch ist hierbei jedoch, daß durch dieses Verfahren die Positionen der Standardproteine nicht mitgefärbt werden. Eine allgemeine Anfärbung mit einem Proteinfärbereagenz ist nicht möglich, da dadurch auch die Proteine der Proteinmischung des zu untersuchenden Proteins angefärbt würden.

Nicht unüblich ist es daher, die Membran mit den geblotteten Standardproteinen von der restlichen Membran abzuschneiden und nur den Standard einem Färbeprozeß zu unterwerfen. Durch den Einsatz von organischen Lösungsmitteln in der Färbelösung kommt es jedoch häufig zu einer Dehnung oder Schrumpfung der Membran, so daß eine hinreichend exakte Zuordnung der Eigenschaft des Standardproteins und der Eigenschaft des zu untersuchenden Pro­ teins unmöglich wird.

Das technische Problem, das der vorliegenden Erfindung zugrunde­ liegt, ist es daher, Standardproteine bereitzustellen, die in einfacher Weise eine selektive Anfärbung der Standardproteine im Western-Blot erlauben und darüber hinaus kompatibel zu labor­ üblichen chromatographischen oder elektrophoretischen Trennver­ fahren sind.

Das Problem wird gelöst durch ein Standardprotein gemäß Anspruch 1, eine Mischung von Standardproteinen gemäß Anspruch 7, eine Zusammenstellung gemäß Anspruch 15, ein Verfahren zur Herstellung des Standardproteins gemäß Anspruch 17 unter Verwendung eines Expressionsvektors gemäß Anspruch 16.

Das erfindungsgemäße Standardprotein weist mindestens eine spezifische Bindungsstelle für Enzyme auf, die nach einem unter denaturierenden Bedingungen durchgeführten elektrophoretischen Trennung funktional ist. Dadurch können z. B. im Western-Blot das zu analysierende Protein und das Standardprotein bzw. die Standardproteine durch Zugabe des enzymkonjugierten, sekundären Antikörpers oder einer Mischung von sekundärem Antikörper und freiem Enzym in einem gemeinsamen Schritt gleichzeitig angefärbt werden.

Insbesondere vorteilhaft ist es, wenn die Bindungsstelle des erfindungsgemäßen Standardproteins in der Lage ist, einen stabilen Komplex mit dem Enzym zu bilden, um die Farbreaktion möglichst lokalisiert durchzuführen.

Es ist insbesondere vorteilhaft, wenn das Standardprotein ein rekombinantes Protein ist, das aus ein bis mehreren Molekular­ gewichtsdomänen 1 besteht, das mit einem oder mehreren Bindungs­ domänen 2 ein rekombinantes Fusionsprotein bildet. Durch die mehrmalige Wiederholung dieser Module können sowohl die Protein­ eigenschaften des Standards als auch die Bindungsstellen in besonders einfacher Weise vielfach kombiniert werden.

Fig. 1 zeigt schematisch eine bevorzugte Ausführungsform.

Das erfindungsgemäße Standardprotein kann eine Bindungsstelle für ein beliebiges, zum Nachweis geeignetes Enzym und auch mehrere verschiedene Bindungsstellen im gleichen Protein aufweisen.

Bevorzugt werden jedoch insbesondere Bindungsstellen für saure und alkalische Phosphatasen, für Peroxidasen, Luciferasen und Dehydrogenasen oder deren Kombination.

Die Bindungsstellen des erfindungsgemäßen Standardproteins liegen vorteilhaft am N- oder C-Terminus, da dadurch ein freier Zugang des Bindungspartners erleichtert wird. Da die Bindung aber häufig nach einer Denaturierung erfolgt, z. B. nach einer Polyacrylamid­ gelelektrophorese, können die Bindungsstellen auch über das gesamte Protein verteilt sein, soweit zumindest ein Teil davon für die zu bindenden Enzyme erreichbar ist.

Insbesondere vorteilhaft ist es, wenn das Standardprotein nicht postranslational modifiziert ist, insbesondere nicht glykosyliert wird. Postranslationale Modifikationen können zu einer sogenannten Mikroheterogenität führen, wodurch Proteine mit der gleichen Aminosäuresequenz durch die Kopplung weiterer Substanzen eine Molekulargewichtsbandbreite aufweisen, die sich nachteilig auf die Schärfe der durch die chromatographische oder elektro­ phoretische Trennung erhaltenen Banden oder Fraktionen auswirkt. Nicht postranslational modifizierte Proteine zeigen demgegenüber eine bessere, weil schärfere Trennung.

Zumeist wird es sinnvoll sein, eine Mischung der Standardproteine einzusetzen, um durch Interpolation die Eigenschaften des zu untersuchenden Proteins möglichst exakt bestimmen zu können. Die erfindungsgemäßen Standardproteine in der Mischung können sich zum Beispiel in ihrem Molekulargewicht unterscheiden.

Da die Wanderungsgeschwindigkeit eines Proteins in einer Poly­ acrylamidgelelektrophorese unter denaturierenden Bedingungen (Zusatz von Natriumdodecylsulfat (SDS)) in einem logarithmischen Zusammenhang mit dem Molekulargewicht des Proteins steht, ist es besonders vorteilhaft, wenn sich die Molekulargewichte der Standardproteine um den Faktor 2 unterscheiden, da dadurch ein in etwa gleicher Abstand der Proteinbanden im Gel erreicht wird.

Aufgrund des Trennbereichs der Polyacrylamidgelelektrophorese werden insbesondere Mischungen bevorzugt, die Standardproteine mit einem Molekulargewicht von 5, 10, 20, 40, 80 und 160 kDa auf­ weisen. Auch Mischungen mit einem engeren Molekulargewichts­ abstand, z. B. 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120 kDa können - je nach Trennproblem - vorteilhaft sein. Einzelne Standardproteine können in deutlich höherer Menge als andere Standardproteine ein­ gesetzt werden, um die Zuordnung der Banden zu erleichtern.

Alternativ dazu können sich die Standardproteine jedoch auch in ihrem isoelektrischen Punkt (pI) unterscheiden.

Isoelektrische Fokusierung (IEF) erfolgt in einem Gel, das einen pH-Gradienten aufweist (Bollag, D.M., Edelstein, S.J. (eds.): "Protein methods" Wiley-Liss, New-York, NY, 1991 und Cooper, T.G. (Hrsg.) : "Biochemische Arbeitsmethoden" Walter de Gruyter, Berlin, BRD, 1981). Bei der IEF wandern die Proteine entsprechend ihrer Eigenladung in einem pH-Gradienten, wobei dieser pH-Gradient je nach Technik entweder schon im Gel vorliegt (Immobiline-Technik) oder sich erst beim Anlegen einer Spannung entwickelt (Carrier- Ampholyte-Technik). Die Proteine wandern solange, bis ihr pI dem pH des Gels entspricht. Die native IEF benötigt im Gegensatz zu der weit häufiger verwendeten denaturierenden Technik keinen Harnstoffzusatz. Sinn des Harnstoffeinsatzes ist die Vermeidung von Aggregationen; durch auftretende Aggregationen erreicht die native nicht die Auflösung der denaturierenden IEF.

Für einen linearen pH-Gradienten ist es besonders vorteilhaft, wenn sich die Standardproteine jeweils um den gleichen Wert unter­ scheiden, wobei je nach Auflösung des Gels bzw. der Breite des Gradienten der Unterschied der isoelektrischen Punkte zwischen den Proteinen 0,5 oder 1 betragen sollte.

Vorzugsweise sollte die Mischung einen pH-Bereich von 3 bis 11 abdecken. Für eine exakte Bestimmung des isoelektrischen Punktes kann es jedoch auch vorteilhaft sein, nur Teilbereiche des pH-Spektrums abzudecken.

Neben der Tatsache, daß das erfindungsgemäße Standardprotein in einem Protein verschiedene Bindungsstellen tragen kann, sind auch Mischungen geeignet, in denen die Standardproteine sich nur in ihren Bindungsstellen für die Enzyme unterscheiden. Für mehr­ dimensionale Gele kann es vorteilhaft sein, wenn sich die Proteine in mehr als einer Eigenschaft unterscheiden.

Neben der Möglichkeit, vorbereitete Mischungen der Standard­ proteine bereitzustellen, kann es auch vorteilhaft sein, dem Anwender eine Zusammenstellung mehrerer Standardproteine in getrennten Gefäßen anzubieten, aus denen er, unter Berück­ sichtigung des betreffenden analytischen Problems, eine indivi­ duelle Mischung von Standardproteinen zusammenstellt.

Bevorzugterweise werden die Standardproteine durch Expression eines Expressionsvektors in einem geeigneten Expressionssystem hergestellt. Der Expressionsvektor kodiert unter anderem für das Expressionsprotein, das sich vorteilhafterweise aus mindestens einem, sich jedoch bevorzugt wiederholenden Molekulargewichts­ domänen und ebenso eine oder mehreren Bindungsdomänen aufweist. Durch an sich bekannte molekularbiologische Techniken kann somit aus einem Stammvektor durch Vervielfachung der Nukleotidsequenzen für die Proteindomänen ein Expressionsvektor für ein gewünschtes Standardprotein erhalten werden.

Während die Verwendung der erfindungsgemäßen Standardproteine bzw. ihrer Mischung insbesondere im Western-Blot vorteilhaft ist, eignen sie sich ebenso gut für andere Analysenmethoden.

Sie können nach Einsatz in einer Polyacrylamidgelelektrophorese auch mit Hilfe üblicher Färbemethode, z. B. Coomassie-Blau oder Silberfärbung angefärbt werden. Auch hierbei sind die exakt definierten Eigenschaften vorteilhaft.

Soweit die erfindungsgemäßen Standardproteine aus Modulen aufge­ baut sind, ist davon auszugehen, daß die Anfärbung der erfindungs­ gemäßen Standardproteine relativ gleichmäßig erfolgt.

Aufgrund ihrer exakt definierten Eigenschaften eignen sich die erfindungsgemäßen Standardproteine auch für weitere analytische Verfahren z. B. Kapillar-Elektrophorese, Gelpermeationschromato­ graphie und Massenspektroskopie.

Die Verwendung der erfindungsgemäßen Standardproteine bzw. ihrer Mischung wird durch die folgenden Beispielenäher erläutert.

Beispiel 1 SDS Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE)

Ein 1 mm dickes, 10 cm × 10 cm großes, 12,5%iges, diskontinuier­ liches SDS-Polyacrylamidgel wird vorbereitet und in eine Laufkam­ mer eingesetzt. Die Proteinprobe und das Standardprotein bzw. die Mischung der Standardproteine werden in 35 µl Probenpuffer 5 Minuten aufgekocht, zentrifugiert und in die Laufkammern ge­ füllt. Die Trennung erfolgt bei einer Spannung von 10 V/cm, wobei die Elektrophorese-Apparatur wassergekühlt wird. Nach der Be­ endigung der Elektrophorese, üblicherweise 2 Stunden, werden die Glasplatten entfernt und das Gel für 45 Minuten in einer Coomassie-Blau Lösung geschwenkt. Danach wird das Gel in eine Entfärbelösung überführt, wodurch die Hintergrundfärbung abge­ schwächt wird. Sowohl Standardproteine als auch Probenproteine werden gut sichtbar angefärbt. Die Ermittlung der Molekular­ gewichte kann durch Interpolation erfolgen.

Beispiel 2 Western-Blot

Ein wie in Beispiel 1 erhaltenes Polyacrylamidgel wird vor oder nach der Färbung auf eine methanolgetränkte PVDF-Membran (Boehringer Mannheim) geblottet. Danach wird die Membran für eine Stunde in einer Blockierungs-Lösung geschwenkt und dreimal durch Schwenken in einer Waschlösung für 10 Minuten gewaschen. An­ schließend wird mit dem primären Antikörper für eine Stunde inkubiert. Daran anschließend erfolgt die Inkubation mit einem sekundären peroxidase-konjugiertem Antikörper. Dieser Antikörper ist gegen den primären Antikörper gerichtet. Gegebenenfalls wird frei Peroxidase hinzugegeben, so daß die Bindungsstellen des Standardproteins bzw. der Standardproteine ebenfalls besetzt sind. Bei Zugabe von 0,05% Diaminobenzidin (DAB) und 0,005% Wasserstoff­ peroxid wird durch die Peroxidase ein unlöslicher Farbkomplex gebildet, was zu einer Anfärbung der Standardproteine und des zu analysierenden Proteins führt.

Beispiel 3 Nachweis rekombinanter Genprodukte

Ein rekombinantes Genprodukt, das einen strep-tag aufweist, wird gemäß Beispiel 1 und 2 einer SDS-PAGE und einem Western-Blot unterzogen. Anstelle der Inkubation mit Antikörper erfolgt die Inkubation mit einem Streptavidin-Peroxidase-Konjugat gegebenen­ falls unter Zusatz von freier Peroxidase. Nach Zugabe des ent­ sprechenden Substrat s erfolgt wie in Beispiel 2 eine Anfärbung der Banden des Genprodukts und der Standardproteinen.

Beispiel 4 Isoelektrische Fokussierung

Entsprechend den Angaben des Herstellers wird eine Minigelkasette zusammengesetzt und ein denaturierendes isoelektrisches Fokussier­ gel gegossen. Das Polyacrylamidgel enthält Ampholyte mit einem pH-Bereich von pH 3,5 bis 10. Nachdem das Gel polymerisiert ist, wird das Gel in die Gelkammer gestellt und die Anodenkammer mit 10 mM Phosphorsäure und die Kathodenkammer mit 20 mM NaOH gefällt. Die zu untersuchende Proteinprobe wird in einem denaturierenden Gel-Ladepuffer aufgenommen, 5 min bei 10 000 × g zentrifugiert und vom Überstand werden 20 µl in eine Probentasche aufgetragen. Parallel dazu werden die Standarproteine mit bekannten pI-Werten aufgetragen. Die Fokussierung wird zunächst mit 150 V für 30 min und dann mit 200 V für 2,5 Stunden durchgeführt, wobei das Gel durch Kühlung auf 20°C gehalten wird. Nach der Fokussierung kann das Gel mit einem Farbstoff wie z. B. Coomassie-blue oder Silber angefärbt werden und der pI der Probe durch Interpolation der pI-Werte der Standardproteine ermittelt werden.

Claims (17)

1. Standardprotein, dadurch gekennzeichnet, daß das Standardprotein mindestens eine spezifische Bindungs­ stelle für Enzyme aufweist und die Bindungsstelle nach einer unter denaturierenden Bedingungen durchgeführten elektrophoretischen Trennung funktional ist.

2. Standardprotein gemäß Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Standardprotein und das Enzym einen stabilen Komplex bilden.

3. Standardprotein gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Standard­ protein ein rekombinantes Protein ist, das aus Mole­ kulargewichtsdomänen und Bindungsdomänen aufgebaut ist.

4. Standardprotein gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Standard­ protein mindestens eine Bindungsstelle für saure Phosphatase, alkalische Phosphatase, Peroxidase, Luciferase und/oder Dehydrogenase aufweist.

5. Standardprotein gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die mindestens eine Bindungsstelle am C-Terminus oder am N-Terminus liegt.

6. Standardprotein gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Standard­ protein nicht postranslational modifiziert ist.

7. Mischung von Standardproteinen gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Standardproteine in mindestens einer Eigenschaft unterscheiden.

8. Mischung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Standardproteine in ihrem Molekulargewicht unterscheiden.

9. Mischung gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß für jedes Standardprotein das Standardprotein mit dem nächsthöheren Molekulargewicht ein doppelt so hohes Molekulargewicht aufweist.

10. Mischung gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Molekulargewichte der Standardproteine 5, 10, 20, 40, 80, 160 kD betragen.

11. Mischung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Standardproteine in ihrem isoelektrischen Punkt unterscheiden.

12. Mischung gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß für jedes Standardprotein das Standardprotein mit dem nächsthöheren isoelektrischen Punkt einen um 0,5 höheren isoelektrischen Punkt aufweist.

13. Mischung gemäß Anspruch 11 oder 12, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die isoelektrischen Punkte der Standard­ proteine zwischen 3 und 11 liegen.

14. Mischung gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Standardproteine in ihren Bindungsstellen für Enzyme unterscheiden.

15. Zusammenstellung enthaltend mehrere Standardproteine gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6 in ge­ trennten Gefäßen zur individuellen Herstellung einer Mischung gemäß mindestens einem der Ansprüche 7 bis 14.

16. Expressionsvektor zur Expression des Standardproteins gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Expressionsvektor mindestens eine Nukleotidsequenz für eine Molekulargewichtsdomäne (1) und mindestens eine Nukleotidsequenz für eine Bindungsdomäne (2) aufweist, die zusammen als Fusions­ protein exprimiert werden können.

17. Verfahren zur Herstellung eines Standardproteins gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß der Expressionsvektor gemäß Anspruch 16 in einem geeigneten Expressionssystem exprimiert wird.