EP1334353A1 - Verfahren zur trennung und detektion von proteinen mittels elektrophorese - Google Patents

Verfahren zur trennung und detektion von proteinen mittels elektrophorese

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EP1334353A1
EP1334353A1 EP01996736A EP01996736A EP1334353A1 EP 1334353 A1 EP1334353 A1 EP 1334353A1 EP 01996736 A EP01996736 A EP 01996736A EP 01996736 A EP01996736 A EP 01996736A EP 1334353 A1 EP1334353 A1 EP 1334353A1
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EP
European Patent Office
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proteins
separation step
separation
protein
electrophoresis
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01996736A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Markus Hammermann
Herbert Platsch
Gerhard Weber
Heinz Eipel
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Dr Weber GmbH
Original Assignee
BASF SE
Dr Weber GmbH
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Publication date
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Priority claimed from DE2001120803 external-priority patent/DE10120803A1/de
Priority claimed from DE2001135497 external-priority patent/DE10135497A1/de
Application filed by BASF SE, Dr Weber GmbH filed Critical BASF SE
Publication of EP1334353A1 publication Critical patent/EP1334353A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44717—Arrangements for investigating the separated zones, e.g. localising zones
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2550/00—Electrophoretic profiling, e.g. for proteome analysis

Definitions

  • the invention relates to a method for separating and detecting proteins in order to accelerate proteome analysis.
  • a proteome is the term used to describe and quantify all proteins of an organism, a cell, an organelle or a body fluid at a defined point in time and under precisely defined conditions.
  • proteins are examined to determine which proteins play which role in biological processes and which proteins are of particular importance in interaction with other proteins.
  • the question of the extent to which chemicals, active substances and other external factors (environmental influences, heat, cold, lack of water, pH value, etc.) influence cellular protein expression is investigated in the context of proteome analysis.
  • proteome analysis also tries to find out which proteins in which protein constellations can be responsible for which side effects.
  • the question is examined whether the protein expression of microorganisms can be influenced in such a way that the space-time yields of fermentative production processes can be improved.
  • sample preparation poses a significant problem.
  • the course is set to separate and identify even complex protein patterns. It has been found that the solubility has a significant influence on the separation of proteins. Proteins that dissolve quickly in water generally do not pose any problems with regard to separability.
  • Proteins with stable secondary or tertiary structures that are sparingly water-soluble are stabilized in terms of their solubility behavior by adding chaotropic substances such as guanidine hydrochloride or urea.
  • chaotropic substances such as guanidine hydrochloride or urea.
  • undesired reactions of individual proteins can occur, whereby a protein originally present in one form changes into several forms and thus further increases the heterogeneity of the sample already present.
  • Membrane proteins the natural environment of which are lipid membranes and which tend to agglomerate and become insoluble again when they are isolated from one another, are particularly difficult to handle. These hydrophobic proteins can only be kept in the dissolved state if detergents are added, which, however, can frequently impair the subsequent stages of protein separation.
  • High protein concentrations are highly desirable for most separation and evaluation procedures, but are associated with the risk that aggregations will form.
  • low protein concentrations which have a positive effect on the solubility behavior, are associated with additional preparation steps before the actual separation.
  • Proteins have the character of zwitterions and can therefore be positively or negatively charged. Using electrophoresis methods, individual components can be separated according to their mobility in the electrical field. The electrophoretic
  • Mobility of each protein is a characteristic value.
  • proteome analysis two electrophoresis methods are used, isoelectric focusing (IEF) and sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • This method provides for the separation of the proteins in the first dimension with the isoelectric focusing according to their isoelectric point.
  • the second dimension is a sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis to separate the proteins according to their size.
  • This method is currently the only procedure with which complex protein mixtures can be separated with high resolution.
  • the advantages of the 2D-PAGE process are the two mutually complementary separation principles, namely IEF and SDS-PAGE processes according to load and molecular weight. In principle, this technique can be used with all proteins.
  • the resolution of this method can be increased significantly by using narrow pH gradients in isoelectric focusing ("zoom gels").
  • Staining is carried out, for example, with dyes such as Coomassie blue, with colloidal silver, with zinc / imidazole or with fluorescent dyes such as Sypro ® Ruby, Sypro ® Orange or Sypro ® Red. All dyeing methods used have in common that the bond between protein and dye reagent is not covalent , but on the basis of ionic, hydrophobic or Van der Waal interactions. After staining, the gels are usually digitized using a scanner or a fluorescence scanner.
  • US 6,043,025 and US 6,127,134 describe a process and a kit with which one can detect differences in two or more protein samples.
  • the protein extracts from different samples are covalently labeled with different, positively charged fluorescent dyes, combined and subjected to 2D PAGE. Identical proteins from the different samples can then be detected and quantified on the basis of their different fluorescence wavelengths in the same gel.
  • the proteins of a first cell are prepared using known treatment techniques, the first cell originating from a first group of cells.
  • the proteins are covalently labeled with a first dye from a pair of dyes.
  • a second cell is prepared using known treatment techniques that were taken from a second group of cells.
  • the proteins of this second cell are covalently labeled with a second dye.
  • radioactive methods can also be used.
  • the cells are mixed with certain isotope-labeled compounds such as 35 S-cysteine or 32 PO 4 3 " .
  • a phosphor imager is usually used for digitization in these cases.
  • image evaluation programs such as MELANIE, PDQUEST, IMAGEMASTER or The protein spots are then detected, quantified and assigned in the digitized gels obtained.
  • the entire procedure from electrophoresis to staining, detection and quantification according to the 2D-PAGE method is very complex.
  • the object of the invention is to develop a separation method for proteins which reduces the use of gels, is quick and easy to carry out and can be automated, and allows simple quantification of the separated proteins.
  • this object is achieved by a method for the separation and detection of proteins, the protein samples being contained in a separation buffer solution and the following method steps being carried out:
  • the protein samples are broken down into individual fractions according to free-flow electrophoresis with isoelectric focusing (IEF) or isotachophoresis and with a
  • the protein fractions are separated in one or more capillaries according to capillary electrophoresis, at least one labeling substance being detected in the individual capillary (s).
  • protein fractions obtained after the first separation step are linked with a reactive fluorescent dye.
  • a reactive fluorescent dye This can be done, for example, by coupling the N-hydroxysuccinimide esters (NHS esters) or isothiocyanates of fluorescent dyes to free amino groups of the proteins. Free amino groups are preferably the N-termini or lysine selected as coupling sites.
  • the dyes can be covalently bound to the individual proteins in the process proposed according to the invention.
  • protein fractions obtained after the first separation step are mixed with a marking substance.
  • a marking substance e.g. Sypro® Ruby, Sypro Orange or Sypro Red.
  • the fluorescent dyes Sypro Ruby, Sypro Orange or Sypro®Red can be bound by adsorption, e.g. by hydrophobic, ionic or Van der Waal's forces.
  • capillaries In a second separation step, capillaries can be used which are either provided with a polyacrylamide gel or which do not contain this substance, i.e. are empty.
  • the individual proteins are detected in the second separation step using laser-induced fluorescence. Sensitive fluorescence detection ensures a wide dynamic range and high sensitivity.
  • sodium dodecyl sulfate can be added to the separation buffer. Due to the high separation performance of capillary electrophoresis, a significantly better resolution in the second dimension is achieved compared to the 2D-PAGE gel process; Furthermore, the high degree of automation of both separation steps, the FFE and the capillary electrophoresis, enables a significantly higher throughput and thus a better statistical validation of the results obtained. In order to ensure the parallel processing of a higher number of protein samples after free-flow electrophoresis, all wells of a microtiter plate can be detected and quantified separately in parallel by as many capillaries. This can be achieved, for example, by using a commercially available device for DNA sequencing.
  • several different fluorescent dyes can be detected simultaneously in each capillary in the second separation step.
  • the sensitive fluorescence detection ensures a large dynamic range and high sensitivity. Due to the high separation performance of capillary electrophoresis, a significantly better resolution in the second dimension is achieved compared to the 2D PAGE gel process. Due to the high degree of automation of both separation steps, FFE and capillary electrophoresis, a significantly higher throughput and thus a better statistical validation of the measured results is expected.
  • the separation of the protein samples in the first separation step can e.g. in an advantageous manner in a microtiter plate, a microtiter plate being used, the number of wells of which corresponds to that of the separated protein fractions.
  • the number of capillaries used in the second separation step according to capillary electrophoresis advantageously corresponds to the number of sample fractions introduced into the microtiter plate.
  • two different free-flow electrophoresis methods can be used for the method proposed according to the invention: isoelectric focusing and isotachophoresis.
  • isotachophoresis can be used in the first separation step.
  • a potential gradient is formed in the electrical field in a discontinuous buffer system consisting of the lead and secondary electrolytes.
  • the field strength is higher in the area of ions with low mobility than in the area of more mobile ions. Since all ions must migrate at the same speed, pure zones of the individual proteins are formed from the protein sample mixture. In the equilibrium state, the ion with the highest mobility follows the lead ion of the lead electrolyte, the one with the lowest mobility moves in front of the follow-up electrolyte, the others move in between in the order of decreasing mobility.
  • interval isotachophoresis is performed (Gerhard Weber and Petr Bocek in Electrophoresis 1998, 19, 3090 - 3093). After the protein sample and the electrolytes have been applied to the free-flow electrophoresis chamber, high voltage is applied for 2 minutes to separate the proteins, then the separated fractions are conveyed without tension via a series of tubes into the individual wells of a microtiter plate.
  • individual protein fractions are obtained in microtiter plates in this electrophoresis device.
  • the proteins in these fractions can be linked both to a marker, for example a fluorescent dye such as Sypro®Orange, Sypro®Red or Sypro®Ruby, and to at least one reactive fluorescent dye.
  • a marker for example a fluorescent dye such as Sypro®Orange, Sypro®Red or Sypro®Ruby
  • Derivatives such as the N-hydroxysuccinimide esters (NHS esters) or the isothiocyanates of fluorescent dyes, which are coupled to free amino groups of the proteins, are suitable for this. N-termini or lysine of the proteins or the protein fractions are particularly suitable.
  • the second separation step e.g. Separate covalently fluorescence-labeled proteins using capillary electrophoresis.
  • the one or more capillary tubes used can be filled on the one hand with a polyacryamide gel, on the other hand the use of unloaded, i.e. empty capillary tube possible.
  • Detection preferably follows with laser-induced fluorescence, and sodium dodecyl sulfate can be added to the separation buffer to improve the running behavior of the proteins in capillary electrophoresis.
  • all wells of the microtiter plate are separately detected and quantified in parallel in as many capillaries.
  • a commercially available device for DNA sequencing is used, for example a Mega-BACE from Amersham Pharmacia or another device of a similar design.
  • An advantage over conventional 2D gel electrophoresis with subsequent non-covalent staining with image evaluation for quantification is that the electropherograms obtained by the method described here can be easily quantified using commercially available software.
  • several different marking substances such as, for example, fluorescent dyes
  • only a fluorescent dye or fluorescent substance can be detected just as well.
  • the multiple samples analyzed in one run are proteins from different cells or from cells in different stages of development or from cells that were exposed to different external conditions (such as heat, cold, active substances, chemicals, etc.).
  • Dissolution of the protein samples or the protein samples of cellular origin in the second Dimension compared to the 2D PAGE method can be achieved. Due to the significantly better automatability of both methods, free-flow electrophoresis and capillary electrophoresis, a significantly higher throughput and thus a better statistical validation of the results will take place.
  • a program sequence for evaluating the electropherograms is to be created; furthermore, in order to implement the method proposed according to the invention, a free-flow electrophoresis apparatus (“Octopus” from Dr. Weber GmbH), for example, and, for example, a Mega-BACE sequencer from Amersham or a similar device are required.

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Auftrennung und Detektion von Proteinen oder Proteinproben zellulären Ursprungs, wobei die Proteine in einer Trennpufferlösung enthalten sind und die nachfolgenden Verfahrensschritte durchlaufen werden: die Proteinproben werden in einem ersten Trennschritt gemäss der Free-Flow-Elektrophorese oder der isoelektrischen Fokussierung (IEF) oder der Isotachophorese in einzelne Fraktionen zerlegt und mit einem Markierungsstoff verknüpft, in einem zweiten Trennschritt werden die Proteinfraktionen gemäss der Kapillarelektrophorese in einer oder mehreren Kapillaren aufgetrennt, wobei in der einen oder den mehreren Kapillaren mindestens mit den Proteinfraktionen verknüpfter Markierungsstoff detektiert wird.

Description

VERFAHREN ZUR TRENNUNG UND DETEKTION VON PROTEINEN MITTELS ELEKTROPHORESE
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Trennung und Detektion von Proteinen, um eine Beschleunigung der Proteomanalytik zu erreichen.
Als Proteom bezeichnet man alle Proteine eines Organismus, einer Zelle, einer Organelle oder einer Körperflüssigkeit zu einem definierten Zeitpunkt und unter genau definierten Bedingungen detektiert und quantifiziert. In der Proteomanalytik werden Proteine daraufhin untersucht, welche Proteine welche Rolle in biologischen Vorgängen spielen und welchen Proteinen eine besondere Bedeutung in Wechselwirkung mit anderen Proteinen zukommt. Ferner wird im Rahmen der Proteomanalytik der Frage nachgegangen, inwieweit Chemikalien, Wirkstoffe und andere externe Faktoren (Umwelteinflüsse, Hitze, Kälte, Wassermangel, pH-Wert etc.) die zelluläre Proteinexpression beeinflussen. In der Toxikologie und Pharmakologie wird mit der Proteomanalytik des weiteren versucht, zu ergründen, welche Proteine in welchen Proteinkonstellationen für welche Nebenwirkungen verantwortlich sein können. Schließlich wird der Frage nachgegangen, ob die Proteinexpression von Mikroorganismen derart beeinflusst werden kann, dass die Raum- Zeit- Ausbeuten von fermentativen Produktionsprozessen verbessert werden können.
Aus technischen Gründen - sowohl die Trennung als auch die Detektion betreffend - ist eine vollständige quantitative Beobachtung und Auswertung aller Proteine eines Proteoms bisher nicht möglich; hydrophobe Proteine, Proteine extremer Größe, seien sie besonders groß oder besonders klein, stark sauer oder stark basisch, verursachen ernsthafte Probleme bei der Trennung solcher Proteine, so dass sich vollständige Proteome selbst unter sonst optimalen Bedingungen nicht detektieren lassen. Gegenwärtig wird davon ausgegangen, dass erheblich mehr als 50 % aller exprimierten Proteine quantitativ erfaßt werden können.
Ein erhebliches Problem stellt angesichts der unübersehbaren Vielzahl von exprimierten Proteinen die Probenaufbereitung dar. In der Phase der Probenaufbereitung werden die Weichen dafür gestellt, auch komplex aufgebaute Proteinmuster zu trennen und zu identifizieren. Es hat sich herausgestellt, dass die Löslichkeit die Auftrennung von Proteinen erheblich beeinflußt. Proteine, die sich schnell in Wasser lösen, bereiten in der Regel keine Probleme hinsichtlich der Auf trennbarkeit.
Proteine mit stabilen Sekundär- oder Tertiärstrukturen, die schwer wasserlöslich sind, werden hinsichtlich ihres Löslichkeitsverhaltens durch Zugabe von chaotropen Substanzen wie beispielsweise Guanidin-Hydrochlorid oder Harnstoff stabilisiert. Dabei kann es jedoch zu unerwünschten Reaktionen einzelner Proteine kommen, wodurch ein ursprünglich in einer Form vorliegendes Protein in mehrere Formen übergeht und so die Heterogenität der bereits vorliegenden Probe zusätzlich erweitert.
Membran-Proteine, deren natürliche Umgebung Lipidmembranen sind und die während ihrer Isolation voneinander direkt wieder zum Agglomerieren neigen und wieder unlöslich werden, sind besonders schwer zu handhaben. Diese hydrophoben Proteine können nur im gelösten Zustand gehalten werden, wenn Detergentien zugegeben werden, die jedoch häufig die nachfolgenden Stadien der Proteinauftrennung beeinträchtigen können.
Hohe Proteinkonzentrationen sind zwar für die meisten Auftrennverfahren und Auswerteprozeduren im hohen Maße erwünscht, gehen jedoch mit dem Risiko einher, dass sich Aggregationen ausbilden. Im Gegensatz dazu sind niedrige Proteinkonzentrationen, die sich positiv auf das Löslichkeitsverhalten auswirken, mit zusätzlichen Vorbereitungsschritten vor der eigentlichen Separation verbunden.
Die bisherigen Auftrenntechniken im Bereich der molaren Masse von Proteinen sind die Elektrophorese einerseits und die Chromatographie andererseits. Jedoch vermag keine dieser beiden Auftrenntechniken von Proteinen alleine wesentlich mehr als 100 verschiedene Komponenten zu trennen. Da jedoch eine einfache Zelle in der Regel mehrere Tausend verschiedene Spezies von Proteinen enthält und die Menge der in einer Probe enthaltenen Proteine um den Faktor 106 differieren kann, muß eine ausreichend große Trennkapazität zur Verfügung gestellt werden, die nur durch gekoppelte, mehrdimensionale Auftrennverfahren geschaffen werden kann.
Proteine haben den Charakter von Zwitterionen und können dementsprechend positiv oder negativ geladen sein. Mit Elektrophoreseverfahren können einzelne Komponenten entsprechend ihrer Mobilität im elektrischen Feld getrennt werden. Die elelctrophoretische
Mobilität jedes Proteins ist ein charakteristischer Wert. Im Rahmen der Proteomanalytik werden zwei Elektrophorese- Verfahren angewendet, die isoelektrische Fokussierung (IEF) und die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelelctrophorese (SDS-PAGE).
Bei der isoelektrischen Fokussierung bewegen sich die einzelnen Proteine auf dem Gel innerhalb eines pH-Gradienten zu ihrem jeweiligen isoelektrischen Punkt, an dem sie ihre Nettoladung ausgleichen und so ihre elektrophoretische Mobilität einbüßen. Bewegt sich ein Protein aufgrund thermischer Diffusionserscheinungen aus der pH-Region, die der isoelektrischen Ladung entspricht, so nimmt es wieder eine Ladung an und bewegt sich im elektrischen Feld wieder zurück zu der Stelle im pH-Gradienten, die seinem isoelektrischen Punkt entspricht.
Das SDS-PAGE-Verfahren sieht das Beladen sämtlicher Proteine mit Natriumdodecylsulfat (= SDS) vor; die negativen SDS-Protein-Komplexe bewegen sich in Richtung Anode im elektrischen Feld und lassen sich entsprechend ihrer molekularen Größen in der Polyacrylamidmatrix trennen.
Aus der Kombination des IEF- und des SDS-PAGE- Verfahrens entstand die 2D-Gel- Elektrophorese (2D-PAGE) nach Klose und O'Farrell 1975 (J. Biol. Chem. 1975, 250, 4007 bis 4020; Humangenetik 1975, 25, 231 bis 245).
Dieses Verfahren sieht eine Trennung der Proteine in der ersten Dimension mit der isoelektrischen Fokussierung nach ihrem isoelektrischen Punkt vor. Als zweite Dimension wird eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zur Auftrennung der Proteine nach ihrer Größe durchgeführt. Diese Methode stellt derzeit die einzige Vorgehensweise dar, mit der komplexe Proteinmixturen mit hoher Auflösung aufgetrennt werden können. Die Vorteile des 2D-PAGE-Verfahrens sind die zwei zueinander komplementären Trennprinzipien, nämlich IEF- und SDS-PAGE-Verfahren nach Ladung und Molgewicht. Diese Technik läßt sich prinzipiell bei allen Proteinen nutzen. Das Auflösungsvermögen dieser Methode kann durch den Einsatz von engen pH-Gradienten in der isoelektrischen Fokussierung deutlich erhöht werden ("Zoom-Gele").
Andererseits bestehen bei diesem Verfahren auch Nachteile; so ist einige Erfahrung und Geschick bei der Probenaufbereitung erforderlich. Die Auftragsmenge ist begrenzt, so dass schwach exprimierte Proteine nicht direkt delektiert werden können. Protein-Transfer von der ersten zur zweiten Dimension ist schwierig und schlecht reproduzierbar. Eine einfache Automatisierungsmöglichkeit besteht bei diesem Verfahren nicht. Auch werden nicht alle Proteine durch dieses Verfahren delektiert. Für Molekulargewichte kleiner als 10.000 und für Molekulargewichte größer als 100.000 werden keine befriedigenden und aussagekräftigen Resultate erhalten. Nach der Trennung im Gel müssen die Proteine noch aufwändig gefärbt werden.
Das Färben erfolgt beispielsweise mit Farbstoffen wie Coomassie-Blau, mit kolloidalem Silber, mit Zink/Imidazol oder mit Fluoreszenzfarbstoffen wie Sypro®Ruby, Sypro®Orange oder Sypro®Red. Allen eingesetzten Färbemethoden ist gemeinsam, dass die Bindung zwischen Protein und Färbereagenz nicht kovalent, sondern auf der Basis von ionischen, hydrophoben oder Van-der-Waal'schen-Wechselwirkungen erfolgt. Im Anschluß an die Färbung werden die Gele in der Regel mit Hilfe eines Scanners oder eines Fluoreszenz-Scanners digitalisiert.
In US 6,043,025 und in US 6,127,134 wird ein Prozeß und ein Kit beschrieben, mit welchem man Unterschiede in zwei oder mehr Proteinproben detektieren kann. Die Proteinextralcte von unterschiedlichen Proben werden mit verschiedenen, positiv geladenen Fluoreszenzfarbstoffen kovalent markiert, vereinigt und der 2D-PAGE unterworfen. Identische Proteine aus den verschiedenen Proben können dann an Hand ihrer unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlängen im gleichen Gel detektiert und quantifiziert werden. Gemäß der US 6,127,134 offenbarten Lösung werden die Proteine einer ersten Zelle mittels bekannter Behandlungstechniken präpariert, wobei die erste Zelle aus einer ersten Gruppe von Zellen stammt. Die Proteine werden mit einem ersten Farbstoff aus einem Paar von Farbstoffen kovalent markiert. Danach erfolgt die Präparation einer zweiten Zelle mittels bekannter Behandlungstechniken, die einer zweiten Gruppe von Zellen entnommen wurde. Die Proteine dieser zweiten Zelle werden mit einem zweiten Farbstoff kovalent markiert.
Alternativ zu diesen Färbemethoden können auch radioaktive Verfahren eingesetzt werden. Dazu werden die Zellen mit bestimmten isotopenmarkierten Verbindungen wie beispielsweise 35S-Cystein oder 32PO4 3" versetzt. Im Anschluß an die 2D-PAGE wird zur Digitalisierung in diesen Fällen gewöhnlich ein Phosphorimager eingesetzt. Mit Bildauswerteprogrammen wie beispielsweise MELANIE, PDQUEST, IMAGEMASTER oder Z3 werden in den erhaltenen digitalisierten Gelen anschließend die Proteinspots detektiert, quantifiziert und zugeordnet. Die Erkennung der einzelnen Spots sowie die Zuordnung der Spots zwischen den einzelnen Gelen (= "Matchen") sind sehr zeitaufwändig und erfordern manuelles Eingreifen des Operators. Die gesamte Prozedur ausgehend von der Elektrophorese bis hin zur Färbung, Detektion und Quantifizierung gemäß des 2D-PAGE- Verfahrens ist sehr aufwändig.
Angesichts der skizzierten technischen Probleme liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Trennverfahren für Proteine zu entwickeln, welches den Einsatz von Gelen reduziert, schnell und einfach durchführbar sowie automatisierbar ist und eine einfache Quantifizierung der aufgetrennten Proteine erlaubt.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Auftrennung und Detektion von Proteinen gelöst, wobei die Proteinproben in einer Trennpufferlösung enthalten sind und die nachfolgenden Verfahrensschritte durchlaufen werden:
Die Proteinproben werden in einem ersten Trennschritt gemäß der Free- Flow-Elektrophorese mit der isoelektrischen Fokussierung (IEF) oder der Isotachophorese in einzelne Fraktionen zerlegt und mit einem
Markierungsstoff verknüpft;
in einem zweiten Trennschritt werden die Proteinfraktionen gemäß der Kapillarelektrophorese in einer oder mehreren Kapillaren aufgetrennt, wobei in der oder den einzelnen Kapillaren mindestens ein Markierungsstoff detektiert wird.
Die Vorteile des erfmdungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens sind vor allem darin zu erblicken, dass die Auftrennung der Proteine bzw. der zellulären Proteine nunmehr automatisierbar bei mehreren Proben gleichzeitig erfolgen kann. Dadurch läßt sich der Probendurchsatz erheblich steigern. Ferner kann mit dem erfmdungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren die jetzige komplizierte personalintensive Bildauswertung entfallen. Ferner kann die aufzutragende Probenauftragsmenge erheblich verringert werden. Durch ein geeignetes Markierungsverfahren wie die Fluoreszenzmarkierung kann die Empfindlichkeit und damit das Auflösungsvermögen hinsichtlich der Detektion schwach exprimierter Proteine erheblich erhöht werden.
In einer vorteilhaften Ausführungsvariante des erfmdungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens werden nach dem ersten Trennschritt erhaltenen Proteinfraktionen mit einem reaktiven Fluoreszenzfarbstoff verknüpft. Dies kann z.B. durch Kopplung der N- Hydroxysuccinimidester (NHS-Ester) oder Isothiocyanate von Fluoreszenzfarbstoffen an freie Aminogruppen der Proteine erfolgen. Vorzugsweise werden freie Aminogruppen der N-Termini oder Lysine als Kopplungsstellen ausgewählt. Im Unterschied zu Fluoreszenzfärbungen im Polyacrylamidgel können die Farbstoffe beim erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren kovalent an die einzelnen Proteine gebunden werden.
In einer vorteilhaften Ausfuhrungsvariante des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens, werden nach dem ersten Trennschritt erhaltene Proteinfraktionen mit einer Markierungsstoff versetzt. Dies kann zum Beispiel durch Zugabe eines Fluoreszenzfarbstoffes z.B. Sypro®Ruby, Sypro Orange oder Sypro Red erfogen. Die Fluoreszenzfarbstoffe Sypro Ruby, Sypro Orange oder Sypro®Red können adsorptiv gebunden werden, z.B. durch hydrophobe, ionische oder Van-der-Waal'sche Kräfte.
In einem zweiten Trennschritt können Kapillaren eingesetzt werden, die entweder mit einem Polyacrylamidgel versehen sind oder die diese Substanz nicht enthalten, d.h. leer sind. Die Detektion der einzelnen Proteine erfolgt im zweiten Trennschritt mit laserinduzierter Fluoreszenz. Die empfindliche Fluoreszenzdetektion gewähleistet einen großen dynamischen Bereich und eine hohe Empfindlichkeit.
Um eine Verbesserung des Laufverhaltens der Proteine im Rahmen der Kapillarelektrophorese zu erzielen, kann Natriumdodecylsulfat zum Trennpuffer beigegeben werden. Durch die hohe Trennleistung der Kapillarelektrophorese wird eine wesentlich bessere Auflösung in der zweiten Dimension verglichen mit dem 2D-PAGE- Gelverfahren erreicht; ferner erlaubt die hohe Automatisierbarkeit beider Trennschitte, der FFE und de Kapillarelelctrophoese einen wesentlich höheren Durchsatz und damit eine bessere statistische Absicherung der erhaltenen Ergebnisse. Um die parallele Abarbeitung einer höheren Anzahl von Proteinproben nach der Free-Flow-Elektrophorese zu gewährleisten, können alle Vertiefungen einer Mikrotiterplatte parallel durch ebenso viele Kapillaren getrennt detektiert und quantifiziert werden. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, dass ein handelsübliches Gerät zur DNA-Sequenzierung eingesetzt wird.
In vorteilhafter Weise können in jeder Kapillare im zweiten Trennschritt gleichzeitig mehrere verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe detektiert werden. Dadurch lassen sich auch mehrere Proteinproben, die mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, simultan in einer Kapillare gleichzeitig trennen. Dies ermöglicht es, Proteinproben aus unterschiedlichen experimentellen Bedingungen nach dem FFE-IEF- Verfahren und Fluoreszenzmarl ierung zu vereinigen und in einem einzigen Kapillarelektrophoreselauf aufzutrennen. Die bisher notwendige Zuordnung der einzelnen Spots in den einzelnen Gelen, das sogenannte Matchen, entfällt.
Die empfindliche Fluoreszenzdetektion gewährleistet einen großen dynamischen Bereich und eine hohe Empfindlichkeit. Durch die hohe Trennleistung der Kapillarelektrophorese wird eine wesentlich bessere Auflösung in der zweiten Dimension verglichen mit dem 2D- PAGE-Gelverfahren erreicht. Aufgrund der hohen Automatisierbarkeit beider Trennschritte, der FFE und der Kapillarelektrophorese, wird ein wesentlich höherer Durchsatz und damit eine bessere statistische Absicherung der gemessenen Ergebnisse erwartet.
Die Auftrennung der Proteinproben im ersten Trennschritt kann z.B. in vorteilhafter Weise in eine Mikrotiterplatte erfolgen, wobei eine Mikrotiterplatte eingesetzt wird, deren Anzahl von Vertiefungen der der getrennten Proteinfraktionen entspricht. Die Anzahl der Kapillaren, die im zweiten Trennschritt gemäß der Kapillarelektrophorese eingesetzt werden, entspricht in vorteilhafter Weise der Anzahl der in die Mikrotiterplatte eingebrachten Probenfraktionen.
Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren, welches in zwei Trennschritten unter Ausnutzung der Free-Flow-Elektrophorese und der Kapillarelektrophorese erfolgt, sei nachfolgend näher beschrieben unter Benennung der benutzten Komponenten.
Bei der von Hannig entwickelten Free-Flow-Elektrophorese (Hannig in Electrophoresis 1982, 3, 235 - 243) fließt senlcrecht zu einem elelctrischen Feld ein kontinuierlicher
Pufferfilm. An einer Seite der Free-Flow-Elektrophoresekammer wird an einer definierten
Stelle die Proteinprobe zugeführt.
Im ersten Trennschritt können für das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren zwei unterschiedliche Methoden der Free-Flow-Elektrophorese eingesetzt werden: die isoelektrische Fokussierung und die Isotachophorese.
Zur isoelektrischen Fokussierung wird mit Hilfe von Trägerampholyten (Gerhard Weber und Petr Bocek in Electrophoresis 1998, 19, 1649 - 1653), die zusammen mit dem Puffer appliziert werden, ein pH-Gradient zwischen den beiden Elektroden senkrecht zur Fließrichtung des Pufferfilms erzeugt, der die Proteine auf Grund ihrer Ladung im freien Fluß auftrennt (FFE-IEF). Am anderen Ende der Free-Flow-Elektrophoresekammer werden die Einzelfraktionen durch eine Reihe von Schläuchen beispielsweise in den einzelnen Vertiefungen einer Mikrotiterplatte aufgesammelt.
Alternativ zur FFE-IEF kann die Isotachophorese im ersten Trennschritt verwendet werden. In einem diskontinuierlichen Puffersystem, bestehend aus Leit- und Folgeelektrolyt, bildet sich im elektrischen Feld ein Potentialgradient aus. Im Bereich der Ionen mit niedriger Mobilität ist die Feldstärke höher als im Bereich der mobileren Ionen. Da die Wanderung aller Ionen mit gleicher Geschwindigkeit erfolgen muß, bilden sich aus dem Proteinprobengemisch reine Zonen der einzelnen Proteine aus. Im Gleichgewichtszustand folgt das Ion mit der höchsten Mobilität dem Leit-Ion des Leitelektrolyten, das mit der niedrigsten Mobilität wandert vor dem Folgeelektrolyten, die anderen wandern dazwischen in der Reihenfolge abnehmender Mobilitäten. In der Praxis wird eine Intervall-Isotachophorese durchgeführt (Gerhard Weber und Petr Bocek in Electrophoresis 1998, 19, 3090 - 3093). Nach dem Aufbringen der Proteinprobe und der Elektrolyte auf die Free-Flow-Elektrophoresekammer wird für 2 Minuten Hochspannung zur Trennung der Proteine angelegt, anschließend werden die getrennten Fraktionen spannungslos über eine Reihe von Schläuchen in die einzelnen Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gefördert.
Für den erfϊndungsgemäß vorgeschlagenen ersten Schritt zur Trennung der Proteine - sowohl für die FFE-IEF als auch für die Free-Flow-Isotachophorese - wird beispielsweise das Elektrophoresegerät "OCTOPUS" der Firma Dr. Weber GmbH eingesetzt.
In diesem Elektrophoresegerät werden nach der isoelektrischen Fokussierung (FFE-IEF) oder der Isotachophorese einzelne Proteinfraktionen (vorzugsweise 96) in Mikrotiterplatten erhalten. Die Proteine in diesen Fraktionen können sowohl mit einem Markierungsstoff beispielsweise einer Fluoreszenzfarbstoff wie Sypro®Orange, Sypro®Red oder Sypro®Ruby als auch mit mindestens einem reaktiven Fluoreszenzfarbstoff verknüpft werden. Dazu eignen sich Derivate wie beispielsweise die N-Hydroxysuccinimidester (NHS-Ester) oder die Isothiocyanate von Fluoreszenzfarbstoffen, die an freie Aminogruppen der Proteine gekoppelt werden. Insbesondere eigenen sich N-Termini oder Lysine der Proteine bzw. der Proteinfralctionen. Daneben sind auch Verknüpfungen von entsprechenden derivatisierten Fluoreszenzfarbstoffen an die Carboxylat-, Thiol- und Hydroxylgruppen der Proteine ohne weiteres möglich. Der bei der Verwendung von kovalent gebundenen Fluoreszenzfarbstoffen erzielbare Vorteil ist vor allem darin zu erblicken, dass in jeder Kapillare im nachfolgenden Trennschritt mehrere mit unterschiedlichen Farbstoffen markierten Proben gleichzeitig detektiert werden können.
Im zweiten Trennschritt lassen sich z.B. kovalent fluoreszenzmarkierte Proteine mit Hilfe der Kapillarelektrophorese separieren. Die eingesetzten ein- oder mehreren Kapillarröhrchen können einerseits mit einer Polyacryamidgel gefüllt werden, andererseits ist auch der Einsatz unbeladener, d.h. leerer Kapillarröhrchen möglich.
Die Detektion folgt bevorzugt mit laserinduzierter Fluoreszenz, wobei zur Verbesserung des Laufverhaltens der Proteine in der Kapillarelektrophorese Natriumdodecylsulfat zum Trennpuffer gegeben werden kann. Idealerweise werden alle Vertiefungen der Mikrotiterplatte parallel in ebensovielen Kapillaren getrennt detektiert und quantifiziert. Es wird in bevorzugter und einfacher Weise ein handelsübliches Gerät zur DNA- Sequenzierung eingesetzt, beispielsweise ein Mega-BACE von Amersham Pharmacia oder ein anderes Gerät ähnlicher Bauart. Ein Vorteil gegenüber der herkömmlichen 2D- Gelelektrophorese mit anschließender nicht-kovalenter Färbung mit Bildauswertung zur Quantifizierung liegt darin, dass die nach der hier beschriebenen Methode erhaltenen Elektropherogramme mit handelsüblicher Software leicht quantifizierbar sind.
In jeder Kapillare, die gemäß des zweiten Auftrennschrittes im Rahmen der Kapillarelektrophorese eingesetzt werden kann, können in einer Ausführungsvariante des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens gleichzeitig mehrere verschiedene Markierungsstoffe wie z.B: Fluoreszenzfarbstoffe detektiert werden. Ebenso gut lässt sich in Abwandlung dieses Verfahrens lediglich ein Fluoreszenzfarbstoff oder Fluoreszenzstoff detektieren. Daher lassen sich auch mehrere Proteinproben, die mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert worden sind, mischen und simultan in einer einzigen Kapillare trennen. Dieser Umstand trägt im zweiten Verfahrensschritt zu einer Parallelisierung, d.h. einer parallelen Bearbeitung mehrerer Proben gleichzeitig bei. Vorzugsweise handelt es sich bei den in einem Lauf analysierten mehreren Proben um Proteine aus unterschiedlichen Zellen oder aus Zellen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien oder aus Zellen, die unterschiedlichen äußeren Bedingungen (wie z.B. Hitze, Kälte, Wirkstoffe, Chemikalien etc.) ausgesetzt waren.
Durch die wesentlich empfindlicher einzustufende Fluoreszenzdetektion ist ein großer dynamischer Bereich und eine hohe Empfindlichkeit gewährleistet. Weiterhin kann durch die hohe Trennleistung innerhalb der Kapillarelektrophorese eine wesentlich bessere
Auflösung der Proteinproben oder der Proteinproben zellulären Ursprungs in der zweiten Dimension, verglichen mit den 2D-PAGE-Verfahren, erreicht werden. Aufgrund der wesentlich besseren Automatisierbarkeit beider Methoden, der Free-Flow-Elektrophorese und der Kapillarelektrophorese, wird ein wesentlich höherer Durchsatz und damit eine bessere statistische Absicherung der Ergebnisse erfolgen. Nach Durchführung des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens ist eine Programmsequenz zur Auswertung der Elektropherogramme zur erstellen; ferner sind zur Realisierung des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens beispielsweise eine Free-Flow-Elektrophoreseapparatur („Octopus" der Firma Dr. Weber GmbH) erforderlich sowie beispielsweise ein Mega- BACE-Sequenzer der Firma Amersham oder ein ähnliches Gerät.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Auftrennung und Detektion von Proteinen oder Proteinproben zellulären Ursprungs, wobei die Proteine in einer Trennpufferlösung enthalten sind und die nachfolgenden Verfahrensschritte durchlaufen werden:
- die Proteinproben werden in einem ersten Trennschritt gemäß der Free-
Flow-Elektrophorese oder der isoelektrischen Fokussierung (IEF) oder der Isotachophorese in einzelne Fraktionen zerlegt und mit einem Markierungsstoff verknüpft,
- in einem zweiten Trennschritt werden die Proteinfraktionen gemäß der
Kapillarelektrophorese in einer oder mehreren Kapillaren aufgetremit, wobei in der einen Kapillare oder den mehreren Kapillaren mindestens ein mit den Proteinfraktionen verknüpfter Markierungsstoff detektiert wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass nach -dem ersten Trennschritt alle Proteine in den erhaltenen Proteinfraktionen mit einem reaktiven Fluoreszenzfarbstoff verknüpft werden.
3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass N- Hydroxysuccinimidester (NHS-Ester) oder Isothiocyanate von Fluoreszenzfarbstoffen an freie Aminogruppen der Proteine gekoppelt werden.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Kopplungsstellen freie Aminogruppen wie N-Termini oder Lysine der Proteine sind.
5. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass Jodoacetamido- Maleimid-, [Acetylmercaptosuccinoyljamino- (=SAMSA), Pyridyldithiopropionamid- (=PDP) oder Bromomethyl-Derivate von Fluoreszenzfarbstoffen an freie Sulfhydrilgruppen der Proteine gekoppelt werden.
6. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die reaktiven Fluoreszenzfarbstoffe an Carboxylat-, Thiol- oder Hydroxylgruppen der Proteine gekoppelt werden.
7. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Kopplungsstelle freie Sulfhydrilgruppen der Cysteine sind.
8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem ersten Trennschritt aller Proteine in den erhaltenen Proteinfraktionen mit einem fluoreszierenden Markierungsstoff versetzt werden.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungsstoffe adsorptiv durch van-der-Waals'sche, ionische oder hydrophobe Wechselwirkungen an die Proteine gebunden sind.
10. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im zweiten Trennschritt die eingesetzten Kapillaren ein Polyacrylamidgel enthalten.
11. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im zweiten Trennschritt die eingesetzten Kapillaren Agarose enthalten.
12. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im zweiten Trennschritt die eingesetzten Kapillaren kein Gel enthalten.
13. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im zweiten Trennschritt die eingesetzten Kapillaren eine synthetisches Polymermatrix enthalten.
14. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion im zweiten Auftrennschritt mit laserinduzierter Fluoreszenz erfolgt.
15. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass während der Kapillar- Elektrophorese Natriumdodecylsulfat zum die Proteine enthaltenden Trennpuffer beigegeben wird.
16. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Auftrennung der Proteinproben im ersten Trennschritt parallelisiert in vorzugsweise 96 verschiedenen Proteinfraktionen erfolgt, wobei eine Mikrotiterplatte eingesetzt wird, deren Anzahl von Vertiefungen der der getrennten Proteinfraktionen entspricht.
7. Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Anzahl der Kapillaren im zweiten Trennschritt der Anzahl oder einem Teil der auf die Mikrotiterplatte aufgebrachten Anzahl von Proteinfraktionen entspricht.
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