DE10056838A1 - Verfahren zur Trennung und Detektion von Proteinen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Auftrennung und Detektion von Proteinen, wobei die Proteinproben in einer Trennpufferlösung enthalten sind. Die Auftrennung der Proteine erfolgt in zwei Schritten: DOLLAR A Zunächst werden die Proteine oder die Proteinprobe zellulären Ursprungs in einem ersten Trennschritt gemäß der Free-Flow-Elektrophorese nach der isoelektrischen Fokussierung (IEF) oder der Isotachophorese in einzelne Proteinfraktionen zerlegt und mit einem reaktiven Markierungsstoff verknüpft. In einem zweiten Trennschritt werden die Proteinfraktionen mit der Kapillarelektrophorese in mehreren Kapillaren gleichzeitig aufgetrennt, wobei in den einzelnen Kapillaren gleichzeitig mehrere verschiedene reaktive Markierungsstoffe detektiert werden können.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Trennung und Detektion von Proteinen, um eine Beschleunigung der Proteomanalytik zu erreichen.

Als Proteom bezeichnet man alle Proteine eines Organismus, einer Zelle, einer Organelle oder einer Körperflüssigkeit zu einem definierten Zeitpunkt und unter genau definierten Bedingungen detektiert und quantifiziert. In der Proteomanalytik werden Proteine daraufhin untersucht, welche Proteine welche Rolle in biologischen Vorgängen spielen und welchen Proteinen eine besondere Bedeutung in Wechselwirkung mit anderen Proteinen zukommt. Ferner wird im Rahmen der Proteomanalytik der Frage nachgegangen, inwieweit Chemikalien, Wirkstoffe und andere externe Faktoren (Umwelteinflüsse, Hitze, Kälte, Wassermangel, pH-Wert etc.) die zelluläre Proteinexpression beeinflussen. In der Toxikologie und Pharmakologie wird mit der Proteomanalytik des weiteren versucht, zu ergründen, welche Proteine in welchen Proteinkonstellationen für welche Nebenwirkungen verantwortlich sein können. Schließlich wird der Frage nachgegangen, ob die Proteinexpression von Mikroorganismen derart beeinflusst werden kann, daß die Raum- Zeit-Ausbeuten von fermentativen Produktionsprozessen verbessert werden können.

Aus technischen Gründen - sowohl die Trennung als auch die Detektion betreffend - ist eine vollständige quantitative Beobachtung und Auswertung aller Proteine eines Proteoms bisher nicht möglich; hydrophobe Proteine, Proteine extremer Größe, seien sie besonders groß oder besonders klein, stark sauer oder stark basisch, verursachen ernsthafte Probleme bei der Trennung solcher Proteine, so daß sich vollständige Proteome selbst unter sonst optimalen Bedingungen nicht detektieren lassen. Gegenwärtig wird davon ausgegangen, daß erheblich mehr als 50% aller exprimierten Proteine quantitativ erfaßt werden können.

Ein erhebliches Problem stellt angesichts der unübersehbaren Vielzahl von exprimierten Proteinen die Probenaufbereitung dar. In der Phase der Probenaufbereitung werden die Weichen dafür gestellt, auch komplex aufgebaute Proteinmuster zu trennen und zu identifizieren.

Es hat sich herausgestellt, daß die Löslichkeit die Auftrennung von Proteinen erheblich beeinflußt. Proteine, die sich schnell in Wasser lösen, bereiten in der Regel keine Probleme hinsichtlich der Auftrennbarkeit.

Proteine mit stabilen Sekundär- oder Tertiärstrukturen, die schwer wasserlöslich sind, werden hinsichtlich ihres Löslichkeitsverhaltens durch Zugabe von chaotropen Substanzen wie beispielsweise Guanidin-Hydrochlorid oder Harnstoff stabilisiert. Dabei kann es jedoch zu unerwünschten Reaktionen einzelner Proteine kommen, wodurch ein ursprünglich in einer Form vorliegendes Protein in mehrere Formen übergeht und so die Heterogenität der bereits vorliegenden Probe zusätzlich erweitert.

Membran-Proteine, deren natürliche Umgebung Lipidmembranen sind und die während ihrer Isolation voneinander direkt wieder zum Agglomerieren neigen und wieder unlöslich werden, sind besonders schwer zu handhaben. Diese hydrophoben Proteine können nur im gelösten Zustand gehalten werden, wenn Detergentien zugegeben werden, die jedoch häufig die nachfolgenden Stadien der Proteinauftrennung beeinträchtigen können.

Hohe Proteinkonzentrationen sind zwar für die meisten Auftrennverfahren und Auswerteprozeduren im hohen Maße erwünscht, gehen jedoch mit dem Risiko einher, daß sich Aggregationen ausbilden. Im Gegensatz dazu sind niedrige Proteinkonzentrationen, die sich positiv auf das Löslichkeitsverhalten auswirken, mit zusätzlichen Vorbereitungsschritten vor der eigentlichen Separation verbunden.

Die bisherigen Auftrenntechniken im Bereich der molaren Masse von Proteinen sind die Elektrophorese einerseits und die Chromatographie andererseits. Jedoch vermag keine dieser beiden Auftrenntechniken von Proteinen alleine wesentlich mehr als 100 verschiedene Komponenten zu trennen. Da jedoch eine einfache Zelle in der Regel mehrere Tausend verschiedene Spezies von Proteinen enthält und die Menge der in einer Probe enthaltenen Proteine um den Faktor 10⁶ differieren kann, muß eine ausreichend große Trennkapazität zur Verfügung gestellt werden, die nur durch gekoppelte, mehrdimensionale Auftrennverfahren geschaffen werden kann.

Proteine haben den Charakter von Zwitterionen und können dementsprechend positiv oder negativ geladen sein. Mit Elektrophoreseverfahren können einzelne Komponenten entsprechend ihrer Mobilität im elektrischen Feld getrennt werden. Die elektrophoretische Mobilität jedes Proteins ist ein charakteristischer Wert. Im Rahmen der Proteomanalytik werden zwei Elektrophorese-Verfahren angewendet, die isoelektrische Fokussierung (IEF) und die Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE).

Bei der isoelektrischen Fokussierung bewegen sich die einzelnen Proteine auf dem Gel innerhalb eines pH-Gradienten zu ihrem jeweiligen isoelektrischen Punkt, an dem sie ihre Nettoladung ausgleichen und so ihre elektrophoretische Mobilität einbüßen. Bewegt sich ein Protein aufgrund thermischer Diffusionserscheinungen aus der pH-Region, die der isoelektrischen Ladung entspricht, so nimmt es wieder eine Ladung an und bewegt sich im elektrischen Feld wieder zurück zu der Stelle im pH-Gradienten, die seinem isoelektrischen Punkt entspricht.

Das SDS-PAGE-Verfahren sieht das Beladen sämtlicher Proteine mit Natriumdodecylsulfat (= SDS) vor; die negativen SDS-Protein-Komplexe bewegen sich in Richtung Anode im elektrischen Feld und lassen sich entsprechend ihrer molekularen Größen in der Polyacrylamidmatrix trennen.

Aus der Kombination des IEF- und des SDS-PAGE-Verfahrens entstand die 2D-Gel- Elektrophorese (2D-PAGE) nach Klose und O'Farrell 1975 (J. Biol. Chem. 1975, 250, 4007 bis 4020; Humangenetik 1975, 25, 231 bis 245).

Dieses Verfahren sieht eine Trennung der Proteine in der ersten Dimension mit der iso­ elektrischen Fokussierung nach ihrem isoelektrischen Punkt vor. Als zweite Dimension wird eine Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zur Auftrennung der Proteine nach ihrer Größe durchgeführt. Diese Methode stellt derzeit die einzige Vorgehensweise dar, mit der komplexe Proteinmixturen mit hoher Auflösung aufgetrennt werden können. Die Vorteile des 2D-PAGE-Verfahrens sind die zwei zueinander komplementären Trennprinzipien, nämlich IEF- und SDS-PAGE-Verfahren nach Ladung und Molgewicht. Diese Technik läßt sich prinzipiell bei allen Proteinen nutzen. Das Auflösungsvermögen dieser Methode kann durch den Einsatz von engen pH-Gradienten in der isoelektrischen Fokussierung deutlich erhöht werden ("Zoom-Gele").

Andererseits bestehen bei diesem Verfahren auch Nachteile; so ist einige Erfahrung und Geschick bei der Probenaufbereitung erforderlich. Die Auftragsmenge ist begrenzt, so daß schwach exprimierte Proteine nicht direkt detektiert werden können. Protein-Transfer von der ersten zur zweiten Dimension ist schwierig und schlecht reproduzierbar. Eine einfache Automatisierungsmöglichkeit besteht bei diesem Verfahren nicht. Auch werden nicht alle Proteine durch dieses Verfahren detektiert. Für Molekulargewichte kleiner als 10.000 und für Molekulargewichte größer als 100.000 werden keine befriedigenden und aussagekräftigen Resultate erhalten. Nach der Trennung im Gel müssen die Proteine noch aufwändig gefärbt werden.

Das Färben erfolgt beispielsweise mit Farbstoffen wie Coomassie-Blau, mit kolloidalem Silber, mit Zink/Imidazol oder mit Fluoreszenzfarbstoffen wie Sypro®Ruby, Sypro®Orange oder Sypro®Red. Allen eingesetzten Färbemethoden ist gemeinsam, daß die Bindung zwischen Protein und Färbereagenz nicht kovalent, sondern auf der Basis von ionischen, hydrophoben oder van-der-Waals-Wechselwirkungen erfolgt. Im Anschluß an die Färbung werden die Gele in der Regel mit Hilfe eines Scanners oder eines Fluoreszenz- Scanners digitalisiert.

In US 6,043,025 und in US 6,127,134 wird ein Prozeß und ein Kit beschrieben, mit welchem man Unterschiede in zwei oder mehr Proteinproben detektieren kann. Die Proteinextrakte von unterschiedlichen Proben werden mit verschiedenen, positiv geladenen Fluoreszenzfarbstoffen kovalent markiert, vereinigt und der 2D-PAGE unterworfen. Identische Proteine aus den verschiedenen Proben können dann an Hand ihrer unterschiedlichen Fluoreszenzwellenlängen im gleichen Gel detektiert und quantifiziert werden.

Alternativ zu diesen Färbemethoden können auch radioaktive Verfahren eingesetzt werden. Dazu werden die Zellen mit bestimmten isotopenmarkierten Verbindungen wie beispielsweise ³⁵S-Cystein oder ³²PO₄ ^3- versetzt. Im Anschluß an die 2D-PAGE wird zur Digitalisierung in diesen Fällen gewöhnlich ein Phosphorimager eingesetzt. Mit Bildauswerteprogrammen wie beispielsweise MELANIE, PDQUEST, IMAGEMASTER oder Z3 werden in den erhaltenen digitalisierten Gelen anschließend die Proteinspots detektiert, quantifiziert und zugeordnet. Die Erkennung der einzelnen Spots sowie die Zuordnung der Spots zwischen den einzelnen Gelen (= "Matchen") sind sehr zeitaufwändig und erfordern manuelles Eingreifen des Operators.

Die gesamte Prozedur ausgehend von der Elektrophorese bis hin zur Färbung, Detektion und Quantifizierung gemäß des 2D-PAGE-Verfahrens ist sehr aufwändig.

Angesichts der skizzierten technischen Probleme liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Trennverfahren für Proteine zu entwickeln, welches den Einsatz von Gelen reduziert, schnell und einfach durchführbar sowie automatisierbar ist und eine einfache Quantifizierung der aufgetrennten Proteine erlaubt.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zur Auftrennung und Detektion von Proteinen gelöst, wobei die Proteinproben in einer Trennpufferlösung enthalten sind und die nachfolgenden Verfahrensschritte durchlaufen werden:

• - Die Proteinproben werden in einem ersten Trennschritt gemäß der Free- Flow-Elektrophorese mit der isoelektrischen Fokussierung (IEF) oder der Isotachophorese in einzelne Fraktionen zerlegt und mit einem reaktiven Markierungsstoff verknüpft;
• - in einem zweiten Trennschritt werden die Proteinfraktionen gemäß der Kapillarelektrophorese in vorzugsweise mehreren Kapillaren gleichzeitig aufgetrennt, wobei in den einzelnen Kapillaren gleichzeitig mehrere verschiedene reaktive Markierungsstoffe detektiert werden.

Die Vorteile des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens sind vor allem darin zu erblicken, daß die Auftrennung der Proteine bzw. der zellulären Proteine nunmehr automatisierbar bei mehreren Proben gleichzeitig erfolgen kann. Dadurch läßt sich der Probendurchsatz erheblich steigern. Ferner kann mit dem erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren die jetzige komplizierte personalintensive Bildauswertung entfallen. Ferner kann die aufzutragende Probenauftragsmenge erheblich verringert werden. Durch ein geeignetes Markierungsverfahren wie die Fluoreszenzmarkierung kann die Empfindlichkeit und damit das Auflösungsvermögen hinsichtlich der Detektion schwach exprimierter Proteine erheblich erhöht werden.

In einer vorteilhaften Ausführungsvariante des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens werden nach dem ersten Trennschritt erhaltenen Proteinfraktionen mit einem reaktiven Fluoreszenzfarbstoff verknüpft. Dies kann z. B. durch Kopplung der N- Hydroxysuccinimidester (NHS-Ester) oder Isothiocyanate von Fluoreszenzfarbstoffen an freie Aminogruppen der Proteine erfolgen. Vorzugsweise werden an den Proteinen die freien Aminogruppen der N-Termini oder Lysine als Kopplungsstellen ausgewählt.

Im Unterschied zu Fluoreszenzfärbungen im Polyacrylamidgel sind die Farbstoffe beim erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahren kovalent an die einzelnen Proteine gebunden. Die üblicherweise nach der 2D-Elektrophorese verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe wie Sypro®Ruby, Sypro®Orange oder Sypro®Red sind nur adsorptiv gebunden, beispielsweise durch hydrophobe, ionische oder van-der-Waals Kräfte. In einem zweiten Trennschritt werden Kapillaren eingesetzt, die in bevorzugter Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens Polyacrylamidgel enthalten. Die Detektion der einzelnen Proteine erfolgt im zweiten Trennschritt mit laserinduzierter Fluoreszenz.

Um eine Verbesserung des Laufverhaltens der Proteine im Rahmen der Kapillarelektrophorese zu erzielen, kann Natriumdodecylsulfat zum Trennpuffer beigegeben werden.

Um die parallele Abarbeitung einer höheren Anzahl von Proteinproben nach der Free- Flow-Elektrophorese zu gewährleisten, können alle Vertiefungen einer Mikrotiterplatte parallel durch ebenso viele Kapillaren getrennt detektiert und quantifiziert werden. Dies kann beispielsweise dadurch erreicht werden, daß ein handelsübliches Gerät zur DNA- Sequenzierung eingesetzt wird.

In vorteilhafter Weise können in jeder Kapillare im zweiten Trennschritt gleichzeitig mehrere verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe detektiert werden. Dadurch lassen sich auch mehrere Proteinproben, die mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind, simultan in einer Kapillare gleichzeitig trennen. Dies ermöglicht es, Proteinproben aus unterschiedlichen experimentellen Bedingungen nach dem FFE-IEF-Verfahren und Fluoreszenzmarkierung zu vereinigen und in einem einzigen Kapillarelektrophoreselauf aufzutrennen. Die bisher notwendige Zuordnung der einzelnen Spots in den einzelnen Gelen, das sogenannte Matchen, entfällt.

Die empfindliche Fluoreszenzdetektion gewährleistet einen großen dynamischen Bereich und eine hohe Empfindlichkeit. Durch die hohe Trennleistung der Kapillarelektrophorese wird eine wesentlich bessere Auflösung in der zweiten Dimension verglichen mit dem 2D- PAGE-Gelverfahren erreicht. Aufgrund der hohen Automatisierbarkeit beider Trennschritte, der FFE und der Kapillarelektrophorese, wird ein wesentlich höherer Durchsatz und damit eine bessere statistische Absicherung der gemessenen Ergebnisse erwartet.

Die Auftrennung der Proteinproben im ersten Trennschritt kann z. B. in vorteilhafter Weise in eine Mikrotiterplatte erfolgen, wobei eine Mikrotiterplatte eingesetzt wird, deren Anzahl von Vertiefungen der der getrennten Proteinfraktionen entspricht. Die Anzahl der Kapillaren, die im zweiten Trennschritt gemäß der Kapillarelektrophorese eingesetzt werden, entspricht in vorteilhafter Weise der Anzahl der in die Mikrotiterplatte eingebrachten Anzahl von Probenfraktionen.

Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren, welches in zwei Trennschritten unter Ausnutzung der Free-Flow-Elektrophorese und der Kapillarelektrophorese erfolgt, sei nachfolgend näher beschrieben unter Benennung der benutzten Komponenten.

Bei der von Hannig entwickelten Free-Flow-Elektrophorese (Hannig in Electrophoresis 1982, 3, 235-243) fließt senkrecht zu einem elektrischen Feld ein kontinuierlicher Pufferfilm. An einer Seite der Free-Flow-Elektrophoresekammer wird an einer definierten Stelle die Proteinprobe zugeführt.

Im ersten Trennschritt können für das erfindungsgemäß vorgeschlagene Verfahren zwei unterschiedliche Methoden der Free-Flow-Elektrophorese eingesetzt werden: die isoelektrische Fokussierung und die Isotachophorese.

Zur isoelektrischen Fokussierung wird mit Hilfe von Trägerampholyten (Gerhard Weber und Petr Bocek in Electrophoresis 1998, 19, 1649-1653), die zusammen mit dem Puffer appliziert werden, ein pH-Gradient zwischen den beiden Elektroden senkrecht zur Fließrichtung des Pufferfilms erzeugt, der die Proteine auf Grund ihrer Ladung im freien Fluß auftrennt (FFE-IEF). Am anderen Ende der Free-Flow-Elektrophoresekammer werden die Einzelfraktionen durch eine Reihe von Schläuchen beispielsweise in den einzelnen Vertiefungen einer Mikrotiterplatte aufgesammelt.

Alternativ zur FFE-IEF kann die Isotachophorese im ersten Trennschritt verwendet werden. In einem diskontinuierlichen Puffersystem, bestehend aus Leit- und Folgeelektrolyt, bildet sich im elektrischen Feld ein Potentialgradient aus. Im Bereich der Ionen mit niedriger Mobilität ist die Feldstärke höher als im Bereich der mobileren Ionen. Da die Wanderung aller Ionen mit gleicher Geschwindigkeit erfolgen muß, bilden sich aus dem Proteinprobengemisch reine Zonen der einzelnen Proteine aus. Im Gleichgewichtszustand folgt das Ion mit der höchsten Mobilität dem Leit-Ion des Leitelektrolyten, das mit der niedrigsten Mobilität wandert vor dem Folgeelektrolyten, die anderen wandern dazwischen in der Reihenfolge abnehmender Mobilitäten. In der Praxis wird eine Intervall-Isotachophorese durchgeführt (Gerhard Weber und Petr Bocek in Electrophoresis 1998, 19, 3090-3093). Nach dem Aufbringen der Proteinprobe und der Elektrolyte auf die Free-Flow-Elektrophoresekammer wird für 2 Minuten Hochspannung zur Trennung der Proteine angelegt, anschließend werden die getrennten Fraktionen spannungslos über eine Reihe von Schläuchen in die einzelnen Vertiefungen einer Mikrotiterplatte eluiert.

Für den erfindungsgemäß vorgeschlagenen ersten Schritt zur Trennung der Proteine - sowohl für die FFE-IEF als auch für die Free-Flow-Isotachophorese - wird beispielsweise das Elektrophoresegerät "OCTOPUS" der Firma Dr. Weber GmbH eingesetzt.

In diesem Elektrophoresegerät werden nach der isoelektrischen Fokussierung (FFE-IEF) oder der Isotachophorese einzelne Proteinfraktionen (vorzugsweise 96) in Mikrotiterplatten erhalten. Die Proteine in diesen Fraktionen werden mit einem reaktiven Fluoreszenzfarbstoff verknüpft. Dazu eignen sich Derivate wie beispielsweise die N- Hydroxysuccinimidester (NHS-Ester) oder die Isothiocyanate von Fluoreszenzfarbstoffen, die an freie Aminogruppen der Proteine gekoppelt werden. Insbesondere eigenen sich N- Termini oder Lysine der Proteine bzw. der Proteinfraktionen. Daneben sind auch Verknüpfungen von entsprechenden derivatisierten Fluoreszenzfarbstoffen an die Carboxylat-, Thiol- und Hydroxylgruppen der Proteine ohne weiteres möglich. Der bei der Verwendung von kovalent gebundenen Fluoreszenzfarbstoffen erzielbare Vorteil ist vor allem darin zu erblicken, daß in jeder Kapillare im nachfolgenden Trennschritt mehrere mit unterschiedlichen Farbstoffen markierten Proben gleichzeitig detektiert werden können.

Im zweiten Trennschritt lassen sich die kovalent fluoreszenzmarkierten Proteine mit Hilfe einer Kapillarelektrophorese separieren. Vorzugsweise werden dazu die Kapillaren mit einem Polyacrylamidgel gefüllt. Die Detektion folgt bevorzugt mit laserinduzierter Fluoreszenz, wobei zur Verbesserung des Laufverhaltens der Proteine in der Kapillarelektrophorese Natriumdodecylsulfat zum Trennpuffer gegeben werden kann. Idealerweise werden alle Vertiefungen der Mikrotiterplatte parallel in ebensovielen Kapillaren getrennt detektiert und quantifiziert. Es wird in bevorzugter und einfacher Weise ein handelsübliches Gerät zur DNA-Sequenzierung eingesetzt, beispielsweise ein MEGA-Bace von Amersham Pharmacia oder ein anderes Gerät ähnlicher Bauart. Ein Vorteil gegenüber der herkömmlichen 2D-Gelelektrophorese mit anschließender nicht- kovalenter Färbung mit Bildauswertung zur Quantifizierung liegt darin, daß die nach der hier beschriebenen Methode erhaltenen Elektropherogramme mit handelsüblicher Software leicht quantifizierbar sind.

In jeder Kapillare, die gemäß des zweiten Auftrennschrittes im Rahmen der Kapillarelektrophorese Verwendung findet, können gleichzeitig mehrere verschiedene Fluoreszenzfarbstoffe detektiert werden. Deshalb lassen sich auch mehrere Proteinproben, die mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert worden sind, mischen und simultan in einer einzigen Kapitallare trennen. Dieser Umstand trägt im zweiten Verfahrensschritt zu einer Parallelisierung, d. h. einer parallelen Bearbeitung mehrerer Proben gleichzeitig bei. Vorzugsweise handelt es sich bei den in einem Lauf analysierten mehreren Proben um Proteine aus unterschiedlichen Zellen oder aus Zellen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien oder aus Zellen, die unterschiedlichen äußeren Bedingungen (wie z. B. Hitze, Kälte, Wirkstoffe, Chemikalien etc.) ausgesetzt waren.

Durch die wesentlich empfindlicher einzustufende Fluoreszenzdetektion ist ein großer dynamischer Bereich und eine hohe Empfindlichkeit gewährleistet. Weiterhin kann durch die hohe Trennleistung innerhalb der Kapillarelektrophorese eine wesentlich bessere Auflösung der Proteinproben oder der Proteinproben zellulären Ursprungs in der zweiten Dimension, verglichen mit den 2D-PAGE-Verfahren, erreicht werden. Aufgrund der wesentlich besseren Automatisierbarkeit beider Methoden, der Free-Flow-Elektrophorese und der Kapillarelektrophorese, wird ein wesentlich höherer Durchsatz und damit eine bessere statistische Absicherung der Ergebnisse erfolgen. Nach Durchführung des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens ist eine Programmsequenz zur Auswertung der Elektropherogramme zur erstellen; Ferner sind zur Realisierung des erfindungsgemäß vorgeschlagenen Verfahrens beispielsweise eine Free-Flow-Elektrophoreseapparatur ("Octopus" der Firma Dr. Weber GmbH) erforderlich sowie beispielsweise ein MEGA- Bace-Sequenzer der Firma Amersham oder ein ähnliches Gerät.

Claims (13)

1. Verfahren zur Auftrennung und Detektion von Proteinen oder Proteinproben zellulären Ursprungs, wobei die Proteine in einer Trennpufferlösung enthalten sind und die nachfolgenden Verfahrensschritte durchlaufen werden:

• - die Proteinproben werden in einem ersten Trennschritt gemäß der Free- Flow-Elektrophorese nach der isoelektrischen Fokussierung (IEF) oder der Isotachophorese in einzelne Fraktionen zerlegt und mit einem reaktiven Markierungsstoff verknüpft,
• - in einem zweiten Trennschritt werden die Proteinfraktionen gemäß der Kapillarelektrophorese in mehreren Kapillaren gleichzeitig aufgetrennt, wobei in den einzelnen Kapillaren gleichzeitig mehrere verschiedene reaktive Markierungsstoffe detektiert werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß nach dem ersten Trennschritt alle Proteine in den erhaltenen Proteinfraktionen mit einem reaktiven Fluoreszenzfarbstoff verknüpft werden.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß N- Hydroxysuccinimidester (NHS-Ester) oder Isothiocyanate von Fluoreszenzfarbstoffen an freie Aminogruppen der Proteine gekoppelt werden.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplungsstellen freie Aminogruppen wie N-Termini oder Lysine der Proteine sind.

5. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktiven Fluoreszenzfarbstoffe an Carboxylat-, Thiol- oder Hydroxylgruppen der Proteine gekoppelt werden.

6. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im zweiten Trennschritt die eingesetzten Kapillaren ein Polyacrylamidgel enthalten.

7. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im zweiten Trennschritt die eingesetzten Kapillaren Agarose enthalten.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im zweiten Trennschritt die eingesetzten Kapillaren kein Gel enthalten.

9. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im zweiten Trennschritt die eingesetzten Kapillaren eine synthetisches Polymermatrix enthalten.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Detektion im zweiten Auftrennschritt mit laserinduzierter Fluoreszenz erfolgt.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß während der Kapillar- Elektrophorese Natriumdodecylsulfat zum die Proteine enthaltenden Trennpuffer beigegeben wird.

12. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Auftrennung der Proteinproben im ersten Trennschritt parallelisiert in vorzugsweise 96 verschiedenen Proteinfraktionen erfolgt, wobei eine Mikrotiterplatte eingesetzt wird, deren Anzahl von Vertiefungen der der getrennten Proteinfraktionen entspricht.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Anzahl der Kapillaren im zweiten Trennschritt der Anzahl oder einem Teil der auf die Mikrotiterplatte aufgebrachten Anzahl von Proteinfraktionen entspricht.