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Technisches
Gebiet
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Das
Gebiet der vorliegenden Anwendung betrifft die Auftrennung und Konzentrierung
von ampholytischen Verbindungen. Genauer betrifft die vorliegende
Anmeldung ein Verfahren zur Veränderung der
Zusammensetzung von Proben, die mindestens einen ampholytischen
Probenbestandteil umfassen, unter Verwendung von pH-beeinflussten
isoelektrischen Einfangtechniken.
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Hintergrund
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Elektrophoretische
Techniken und isoelektrische Fokussierungs (IEF)-Techniken im Besonderen bleiben
Schlüsseltechnologien
für die
Auftrennung von ampholytischen Bestandteilen, gleichermaßen von
kleinen und großen,
einfachen und komplexen. IEF wird auf vielen Gebieten und in vielen
Industriezweigen und sowohl im analytischen als auch im präparativen
Maßstab
ausgeführt.
Zum Beispiel wird IFE in der klinischen Diagnostik, Biotechnologie,
pharmazeutischen und Lebensmittel-Industrie etc. allein oder in
Verbindung mit anderen analytischen oder präparativen Techniken verwendet.
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Bei
der IEF werden ampholytische Bestandteile mit Hilfe eines elektrischen
Feldes über
einen pH-Gradienten aufgetrennt, in dem der pH von einem niedrigeren
pH-Wert an der Anode zu einem höheren pH-Wert
an der Kathode ansteigt. (Bezüglich
einer Monographie über
IEF siehe z.B. P.G. Righetti, Isoelectric focusing: theory, methodology
and applications, Elsevier Biomedical, Amsterdam, 1983). Da die Nettoladung
eines ampholytischen Bestandteils in seinem isoelektrischen Zustand
Null beträgt,
wird die elektrophoretische Wanderungsgeschwindigkeit eines ampholytischen
Bestandteils Null, wann immer der pH seiner Umgebung den gleichen
Wert annimmt wie sein isoelektrischer Punkt (pI). Somit hören ampholytische
Verbindungen mit verschiedenen isoelektrischen Punkten im pH-Gradient an verschiedenen
Stellen auf zu wandern.
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Vergleichsweise
stabile kontinuierliche pH-Gradienten können auf mehrere Arten erzeugt werden.
Zum Beispiel können
Mischungen von Trägerampholyten
(Verbindungen, die im Bereich ihres pI-Wertes eine geeignete Pufferfähigkeit
und Leitfähigkeit
aufweisen) verwendet werden. Auch können angemessene Mengen geeigneter
schwacher Säuren
und schwacher Basen oder schwacher Säuren und starker Basen oder
starker Säuren
und schwacher Basen auf eine räumlich
kontrollierte Weise in eine Ionen-permeable Matrix wie quervernetztes
Polyacrylamidgel gebunden werden, um einen pH-Gradienten vorab auszubilden
und zu stabilisieren, der anschließend für IEF mit immobilisiertem pH-Gradienten (IPGIEF)
verwendet wird. (Bezüglich
einer Monographie über
IPGIEF siehe z.B. P.G. Righetti, Immobilized pH gradients: theory
and methodology, Elsevier, Amsterdam, 1990).
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Alternativ
können
ampholytische Probenbestandteile auch durch isoelektrisches Einfangen (IET)
unter Verwendung von Membran-basierten Multi-Kompartiment-Elektrolysegeräten (z.B.
Faupel et al., U.S. Patent Nummer 5,082,548) voneinander getrennt
werden, wobei ampholytische Probenbestandteile am Ende eines IET-Trennungsvorgangs
in ihrem isoelektrischen Zustand erhalten werden.
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Zusammenfassung
der Erfindung:
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Ausführungsformen
der vorliegenden Anmeldung verändern
die anfängliche
Zusammensetzung einer Probe, die mindestens einen ampholytischen
Bestandteil enthält,
elektrophoretisch unter Verwendung eines pH-beeinflussten isoelektrischen Einfang
(IET)-Vorgangs durch
Zugabe von einem oder mehreren geeigneten isoelektrischen Puffern, die
eine angemessene Puffer- und Titrationskapazität sowie Leitfähigkeit
im Bereich ihrer pI-Werte
aufweisen, um einen ampholytischen Probenbestandteil am Ende des
IET-Vorgangs in seinem nicht-isoelektrischen Zustand zu erhalten.
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Kurz
gesagt sieht ein gemäß der vorliegenden
Anmeldung praktiziertes Verfahren das Auswählen eines elektrophoretischen
Trennsystems vor, das mindestens eine Ionen-permeable, isoelektrische Barriere aufweist,
das Auswählen
eines Anolyten, der einen niedrigeren pH-Wert als den pI-Wert des ampholytischen
Probenbestandteils aufweist, das Auswählen eines Katolyten, der einen
höheren pH-Wert
als den pI-Wert des ampholytischen Probenbestandteils aufweist,
das Bereitstellen eines isoelektrischen Puffers, der einen pI-Wert
aufweist, der höher
als der pH-Wert des Anolyten und niedriger als der pH-Wert des Katolyten
und verschieden von dem pI-Wert des ampholytischen Probenbestandteils
ist, das Einführen
der Probe und des isoelektrischen Puffers in das Elektrophoresesystem
und das Einfangen des ampholytischen Probenbestandteils in einem nicht-isoelektrischen
Zustand, indem eine elektrophoretische Auftrennung vorgenommen wird.
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Ein
Aspekt sieht das Auswählen
eines elektrophoretischen Trennsystems, das ein oder mehrere Trennkompartimente
aufweist, vor. Ein weiterer Aspekt sieht das Auswählen von
zwei oder mehr Ionen-permeablen, isoelektrischen Barrieren vor,
die von den pI-Werten des ampholytischen Probenbestandteils und
des isoelektrischen Puffers verschiedene pI-Werte aufweisen.
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Ein
weiterer Aspekt sieht das Auswählen
eines zweiten isoelektrischen Puffers vor, der einen von den pI-Werten
des ampholytischen Probenbestandteils, des ersten isoelektrischen
Puffers und der isoelektrischen Barriere verschiedenen pI-Wert aufweist.
Ein weiterer Aspekt sieht das Einfangen eines ersten ampholytischen
Probenbestandteils und eines zweiten ampholytischen Probenbestandteils
in ihren nicht-isoelektrischen Zuständen auf den beiden Seiten
einer isoelektrischen Barriere vor, indem eine elektrophoretische
Auftrennung vorgenommen wird.
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In
einem ersten Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zum Abtrennen
eines ampholytischen Bestandteils durch Elektrophorese bereit, wobei
das Verfahren umfasst:
Anordnen einer Probe, die einen ampholytischen
Bestandteil umfasst, der einen pI-Wert aufweist, in ein Elektrophoresetrennsystem,
das einen Anolyten, der einen pH aufweist, und einen Katolyten,
der einen pH aufweist, umfasst, wobei der pH des Katolyten höher ist
als der pH des Anolyten, und das eine oder mehrere Ionen-permeable
Barrieren umfasst, die zwischen dem Anolyten und dem Katolyten angeordnet sind,
wobei mindestens eine der Barrieren eine isoelektrische Barriere
ist, die einen pI-Wert aufweist, der höher als der pH des Anolyten
und niedriger als der pH des Katolyten ist,
Bereitstellen eines
isoelektrischen Puffers, der einen pH-Wert aufweist, der höher als
der pH des Anolyten, niedriger als der pH des Katolyten, verschieden
von dem pI-Wert des ampholytischen Probenbestandteils und verschieden
von dem pI-Wert der Ionen-permeablen isoelektrischen Barriere ist,
und
Exponieren
der Probe gegenüber
einem elektrischen Potential, um den ampholytischen Probenbestandteil in
einem nicht-isoelektrischen Zustand in Gegenwart des isoelektrischen
Puffers in dem Elektrophoresesystem einzufangen.
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Bevorzugterweise
umfasst das Elektrophoresetrennsystem ein Anodenkompartiment, das
eine Anode umfasst und ausgeführt
ist, den Anolyten aufzunehmen, ein Kathodenkompartiment, das eine
Kathode umfasst und ausgeführt
ist, den Katolyten aufzunehmen, und eine Ionen-permeable Barriere in der Form einer
Ionen-permeablen isoelektrischen Barriere, die einen pH-Wert aufweist
und zwischen dem Anodenkompartiment und dem Kathodenkompartiment
angeordnet ist.
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Bevorzugterweise
umfasst das Elektrophoresetrennsystem weiterhin eine erste und zweite
Ionen-permeable Barriere, die zwischen dem Anodenkompartiment und
dem Kathodenkompartiment angeordnet sind und ein erstes Trennkompartiment
zwischen dem Anodenkompartiment und dem Kathodenkompartiment bilden.
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In
einer bevorzugten Form sind die erste und zweite Ionen-permeable
Barriere isoelektrische Barrieren, die jeweils einen definierten,
aber unterschiedlichen pI aufweisen.
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Die
Probe kann in mindestens eines von dem Probenkompartiment, dem Anodenkompartiment oder
dem Kathodenkompartiment gegeben werden. In einer bevorzugten Form
wird die Probe in ein Probenkompartiment gegeben, und der ampholytische Probenbestandteil
wird in einem nicht-isoelektrischen Zustand im Probenkompartiment
abgetrennt. Alternativ kann der ampholytische Bestandteil in einem
nicht-isoelektrischen Zustand in dem Probenkompartiment oder dem
Kathodenkompartiment oder dem Anodenkompartiment erhalten werden.
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Es
wird anerkannt werden, dass die Probe zwei oder mehr ampholytische
Bestandteile umfassen kann, die in nicht-isoelektrischen Zuständen im Probenkompartiment
oder Kathodenkompartiment oder Anodenkompartiment oder zweien oder
mehr von dem Probenkompartiment, dem Anodenkompartiment oder dem
Kathodenkompartiment erhalten werden.
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Das
Elektrophoresetrennsystem kann weiterhin eine dritte Ionen-permeable
Barriere umfassen, die zwischen dem Anodenkompartiment und dem Kathodenkompartiment
angeordnet ist und neben dem ersten Trennkompartiment ein zweites Trennkompartiment
bildet, wobei das System eine erste Ionen-permeable, isoelektrische
Barriere, die einen ersten pI-Wert aufweist, und eine zweite Ionen-permeable,
isoelektrische Barriere aufweist, die einen zweiten pI-Wert aufweist,
der von dem ersten pI-Wert der ersten Ionen-permeablen isoelektrischen Barriere
verschieden ist.
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Bevorzugterweise
sind alle Ionen-permeablen Barrieren isoelektrische Barrieren, von
denen jede einen definierten, aber unterschiedlichen pI aufweist.
Es wird anerkannt werden, dass eine beliebige oder mehrere der Barrieren
isoelektrische Barrieren sein können.
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In
dieser Form kann die Probe in das erste Probenkompartiment, das
zweite Probenkompartiment, sowohl in das erste als auch das zweite
Probenkompartiment oder in das Anodenkompartiment oder Kathodenkompartiment
gegeben werden. Der ampholytische Bestandteil kann in einem nicht-isoelektrischen
Zustand im ersten Probenkompartiment oder im zweiten Probenkompartiment
oder im Anodenkompartiment oder Kathodenkompartiment erhalten werden.
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Die
Probe kann zwei oder mehr ampholytische Bestandteile umfassen, die
in einem nicht-isoelektrischen
Zustand im ersten Probenkompartiment oder im zweiten Probenkompartiment
oder Anodenkompartiment oder Kathodenkompartiment oder in jedem
von dem ersten Probenkompartiment und dem zweiten Probenkompartiment
erhalten werden.
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In
einer weiteren bevorzugten Form umfasst das Elektrophoresetrennsystem
eine Vielzahl an Ionen-permeablen Membranen, die zwischen dem Anodenkompartiment
und dem Kathodenkompartiment angeordnet sind und eine Vielzahl von
Trennkompartimenten bilden, die zwischen dem Anoden- und Kathodenkompartiment
angeordnet sind, wobei zwei oder mehr Ionen-permeable Barrieren
Ionen-permeable, isoelektrische Barrieren sind, von denen jede einen
unterschiedlichen pI-Wert aufweist. Drei oder mehr der Ionen-permeablen
Barrieren können
Ionen-permeable, isoelektrische Barrieren sein, von denen jede einen
unterschiedlichen pI-Wert aufweist. Es wird anerkannt werden, dass
alle Ionen-permeablen Barrieren Ionen-permeable, isoelektrische
Barrieren sein können,
von denen jede einen unterschiedlichen pI-Wert aufweist.
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Das
Verfahren kann die Bereitstellung eines ersten isoelektrischen Puffers
und eines zweiten isoelektrischen Puffers umfassen, von denen jeder
einen unterschiedlichen pI-Wert aufweist, in mindestens zweien von
den Probenkompartimenten oder dem Anodenkompartiment oder dem Kathodenkompartiment.
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Die
Ionen-permeablen Barrieren können
aus jedem geeigneten Material oder jeder geeigneten Substanz wie
unvermischbaren Flüssigkeiten,
porösen
Feststoffen, nicht-ionischen Membranen, Membranen, isoelektrischen
Membranen, Hydrogel-Membranen, Gelen und Hydrogelen ausgewählt sein.
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Der
Erfinder der vorliegenden Erfindung hat festgestellt, dass Hydrogelmembranen
bevorzugterweise Polyethersulfon-, Poly(vinyl)alkohol- oder Polyacrylamid-basiert
sind. Es wird anerkannt werden, dass eine beliebige andere Art von
Hydrogelmembran für
die vorliegende Erfindung verwendet werden kann.
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Bevorzugterweise
sind die nicht-ionischen Membranen gestützte Membranen wie quervernetztes
Polyacrylamid oder Poly(vinyl)alkohol, die von Glasfasern, Filterpapier,
Polymergitter und Papier gestützt
sind. Die Ionen-permeablen Membranen können poröse Fritten wie Glasfritten,
Keramikfritten und Polymerfritten sein.
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In
einer bevorzugten Form können
die Ionen-permeablen Barrieren den Durchtritt von Molekülen, die
eine Größe oder
einen hydratisierten Ionenradius aufweisen, der größer als
eine vorbestimmte Größe ist,
wesentlich beschränken.
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Die
Ionen-permeablen, isoelektrischen Barrieren sind bevorzugterweise
isoelektrische, poröse Feststoffe,
isoelektrische Membranen und isoelektrische Gele. Bevorzugtererweise
sind die Ionen-permeablen, isoelektrischen Barrieren isoelektrische Membranen.
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Die
Ionen-permeablen Barrieren verhindern bevorzugterweise eine wesentliche
Konvektionsmischung von gelösten
Stoffen zwischen den Barrieren. Bei der Benutzung tritt bevorzugterweise
im Wesentlichen keine Konvektionsmischung zwischen den Kompartimenten
auf.
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Der
isoelektrische Puffer kann in mindestens eines von einem Probenkompartiment,
dem Anodenkompartiment und dem Kathodenkompartiment gegeben werden.
Bevorzugterweise unterscheidet sich der pI-Wert des isoelektrischen
Puffers um mindestens ungefähr
0.001 pH-Einheiten
vom pI-Wert des ampholytischen Probenbestandteils. Der absolute Wert
der Differenz zwischen dem pI-Wert und dem pKa-Wert, der dem pI-Wert
des isoelektrischen Puffers am nächsten
liegt, beträgt
bevorzugterweise weniger als ungefähr 1,5.
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Der
isoelektrische Puffer kann jeder geeignete Puffer sein, der einem
ampholytischen Bestandteil erlauben wird, in einem im Wesentlichen
nicht-isoelektrischen Zustand erhalten zu werden. Geeignete Puffer
umfassen, sind aber nicht beschränkt
auf Iminoacetessigsäure,
N-Methyliminoacetessigsäure, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycyl-Asparaginsäure, m-Aminobenzoesäure, Histidyl-Glycin,
Histidyl-Histidin, Histidin, 1,2-Diaminopropansäure, Ornithin, Lysin, Lysyl-Lysin
und Arginin. Bevorzugterweise ist der isoelektrische Puffer Glutaminsäure oder
Lysin. Der Erfinder der vorliegenden Erfindung hat festgestellt,
dass Glutaminsäure
und Lysin besonders geeignet sind, wenn zwei isoelektrische Puffer
verwendet werden.
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Das
Verfahren kann weiterhin umfassen, dass ein nicht-ionisches Solubilisierungsagens
bereitgestellt wird. Bevorzugterweise ist das Solubilisierungsagens
ein nicht-ionisches Detergent. Beispiele umfassen, sind aber nicht
beschränkt
auf TWEENTM20, BrijTM30,
TRITONTM X-100 oder NDSB-195.
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Das
Verfahren ist besonders für
die Auftrennung von ampholytischen Probenbestandteilen wie Proteinen,
Polypeptiden, Oligopeptiden, Aminophenolen, Aminophosphonsäuren und
Aminosäuren
geeignet. Bevorzugterweise ist der ampholytische Probenbestandteil
ein Protein.
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Die
vorliegende Erfindung überwindet
Probleme mit isoelektrischen Trennungen nach dem Stand der Technik,
die erfordern, dass der Bestandteil in seinem isoelektrischen Zustand
abgetrennt wird, dahingehend, dass die elektrophoretische Auftrennung
viel schneller abläuft
und es weniger Probleme mit der Löslichkeit des Bestandteils
gibt.
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Ein
weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass
sie in jedem Elektrophoresetrennsystem ausgeführt werden kann, dass für isoelektrische
Auftrennungen ausgeführt
ist. Das Verfahren erfordert keine spezielle Vorrichtung und bewirkt
die effizientere Verwendung bekannter Elektrophoresetrennsysteme.
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In
dieser Beschreibung wird das Wort „umfassen" oder Abwandelungen davon wie „umfasst" oder „umfassend", sofern der Zusammenhang
nicht etwas Anderes erfordert, durchgehend in dem Sinn verstanden
werden, dass es den Einschluss eines genannten Elementes, einer
ganzen Zahl oder eines Schrittes oder einer Gruppe von Elementen,
ganzen Zahlen oder Schritten impliziert, aber nicht den Ausschluss
eines jeglichen anderen Elementes, einer jeglichen anderen ganzen
Zahl oder eines jeglichen anderen Schrittes, oder Gruppe von Elementen,
ganzen Zahlen oder Schritten impliziert.
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Jede
Diskussion von Dokumenten, Handlungen, Materialien, Vorrichtungen,
Artikeln oder dergleichen, die in die vorliegende Beschreibung aufgenommen
wurde, erfolgt ausschließlich
zu dem Zweck, dass ein Zusammenhang für die vorliegende Erfindung
bereitgestellt wird. Sie ist nicht als Eingeständnis aufzufassen, dass einer
oder alle diese Inhalte Teil des der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden
Standes der Technik bilden oder übliches Allgemeinwissen
auf dem Gebiet darstellen, wie er/es in Australien vor dem Prioritätstag eines
jeden Anspruchs dieser Erfindung existierte.
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Damit
die vorliegende Erfindung besser verstanden werden kann, werden
bevorzugte Formen unter Bezugnahme auf die folgenden Zeichnungen und
Beispiele beschrieben werden.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 zeigt
ein schematisches Diagramm einer isoelektrischen Einfang (IET)-Einheit
(Stand der Technik) (Gradipore, Australia), die verwendet werden
kann, um Ausführungsformen
der vorliegenden Anwendung zu praktizieren;
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2 zeigt
ein schematisches Diagramm, das die Merkmale von repräsentativen
Lösungen
in den Kompartimenten der in 1 gezeigten
IET-Einheit zu Beginn des Abtrennungsprozesses gemäß der vorliegenden
Erfindung zeigt;
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3 zeigt
eine Spur eines die ganze Säule abbildenden
UV-Absorptions-Detektors einer Hühnereiweißprobe,
die wie in Beispiel 1 beschrieben durch kapillarisoelektrische Fokussierung
analysiert wurde;
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4 zeigt
eine Spur eines die ganze Säule abbildenden
UV-Absorptions-Detektors von Aliquots, die am Ende einer IET-Abtrennung
aus dem Kathoden- und dem Anodentrennkompartiment der IET-Einheit,
die in 1 gezeigt ist und wie in Beispiel 2 beschrieben
bedient wurden, entnommen und wie in Beispiel 1 beschrieben durch
kapillarisoelektrische Fokussierung analysiert wurden.
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5 zeigt
eine Spur eines die ganze Säule abbildenden
UV-Absorptions-Detektors von Aliquots, die am Ende der IET-Abtrennung
aus dem Kathoden- und dem Anodentrennkompartiment der IET-Einheit, die
in 1 gezeigt ist und wie in Beispiel 3 beschrieben
bedient wurde, entnommen und wie in Beispiel 1 beschrieben durch
kapillarisoelektrische Fokussierung analysiert wurden.
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6 zeigt
eine Spur eines die ganze Säule abbildenden
UV-Absorptions-Detektors der Aliquots, die aus dem Kathoden- und
Anodentrennkompartiment der IET-Einheit, die in 1 gezeigt
ist und wie in Beispiel 4 beschrieben bedient wurde, am Ende der
IET-Abtrennung der
Probe, die dem Anodentrennkompartiment in Beispiel 3 entnommen wurde, entnommen
und wie in Beispiel 1 beschrieben durch kapillarisoelektrische Fokussierung
analysiert wurden.
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7 zeigt
eine Spur eines die ganze Säule abbildenden
UV-Absorptions-Detektors von Aliquots, die am Ende der IET-Abtrennung
aus dem Kathoden- und dem Anodentrennkompartiment der IET-Einheit, die
in 1 gezeigt ist und wie in Beispiel 5 beschrieben
bedient wurde, entnommen und wie in Beispiel 1 beschrieben durch
kapillarisoelektrische Fokussierung analysiert wurden.
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8 zeigt
eine Spur eines UV-Absorptions-Detektors, die während einer druckvermittelten kapillarelektrophoretischen
Abtrennung von Aliquots aufgenommen wurde, die zu Beginn und am
Ende der IET-Abtrennung aus dem Trennkompartiment der IET-Einheit, die wie
in Beispiel 6 beschrieben bedient wurde, entnommen wurden.
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9 zeigt
eine Spur eines UV-Absorptions-Detektors, die während einer druckvermittelten kapillarelektrophoretischen
Abtrennung von Aliquots aufgenommen wurde, die zu Beginn und am
Ende der IET-Abtrennung aus dem Trennkompartiment der IET-Einheit,
die wie in Beispiel 7 beschrieben bedient wurde, entnommen wurden.
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10 zeigt
eine Spur eines die ganze Säule
abbildenden UV-Absorptions-Detektors von Aliquots, die am Ende der
IET-Abtrennung nach acht Durchgängen
aus dem Kathoden- und dem Anodentrennkompartiment der IET-Einheit,
die in 1 gezeigt und wie in Beispiel 8 beschrieben bedient
wurde, entnommen und wie in Beispiel 1 beschrieben durch kapillarelektrophoretische
Fokussierung analysiert wurden.
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Modus/Modi für die Durchführung der
Erfindung
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Ausführungsformen
für die
Veränderung
der anfänglichen
Zusammensetzung einer Probenmischung, die einen ampholytischen Probenbestandteil aufweist,
gemäß der vorliegenden
Erfindung werden unten mit nicht-beschränkenden Details beschrieben.
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1 bezieht
sich auf eine isoelektrische Einfang (IET)-Einheit, die auf dem
Gebiet bekannt ist und verwendet werden kann, um Ausführungsformen,
die in dieser Anmeldung beschrieben werden, zu praktizieren. In
dieser IET-Trenneinheit (Gradipore, Australien) befindet sich die
Anode 10 im Anodenkompartiment 15. Der Anolyt 20 füllt das
Anodenkompartiment 15 aus. Der Anolyt 20 ist eine
Säurelösung; es
ist zum Beispiel eine wässrige
Lösung
von Phosphorsäure
(H3PO4). Selbstverständlich können andere
geeignete Säurelösungen,
die auf dem Gebiet bekannt sind, ebenfalls verwendet werden. Die
anodische, Ionen-permeable Barriere 30 trennt das Anodenkompartiment 15 von
dem danebenliegenden anodischen Trennkompartiment 40. Die
Ionen-permeable Barriere 30 erlaubt den Durchtritt von
Ionen, verhindert aber im Wesentlichen die Konvektionsmischung der
Inhalte des Anodenkompartiments 15 und des anodischen Trennkompartiments 40.
Die Ionen-permeable Barriere 30 wird üblicherweise auch als Ionen-permeable,
anti-konvektive Barriere oder Begrenzungsmembran bezeichnet. Während die
anodische Ionen-permeable Barriere 30 in diesem Beispiel
eine Ionen-permeable, anti-konvektive, nicht-isoelektrische Barriere
ist, kann sie auch eine Ionen-permeable, anti-konvektive, isoelektrische oder
eine beliebige andere Barriere sein, die den Durchtritt von Ionen
erlaubt und die Konvektionsmischung der Inhalte des anodischen Trennkompartiments 40 und
des Anodenkompartiments 15 verhindert. Die Ionen-permeable
isoelektrische Trennbarriere 50, die angemessene Puffer-
und Titrationskapazität
bei ihrem pI-Wert aufweist, trennt das anodische Trennkompartiment 40 und
das kathodische Trennkompartiment 60 und verhindert im
Wesentlichen die Konvektionsmischung der Inhalte der Kompartimente 40 und 60.
Die isoelektrische Trennbarriere 50 kann eine isoelektrische
Membran, ein immobilisiertes isoelektrisches Gel, ein isoelektrisches
Portal oder eine beliebige andere, auf dem Gebiet bekannte isoelektrische
Barriere sein, die bei ihrem pI-Wert angemessene Puffer- und Titrationskapazität aufweist.
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Die
kathodische Ionen-permeable Barriere 70 trennt das kathodische
Trennkompartiment 60 und das Kathodenkompartiment 85,
das den Katolyt 80 enthält.
Die kathodische Ionen-permeable
Barriere 70 erlaubt den Durchtritt von Ionen, verhindert aber
im Wesentlichen die Konvektionsmischung der Inhalte des kathodischen
Trennkompartiments 60 und des Kathodenkompartiments 85.
Die kathodische Ionen-permeable Barriere 70 wird üblicherweise
auch als eine Ionen-permeable, anti-konvektive Barriere oder Begrenzungsmembran
bezeichnet. Während
die kathodische Ionen-permeable Barriere 70 in diesem Beispiel
eine Ionen-permeable, anti-konvektive, nicht-isoelektrische Barriere
ist, kann sie auch eine Ionen-permeable, anti-konvektive, isoelektrische
Barriere oder eine beliebige andere Barriere sein, die den Durchtritt
von Ionen erlaubt und die Konvektionsmischung der Inhalte des kathodischen Trennkompartiments 60 und
des Kathodenkompartiments 85 verhindert. Der Katolyt 80 ist
eine basische Lösung;
es ist zum Beispiel eine wässrige
Lösung von
Natriumhydroxid (NaOH). Andere geeignete basische Lösungen,
die auf dem Gebiet bekannt sind, können ebenfalls verwendet werden.
Das Kathodenkompartiment 85 umfasst die Kathode 90.
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Während 1 lediglich
ein Beispiel einer geeigneten IET-Trenneinheit darstellt, können andere
Konfigurationen von IET-Trenneinheiten ebenfalls verwendet werden.
Die Kriterien für
die Auswahl der Elemente einer geeigneten IET-Einheit gemäß den grundlegenden
IET-Prinzipien sind
auf dem Gebiet wohlbekannt (z.B. Faupel et al., U.S. Patent Nummer 5,
082,548). Zum Beispiel kann auch nur ein Trennkompartiment zwischen
der anodischen Ionen-permeablen Barriere 30 und der kathodischen
Ionen-permeablen Barriere 70 verwendet werden, oder es
können
mehr als zwei Trennkompartimente zwischen der anodischen Ionen- permeablen Barriere 30 und
der kathodischen Ionen-permeablen Barriere 70 verwendet
werden. Weiterhin können
die anodische Ionen-permeable Barriere 30 und die kathodische
Ionen-permeable Barriere 70 von ähnlicher oder verschiedener
Bauart sein. Zum Beispiel können
sie Ionen-permeable, anti-konvektive, nicht-isoelektrische Barrieren
oder Ionen-permeable,
anti-konvektive, isoelektrische Barrieren oder beliebige andere,
auf dem Gebiet bekannte Barrieren sein, solange die Barrieren 30 und 70 Ionen-permeabel
sind und im Wesentlichen die Konvektionsmischung der Inhalte der
nebeneinander liegenden Kompartimente, die sie trennen, verhindern.
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Während 1 eine
Elektrophoreseeinheit oder ein System zeigt, das drei Ionen-permeable
Barrieren aufweist, kann die vorliegende Erfindung in einem System
ausgeführt
werden, das nur eine isoelektrische Barriere aufweist, die das Anodenkompartiment
und das Kathodenkompartiment trennt. In dieser Form können die
Probe und der isoelektrische Puffer für ein oder mehrere Anoden-
und Kathodenkompartimente bereitgestellt werden, und die Probe kann
in einem nicht-isoelektrischen Zustand in sowohl dem Anoden- als
auch dem Kathodenkompartiment abgetrennt werden.
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2 zeigt
ein schematisches Diagramm, das die Merkmale repräsentativer
Lösungen
in den Kompartimenten der IET-Einheit, die in 1 gezeigt ist,
zu Beginn eines IET-Vorgangs
gemäß der vorliegenden
Anwendung angibt. Ein Merkmal ist die Verwendung eines isoelektrischen
Puffers in einem Trennkompartiment einer IET-Einheit, wobei der
isoelektrische Puffer bei seinem pI-Wert eine angemessene Puffer-
und Titrationskapazität
und Leitfähigkeit aufweist.
Zum Beispiel enthält
das anodische Trennkompartiment 40 eine Mischung der ampholytischen Probenbestandteile 100 und 110 und
des ersten isoelektrischen Puffers 120, wobei der erste
isoelektrische Puffer bei seinem pI-Wert eine angemessene Puffer-
und Titrationskapazität
und Leitfähigkeit
aufweist, und das kathodische Trennkompartiment 60 eine
Mischung der ampholytischen Probenbestandteile 100 und 110 und
des zweiten isoelektrischen Puffers 130 umfasst, wobei
auch der zweite isoelektrische Puffer 130 bei seinem pI-Wert
eine geeignete Puffer- und Titrationskapazität und Leitfähigkeit aufweist. Der pI-Wert
der isoelektrischen Trennbarriere 50 wird so ausgewählt, dass
er von den pI-Werten des ersten ampholytischen Probenbestandteils 100 und
des zweiten ampholytischen Probenbestandteils 110 verschieden
ist. Zum Beispiel ist die isoelektrische Trennbarriere 50 in 2 so
gewählt,
dass sie einen pI-Wert aufweist, der zwischen den pI-Werten der ampholytischen
Probenbestandteile 100 und 110 liegt.
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Die
pI-Werte des ersten und des zweiten isoelektrischen Puffers 120 bzw. 130 werden
so gewählt,
dass sie sich sowohl von den pI-Werten des ersten und des zweiten Probenbestandteils 100 bzw. 110 als
auch dem pI-Wert der isoelektrischen Trennbarriere 50 und
dem pH-Wert des Anolyten 20 und des Katolyten 80 derart
unterscheiden, dass der erste und zweite Probenbestandteil am Ende
des IET-Abtrennungsvorgangs in ihrem nicht-isoelektrischen Zustand vorliegen werden.
In 2 ist der ampholytische Probenbestandteil 100 z.B.
ein Protein mit pI = 4, während
der ampholytische Probenbestandteil 110 z.B. ein Protein
mit pI = 6 ist. Die isoelektrische Trennbarriere 50 weist
einen pI-Wert von 5 auf, der erste isoelektrische Puffer 120 weist
einen pI-Wert von etwa 3.3 auf, der zweite isoelektrische Puffer 130 weist
einen pI-Wert von etwa 10 auf, und der Anolyt 20 weist
einen pH-Wert von etwa 2 auf, und der Katolyt 80 weist
einen pI-Wert von etwa 12 auf. In diesem Beispiel ist der isoelektrische
Puffer 120 eine 20 mM Glutaminsäure-Lösung, der isoelektrische Puffer 130 eine
20 mM Lysinlösung,
der Anolyt 20 eine wässrige
Lösung
von Phosphorsäure,
und der Katolyt 80 eine wässrige Lösung von Natriumhydroxid.
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Gemäß wohlbekannter
IET-Grundsätze zwingt
das Anlegen des elektrischen Potentials zwischen der Anode 10 und
der Kathode 90 alle ampholytischen Bestandteile, in die
jeweiligen Kompartimente der IET-Einheit zu wandern. Am Ende des IET-Auftrennungsvorgangs
werden alle ampholytischen Bestandteile mit pI-Werten, die höher als
der pH-Wert des Anolyten 20 und niedriger als der pI-Wert
der isoelektrischen Trennbarriere 50 sind, im anodischen
Trennkompartiment 40 eingefangen sein (d.h. der erste ampholytische
Probenbestandteil 100 und der isoelektrische Puffer 120 sind
im anodischen Trennkompartiment 40 gefangen), und alle
ampholytischen Bestandteile mit pI-Werten, die niedriger als der
pH-Wert des Katolyten 80 und höher als der pI-Wert der isoelektrischen
Trennbarriere 50 sind, werden im kathodischen Trennkompartiment 60 eingefangen
sein (d.h. der zweite ampholytische Probenbestandteil 110 und
der isoelektrische Puffer 130 sind im kathodischen Trennkompartiment 60 gefangen).
Jedoch wird der erste ampholytische Probenbestandteil 100 wegen
der Anwesenheit des isoelektrischen Puffers 120 im anodischen
Trennkompartiment 40 am Ende des IET-Vorgangs in seinem nicht-isoelektrischen
Zustand erhalten. Wegen der Anwesenheit des isoelektrischen Puffers 130 im
kathodischen Trennkompartiment 60 wird auch der zweite
ampholytische Probenbestandteil 110 am Ende des IET-Vorgangs
in seinem nicht-isoelektrischen Zustand erhalten.
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Praktiker
auf dem Gebiet werden anerkennen, dass in der Probe zur gleichen
Zeit mehr als zwei ampholytische Probenbestandteile vorhanden sein
können.
Praktiker auf dem Gebiet werden ebenfalls anerkennen, dass der erste
isoelektrische Puffer 120 und der zweite isoelektrische
Puffer 130 getrennt voneinander in die Kompartimente 40 und/oder 60 eingebracht
(z.B. kann der isoelektrische Puffer 120 in das anodische
Trennkompartiment 40 eingebracht werden, und der isoelektrische
Puffer 130 kann in das kathodische Trennkompartiment 60 eingebracht werden),
individuell mit der Probe vermischt (z.B. können der isoelektrische Puffer 120 und
eine Mischung der ampholytischen Probenbestandteile 100 und 110 in
das anodische Trennkompartiment 40 eingebracht werden,
und der isoelektrische Puffer 130 und eine Mischung der
ampholytischen Probenbestandteile 100 und 110 können in
das kathodische Trennkompartiment 60 eingebracht werden),
miteinander vermischt (z.B. können
die isoelektrischen Puffer 120 und 130 beide in
die Kompartimente 40 und/oder 60 eingebracht werden)
oder miteinander und mit der Probe vermischt werden können (z.B. können der
isoelektrische Puffer 120, der isoelektrische Puffer 130,
die ampholytischen Probenbestandteile 100 und 110 in
die Kompartimente 40 und/oder 60 eingebracht werden).
Praktiker auf dem Gebiet werden weiterhin anerkennen, dass es zu
einer beliebigen Zeit mehr als zwei ampholytische Probenbestandteile,
mehr als zwei Trennkompartimente, mehr als zwei isoelektrische Puffer
und mehr als eine isoelektrische Trennbarriere geben kann.
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Weiterhin
werden Praktiker auf dem Gebiet anerkennen, dass sich die Abfolge
oder Reihenfolge der Einbringung der Probe und des/der isoelektrischen
Puffers) in die Trenneinheit ändern
kann, d.h. die Probe oder Puffer können in die Trenneinheit zusammen
oder in einer beliebigen Abfolge eingebracht werden.
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Als
ein nicht-beschränkendes
Beispiel kann eine Mischung von mehreren ampholytischen Probenbestandteilen,
die unterschiedliche pI-Werte aufweisen, in zwei Teile aufgetrennt
werden. In diesem Beispiel kann der erste ampholytische Probenbestandteil 100 am
Ende eines IET-Trennungsvorgangs gemäß der vorliegenden Anwendung
eine Mischung aus ampholytischen Probenbestandteilen einschließen, die
pI-Werte aufweisen, die niedriger als der pI-Wert der isoelektrischen
Trennbarriere 50 sind, während der zweite ampholytische
Probenbestandteil 110 eine Mischung aus ampholytischen
Probenbestandteilen einschließen
kann, die pI-Werte aufweisen, die höher als der pI-Wert der isoelektrischen Trennbarriere 50 sind.
Die ampholytischen Probenbestandteile 100 und 110 können beliebige
ampholytische Probenbestandteile sein, die gemäß den Prinzipien der isoelektrischen
Fokussierung oder des isoelektrischen Einfangens abgetrennt werden
können.
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In 2 ist
die isoelektrische Trennbarriere 50 so ausgewählt, dass
ihr pI-Wert höher
liegt als der pI-Wert des ersten ampholytischen Probenbestandteils 100.
Der erste isoelektrische Puffer 120 ist so ausgewählt, dass
sein pI-Wert niedriger als der pI-Wert der isoelektrischen Trennbarriere 50 ist.
Obwohl der erste isoelektrische Puffer 120 einen niedrigeren
pI-Wert als die isoelektrische Trennbarriere 50 aufweist,
kann der erste isoelektrische Puffer 120 einen pI-Wert
aufweisen, der höher
oder niedriger als der pI-Wert des ersten ampholytischen Probenbestandteils 100 ist,
weil beide den ampholytischen Probenbestandteil 100 am
Ende der IET-Auftrennung in einen nicht-isoelektrischen Zustand
zwingen werden. Zum Beispiel hat der isoelektrische Puffer 120 in 2 einen
pI-Wert, der niedriger als der pI-Wert der ersten ampholytischen
Probe 100 ist. Der isoelektrische Puffer 120 kann
jedoch auch einen pI-Wert aufweisen, der höher als der pI-Wert des ersten
ampholytischen Probenbestandteils 100 ist.
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In ähnlicher
Weise ist die isoelektrische Trennbarriere in 2 so
ausgewählt,
dass ihr pI-Wert
niedriger ist als der pI-Wert des zweiten ampholytischen Probenbestandteils 110.
Der zweite isoelektrische Puffer 130 ist so ausgewählt, dass
sein pI-Wert höher
ist als der pI-Wert der isoelektrischen Trennbarriere 50.
Obwohl der zweite isoelektrische Puffer 130 einen höheren pI-Wert
aufweist als den pI-Wert der isoelektrischen Trennbarriere 50,
kann der zweite isoelektrische Puffer 130 einen höheren oder
niedrigeren pI-Wert aufweisen als den pI-Wert des zweiten ampholytischen Probenbestandteils 110, weil
beide den zweiten ampholytischen Probenbestandteil 110 am
Ende der IET-Auftrennung in einen nicht-isoelektrischen Zustand zwingen werden.
Zum Beispiel weist der zweite isoelektrische Puffer 130 in 2 einen
pI-Wert auf, der höher
ist als der pI-Wert des zweiten ampholytischen Probenbestandteils 110. Der
isoelektrische Puffer 130 kann jedoch auch einen pI-Wert
aufweisen, der niedriger als der pI-Wert des zweiten ampholytischen
Probenbestandteils 110 ist.
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In
einer weiteren Ausführungsform
ist der pI-Wert des isoelektrischen Puffers 120 höher als
der pI-Wert der isoelektrischen Barriere 50, und der pI-Wert
des isoelektrischen Puffers 130 ist niedriger als der pI-Wert
der isoelektrischen Barriere 50. Obwohl der pI-Wert des
isoelektrischen Puffers 120 höher als der pI-Wert der isoelektrischen
Barriere 50 ist, ist der pI-Wert des isoelektrischen Puffers 120 niedriger
als der pI-Wert des zweiten ampholytischen Probenbestandteils 110.
In ähnlicher
Weise ist der pI-Wert des isoelektrischen Puffers 130,
obwohl der pI-Wert des isoelektrischen Puffers 130 niedriger
ist als der pI-Wert der isoelektrischen Trennbarriere 50, höher als
der pI-Wert des ersten ampholytischen Probenbestandteils 100.
In einer weiteren Ausführungsform
ist der pI-Wert des isoelektrischen Puffers 120 höher als
der pI-Wert der isoelektrischen Barriere 50 und höher als
der pI-Wert des zweiten ampholytischen Probenbestandteils 110,
und der pI-Wert des isoelektrischen Puffers 130 ist niedriger
als der pI-Wert der isoelektrischen Trennbarriere 50 und niedriger
als der pI-Wert eines ersten ampholytischen Probenbestandteils 100.
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Während in 2 zwei
isoelektrische Puffer verwendet werden, stellt auch die Verwendung
von nur einem isoelektrischen Puffer Ausführungsformen der Anmeldung
dar. Zum Beispiel kann der isoelektrische Puffer 120 ohne
die Verwendung des isoelektrischen Puffers 130 verwendet
werden. In ähnlicher Weise
kann der isoelektrische Puffer 130 ohne die Verwendung
des isoelektrischen Puffers 120 verwendet werden. Zum Beispiel
kann die Verwendung eines einzigen isoelektrischen Puffers vorteilhaft
sein, wenn die Probe mehrere ampholytische Bestandteile mit unähnlichen
pI-Werten umfasst.
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Als
ein nicht-beschränkendes
Beispiel dieses Prinzips der Verwendung von nur einem isoelektrischen
Puffer, ist der isoelektrische Puffer 120 so ausgewählt, dass
er einen pI-Wert aufweist, der sicherstellt, dass der isoelektrische
Puffer 120 am Ende der IET-Abtrennung im gleichen Trennkompartiment
wie der ausgewählte
ampholytische Probenbestandteil (z.B. der erste ampholytische Probenbestandteil 100)
vorhanden ist und den Probenbestandteil nicht-isoelektrisch macht. Wenn zum Beispiel
der erste ampholytische Probenbestandteil 100 einen pI-Wert
aufweist, der höher
ist als der pI-Wert der isoelektrischen Trennbarriere 50,
ist der isoelektrische Puffer 120 auch so ausgewählt, dass
sein pI-Wert höher
als der pI-Wert der isoelektrischen Barriere 50 ist. In ähnlicher
Weise ist der isoelektrische Puffer 120, wenn der erste
ampholytische Probenbestandteil 100 einen pI-Wert aufweist,
der niedriger ist als der der isoelektrischen Trennbarriere 50,
so ausgewählt, dass
er einen pI-Wert aufweist, der niedriger ist als der pI-Wert der
isoelektrischen Trennbarriere 50. Während der isoelektrische Puffer 120 einen
pI-Wert aufweist, der von dem pI-Wert des ersten ampholytischen
Probenbestandteils 100 verschieden ist, kann der pI-Wert
des isoelektrischen Puffers 120 höher oder niedriger sein als
der pI-Wert des ersten ampholytischen Probenbestandteils 100.
In einer Ausführungsform
ist der isoelektrische Puffer 120 so ausgewählt, dass
er einen pI-Wert
aufweist, der höher
als der pI-Wert des ersten ampholytischen Probenbestandteils 100 ist.
In einer weiteren Ausführungsform ist
der isoelektrische Puffer 120 so ausgewählt, dass er einen pI-Wert
aufweist, der niedriger als der pI-Wert des ersten ampholytischen
Probenbestandteils 100 ist.
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In
einer weiteren, nicht-beschränkenden Ausführungsform
kann der isoelektrische Puffer 120 so ausgewählt werden,
dass er einen pI-Wert aufweist, der sicherstellt, dass der isoelektrische
Puffer 120 am Ende der IET-Abtrennung in einem anderen Trennkompartiment
vorhanden ist als der erste und zweite ampholytische Probenbestandteil 100 bzw. 110.
Auf diese Weise können
ampholytische Probenbestandteile auf einer Seite der isoelektrischen Trennbarriere 50 erhalten
werden, während nicht-elektrolytische
Probenbestandteile auf der anderen Seite der isoelektrischen Trennbarriere 50 verbleiben.
Zum Beispiel umfasst eine Probenlösung in einer Ausführungsform
die ampholytischen Probenbestandteile 100 und 110,
die unterschiedliche pI-Werte aufweisen, zusammen mit dem nicht-elektrolytischen
Probenbestandteil 115. Der pI-Wert der isoelektrischen
Trennbarriere 50 ist so ausgewählt, dass sich die ampholytischen
Probenbestandteile 100 und 110 am Ende des IET-Trennungsvorgangs auf
der gleichen Seite der isoelektrischen Trennbarriere 50 befinden.
Zum Beispiel wird der pI-Wert der isoelektrischen Barriere 50 in
dieser Ausführungsform
so ausgewählt,
dass er niedriger ist als der pI-Wert der beiden ampholytischen
Probenbestandteile 100 und 110. Der isoelektrische
Puffer 120 ist so ausgewählt, dass er einen solchen
pI-Wert aufweist, dass sich der isoelektrische Puffer 120 am
Ende des IET-Trennungsvorgangs
auf der anderen Seite der isoelektrischen Trennbarriere 50 als
die ampholytischen Probenbestandteile 100 und 110 befindet. Zum
Beispiel wird der isoelektrische Puffer 120 in dieser Ausführungsform
so ausgewählt,
dass er einen pI-Wert aufweist, der sowohl niedriger ist als die pI-Werte
der ampholytischen Probenbestandteile 100 und 110 als
auch der isoelektrischen Trennbarriere 50. Das kathodische
Trennkompartiment 60 ist mit dem isoelektrischen Puffer 120 gefüllt, während das
anodische Trennkompartiment 40 nur mit der Probenlösung allein
oder mit einer Mischung aus der Probenlösung und dem isoelektrischen
Puffer 120 gefüllt
sein kann. Am Ende des IET-Trennungsvorgangs umfasst das anodische
Trennkompartiment den nicht-elektrolytischen Probenbestandteil 115 und den
isoelektrischen Puffer 120, wobei letzterer eine angemessene
Leitfähigkeit
im anodischen Trennkompartiment 40 bereitstellt. Am Ende
des IET-Trennvorgangs umfasst das kathodische Trennkompartiment 60 eine
Mischung der ampholytischen Probenbestandteile 100 und 110,
die eine angemessene Leitfähigkeit
im kathodischen Trennkompartiment 60 bereitstellt.
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Wenn
die Probe nur in eines der Trennkompartimente einer IEF-Einheit
eingebracht wird, kann es vorteilhaft, wenn auch nicht notwendig
sein, das andere Trennkompartiment mit isoelektrischem Puffer 120 statt
mit Wasser zu füllen,
weil der isoelektrische Puffer 120 die Potentialverteilung über die IET-Einheit
verbessert und zu einer schnelleren IET-Auftrennung führt.
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Die
geeigneten isoelektrischen Puffer 120 und 130 weisen
im Bereich ihrer pI-Werte eine angemessene Puffer- und Titrationskapazität und Leitfähigkeit
auf. Damit ein isoelektrischer Puffer bei seinem pI-Wert eine angemessene
Pufferkapazität
und Leitfähigkeit
aufweist, ist bevorzugt, dass die Differenz zwischen seinem pI-Wert
und seinem nächstgelegenen
pKa-Wert weniger
als 1, bevorzugterweise weniger als 0,75 und bevorzugtererweise
weniger als 0,5 beträgt.
Zum Beispiel umfassen geeignete isoelektrische Puffer N-Methyliminoacetessigsäure, Iminoacetessigsäure, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycyl-Asparaginsäure, m-Aminobenzoesäure, Histidyl-Glycin,
Histidyl-Histidin, Histidin, 1,2-Diaminopropansäure, Ornithin,
Lysin, Lysyl-Lysin und Arginin. Praktiker auf dem Gebiet werden
anerkennen, dass andere geeignete isoelektrische Puffer, die angemessene
Puffer- und Titrationskapazitäten
und Leitfähigkeiten
aufweisen, ebenfalls verwendet werden können.
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Während 2 eine
einfache Zweistofftrennung veranschaulicht, praktizieren andere
Ausführungsformen
sequentielle Zweistofftrennungen. Die für eine jede sequentielle IET-Abtrennung ausgewählten isoelektrischen
Puffer können
die gleichen oder verschiedene sein. Zum Beispiel kann der isoelektrische
Puffer 120 am Ende einer ersten sequentiellen IET-Abtrennung verwendet
werden, um die beiden ersten ampholytischen Probenbestandteile 100 und 110 zu
enthalten. Wenn das erwünschte
Ziel einer zweiten sequentiellen IET-Abtrennung der erste isoelektrische
Probenbestandteil 100 ist, und es erwünscht ist, dass dieser in einer
Lösung
des isoelektrischen Puffers 135 erhalten wird, kann die
isoelektrische Barriere 50 für die zweite sequentielle Trennung
so ausgewählt
werden, dass ihr pI-Wert zwischen den pI-Werten des ersten und zweiten Probenbestandteils 100 bzw. 110 liegt,
und der isoelektrische Puffer 120 ist so gewählt, dass
sein pI-Wert höher
als die pI-Werte sowohl der isoelektrischen Probenbestandteile 100 und 110 als
auch der isoelektrischen Trennbarriere 50 liegt. In einer
Ausführungsform
können
das anodische und kathodische Trennkompartiment 40 bzw. 60 mit
einer Mischung der isoelektrischen Probenbestandteile 100 und 110 und den
isoelektrischen Puffern 120 und 135 gefüllt sein. In
einer weiteren Ausführungsform
kann das anodische Trennkompartiment 40 mit dem isoelektrischen Puffer 135 und
das kathodische Trennkompartiment 60 mit einer Mischung
der isoelektrischen Probenbestandteile 100 und 110 und
den isoelektrischen Puffern 120 und 135 gefüllt sein.
In einer weiteren Ausführungsform
kann das anodische Trennkompartiment 40 mit dem isoelektrischen
Puffer 135 und das kathodische Trennkompartiment 60 mit
einer Mischung der isoelektrischen Probenbestandteile 100 und 110 und
des isoelektrischen Puffers 120 gefüllt sein. In einer weiteren
Ausführungsform
kann das anodische Trennkompartiment 40 mit dem isoelektrischen
Puffer 135 und das kathodische Trennkompartiment 60 mit
einer Mischung der isoelektrischen Probenbestandteile 100 und 110 und
der isoelektrischen Puffer 120 und 135 gefüllt sein.
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In
weiteren Ausführungsformen
können
frische isoelektrische Puffer zu einem jeden sequentiellen Trennschritt
hinzugegeben werden, oder isoelektrischer Puffer kann von einem
vorherigen Trennschritte übertragen
werden. Andere Ausführungsformen
praktizieren Mehr-Schnitt-Abtrennungen
(z.B. ausgeführt
mit einer IsoPrimeTM-Einheit (Amersham Pharmacia)
mit mehreren isoelektrischen Puffern.
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Während die
Anwesenheit eines isoelektrischen Puffers die Löslichkeit eines ampholytischen Probenbestandteils
typischerweise erhöht,
indem sie ihn nicht-isoelektrisch macht, können geeignete Solubilisierungsagenzien,
die in IEF-Systemen verwendet werden, auch im Rahmen der vorliegenden
Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel können auf dem Gebiet bekannte
nicht-ionische und zwitterionische Solubilisierungsagenzien ebenfalls
verwendet werden, um die Löslichkeit
der Probenbestandteile zu erhöhen.
Zum Beispiel können
auch TWEENTM20, BrijTM30,
TRITONTM X-100 (Aldrich) oder beliebige andere
geeignete nicht-ionische
Solubilisierungsagenzien verwendet werden. In ähnlicher Weise können auch
NDSB-195TM (Toronto Research Chemicals,
New York, ON, Kanada) oder beliebige andere geeignete zwitterionische
Solubilisierungsagenzien, die auf dem Gebiet bekannt sind, verwendet
werden.
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Um
das Verständnis
der vorliegenden Anmeldung zu unterstützen, sind die folgenden Beispiele
mit einbezogen, die die Ergebnisse einer Reihe von Experimenten
beschreiben. Die folgenden Beispiele, die diese Erfindung betreffen,
sollten nicht in der Weise ausgelegt werden, dass sie die Erfindung oder
solche Abwandelungen der Erfindung spezifisch beschränken, die
jetzt bekannt sind oder später
entwickelt werden und in den Umfang der Erfindung fallen, wie sie
hierin beschrieben und beansprucht wird.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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Ganz-Säulen-UV-Absorptions-Abbildungs-kapillarisoelektrische-Fokussierungs
Abtrennung einer Hühnereiweißprobe.
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In
einem Verhältnis
von 1:25 in entionisiertem Wasser verdünntes Hühnereiweiß wurde als eine Probe verwendet,
die ampholytische Verbindungen umfasst. Eine Ganz-Säulen-UV-Absorptions-Abbildungs-kapillarisoelektrische-Fokussierung
auf einem iCE280 Gerät
(Convergent Bioscience, Toronto, Kanada) wurde verwendet, und die
Hühnereiweißprobe zu
analysieren. Die geschmolzene Silikatrennkapillare war 5 cm lang,
ihr Innenurchmesser betrug 75 Mikrometer.
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Das
Fokussierungsmedium umfasste 8% Trägerampholyte (Pharmalyte 3–10, Amersham-Pharmacia) und deckte
einen Bereich von pH 3–10
in einer wässrigen,
0.28%igen Methylcelluloselösung
(durchschnittliches Molekulargewicht = 80 000, Aldrich) ab. 75 Mikroliter
der zu analysierenden Probe wurden mit 150 Mikroliter des Fokussierungsmediums
gemischt. Ein Aliquot dieser Lösung
wurde in die Trennkapillare gefüllt
und 5 Minuten lang bei 3 000 V fokussiert. Dansylphenylalanin (ungefährer pI
= 3.52) und Terbutalin (pI = 9.61) wurden als pI-Marker verwendet. 3 zeigt
das Ganz-Säulen-UV-Absorptions-Abbildungs-Kapillar-IEF-Elektropherogramm
der Hühnereiweißprobe. Ovalbumin
fokussierte in einem Bereich der Kapillare, der den Pixeln 450 bis
650 entspricht. Ovotransferrin fokussierte in einem Bereich der
Kapillare, der den Pixeln 1050 bis 1150 entspricht.
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Beispiel 2
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Auftrennung einer Hühnereiweißprobe im
präparativen
Maßstab
durch ein bekanntes IET-Verfahren (Stand
der Technik)
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Um
die vorliegende Anmeldung mit einem bekannten IET-Verfahren zu vergleichen,
wurde die Abtrennung einer Probe, die ampholytische Bestandteile
umfasst, im präparativen
Maßstab
unter Verwendung eines bekannten IET-Verfahrens unter den unten
beschriebenen Bedingungen ausgeführt.
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Diese
für den
Stand der Technik stehende Abtrennung wurde mit einer von Gradipore,
Australien, hergestellten IET-Einheit erhalten. Die IET-Patrone
(U.S. Patent Nummer 6,328,869) umfasst die anodische, Ionen-permeable
Barriere 30, die aus einer Polyethersulfonmembran mit einer
nominalen Ausschlußgröße von 5000
D (Gelman) hergestellt war, das anodische Trennkompartiment 40,
die isoelektrische Trennbarriere 50 mit pI = 4.7 (Gradipore),
die aus ImmobilineTM-Chemikalien (Amersham-Pharmacia),
Acrylamid und N-N'-Methylen-bis-Acrylamid (Amersham-Pharmacia)
hergestellt war, das kathodische Trennkompartiment 60 und
die kathodische, Ionen-permeable Barriere 70, die aus einer
Polyethersulfonmembran mit einer nominalen Ausschlußgröße von 5000
D (Gelman) hergestellt war. 80 ml einer 50 mM Phosphorsäurelösung (ungefährer pH
= 1.8) wurden mit einer Fließgeschwindigkeit
von 2 L/min durch das Anodenkompartiment 15 zirkuliert.
80 ml einer 50 mM Natriumhydroxidlösung (ungefährer pH = 12.4) wurden mit
einer Fließgeschwindigkeit
von 2 L/min. durch das Kathodenkompartiment zirkuliert. Je 40 ml
einer gefilterten Hühnereiweißlösung (die
in einem Verhältnis
von 1:25 in entionisiertem Wasser verdünntes Hühnereiweiß umfasst) wurden durch das
anodische und kathodische Trennkompartiment 40 bzw. 60 mit
einer Fließgeschwindigkeit
von 20 mL/min zirkuliert. Die Anode 10 wurde in das Anodenkompartiment 15 eingesetzt,
und die Kathode 90 wurde in das Kathodenkompartiment 85 eingesetzt. Das
angelegte Potential betrug zunächst
250 V und erzeugte einen Strom von 400 mM. Nach zehn Durchgängen der
Hühnereiweißlösung durch
die Trennkompartimente sank der Strom auf 37 mA. Das Potential wurde
dann auf 500 V erhöht,
was einen Strom von 74 mM erzeugte. Die Trennung war nach sieben
weiteren Durchgängen
praktisch abgeschlossen, wie durch das Absinken des Endstroms auf
25 mA angezeigt wurde, und ergab eine Trennzeit von insgesamt 40
Minuten. Nach jedem Durchgang der Hühnereiweißlösung wurden den anodischen
und kathodischen Trennkompartimenten 40 bzw. 60 Aliquots
entnommen und wie in Beispiel 1 beschrieben mit dem Ganz-Säulen-UV-Absorptions-Abbildungs-Kapillar-IEF-Gerät analysiert.
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Als
ein Ergebnis dieser IET-Abtrennung sammelten sich Proteine mit pI-Werten,
die niedriger als 4.7 waren, wie Ovalbumin (ungefährer pI
= 4.6), im anodischen Trennkompartiment 40 auf der anodischen
Seite der isoelektrischen Trennbarriere 50 mit pI = 4.7
(unterstes Feld in 4, als „stromabwärts" bezeichnet) an. Proteine mit pI-Werten,
die höher
als 4.7 waren wie Ovotransferrin (ungefährer pI = 6.1), sammelten sich
im kathodischen Trennkompartiment 60 auf der kathodischen
Seite der isoelektrischen Trennbarriere 50 (oberstes Feld
in 4, als „stromaufwärts" bezeichnet) an.
Praktisch das gesamte Ovalbumin und die gesamten Proteine mit niedrigerem pI
verlagerten sich in das anodische Trennkompartiment 40.
Eine visuelle Untersuchung des Inneren der Trennpatrone am Ende
dieser IET-Auftrennung zeigte die Anwesenheit von präzipitiertem
Protein im anodischen Trennkompartiment 40.
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Beispiel 3
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Auftrennung einer Hühnereiweißprobe durch
eine IET-Auftrennung im präparativen
Maßstab
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Die
Auftrennung einer Probe, die ampholytische Bestandteile umfasst,
im präparativen
Maßstab wurde
in Gegenwart von zwei isoelektrischen Puffern gemäß der vorliegenden
Anmeldung unter den unten beschriebenen Bedingungen ausgeführt.
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Die
IET-Abtrennung gemäß der vorliegenden Anmeldung
wurde mit der in Beispiel 2 verwendeten IET-Einheit erhalten. Die
IET-Patrone (U.S. Patent Nummer 6,328,869) umfasste die anodische
Ionen-permeable Barriere 30, die aus einer Polyethersulfonmembran
mit einem nominalen Ausschluss von 5000 D (Gelman) hergestellt war,
das anodische Trennkompartiment 40, die isoelektrische
Trennbarriere 50 (Gradipore) mit pI = 4.8, die aus ImmobilineTM-Chemikalien (Amersham-Pharmacia), Acrylamid
und N-N'-bis-Acrylamid
(Amersham-Pharmacia) hergestellt war, das kathodische Trennkompartiment 60 und
die kathodische Ionen-permeable Barriere 70, die aus einer
Polyethersulfonmembran mit einem nominalen Ausschluss von 5000 D
(Gelman) hergestellt war. 80 mL einer 50 mM Phosphorsäure-Lösung (ungefährer pI
= 1.8) wurden mit einer Fließgeschwindigkeit
von 2 L/min. durch das Anodenkompartiment 15 zirkuliert.
80 mL einer 50 mM Natriumhydroxidlösung (ungefährer pH = 12.4) wurden durch
das Kathodenkompartiment 85 mit einer Fließgeschwindigkeit
von 2 L/min. geströmt.
Jeweils 40 mL einer filtrierten Hühnereiweißlösung (die in einem Verdünnungsverhältnis von
1:25 in 20 mM Glutaminsäure
bzw. 20 mM Lysin gelöstes
Hühnereiweiß umfasste)
wurden mit einer Fließgeschwindigkeit
von 20 mL/min. durch das anodische bzw. kathodische Trennkompartiment 40 bzw. 60 zirkuliert.
Die Anode 10 wurde in das Anodenkompartiment 15 eingesetzt,
und die Kathode 90 wurde in das Kathodenkompartiment 85 eingesetzt. Das
angelegte Potential betrug 250 V, was anfänglich einen Strom von 480
mA erzeugte. Die Abtrennung war nach zehn Durchgängen der Hühnereiweißlösung durch die Trennkompartimente
praktisch abgeschlossen, was durch das Absinken des Endstrom auf
53 mM angezeigt wurde und eine Trennzeit von insgesamt 25 Minuten
ergab. Nach jedem Durchgang wurden aus dem anodischen und kathodischen Trennkompartiment 40 bzw. 60 Aliquots
entnommen und wie in Beispiel 1 beschrieben mit dem Ganz-Säulen-UV-Absorptions-Abbildungs-Kapillar-IEF-Gerät analysiert.
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Als
ein Ergebnis der IET-Abtrennung gemäß der vorliegenden Anmeldung
sammelten sich Proteine mit pI-Werten, die geringer als 4.8 waren,
wie Ovalbumin (ungefährer
pI = 4.6), im anodischen Trennkompartiment 40 auf der anodischen
Seite der isoelektrischen Trennbarriere 50 mit pI = 4.8
(unterstes Feld in 5, bezeichnet als „stromabwärts") an. Proteine mit
pI-Werten, die höher
als 4.8 waren, wie Ovotransferrin (ungefährer pI = 6.1), sammelten sich im
kathodischen Trennkompartiment 60 auf der kathodischen
Seite der isoelektrischen Trennbarriere 50 (oberstes Feld
in 5, bezeichnet als „stromaufwärts") an. Praktisch das gesamte Ovalbumin
und die gesamten Proteine mit geringeren pI-Werten verlagerten sich
ins anodische Trennkompartiment 40. Eine visuelle Untersuchung
des Inneren der Trennpatrone am Ende dieser IET-Auftrennung zeigte
an, dass weder im anodischen Trennkompartiment 40 noch
im kathodischen Trennkompartiment 60 Proteinpräzipitation
auftrat.
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Somit
wurde in Beispiel 3 im Wesentlichen die gleiche Abtrennung erreicht
wie in Beispiel 2, aber die Abtrennung erforderte eine kürzere Zeitspanne
und eine geringere Anzahl an Durchgängen dieser Lösungen durch
die IET-Patrone trotz der Tatsache, das das im Verlauf der Abtrennung
angelegte Potential geringer war. Zusätzlich wurde eine der wichtigsten
Beschränkungen
bekannter IET-Abtrennungen abgeschwächt, d.h. dass die geringe
Löslichkeit
der in ihrem isoelektrischen Zustand wiedergewonnenen ampholytischen
Probenbestandteile ihre Präzipitation
verursacht.
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Beispiel 4
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Sequentielle binäre Abtrennung
einer Hühnereiweißprobe im
präparativen
Maßstab
durch eine IET-Abtrennung
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Die
sequentielle binäre
Trennung einer Probe, die ampholytische Bestandteile enthält, im präparativen
Maßstab
wurde in Gegenwart von zwei isoelektrischen Puffern gemäß der vorliegenden
Anmeldung unter den Bedingungen, die unten beschrieben sind, ausgeführt, um
eine Fraktion von ampholytischen Bestandteilen mit nahe beieinander
liegenden pI-Werten zu erhalten.
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In
diesem Beispiel wurde die Probe, die aus dem anodischen Trennkompartiment 40 in
Beispiel 3 erhalten worden war, einer erneuten IET-Abtrennung unter
Verwendung einer IET-Patrone
(U.S. Patent 6,328,869) unterzogen, die die anodische Ionen-permeable
Barriere 30, die aus einer Polyethersulfonmembran mit einem
nominalen Ausschluss von 5000 D (Gelman) hergestellt war, das anodische
Trennkompartiment 40, die isoelektrische Trennbarriere 50 mit
pI = 4,5 (Gradipore), die aus ImmobilineTM-Chemikalien
(Amersham-Pharmacia),
Acrylamid und N-N'-Methylen-bis-Acrylamid
(Amersham-Pharmacia) hergestellt war, das kathodische Trennkompartiment 60 und
die kathodische Ionen-permeable Barriere 70, die aus einer
Polyethersulfonmembran mit einer nominellen Ausschlußgröße von 5000
D (Gelman) hergestellt worden war, umfasste. 80 mL einer 50 mM Phosphorsäurelösung (ungefährer pH
= 1.8) wurden mit einer Fließgeschwindigkeit
von 2 L/min. durch das Anodenkompartiment 15 zirkuliert.
80 mL einer 50 mM Natriumhydroxidlösung (ungefährer pH = 12.4) wurden mit
einer Fließgeschwindigkeit
von 2 L/min durch das Kathodenkompartiment 85 zirkuliert. 38
mL der Flüssigkeit,
die aus dem anodischen Trennkompartiment 40 nach der IET-Auftrennung
in Beispiel 3 unter Verwendung der isoelektrischen Trennbarriere 50 mit
einem pI-Wert von 4.8 wiedererhalten worden waren, wurden mit einer
Fließgeschwindigkeit
von 20 mL/min. durch das anodische Trennkompartiment 40 zirkuliert.
Somit waren anfänglich
sowohl die Proteine mit pI < 4.8
als auch die in Beispiel 3 hinzugegebene Glutaminsäure in diesem
Strom vorhanden. 40 mL einer 20 mM Lysinlösung wurden mit einer Fließgeschwindigkeit
von 20 mL/min. durch das kathodische Trennkompartiment 60 zirkuliert.
Die Anode 10 wurde in das Anodenkompartiment 15 eingesetzt,
und die Kathode 90 wurde in das Kathodenkompartiment 85 eingesetzt.
Das angelegte Potential betrug 250 mV und erzeugte einen anfänglichen
Strom von 87 mA. Nach sechs Durchgängen der vorfraktionierten
Hühnereiweißlösung nahm
der Strom auf 68 mA ab. Nach jedem Durchgang wurden dem anodischen
und kathodischen Trennkompartiment 40 bzw. 60 Aliquots
entnommen und wie in Beispiel 1 beschrieben mit Hilfe des Ganz-Säulen-UV-Absorptions-Abbildungs-Kapillar-Instrumentes
analysiert.
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Als
ein Ergebnis der sequentiell angewandten zweiten IET-Abtrennung
blieben Proteine mit pI-Werten, die niedriger als 4.5 waren, im
anodischen Trennkompartiment 40 auf der anodischen Seite
der isoelektrischen Trennbarriere 50 mit pI = 4.5 (unterstes
Feld in 6, als „stromabwärts" bezeichnet). Proteine mit pI-Werten,
die höher
als 4.5 waren, wie Ovalbumin (ungefährer pI-Wert = 4.6) sammelten sich
im kathodischen Trennkompartiment 60 auf der kathodischen
Seite der isoelektrischen Trennbarriere 50 an (oberstes
Feld in 6, als „stromaufwärts" bezeichnet). Die Verlagerung des Ovalbumins
war nach sechs Durchgängen
zu 90% abgeschlossen, was durch die Anwesenheit von Glutaminsäure im anodischen
Trennkompartiment 40 und von Lysin im kathodischen Trennkompartiment 60 unterstützt wurde.
Bemerkenswerterweise enthielt das kathodische Trennkompartiment 60 keines
der Proteine mit pI < 4.5;
diese verblieben im anodischen Trennkompartiment 40. Das
anodische Trennkompartiment 40 enthielt einige Überreste
der Proteine mit pI > 4.5.
Die visuelle Untersuchung des Inneren der IET-Patrone am Ende der
IET-Abtrennung gemäß der vorliegenden
Anwendung zeigte wieder einmal, dass weder im anodischen Trennkompartiment 40 noch
im kathodischen Trennkompartiment 60 Proteinpräzipitation auftrat.
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Beispiel 5
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Abtrennung einer Hühnereiweißprobe,
die ampholytische Bestandteile enthält, im präparativen Maßstab durch
eine IET-Abtrennung
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Die
Abtrennung einer Probe, die ampholytische Bestandteile umfasst,
im präparativen
Maßstab wurde
in Gegenwart eines isoelektrischen Puffers gemäß der vorliegenden Anwendung
unter den unten beschriebenen Bedingungen ausgeführt.
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Die
Abtrennung gemäß der vorliegenden
Anwendung wurde mit Hilfe der in den Beispielen 3 und 4 verwendeten
IET-Einheit unter Verwendung einer IET-Patrone (U.S. Patent 6,328,
869) erhalten, die die anodische, Ionen-permeable Barriere 30,
die aus einer Polyethersulfonmembran mit einer nominalen Ausschlussgröße von 1000
D (Gradipore) hergestellt war, das anodische Trennkompartiment 40,
die isoelektrische Trennbarriere 50 mit pI = 5.0 (Gradipore), die
aus ImmobilineTM-Chemikalien (Amersham-Pharmacia),
Acrylamid und N-N'-Methylen-bis-Acrylamid (Amersham-Pharmacia)
hergestellt war, das kathodische Trennkompartiment 60 und
die kathodische, Ionen-permeable Barriere 70, die aus einer
Polyethersulfonmembran mit einer nominalen Ausschlussgröße von 1000
D (Gradipore) hergestellt war, umfasste. 60 mL einer 2 mM Essigsäurelösung (ungefährer pH =
3.9) wurden mit einer Fließgeschwindigkeit
von 2 L/min. durch das Anodenkompartiment 15 zirkuliert. 60
mL einer 15 mM Ethanolaminlösung
(ungefährer pH
= 10.5) wurden mit einer Fließgeschwindigkeit von
2 L/min. durch das Kathodenkompartiment 85 geströmt. 30 mL
einer filtrierten Hühnereiweißlösung (die
Hühnereiweiß umfasste,
das in einem Verhältnis von
1:25 in entionisiertem Wasser verdünnt worden war) wurden mit
einer Fließgeschwindigkeit
von 20 mL/min. durch das anodische Trennkompartiment 40 zirkuliert.
30 mL einer filtrierten Hühnereiweißlösung (die
in einem Verhältnis
von 1:25 in 5 nM Lysinlösung verdünnt worden
war) wurden mit einer Fließgeschwindigkeit
von 20 mL/min. durch das kathodische Trennkompartiment 60 zirkuliert.
Die Anode 10 wurde in das Anodenkompartiment 15 eingesetzt,
und die Kathode 90 wurde in das Kathodenkompartiment 85 eingesetzt.
Das angelegte Potential betrug 250 V, was einen anfänglichen
Strom von 280 mA erzeugte. Nach jedem Durchgang wurden aus dem anodischen und
kathodischen Trennkompartiment 40 bzw. 60 Aliquots
entnommen und wie in Beispiel 1 beschrieben mit Hilfe des Ganz-Säule-UV-Absorptions-Abbildungs-Kapillar-Instrumentes
analysiert. Die IET-Abtrennung war wie in 7 gezeigt
nach drei Durchgängen
der Hühnereiweißlösungen fast
vollständig und
erforderte eine Trennzeit von insgesamt sechs Minuten.
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Als
ein Ergebnis der IET-Abtrennung sammelten sich Proteine mit pI-Werten,
die niedriger als 5.0 waren, wie Ovalbumin (pI = 4.6), im anodischen Trennkompartiment 40 auf
der anodischen Seite der isoelektrischen Trennbarriere 50 mit
pI = 5.0 an (unterstes Feld in 7, als „stromabwärts" bezeichnet). Proteine
mit pI-Werten, die höher
als 5.0 waren, wie Ovotransferrin (ungefährer pI = 6.1), sammelten sich
im kathodischen Trennkompartiment 60 auf der kathodischen
Seite der isoelektrischen Trennbarriere 50 an (oberstes
Feld in 7, als „stromaufwärts" bezeichnet). Praktisch das gesamte
Ovalbumin und die gesamten Proteine mit einem niedrigeren pI-Wert verlagerten
sich ins anodische Trennkompartiment 40.
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Beispiel 6
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Entsalzen einer ampholytischen
Probenmischung im präparativen
Maßstab
durch eine IET-Abtrennung
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Das
Entsalzen einer einen ampholytischen Bestandteil enthaltenden Probe
im präparativen Maßstab wurde
in Anwesenheit eines isoelektrischen Puffers gemäß der vorliegenden Anwendung
unter den unten beschriebenen Bedingungen ausgeführt.
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Der
IET-Entsalzungsvorgang gemäß der vorliegenden
Anmeldung wurde mit Hilfe der in Beispiel 2 verwendeten IET-Einheit
erhalten. Die IET-Patrone (U.S. Patent 6,328,869) umfasste die anodische
Ionen-permeable Barriere 30, die aus einer quervernetzten Poly(vinylalkohol)membran
(Gradipore) hergestellt war, und die kathodische Ionen-permeable Barriere 70,
die aus einer quervernetzten Poly(vinylalkohol)membran (Gradipore)
hergestellt war. 200 mL einer 80 mM Phosphorsäurelösung (ungefährer pH = 1.6) wurden mit einer
Fließgeschwindigkeit
von 2 L/min. durch das Anodenkompartiment 15 zirkuliert.
200 mL einer 400 mM Natriumhydroxidlösung (ungefährer pH = 13.2) wurden mit
einer Fließgeschwindigkeit
von 2 L/min. durch das Kathodenkompartiment 85 zirkuliert.
30 mL der Probenlösung
(die anfänglich
30 mM Tyramin als einen ampholytischen Probenbestandteil, 30 mM
m-Aminobenzoesäure
als einen isoelektrischen Puffer und 30 mM Benzyltrimethylammonium-para-Toluensulfonat
als ein starkes elektrolytisches Salz enthielt) wurden mit einer
Fließgeschwindigkeit
von 20 mL/min. durch das Trennkompartiment zirkuliert. Die Anode 10 wurde
in das Anodenkompartiment 15 eingesetzt, und die Kathode 90 wurde
in das Kathodenkompartiment 85 eingesetzt. Anfänglich betrug
das angelegte Potential 5 V, was einen Strom von 500 mA erzeugte.
Die rezyklisierte Lösung
wurde 450 Minuten lang der Elektrophorese unterzogen, um zu zeigen,
dass der ampholytische Probenbestandteil Tyramin in der IET-Einheit in
einem nicht-isoelektrischen Zustand (vermischt mit dem isoelektrischen
Puffer m-Aminobenzoesäure) über sehr
lange Zeitspannen (7.5 Stunden) eingefangen werden konnte. Nach
450 Minuten erzeugte ein angelegtes Potential von 80 V einen elektrophoretischen
Strom von 300 mA. Im Verlauf des Experiments wurden Aliquots aus
dem Trennkompartiment entnommen und durch druckvermittelte Kapillarelektrophorese
(PreMCE) analysiert, wie in W.A. Williams and G. Vigh, „A Fast,
Accurate Mobility Determination Method for Capillary Electrophoresis", Analytical Chemistry
68 (1996) 1174 beschrieben. Die PreMCE-UV-Absorptions-Detektorspur der
anfänglichen Probe
ist im obersten Feld von 8 (als T0min bezeichnet)
gezeigt, die des letzten Aliquots ist im untersten Feld von 8 (als
T450min bezeichnet) gezeigt. Bei den Detektor-Spuren
zeigt die Markierung BTA den Peak an, der dem Benzyltrimethylammoniumion
entspricht, die Markierung PTSA zeigt den Peak an, der m-Aminobenzoesäure entspricht,
wohingegen die Markierungen NM1, NM2 und NM3 die Peaks anzeigen,
die Nitromethan, einem internen Standard bei der PreMCE-Analyse,
entsprechen.
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Als
ein Ergebnis der IET-Abtrennung gemäß der vorliegenden Anmeldung
wurde das starke elektrolytische Salz Benzyltrimethylammonium-para-Toluensulfonat
aus der Probe entfernt, die den ampholytischen Bestandteil Tyramin
umfasste. Das Tyramin wurde im Trennkompartiment zusammen mit m-Aminobenzoesäure eingefangen
und befand sich in seinem nicht-isoelektrischen Zustand. Somit wurde
die anfängliche
Zusammensetzung der Probe erfolgreich verändert, und der ampholytische
Probenbestandteil wurde in der IET-Einheit in seinem nicht-isoelektrischen
Zustand eingefangen.
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Beispiel 7
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Entsalzen einer Hühnereiweißprobe im
präparativen Maßstab durch
eine IET-Abtrennung
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Das
Entsalzen einer Probe im präparativen Maßstab, die
ampholytische Bestandteile enthielt, wurde in Gegenwart von zwei
isoelektrischen Puffern gemäß der vorliegenden
Anwendung unter den unten beschriebenen Bedingungen ausgeführt.
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Der
IET-Entsalzungsvorgang gemäß der vorliegenden
Anmeldung wurde mit Hilfe der in Beispiel 2 beschriebenen IET-Einheit
ausgeführt.
Die IET-Patrone (U.S. Patent 6,328,869) umfasste die anodische Ionen-permeable
Barriere 30, die aus einer Polyethersulfonmembran mit einer
nominalen Ausschlussgröße von 5000
D (Gelman) hergestellt war, und die kathodische Ionen-permeable
Barriere 70, die aus einer Polyethersulfonmembran mit einer
nominalen Ausschlussgröße von 5000
D (Gelman) hergestellt war. 200 mL einer 50 mM Phosphorsäurelösung (ungefährer pI
= 1.8) wurden mit einer Fließgeschwindigkeit
von 2 L/min. durch das Anodenkompartiment 15 zirkuliert.
200 mL einer 50 mM Natriumhydroxidlösung (ungefährer pH = 12.4) wurden mit
einer Fließgeschwindigkeit
von 2 L/min. durch das Kathodenkompartiment 85 zirkuliert.
80 mL einer filtrierten Hühnereiweißlösung (die
Hühnereiweiß als ampholytische
Probenbestandteile umfasste, das in einem Verhältnis von 1:25 in einer Lösung verdünnt worden
war, die auch 20 mM Glutaminsäure
als ersten isoelektrischen Puffer, 20 mM Lysin als zweiten isoelektrischen
Puffer und 25 mM Benzyltrimethylammonium-para-Toluensulfonat als
starkes elektrolytisches Salz enthielt) wurden mit einer Fließgeschwindigkeit
von 40 mL/min durch das Trennkompartiment 40 zirkuliert.
Die Anode 10 wurde in das Anodenkompartiment 15 eingesetzt,
und die Kathode 90 wurde in das Kathodenkompartiment 85 eingesetzt.
Das anfänglich
angelegte Potential betrug 35 V, was einen Strom von 500 mA erzeugte.
Der Großteil
des Benzyltrimethylammonium-para-Toluensulfonat-Salzes wurde von
der rezirkularisierten Hühnereiweißlösung in
so wenig wie 55 Minuten entfernt, wie durch das Absinken des Endstroms
auf 24 mA angezeigt wurde. Im Verlauf des Experiments wurden Aliquots
aus dem Trennkompartiment entnommen und durch druckvermittelte Kapillarelektrophorese
(PreMCE) analysiert, wie in W.A. Williams and G. Vigh, „A Fast, Accurate
Mobility Determination Method for Capillary Electrophoresis", Analytical Chemistry
68 (1996) 1174 beschrieben. Die PreMCE-UV-Absorptions-Detektor-Spur
der anfänglichen
Probe ist im obersten Feld von 9 (als T0minbezeichnet) gezeigt, die des letzten
Aliquots ist im untersten Feld von 9 (als T450min min bezeichnet) gezeigt. Bei den Detektor-Spuren
zeigt die Markierung BTA den Peak an, der dem Benzyltrimethylammoniumion
entspricht, die Markierung PTSA zeigt den Peak an, der m-Aminobenzoesäure entspricht,
wohingegen die Markierungen NM1, NM2 und NM3 die Peaks bezeichnen,
die Nitromethan, einem internen Standard bei der PreMCE-Analyse,
entsprechen.
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Als
ein Ergebnis der IET-Abtrennung gemäß der vorliegenden Anwendung
wurde das stark elektrolytische Salz Benzyltrimethylammonium-para-Toluensulfonat
aus der Probe entfernt, wohingegen die ampholytischen Probenbestandteile,
die Hühnereiweißproteine
im Trennkompartiment in ihrem nicht-isoelektrischen Zustand und
vermischt sowohl mit Lysin als auch Glutaminsäure eingefangen wurden. Somit
wurde die anfängliche
Zusammensetzung der Probe erfolgreich verändert, und die ampholytischen
Probenbestandteile wurden in der IET-Einheit in ihrem nicht-isoelektrischen
Zustand in Anwesenheit von zwei isoelektrischen Puffern eingefangen.
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Beispiel 8
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Abtrennung einer Hühnereiweißprobe im
präparativen
Maßstab
durch eine IET-Abtrennung
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Die
Abtrennung einer Probe im präparativen Maßstab, die
ampholytische Bestandteile enthält, wurde
in Gegenwart von zwei isoelektrischen Puffern gemäß der vorliegenden
Anwendung unter den unten beschriebenen Bedingungen ausgeführt.
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Die
IET-Abtrennung gemäß der vorliegenden Erfindung
wurde mit Hilfe der in Beispiel 2 verwendeten IET-Einheit erhalten.
Die IET-Patrone (U.S. Patent 6,328,869) umfasste die anodische Ionen-permeable
Barriere 30, die aus einer isoelektrischen Barriere mit
pI = 3.0 (Gradipore) bestand, die aus ImmobilineTM-Chemikalien
(Amersham-Pharmacia), Acrylamid und N-N'-Methylen-bis-Acrylamid hergestellt
war, das anodische Trennkompartiment 40, die isoelektrische
Trennbarriere 50 mit pI = 5.0 (Gradipore), die aus ImmobilineTM-Chemikalien (Amersham-Pharmacia), Acrylamid
und N-N'-Methylen-bis-Acrylamid
(Amersham-Pharmacia)
hergestellt war, das kathodische Trennkompartiment 60 und
die kathodische, Ionen-permeable Barriere 70, die aus einer
isoelektrischen Barriere mit pI = 8.2 (Gradipore) bestand, die aus
ImmobilineTM-Chemikalien (Amersham-Pharmacia),
Acrylamid und N-N'-Methylen-bis-Acrylamid
(Amersham-Pharmacia) hergestellt war. 80 mL einer 10 mM Phosphorsäurelösung wurden
mit einer Fließgeschwindigkeit von
2 mL/min. durch das Anodenkompartiment 15 zirkuliert. 80
mL einer 10 mM Triethanolaminlösung wurden
mit einer Fließgeschwindigkeit
von 2 L/min. durch das Kathodenkompartiment 85 zirkuliert.
Jeweils 30 mL einer filtrierten Hühnereiweißlösung (die Hühnereiweiß enthielt, das mit einem Verdünnungsverhältnis von
1:25 jeweils in 20 mM Glutaminsäure bzw.
20 mM Histidin gelöst
war) wurden mit einer Fließgeschwindigkeit
von 20 mL/min. durch das Anoden- und Kathodentrennkompartiment 40 bzw. 60 zirkuliert.
Die Anode 10 wurde in das Anodenkompartiment 15 eingesetzt,
und die Kathode 90 wurde in das Kathodenkompartiment 85 eingesetzt.
Der anfängliche
Elektrophoresestrom wurde auf 250 mA eingestellt. Die Abtrennung
war nach acht Durchgängen der
Hühnereiweißlösung durch
die Trennkompartimente praktisch abgeschlossen, was eine Trennzeit von
insgesamt 16 Minuten ergab. Nach jedem Durchgang wurden dem Anoden-
und Kathodentrennkompartiment 40 bzw. 60 Aliquots
entnommen und wie in Beispiel 1 beschrieben mit Hilfe des Ganz-Säulen-UV-Absorptions-Abbildungs-Kapillar-Instrumentes
analysiert.
-
Als
ein Ergebnis der IET-Abtrennung gemäß der vorliegenden Anmeldung
sammelten sich Proteine mit pI-Werten, die geringer als 5.0 waren,
wie Ovalbumin (ungefährer
pI = 4.6), im anodischen Trennkompartiment 40 auf der anodischen
Seite der isoelektrischen Trennbarriere 50 mit pI = 5.0
an (unterstes Feld in 10, bezeichnet als „stromabwärts"). Proteine mit pI-Werten,
die höher
als 5.0 waren, wie Ovotransferrin (ungefährer pI = 6.1) sammelten sich im
kathodischen Trennkompartiment 60 auf der kathodischen
Seite der isoelektrischen Trennbarriere 50 an (oberstes
Feld in 10, bezeichnet als „stromaufwärts"). Praktisch das
gesamte Ovalbumin und die Proteine mit niedrigeren pI-Werten verlagerten
sich ins anodische Trennkompartiment 40. Eine visuelle
Untersuchung des Inneren der Trennpatrone am Ende der IET-Abtrennung
zeigte, dass Proteinpräzipitation
weder im anodischen Trennkompartiment 40 noch im kathodischen
Trennkompartiment 60 auftrat.