JP5221529B2 - 電気泳動を利用してある種のタンパク質および粒子を分離して枯渇させる方法および装置 - Google Patents
電気泳動を利用してある種のタンパク質および粒子を分離して枯渇させる方法および装置 Download PDFInfo
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Description
必要に応じ、分析物組成物から分離する1つの分析物のpIを同定するステップと;
フリー・フロー電気泳動(FFE)チェンバーの中でアノードとカソードの間に、pHの平均が分離する分析物の等電点(pI)に実質的に対応していて、上限pHと下限pHによって限定されたpH範囲を持つpH分離平坦部と、アノードとそのpH分離平坦部の間にあって、そのpH分離平坦部のpHよりも小さな平均pHを持つおよび/またはそのpH分離平坦部よりも大きな導電率を持つpH機能と、カソードとそのpH分離平坦部の間にあって、そのpH分離平坦部のpHよりも大きな平均pHを持つおよび/またはそのpH分離平坦部よりも大きな導電率を持つpH機能とを含む、pH機能プロファイルを形成するステップと;
分析物混合物から分離する1つの分析物を含むサンプルを、FFEチェンバー内のpH分離平坦部、そのpH分離平坦部のアノード側の領域、またはそのpH分離平坦部のカソード側の領域に導入するステップと;
FFEチェンバーから分析物を流出させ、必要に応じてその分析物のすべてまたは一部を1つまたは複数の画分として回収するステップを含む方法が提供される。
請求項1または2のいずれかの方法に従ってフリー・フロー電気泳動により複数の分析物を含むサンプルの分離を行なうことにより、そのサンプルから、少なくとも1つの非枯渇部分と、pH分離平坦部上でその非枯渇部分から分離される分析物を含む部分とを生成させるステップと;
その後、FFEチェンバーから流出した1つ以上の画分を分析するステップを含む方法に関する。
必要に応じ、分析物組成物から分離する1つの分析物のpIを同定するステップと;
フリー・フロー電気泳動(FFE)チェンバーの中で単一のアノードと単一のカソードの間に、N個の分離領域と、それぞれの分離領域を隣接した各分離領域から隔てる(N−1)個の電極間安定化媒体とを含むpH機能プロファイルを形成するステップと;
ここで、各分離領域は、pHが分離する各分析物の等電点(pI)に実質的に対応していて、pHの範囲が上限pHと下限pHによって限定されているpH分離平坦部と、そのpH分離平坦部のアノード側に隣接していて、そのpH分離平坦部のpHよりも小さな平均pHを持つおよび/またはそのpH分離平坦部よりも大きな導電率を持つpH機能と、そのpH分離平坦部のカソード側に隣接していて、その第1のpH分離平坦部のpHよりも大きな平均pHを持つおよび/またはそのpH分離平坦部よりも大きな導電率を持つpH機能とを備えており;
分析物組成物から分離する1つの分析物を含む各サンプルを個別に、FFEチェンバーの1つの分離領域(各分離領域には、分析物組成物から分離するその分析物をその分離領域において分離するのに適したpH分離平坦部が含まれている)のpH分離平坦部、そのpH分離平坦部のアノード側の領域、またはそのpH分離平坦部のカソード側の領域に導入するステップと;
FFEチェンバーから分析物を流出させ、必要に応じてその分析物のすべてまたは一部を1つまたは複数の画分として回収するステップを含んでいる。
(i)興味の対象である化合物からなるサンプルが溶液により多く直接的に回収されること;
(ii)分離の分解能がより高いこと;
(iii)検出されるタンパク質の幅がより広いこと;
(iv)帯電した分子が溶液中を移動するのであり、より密なゲルなどの材料の中を通過するのではないため、高分解能の分離がより高速になされること;
(v)少量のタンパク質が富化されること;
(vi)サンプルの損失がないか、限られていること;
(vii)分離装置を繰り返し使用できること;
(viii)豊富なタンパク質群への分析物の非特異的結合が少なくなること;
(ix)異なる多彩な分析物に対する柔軟性と適用性がより優れていること;
(x)下流の分析技術(例えば以下に限られないが、ゲル電気泳動(1D−PAGE、2D−PAGEなど)、質量分析(MS)(ESI、MALDI、SELDIなど)、LC−MS(/MS)、MALDI−ToF−MS(/MS)、化学発光、HPLC、エドマン・シークエンシング、NMR分光、X線回折、核酸シークエンシング、エレクトロブロッティング、アミノ酸シークエンシング、フロー・サイトメトリー、円二色性またはこれらの組み合わせ)とそのままで相性がよいこと。
図1Aと図4Aに、分離チェンバー内の2つの電極間を流れる分離媒体に含まれていて正味の電荷および/または等電点によって分離できる種を分離するための本発明の実施態様による装置を示してある。この電気泳動装置は、第1の(下方の)壁と、第2の(上方の)壁と、2つの側壁と、平行に重ねた2つの平らなプレート(図示せず)とを有する長方形の分離チェンバーを備えている。これらの要素が合わさって、密封された分離チェンバーを形成している。高電位の電場の発生が可能なように設計された2つの電極がこの分離チェンバーの中に配置されていて、分離空間を規定しやすくしている。この分離空間は、一般に、これら電極間に位置する領域の一部である。電極は、電極チェンバーとして具現化されることが好ましい。電極チェンバーの中を電極緩衝液が電流供給線と接触することによって流れる。電極チェンバーは、分離チェンバーの隣に位置する半透過性の膜を備えることが好ましい。電極緩衝液は、別々の供給ライン(図1Aと図4Aでは一部しか見えない)によって電極チェンバーに供給され、別々の出口を通ってこれらの電極チェンバーから出ていく。追加のポンプ装置(図示せず)を用いて電極緩衝液を循環させ、必要な場合にはサーモスタットを用いてその電極緩衝液を冷却することが好ましい。
本発明の実施態様によるpH機能プロファイルを形成するのにいくつかの緩衝系が役立つ。緩衝系は、市販の両性電解質(例えばセルバ・エレクトロフォレシス社(ドイツ国)がServalyt(登録商標)の名称で販売しているもの)、相補的マルチ−ペア緩衝系(例えばBD社(ドイツ国)が販売しているBD FFE分離用緩衝液1と2)、揮発性緩衝系、A/B媒体として知られる二元緩衝系からなる群から選択できるが、これだけに限られるわけではない。
本発明のいくつかの実施態様では、pH勾配を発生させるのに用いる混合物は、その混合物の中を電流が流れるときにその混合物によって滑らかなpHの勾配が提供されるように、注意深く組み合わせた酸と塩基からなっていてもよい。市販されている高分子量の両性電解質と比べて緩衝能力を大きくできる低分子量の有機酸と有機塩基の混合物が選択される。注意深く組み合わせた酸と塩基からなるこの混合物は、分子量、pI、純度、毒性に関する特徴が極めてよくわかっている。一般に、その酸と塩基は、市販の両性電解質よりも分子量が小さい。適切な相補的マルチ−ペア緩衝系は従来技術で知られている。特に、pHの範囲が3〜5の混合物がBD社(ドイツ国)からBD FFE分離用緩衝液1として販売されており、pHの範囲が5〜8の混合物がBD FFE分離用緩衝液2として販売されている。これらの緩衝系は、例えば一般的な形態がアメリカ合衆国特許出願公開2004/0101973(その開示内容は参考としてその全体がこの明細書に組み込まれているものとする)に記載されている。上に説明した相補的なマルチ−ペア緩衝系をこの明細書では“CMPBS”または“CMPBS媒体”と呼ぶ。
本発明の別の実施態様では、揮発性緩衝系を用いると、本発明の実施態様によるpH勾配を形成するためのいくつかの入口を利用し、pH分離平坦部と、pH機能およびpH勾配の中のpH平坦部とを形成することができる。このような緩衝系は、FFE分離ステップの後に回収された分画化されたサンプルから残留物なしで除去できるという特別な利点を有する。
以下に規定する二元緩衝系をこの明細書では“A/B媒体”と呼ぶ。この二元緩衝系は、本発明の各実施態様にとって一般に有用である。分離媒体は、少なくとも1種類の緩衝酸と、少なくとも1種類の緩衝塩基を含んでいる。ただしその緩衝酸のpKa値は分離媒体のpHよりも大きく、その緩衝塩基のpKa値は分離媒体のpHよりも小さい。言い換えるならば、その緩衝酸のpKa値はその緩衝塩基のpKa値よりも大きい。
本発明の分離媒体は、1種類以上の添加剤をさらに含んでいてもよい。本発明の実施態様による添加剤は、緩衝酸と緩衝塩基によって提供される緩衝能力に寄与しない(または少なくとも大きくは寄与しない)化合物またはイオンである。一般に、添加剤の数と濃度は最小に維持する必要があるが、分析物または分離によっては、分析物を完全な状態に維持するため、または媒体が所望の性質(例えば変性条件、さまざまな分離媒体間の粘性の適合性など)を持つようにするために追加の化合物が存在している必要がある。
等電点電気泳動(IEF)(エレクトロフォーカシングとしても知られる)は、異なる分子をその正味の電荷の違いによって分離する技術である。この技術は、フリー・フロー電気泳動条件下でうまく実施することができる。これは、分子の電荷がその周囲のpHに合わせて変化するという事実を利用した電気泳動の一種である。IEFには、pH勾配またはpH機能を含むか含むようにできる分離媒体の中を、混合物を通過させる操作が含まれる。分離チェンバーは、アノード側が相対的に小さなpHであり、カソード側が相対的に大きなpHである。その両方の側の間で作り出されるpH勾配プロファイルまたはpH機能プロファイルが形成され、電気泳動による問題の分析物の運動が支配される。ある分子の等電点(pI)では、その分子の正味の電荷がゼロであるため、分離チェンバーの中でそれ以上の運動は観察されない。
1つまたは複数のpH平坦部を本発明の実施態様で利用して、pH分離平坦部またはその周囲でタンパク質の枯渇または分離が容易する一方で、他のタンパク質はそのpH分離平坦部に隣接した部分またはそのpH分離平坦部から離れた部分で富化することができる。その平坦部のpH値を変化させることにより、どのタンパク質をサンプルの残部から分離するか、または枯渇させるかに影響を与えることができる。
本発明の実施態様によるDFEプロトコルは、フリー・フローIEFによって分析物の混合物から分析物(例えば特定のタンパク質)を分離するのに役立つ。
サンプル(一般にタンパク質を含む)の電気泳動による枯渇、分画、富化(DFE)のための上記のプロトコルを利用すると、天然状態または変性状態のタンパク質の少なくとも2つの画分(3つの画分がより好ましい)がうまく生成する。その画分のうちの1つは、枯渇させる(すなわちサンプル中の別の分析物から分離する)分析物を含んでおり、残る画分は、その後の処理および/または分析で利用することができる別の分析物を含んでいる。
分離された画分をすべて回収すると、研究者は、その画分の全部または一部に対してさらに調製操作を実施することができ、場合によってはさまざまな方法でその画分を分析することもできる。
本発明のさらに別の一実施態様では、2つ以上のサンプルに由来する分析物組成物から分離しようとする1つ以上の分析物をフリー・フロー電気泳動によって同時に分離する方法およびプロトコルとして、
必要に応じ、分析物組成物から分離する1つの分析物のpIを同定するステップと;
フリー・フロー電気泳動(FFE)チェンバーの中で単一のアノードと単一のカソードの間に、N個の分離領域と、それぞれの分離領域を隣接した各分離領域から隔てる(N−1)個の電極間安定化媒体とを含むpH機能プロファイルを形成するステップと;
ここで、各分離領域は、pHが分離する各分析物の等電点(pI)に実質的に対応していて、pHの範囲が上限pHと下限pHによって限定されているpH分離平坦部と、そのpH分離平坦部のアノード側に隣接していて、そのpH分離平坦部のpHよりも小さな平均pHを持つおよび/またはそのpH分離平坦部よりも大きな導電率を持つpH機能と、そのpH分離平坦部のカソード側に隣接していて、その第1のpH分離平坦部のpHよりも大きな平均pHを持つおよび/またはそのpH分離平坦部のよりも大きな導電率を持つpH機能とを備えており;
分析物組成物から分離する1つの分析物を含む各サンプルを個別に、FFEチェンバーの1つの分離領域(各分離領域には、分析物組成物から分離するその分析物をその分離領域において分離するのに適したpH分離平坦部が含まれている)のpH分離平坦部、そのpH分離平坦部のアノード側の領域、またはそのpH分離平坦部のカソード側の領域に導入するステップと;
FFEチェンバーから分析物を流出させ、必要に応じてその分析物のすべてまたは一部を1つまたは複数の画分として回収するステップを含む方法が想定される。
当業者には、この明細書で想定される分離媒体は、選択できること、調製できること、単独で使用でするか、他の安定化媒体、フォーカス媒体、分離媒体とそれぞれ組み合わせて使用できることが明らかであろう。
この実施例では、DFEプロトコルによるゲル、支持マトリックス、または担体がないFFE電気泳動法とこの方法を実施するのに適した装置を利用し、豊富なタンパク質(ヒト血清アルブミン、HSA)をヒト血漿サンプルから分離することを示す。天然状態のヒト血漿を、図1Aに示した装置の媒体入口4の媒体を用いて1:10に希釈し、サンプル装填速度5ml/時間でサンプル入口4を通じて分離領域に注入または導入する。
媒体入口1と2:100mMの硫酸+10%グリセロール(pH1.30)
媒体入口3:200mMの2−アミノ−ブチル酸、100mMのグルコン酸、50mMのピリジンエタンスルホン酸(PESS)、30mMのグリシルグリシン、10%グリセロール(pH3.39)
媒体入口4:30mMのMES、100mMのグリシルグリシン、10%グリセロール(pH4.92)
媒体入口5:200mMのMOPSO、20mMのMES、100mMのβ−アラニン、50mMのBISTRIS、10%グリセロール(pH6.06)
媒体入口6と7:100mMのNaOH+10%グリセロール(pH11.80)
この実施例では、DSEプロトコルによるゲル、支持マトリックス、または担体がないFFE電気泳動法とこの方法を実施するのに適した装置を利用し、豊富なタンパク質(ヒト血清アルブミン、HSA)をヒト血漿サンプルから分離することを示す。天然状態のヒト血漿を、図4に示した装置の媒体入口4の媒体を用いて1:10に希釈し、サンプル装填速度5ml/時間でサンプル入口4を通じて分離領域に注入または導入する。
媒体入口1:100mMの硫酸:10%グリセロール
媒体入口2:100mMの硫酸:10%グリセロール
媒体入口3:25%BD FFE分離緩衝液1+10%グリセロール
媒体入口4:30mMのMES;100mMのグリシルグリシン;14%BD FFE分離緩衝液2;10%グリセロール
媒体入口5:25%BD FFE分離緩衝液2+10%グリセロール、(pH6.94)
媒体入口6:150mMのNaOH+50mMのエタノールアミン、10%グリセロール
媒体入口7:150mMのNaOH+50mMのエタノールアミン、10%グリセロール
この実施例では、改変した並列DFEプロトコルを利用した本発明のFFE電気泳動法と、この方法を実施するのに適した装置とを利用し、豊富なタンパク質(ヒト血清アルブミン、HSA)を2つのヒト血漿サンプルから同時に分離することを示す。この実施例で利用するプロトコルでは、アノードからカソードに向かって、アノード安定化媒体、第1のpH機能と第1のpH分離平坦部を含む第1の分離領域、分離領域1と2のpH分離平坦部に隣接したフォーカス媒体としても機能する電極間安定化媒体、第2のpH分離平坦部と第2のpH機能を含む第2の分離領域、カソード安定化媒体を利用した。
アノード溶液:100mMのH2SO4
媒体入口1:200mMの2−アミノブチル、100mMのグルコン酸、50mMのピリジンエタンスルホン酸(PESS)、30mMのグリシルグリシン;10%グリセロール
媒体入口2:30mMのMES、100mMのグリシルグリシン;10%グリセロール
媒体入口3:200mMのMOPSO、50mMのBISTRIS、20mMのMES、100mMのβ−アラニン;10%グリセロール
媒体入口4:なし
媒体入口5:200mMの2−アミノブチル、100mMのグルコン酸、50mMのPESS、30mMのグリシルグリシン;10%グリセロール
媒体入口6:30mMのMES、100mMのグリシルグリシン;10%グリセロール
媒体入口7:200mMのMOPSO、50mMのBISTRIS、20mMのMES、100mMのβ−アラニン;10%グリセロール
カソード溶液:100mMのNaOH
Claims (28)
- 分析物組成物から分離する1つの分析物をフリー・フロー等電点電気泳動によって分離する方法であって、
フリー・フロー電気泳動(FFE)チェンバーの中でアノードとカソードの間に、pHの平均が分離する分析物の等電点(pI)に実質的に対応していて、上限pHと下限pHによって限定されたpH範囲を持つpH分離平坦部と、前記アノードとそのpH分離平坦部の間にあって、そのpH分離平坦部のpHよりも小さな平均pHを持つおよび/またはそのpH分離平坦部の導電率よりも大きな導電率を持つpH機能と、前記カソードとそのpH分離平坦部の間にあって、そのpH分離平坦部のpHよりも大きな平均pHを持つおよび/またはそのpH分離平坦部の導電率よりも大きな導電率を持つpH機能とを含む、pH機能プロファイルを形成するステップと;
分析物混合物から分離する1つの分析物を含むサンプルを、FFEチェンバー内の前記pH分離平坦部、そのpH分離平坦部のアノード側の領域、またはそのpH分離平坦部のカソード側の領域に導入するステップと;
FFEチェンバーから前記分析物を流出させるステップとを含む方法。 - 前記分析物をフリー・フロー等電点電気泳動によって分離する前に、分析物組成物から分離する1つの分析物のpIを同定するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記pH機能プロファイルが、pH分離平坦部と、pH平坦部を形成するpH機能とを含み、前記pH分離平坦部と、隣接する前記pH平坦部とのpHの差が0.5pH単位より大きい、請求項1に記載の方法。
- 前記pH機能プロファイルが、pH分離平坦部と、前記pH分離平坦部のアノード側に隣接していて少なくとも0.5pH単位の範囲にわたるpH勾配と、前記pH分離平坦部のカソード側に隣接していて少なくとも0.5pH単位の範囲にわたるpH勾配とを含む、または
前記pH機能プロファイルがpH分離平坦部を含んでいて、そのアノード側にpH勾配が隣り合い、カソード側にpH平坦部が隣り合っている、または
前記pH機能プロファイルがpH分離平坦部を含んでいて、そのアノード側にpH平坦部が隣り合い、カソード側にpH勾配が隣り合っている、請求項1に記載の方法。 - 前記pH機能プロファイルが、前記pH機能を形成する媒体に隣接して配置される少なくとも1つのフォーカス媒体を含み、前記pH機能がpH分離平坦部に隣接する、請求項1に記載の方法。
- 前記pH機能プロファイルが少なくとも1つのフォーカス媒体を含み、前記フォーカス媒体の導電率が、pH機能またはpH分離平坦部を形成する媒体の導電率の少なくとも2倍である、請求項1に記載の方法。
- 分画化されたサンプルの分析物を分析するため、その分析の前にフリー・フロー等電点電気泳動を実施する操作を含む方法であって、そのフリー・フロー等電点電気泳動が、
フリー・フロー電気泳動(FFE)チェンバーの中でアノードとカソードの間に、pHの平均が分離する分析物の等電点(pI)に実質的に対応していて、上限pHと下限pHによって限定されたpH範囲を持つpH分離平坦部と、前記アノードとそのpH分離平坦部の間にあって、そのpH分離平坦部のpHよりも小さな平均pHを持つおよび/またはそのpH分離平坦部の導電率よりも大きな導電率を持つpH機能と、前記カソードとそのpH分離平坦部の間にあって、そのpH分離平坦部のpHよりも大きな平均pHを持つおよび/またはそのpH分離平坦部の導電率よりも大きな導電率を持つpH機能とを含む、pH機能プロファイルを形成するステップと;
分析物混合物から分離する1つの分析物を含むサンプルを、FFEチェンバー内の前記pH分離平坦部、そのpH分離平坦部のアノード側の領域、またはそのpH分離平坦部のカソード側の領域に導入するステップと;
FFEチェンバーから前記分析物を流出させるステップと;
それによって、そのサンプルから、少なくとも1つの非枯渇部分と、前記pH分離平坦部上でその非枯渇部分から分離される分析物を含む部分とを生成させるステップと;
その後、前記FFEチェンバーから流出した1つ以上の画分を分析するステップとを含む方法。 - 前記分析物をフリー・フロー等電点電気泳動によって分離する前に、分析物混合物から分離する1つの分析物のpIを同定するステップをさらに含む、請求項7に記載の方法。
- 前記pH機能プロファイルが、pH分離平坦部と、pH平坦部を形成するpH機能とを含み、前記pH分離平坦部と、隣接する前記pH平坦部とのpHの差が0.5pH単位より大きい、請求項7に記載の方法。
- 前記pH機能プロファイルが、pH分離平坦部と、前記pH分離平坦部のアノード側に隣接していて少なくとも0.5pH単位の範囲にわたるpH勾配と、前記pH分離平坦部のカソード側に隣接していて少なくとも0.5pH単位の範囲にわたるpH勾配とを含む、または
前記pH機能プロファイルがpH分離平坦部を含んでいて、そのアノード側にpH勾配が隣り合い、カソード側にpH平坦部が隣り合っている、または
前記pH機能プロファイルがpH分離平坦部を含んでいて、そのアノード側にpH平坦部が隣り合い、カソード側にpH勾配が隣り合っている、請求項7に記載の方法。 - 前記pH機能プロファイルが、pH機能を形成する媒体に隣接して配置される少なくとも1つのフォーカス媒体を含み、前記pH機能がpH分離平坦部に隣接する、請求項7に記載の方法。
- 後で実施する分析に、フリー・フロー電気泳動、ゲル電気泳動、1D−PAGE、2D−PAGE、MS、MALDI、ESI、SELDI、LC−MS(/MS)、MALDI−TOF−MS(/MS)、化学発光、HPLC、エドマン・シークエンシング、NMR分光、X線回折、核酸シークエンシング、エレクトロブロッティング、アミノ酸シークエンシング、フロー・サイトメトリー、および円二色性からなる群から選択された1つの技術、またはこれらの組み合わせが含まれる、請求項7に記載の方法。
- 電気泳動による分離の後に、前記pH分離平坦部から流出する分析物をFFEチェンバーから流出する1種類以上の分析物から差し引いたものが回収され、回収された分析物の少なくとも一部に対してゲル電気泳動、質量分析、またはこれらの組み合わせが実施される、請求項7に記載の方法。
- サンプル中の前記非枯渇部分からの少なくとも1つの分析物がバイオマーカーである、請求項7に記載の方法。
- 分離する前記分析物が、アルブミン、α1アンチトリプシン、トランスフェリン、ハプトグロブリン、カゼイン、ミオシン、およびアクチンからなる群から選択されるタンパク質である、請求項7に記載の方法。
- 前記フリー・フロー等電点電気泳動による分離が天然状態下で実施され、前記pH分離平坦部のpHが、pH4.7〜pH5.0の範囲である、または
前記フリー・フロー等電点電気泳動による分離が変性条件下で実施され、前記pH分離平坦部のpHが、pH6.2〜pH6.5の範囲である、または
前記フリー・フロー等電点電気泳動による分離が変性条件下で実施され、このとき興味の対象である分析物が還元およびアルキル化され、前記pH分離平坦部のpHがpH5.9〜pH6.2の範囲である、請求項7に記載の方法。
請求項7に記載の方法。 - 2つ以上のサンプルに由来する分析物組成物から分離する1つ以上の分析物をフリー・フロー等電点電気泳動によって同時に分離する方法であって、
フリー・フロー電気泳動(FFE)チェンバーの中で単一のアノードと単一のカソードの間に、N個の分離領域と、それぞれの分離領域を隣接する各分離領域から隔てる(N−1)個の電極間安定化媒体とを含むpH機能プロファイルを形成するステップであって、前記電極間安定化媒体のそれぞれが、アノード電極間安定化媒体と、前記アノード電極間安定化媒体よりも前記FFEチャンバーの前記アノードに近いカソード電極間安定化媒体とから構成されている、ステップと;
ここで、各分離領域は、pHが分離する各分析物の等電点(pI)に実質的に対応していて、pHの範囲が上限pHと下限pHによって限定されているpH分離平坦部と、そのpH分離平坦部のアノード側に隣接していて、そのpH分離平坦部のpHよりも小さな平均pHを持つおよび/またはそのpH分離平坦部の導電率よりも大きな導電率を持つpH機能と、そのpH分離平坦部のカソード側に隣接していて、その第1のpH分離平坦部のpHよりも大きな平均pHを持つおよび/またはそのpH分離平坦部の導電率よりも大きな導電率を持つpH機能とを備えており;
分析物組成物から分離する1つの分析物を含む各サンプルを個別に、前記FFEチェンバーの1つの分離領域のpH分離平坦部、そのpH分離平坦部のアノード側の領域、またはそのpH分離平坦部のカソード側の領域に導入するステップであって、各分離領域には、分析物組成物から分離するその分析物をその分離領域において分離するのに適したpH分離平坦部が含まれている、ステップと;
FFEチェンバーから前記分析物を流出させるステップとを含む方法。 - 前記分析物をフリー・フロー等電点電気泳動によって分離する前に、分析物組成物から分離する1つ以上の分析物のpIを同定するステップをさらに含む、請求項17に記載の方法。
- 前記pH機能プロファイルが、pH分離平坦部と、pH平坦部を形成するpH機能とを含み、前記pH分離平坦部と、隣接する前記pH平坦部とのpHの差が0.5pH単位より大きい、請求項17に記載の方法。
- 前記pH機能プロファイルが、pH分離平坦部と、前記pH分離平坦部のアノード側に隣接していて少なくとも0.5pH単位の範囲にわたるpH勾配と、前記pH分離平坦部のカソード側に隣接していて少なくとも0.5pH単位の範囲にわたるpH勾配とを含む、または
前記pH機能プロファイルがpH分離平坦部を含んでいて、そのアノード側にpH勾配が隣り合い、カソード側にpH平坦部が隣り合っている、または
前記pH機能プロファイルがpH分離平坦部を含んでいて、そのアノード側にpH平坦部が隣り合い、カソード側にpH勾配が隣り合っている、請求項17に記載の方法。 - 前記pH機能プロファイルが、pH分離平坦部に隣接するpH勾配またはpH機能を形成する媒体に隣接して配置される少なくとも1つのフォーカス媒体を含む、請求項17に記載の方法。
- Nが2〜9の整数である、請求項17に記載の方法。
- 分離するサンプルの数が2〜9である、請求項17に記載の方法。
- 分析物組成物から分離する前記分析物が、各サンプルで同じである、請求項17に記載の方法。
- 前記アノード電極間安定化媒体が、一プロトン性の酸を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記カソード電極間安定化媒体が、一塩基性の塩基を含む、請求項17に記載の方法。
- フリー・フロー等電点電気泳動分離を実施するためのキットであって、フリー・フロー電気泳動(FFE)チェンバーの中で単一のアノードと単一のカソードの間に形成されたpH機能プロファイルが、pH分離平坦部に隣接したカソードpH機能と、前記pH分離平坦部に隣接したアノードpH機能とを含んでおり、
pH機能プロファイル内にpH分離平坦部を形成することのできる少なくとも1つの分離媒体と、
前記pH分離平坦部に隣接したアノードpH機能を形成することのできる少なくとも1つの分離媒体と、
前記pH分離平坦部に隣接したカソードpH機能を形成することのできる少なくとも1つの分離媒体とを含むキット。 - 分析物組成物から分離する分析物を分離するための、フリー・フロー電気泳動法を実施するための装置であって、
フリー・フロー電気泳動(FFE)チェンバーの中でアノードとカソードの間に、
pHの平均が分離する分析物の等電点(pI)に実質的に対応していて、上限pHと下限pHによって限定されたpH範囲を持ち、少なくとも1つの分離媒体入口によって導入された少なくとも1つの分離媒体によって形成される、pH分離平坦部と、
前記アノードとそのpH分離平坦部の間にあって、そのpH分離平坦部のpHよりも小さな平均pHを持つおよび/またはそのpH分離平坦部の導電率よりも大きな導電率を持ち、少なくとも1つの別の分離媒体入口によって導入された少なくとも1つの分離媒体によって形成される、pH機能と、
前記カソードとそのpH分離平坦部の間にあって、そのpH分離平坦部のpHよりも大きな平均pHを持つおよび/またはそのpH分離平坦部の導電率よりも大きな導電率を持ち、少なくとも1つの別の分離媒体入口によって導入された少なくとも1つの分離媒体によって形成される、pH機能とを含む、pH機能プロファイルを形成するための複数の分離媒体入口と、
分析物混合物から分離する分析物を含むサンプルを前記FFEチェンバーの中に導入するためのサンプル入口と、
前記サンプルから、少なくとも1つの非枯渇部分と、前記pH分離平坦部上でその非枯渇部分から分離された分析物を含む部分とに、前記FFEチェンバーから分析物を流出させるための複数の回収出口とを含む、装置。
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