DE1598583C - Verfahren und Vorrichtung zur quan titativen Bestimmung und praparativen Ge winnung von Fraktionen eines Substanz gemisches - Google Patents

Verfahren und Vorrichtung zur quan titativen Bestimmung und praparativen Ge winnung von Fraktionen eines Substanz gemisches

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DE1598583C
DE1598583C DE1598583C DE 1598583 C DE1598583 C DE 1598583C DE 1598583 C DE1598583 C DE 1598583C
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Inventor
Ludvik Dr 8000 München Strauch
Original Assignee
Hannig, Dr Kurt, 8000 München
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung und präparativen Gewinnung von Fraktionen eines Substanzgemisches, die in einem von Pufferlösung durchsetzten Trägermaterial wandern und die beim Austreten aus dem Trägermaterial mittels einer Eluierungslösung eluiert werden, sowie eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.
Die elektrophoretische Auftrennung von Substanzgemischen in feinvernetzten Trägergelen, wie z. B. Gele aus Stärke, Polyacrylamid, Gelatine und Proteinen, liefert gegenüber der Elektrophorese in freien Lösungen sowie in festen, porösen .Trägern, wie z. B. Papier, Azetatzellulose, PVC-Kugeln,. Glaspulver u. a., eine meist viel weitgehendere und schärfere Fraktionierung, da für die Trennung außer den Unterschieden in der elektrischen Ladung der einzelnen Teilchen auch deren Unterschiede in der Molekülgröße ausgenutzt werden. Bei der elektrophoretischen Wanderung durch die Poren der dreidimensionalen Gelstruktur werden größere Moleküle durch den sogenannten Molekularsiebeffekt gegenüber kleineren, gleichgeladenen Molekülen zusätzlich gebremst. Dadurch kann ein Substanzgemisch, welches gleichgeladene, jedoch verschieden große Moleküle enthält, in weitere Fraktionen unterteilt werden.
Die Verwendung dieser Methoden ist zur Zeit jedoch lediglich auf den Bereich der analytischen Feststellung beschränkt, da die Isolierung von Fraktionen nach der elektrophoretischen Auftrennung aus dem Gel bisher technisch nicht befriedigend gelöst werden konnte. Meist werden die Gelbereiche, welche die erwünschten Fraktionen enthalten, nach der Elektrophorese aus dem Gel herausgeschnitten und die Substanzen mühselig und mit schlechten Ausbeuten herauseluiert oder extrahiert. Bekannte Vorrichtungen arbeiten mit Substanzverlusten, oder es werden komplizierte Elutionssysteme verwandt, die mit großen Verdünnungen der aufgefangenen Fraktionen verbunden sind.
Die vorliegende Erfindung strebt deshalb ein Verfahren und eine Vorrichtung zu dessen Durchführung an, mit denen diese Nachteile vermieden werden und mit denen eine genaue, schnelle und sichere Bestimmung der aufgetrennten Fraktion eines Substanzgemisches durchgeführt werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß die Eluierungsgeschwindigkeit der Hluicrungslösung zur Erhaltung einer dem wahren Anteil der Fraktion im Gemisch proportionalen Konzentration an die Wanderungsgeschwindigkeit der Fraktion angepaßt und der Anteil der Fraktion am Gemisch anschließend in bekannter Weise bestimmt wird.
Ein solches Verfahren besitzt den großen Vorteil, ■ daß die einzelnen aufgefangenen Fraktionen unabhängig von ihrer Wanderungsgeschwindigkeit in der Triigcrsubstan/ eine Konzentration in der Eluier.ungsflüssigkeit aulweisen, die ihrem relativen Anteil in dem ursprünglichen Substanzgemisch proportional ist. Außerdem können auf diese Weise auch von den Fraktionen mit kleiner Wanderungsgeschwindigkeit von vornherein Eluate mit hoher Konzentration erhalten werden. Dies bringt den wesentlichen Vorteil mit sich, daß die Menge der aufgefangenen Fraktion olini! weitere Verfahrensschritte sogleich bestimmt werden kann.
Als besonders zweckmäßig hat es sich erwiesen, die Eluierungsgeschwindigkeit durch Veränderung der Strömungsgeschwindigkeit der Eluierungsflüssigkeit anzupassen, indem man z. B. während des EIuierungsvorganges die Strömungsgeschwindigkeit im Verhältnis von 30:1 verlangsamt.
Ebenso zweckmäßig kann es jedoch auch in manchen Fällen sein, die Eluierungsgeschwindigkeit durch Veränderung einer am Trägermaterial angelegten elektrischen Spannung und damit der Austrittsgeschwindigkeit der Fraktionen aus dem Trägermaterial anzupassen. Eine solche Anpassung der Eluierungsgeschwindigkeit kann jedoch gegebenenfalls auch durch Veränderung des magnetischen Feldes erreicht werden, durch die die Austrittsgeschwindigkeit der Fraktionen aus dem Trägermaterial geändert wird.
Eine Anpassung der Eluierungsgeschwindigkeit kann gleichfalls auch dadurch vorgenommen werden, daß die Temperatur der Eluierungsflüssigkeit und/ oder die Temperatur der Pufferlösung in der Trennkammer verändert wird.
Eine weitere vorteilhafte Anpassung der Eluierungsgeschwindigkeit kann man durch Veränderung des Mischungsverhältnisses der Eluierungslösung erreichen, indem man im Laufe des EIuierungsvorganges einen Anteil der Eluierungslösungsmischung, der für eine rasche Eluierung geeignet ist, allmählich vermindert.
Eine besonders schnelle und zuverlässige Messung der Eluatmenge läßt sich durchführen, wenn man die Eluierungsflüssigkeit nach dem Eluierungsvorgang durch ein Durchlaufregistrierphotometer leitet und dabei die Vorschubgeschwindigkeit des Registriergerätes in Abhängigkeit von der Wanderungsgeschwindigkeit der zu messenden Fraktion verändert.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Vorrichtung mit einer mit Trägermaterial und Pufferlösung gefüllten Trennkammer, mit einer an einem Ende dieser Trennkammer vorgesehenen Aufgabeeinrichtung für das Substanzgemisch und mit einer am anderen Ende dieser Trennkammer anschließenden Elutionskammer, einer Registriereinrichtung und einem Fraktionsteiler verwendet, die gekennzeichnet ist durch eine Einrichtung zur Beeinflussung der Eluierungsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der vorbestimmten Wanderungsgeschwindigkeit der Fraktionen des Substanzgemisches.
Die Einrichtung zur Beeinflussung der Eluierungsgeschwindigkeit besteht vorzugsweise aus einer Pumpe, deren Drehzahl und Förderungsgeschwindigkeit für die Eluierungslösung im Laufe des EIuierungsvorganges kontinuierlich und stetig veränderbar ist.
Ebenso kann mit Erfolg als Einrichtung zur Beeinflussung der Eluierungsgeschwindigkeit ein Drosselventil verwendet werden, das in der Zuleitung der Eluierungslösung angeordnet ist und in Abhängigkeit von der Wanderungsgeschwindigkeit der Fraktionen kontinuierlich und stetig veränderbar ist.
Ausgezeichnete Ergebnisse werden gleichfalls mit einer Vorrichtung erhalten, bei der die Einrichtung zur Beeinflussung der Eluierungsgeschwindigkeit aus einem die Temperatur der Eluierungslösung während des Eluierungsvorganges fortlaufend verändernden Wärmeaustauscher bestellt.
Eine gute Beeinflussung der Eluierungsgeschwin-
3 . 4
digkeit läßt sich gleichfalls durch eine Vorrichtung über die Trennsäule TS und die halbdurchlässige erreichen, bei der die Einrichtung zur Beeinflussung Membran M in das untere Elektrodengefäß UEG der Eluierungsgeschwindigkeit aus zwei weiteren die strömen kann. · Die Pufferlösungsniveauhöhen N1 Temperatur der Pufferlösung in der Trennkammer und N2 werden durch einen Kreislauf über die Leiwährend des Eluierungsvorganges fortlaufend ver- 5 tung K aufrechterhalten, durch die über eine Auslaßändernden Wärmeaustauschern besteht. leitung L2, die im unteren Teil des unteren Elek-
Bei einer Vorrichtung, bei der zu beiden Seiten trodengefäßes UEG angeordnet ist, Pufferlösung aus
der Trennkammer an einer Gleichspannung liegende dem unteren Elektrodengefäß UEG abgezogen und
Elektroden vorgesehen sind, besteht die Einrichtung durch eine Einlaßleitung L1, die im oberen Elek-
zur Beeinflussung der Eluierungsgeschwindigkeit io trodengefäß OEG unterhalb der Niveauhöhe Nx an-
zweckmäßigerweise aus einem Spannungsregler, geordnet ist, in das obere Elektrodengefäß OEG ein-
durch den die Höhe der angelegten Spannung fort- geführt wird. Die Niveauhöhe N1 der Pufferlösung
laufend während des Eluierungsvorganges veränder- kann zusätzlich durch ein Überlaufrohr UR ganz
bar ist. genau und konstant eingestellt werden. Durch dieses
Die Registriereinrichtung besteht vorteilhafter- 15 Überlaufrohr werden das Niveau N1 übersteigende
weise aus einem Durchflußphotospektrometer, dessen Pufferlösungen in das untere Elektrodengefäß UEG
Registriergerät einen in Abhängigkeit von der Wan- abgeleitet.
derungsgeschwindigkeit der jeweils zu messenden Sowohl in dem oberen als auch in dem unteren
Fraktion veränderbaren Vorschub des Registrier- Elektrodengefäß OEG, UEG ist in der Pufferlösung
materials aufweist. 20 je eine Elektrode E angeordnet, zwischen denen die
Im folgenden soll die Erfindung an Hand von in Gleichspannung einer nicht gezeigten Gleich-
der Zeichnung dargestellten beispielsweisen Ausfüh- Spannungsquelle angelegt werden kann, wobei die
rungsformen näher erläutert werden, in der Polung der Elektroden E je nach dem zu unter-
F i g. 1 in einer schematischen Darstellung eine suchenden Substanzgemisch gewählt wird. Die AnVorrichtung für die präparative Gel-Elektrophorese 25 Ordnung der Elektroden E in dem oberen und untezur Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens ren Elektrodengefäß OEG, UEG kann beliebig sein, zeigt; jedoch werden beide Elektroden E vorzugsweise auf
Fig. 2 zeigt in schematischer Darstellung eine er- der Mittellinie der Trennsäule TS angeordnet. .
weiterte Anordnung zur Durchführung des erfin- Bei der Auftrennung eines zu untersuchenden
dungsgemäßen Verfahrens; 30 Substanzgemisches wird die Pufferlösung zunächst
Fig. 3 zeigt ein Diagramm, wie es bei der Durch- durch Einschalten des Kreislaufes über die Leitung K
führung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten auf die Niveauhöhen N1 und N2 gebracht. Sodann
wurde. ■ wird das zu untersuchende Substanzgemisch in die
In F i g. 1 ist mit TS eine Trennsäule bezeichnet, Trennsäule TS eingebracht, in der die einzelnen Teildie zum Teil oder ganz mit einem Trägergel TG ge- 35 chen des Gemisches unter der Wirkung der Schwerfüllt ist, das z. B. aus Stärkegel oder Polyacrylamidgel kraft verschieden schnell durch das Trägergel TG bestehen kann. Am unteren Ende der Trennsäule ist hindurchwandern, wobei sie sich in Fraktionen, wie eine Elutionskammer EK angeordnet. Diese EIu- z. B. F1 und F2, auftrennen. Bevor die erste Fraktionskammer steht mit der Trennsäule TS in Verbin- tion die Elutionskammer EK erreicht, wird mit der dung, und ihre Form wird vorzugsweise so gewählt, 40 Elution dieser Kammer EK durch die Eluierungsdaß ihr Querschnitt größer als der Querschnitt der lösung EP begonnen, so daß die einzelnen Fraktionen Trennsäule TS ist und daß nur eine minimale Menge zeitlich aufeinanderfolgend von diesem Eluierungs-Eluierungsflüssigkeit bzw. Eluierungslösung EP für lösungsstrom EP aufgenommen werden, sobald sie die Isolierung der aufgetrennten Fraktionen verwandt aus dem Trägergel TG in die Elutionskammer EK zu werden braucht. Auf der der Trennsäule TS gegen- 45 austreten. Die Eluierungslösung EP bewegt sich hierüberliegenden Seite der Elutionskammer EK ist eine bei senkrecht zu der Wanderungsrichtung der einzelhalbdurchlässige Membran M angeordnet, die für nen Fraktionen.
die Stoffe des zu trennenden Substanzgemisches un- Wird gleichzeitig eine Auftrennung des Substanzdurchlässig ist. gemisches nach elektrischen oder magnetischen Ge-
Der obere, offene Teil der Trennsäule TS ragt in 50 sichtspunkten gewünscht, so wird nach Einfüllen des
ein oberes Elektrodengefäß OEG hinein, und der Substanzgemisches in die Trennsäule TS dem Gra-
Boden dieses oberen Elektrodengefäßes OEG ist vitationsfeld ein elektrisches Feld durch Anlegen
dicht mit der Wand der Trennsäule TS verbunden. einer Gleichspannung an die Elektroden E oder ein
Das obere Elektrodengefäß OEG ist vorzugsweise Magnetfeld, insbesondere ein inhomogenes Magnet-
durch einen Deckel D verschließbar. 55 feld, durch eine nicht gezeigte Einrichtung überlagert,
Der untere Teil der Trennsäule TS, an dem die so daß das Substanzgemisch je nach seinen elektri-
Elutionskammer EK, die mit einer Zuführungs- und sehen- Ladungen bzw. Ladungsverhältnissen oder
einer Abführungsleitung für die Eluierungslösung EP seinem Magnetismus zusätzlich in verschiedene Frak-
ausgestattet ist, befestigt ist, ragt in ein unteres Elek- tionen aufgetrennt wird. Um eine Schädigung der
trodengefäß UEG hinab. Das obere und das untere 60 aufzutrennenden Substanzen durch die entstehende
Elektrodengefäß OEG, UEG können starr oder lös- Joulsche Wärme zu vermeiden, wird die Puffer-
bar oder relativ gegeneinander verschiebbar mitein- lösung in den Elektrodengefäßen OEG, UEG durch
ander verbunden sein. eine in der F i g. 1 nicht gezeigte Kühlschlange ge-
Das obere und das untere Elektrodengefäß OEG, kühlt.
UEG sind bis zu einer Höhe Nt bzw. Ns mit Puffer- 65 In F i g. 2 ist in schematischer Darstellung eine bei-
lösung gefüllt, wobei die Höhe N1 über dem oberen, spielsweise Gesamtanordnung zur Isolierung von
offenen Rand der Trennsäule TS liegt, so daß die elektrischphoretisch in einem Trägergel aufgetrenn-
Puflerlösung von der oberen Elektrodenkammer OEG ten Fraktionen eines Substanzgemisches gezeigt, bei
der die in F i g; 1 gezeigte Trennsäulenvorrichtung verwandt ist, die allgemein mit A bezeichnet ist.
Die gezeigte Vorrichtung wird, wie bereits an Hand der Fig.l zum Teil erläutert wurde, so betrieben, daß der Kreislauf der Pufferlösung durch geeignete Wahl der Fördermenge einer Pumpe P2 so eingestellt wird, daß die Niveauhöhen N1 und N2 konstant bleiben. Nach dem Einfüllen des Substanzgemisches in die Trennsäule TS wird an die Elektroden E eine Gleichspannung angelegt, die durch eine Gleichspannungsquelle GL erzeugt wird. Bevor die am schnellsten wandernde Fraktion des Substanzgemisches die unterste Schicht des Trägergels TG in der Trennsäule TS erreicht hat und in die Elutionskammer EK eingetreten ist, wird durch die Elutionskammer EK ein sodann bis zum Ende der Elektrophorese kontinuierlich fließender Strom von Eluierungslösung EP geführt. Dieser Strom wird durch eine Pumpe P1 erzeugt, die Eluierungslösung EP aus einem Vorratsbehälter B für Eluierungslösung EP entnimmt und in die Elutionskammer EK einführt.
Die aus dem Trägergel TG im Laufe der Zeit nacheinander in die Elutionskammer EK austretenden Fraktionen werden fortlaufend von der Eluierungslösung EP aufgenommen und zusammen mit dieser Eluierungslösung EP durch ein Durchflußphotospektrometer DSP geleitet. Durch dieses Durchflußphotospektrometer wird mit Hilfe einer Lichtquelle Q und einer lichtempfindlichen Vorrichtung PZ, wie z. B. einer Photozelle, kontinuierlich die Absorption oder die Durchlässigkeit des durch die Vorrichtung hindurchfließenden Eluatstromes gemessen. Die beobachteten Werte werden gleichzeitig kontinuierlich von einem Registriergerät RG aufgezeichnet. In F i g. 2 ist schematisch eine Registrierkurve C angedeutet. Die aus dem Durchflußregistrierphotometer DSP austretenden Eluate werden schließlich in einzelnen Behältern eines Fraktionsteilers FT aufgefangen.
Mit der vorliegenden Vorrichtung ist es möglich, nicht nur die einzelnen Fraktionen des ursprünglichen Substanzgemisches getrennt aufzufangen, sondern es ist auch gleichzeitig möglich, die einzelnen Fraktionen sogleich so aufzufangen, daß jede Eluatflüssigkeit eine dem wahren Anteil der Fraktion im ursprünglichen Substanzgemisch proportionale Konzentration aufweist.
Zu diesem Zweck wird die Eluierungsgeschwindigkeit der Wanderungsgeschwindigkeit der einzelnen Fraktionen angepaßt.-Dies kann z. B. dadurch ausgeführt werden, daß die Eluierungsgeschwindigkeit stufenförmig für jede zeitlich nacheinander austretende Fraktion geändert wird, wobei die Eluierunssgeschwindigkeit während des Eintritts einer Fraktion in die Elutionskammer EK konstant gehalten wird. Zweckmäßigerweise wird jedoch die Eluierungsgeschwindigkeit kontinuierlich verändert. Diese Änderung der Eluierungsgesclnvindigkeit, ob sie nun stufenförmig oder kontinuierlich durchgeführt wird, erfolgt dabei so, daß jede Fraktion unabhängig von ihrer Wanderungsgeschwindigkcit von der gleichen Menge Eluierungslösung EP aufgenommen wird.
Eine solche Forderung kann zweckmäßigerweise dadurch erfüllt werden, daß die Menge der Eluierungslösung EP, die durch die Elutionskammer EK geleitet wird, kontinuierlich, insbesondere linear mit der Zeit verringert wird. Zu diesem Zweck ist in F i g. 2 eine Elutionssteucrung ES vorgesehen, die die Fördermenge der Pumpe P1 nach einem vorgegebenen Zeitplan, der in Form einer programmierten oder mechanisch zwangläufigen Steuerung vorliegen kann, steuert, insbesondere kontinuierlich verringert. Die Fördermenge der Pumpe P1 kann z. B. dadurch verringert werden, daß die Umlaufgeschwindigkeit der . Pumpe P1 verändert wird.
Eine Anpassung der Eluierungsgeschwindigkeit an die Wanderungsgeschwindigkeit der Fraktionen kann
αο jedoch auch ohne eine zeitliche Änderung der Menge der Eluierungslösung EP dadurch vorgenommen werden, daß man bei konstanter Menge an Eluierungslösung EP, die pro Zeiteinheit durch die Elutionskammer EK fließt, kontinuierlich die Gleichspannung an den Elektroden E derart ändert, insbesondere kontinuierlich erhöht, daß die Zeit, die vom Eintritt der nach unten weisenden, vorderen Front der Fraktionsschicht F1 (s. F i g. 1) in die Elutionskammer EK bis zum Eintritt der nach oben weisenden, hinteren Front der Fraktionsschicht F1 vergeht, genauso lang ist wie die Zeit, die die Fraktion F2 für ihren genauso definierten Eintritt in die Elutionskammer EK benötigt. Dies wird vorzugsweise durch eine lineare Erhöhung der Wanderungsgeschwindigkeiten der Fraktionen mit der Zeit erreicht. Für die Durchführung eines solchen Schrittes eignet sich.z.B. ein Regler RaL, der zwischen die Gleichspannungsquelle GL und die Elektroden E geschaltet ist und der die Spannung der Elektroden E kontinuierlich ändert, insbesondere erhöht.
Ein ähnliches Verfahren kann angewandt werden, wenn die Fraktionen auf Grund ihres Magnetismus in einem Magnetfeld aufgetrennt werden. In diesem Fall kann z. B. der elektrische Strom, mit dem das Magnetfeld erzeugt wird, so geregelt werden, daß durch die Änderung der Wanderungsgeschwindigkeiten der einzelnen Fraktionen dieselben Zeitbedingungen erfüllt, werden wie im Falle der oben beschriebenen Änderung der Wanderungsgeschwindigkeit auf
Grund eines elektrischen Feldes. '
Eine weitere Möglichkeit, um die Eluierungsgeschwindigkeit an die Wanderungsgeschwindigkeit der Fraktionen anzupassen, besteht darin, daß vorzugsweise bei konstanter elektrischer Spannung an den Elektroden E und bei konstanter Flußmenge an Eluierungslösung EP durch die Elutionskammer EK die Temperatur der Eluierungslösung EP verändert wird. Diese Temperaturänderung sollte in der Richtung ausgeführt werden, daß sich eine größere Aufnahmefähigkeit der Eluierung EP für die Fraktionen bzw. eine größere Löslichkeit der Fraktionen in der Eluierungslösung EP ergibt, wodurch ein zunehmend schnelleres Eintreten der Fraktionen in die Elutionskammer EK stattfindet. Dieselbe Wirkung kann durch eine Temperaturänderung der Pufferlösung in den Elektrodengefäßen OEG und UEG erreicht werden.
Eine Anpassung der Eluierungsgeschwindigkeit an
die Wanderungsgescliwindigkeit der Fraktionen durch eine Temperaturänderung der Eluierungslösung EP
oder der Pufferlösung braucht jedoch nicht bei konstant gehaltener elektrischer Spannung oder konstant gehaltenem Magnetfeld bzw. konsumier Flußmenge an Eluitioiislösung zu erfolgen, sondern es kann eine solche Anpassung auch durch gleichzeitige kontinuier-
liehe oder stufenweise Änderung aller oben beschriebenen Größen oder einiger dieser Größen erfoljien. Eine kontinuierliche oder stufenweise -Änderung der Temperatur der FJuicningslösung /:V oder dv.r
Pufferlösung kann z.B. durch einen Wärmeaustauscher Wx, der in die Leitung zwischen der Pumpe P1 und der Elutionskammer EK eingebaut ist, oder Wärmeaustauscher W2 und/oder W3 erfolgen, die im unteren und/oder im oberen Elektrodengefäß UEK, OEK innerhalb der Pufferlösung angebracht sind. Diese Wärmeaustauscher Wx, W2, Wa können durch Regelvorrichtungen RWx bzw. RW2 derart nach einem vorgegebenen Programm gesteuert werden, daß jede Fraktion von einer gleichgroßen Menge an Eluierungslösung EP aufgenommen wird.
Eine Anpassung kann gleichfalls auch dadurch vorgenommen werden, daß die Eluierungslösung EP aus zwei oder mehreren Komponenten besteht, von denen mindestens eine Komponente für die einzelnen Fraktionen ein größeres bzw. weitaus größeres Aufnahmevermögen als die anderen Komponenten besitzt, und daß das Verhältnis der Anteile der aufnahmefähigeren Komponente zu der für die Fraktionen schlechter aufnahmefähigen Komponente in der Eluierungslösung EP kontinuierlich oder stufenweise geändert wird. Ein solches Verfahren ist insbesondere dann gut geeignet, wenn der gesamte oder der überwiegende Teil der Fraktionen von der besser aufnehmenden Komponente aufgenommen wird und diese Komponente von der oder den anderen Komponenten der Eluierungslösung EP leicht abtrennbar ist. Das Mischungsverhältnis der Anteile der beiden verschieden wirkenden Komponenten wird zweckmäßigerweise linear geändert, wobei insbesondere bei konstanter Temperatur der Eluierungslösung EP und konstantem elektrischem Feld und/oder Magnetfeld der Anteil der aufnahmefähigeren Komponente verringert wird. Auch dieses Verfahren kann jedoch in Verbindung mit einem oder mehreren der vorherbeschriebenen Verfahren angewandt werden.
Um eine möglichst optimale Anpassung im Bereich der zur Verfügung stehenden, nutzbaren Änderungsmöglichkeit einer Größe, wie etwa der Eluierungslösungsmenge pro Zeiteinheit, der elektrischen Spannung, des Magnetfeldes, der Temperatur oder des Mischungsverhältnisses der Eluierungslösung EP, zu erhalten, wird zweckmäßigerweise zuerst ein Leerversuch mit einem Teil des Substanzgemisches durchgeführt, durch den die Zeit festgestellt wird, in der auch die letzte Fraktion des Substanzgemisches in die Elutionskammer EK gelangt ist. Auf Grund dieser festgestellten Zeit wird sodann je nach dem verwandten Verfahren zur Anpassung die betreffende Regeleinrichtung zur Steuerung der zu ändernden Größe so programmiert bzw. eingestellt, daß innerhalb dieser gemessenen Zeit die maximal nutzbare.Änderung der betreffenden Größe durchlaufen wird. Vorzugsweise erfolgt, falls die zu ändernde Größe die Flußmenge der Eluierungslösung EP pro Zeiteinheit ist, eine solche Einstellung der Elutionssteuerung ES, daß diese Größe im Verhältnis 30 :1 während dieser Zeit verringert wird.
Ein Leerversuch zur Feststellung der Durchflußzeit des Substanzgemisches durch die Trennsäule TS ist jedoch keineswegs notwendig. Vielmehr können die betreffenden Regeleinrichtungen zur Steuerung der zu ändernden Größe auch von vornherein so eingestellt werden, daß die maximale, nutzvolle Änderung der betreffenden Größe nach einer Zeit erreicht wird, die größer ist als die Zeit, die für den Durchlauf des Substanzgemisches durch die Trennsäule TS schätzungsweise angenommen wird.
Durch das vorliegende Verfahren können gleichzeitig auch die relativen Anteile der einzelnen Fraktionen am ursprünglichen Substanzgemisch direkt bestimmt werden. Dies wird dadurch erreicht, daß die betreffenden Regeleinrichtungen, wie z. B. die Elutionssteuerung ES oder die Regeleinrichtungen RWi bzw. RW2 oder R0L, zur Steuerung der zu ändernden Größe direkt mit einer Steuerungseinrichtung SRG für das Registriergerät. RG verbunden ist, durch das
ίο die Vorschubgeschwindigkeit des Aufzeichnungsmediums des Registriergerätes RG proportional zu der Änderungsgeschwindigkeit der zu steuernden Größe verändert wird.
In F i g. 2 ist z. B. die Elutionssteuerung ES durch eine elektrische Verbindungsleitung F1, die Regel-. einrichtungen RWx bzw. Rwfür den Wärmeaustauscher W1 bzw. W2 oder W7, durch eine elektrische Verbindungsleitung V2 bzw. V3 und die Regeleinrichtungen RGL für die Gleichspannung der Elektroden E durch eine elektrische Verbindungsleitung V4 mit der Steuerungseinrichtung SRG des Registriergerätes verbunden.
Der relative Anteil der jeweiligen Fraktion am Substanzgemisch wird unter diesen Bedingungen sogleich durch Integration der unter dem jeweiligen Peak der Kurve C, der durch Photometrierung des Eluats einer bestimmten Fraktion hervorgebracht wird, liegenden Fläche erhalten.
Gleichzeitig neben dieser quantitativen Feststellung des relativen Anteils jeder Fraktion am ursprünglichen Substanzgemisch kann jedoch auch das Eluat jeder Fraktion völlig getrennt von denjenigen der nächstfolgenden Fraktionen ohne Hilfe durch eine Bedienungsperson aufgefangen werden. Dies wird dadurch ermöglicht, daß der Fraktionsteiler FT (F i g. 2) vom Registrierphotometer DSP aus so gesteuert wird, daß bei Erreichung eines Schwellenwertes der durch das Registriergerät RG aufgezeichneten Kurve oder z. B. der durch die Photozelle PZ abgegebenen Signale, der den Beginn einer neuen Fraktion anzeigt, mit der Füllung eines neuen Gefäßes des Fraktionsteilers FT begonnen wird. Durch diesen Impuls, der bei der Überschreitung des Schwellenwertes abgegeben wird, wird durch die Steuerungsvorrichtung SFT des Fraktionsteilers FT eine solche Relativbewegung zwischen dem Fraktionsteiler FT und dem Ende einer aus dem Durchflußphotospektrometer DSP austretenden Zuflußleitung Z hervorgebracht, daß das Eluat einer neuen Fraktion in ein neues Auffanggefäß einläuft.
Die Leistungsfähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens soll noch an Hand eines Beispieles näher erläutert werden.
Beispiel
In einer Vorrichtung entsprechend der in Fig. 2, bei der die Anpassung der Eluierungsgeschwindigkeit an die Wanderungsgeschwindigkeit der einzelnen Fraktionen jedoch allein durch eine stetige lineare zeitliche Änderung der Eluierungslösungsflußmcnge durch die Elutionskammer EK vorgenommen wurde, wurde eine Isolierung einzelner Enzym- und Proteinfraktionen aus der Rohkollagenase durchgeführt.
Hierbei bestand die Probe aus 95 mg RohkoIIagcnase. Als Elektrodenpuffer wurden 3 g Tris -I- 14,4 g Glycin, gepuffert mit 1 Mol NaOH bis pH 9,0 und mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt, vcr-
109 619/230
wandt. Der Gelpuffer bestand aus 40 g Tris in etwa 500 ml destilliertem Wasser gelöst, das mit 1 Mol HCl auf pH 8,0 gebracht und mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt worden war. Als Trägergel wurde 7,5% Polyacrylamid im Gelpuffer verwandt.
Die Probe wurde in 1 ml Gelpuffer unter Zusatz von Glukose gelöst und auf das Trägergel aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgte bei 200 V und 60 mA bei einer Temperatur von 15° C über 52 Stunden. Während dieser Zeit wurde die Elutionslösungsflußmenge pro Zeiteinheit im Verhältnis von 30:1 verringert.
In F i g. 3 ist mit P die im Registriergerät RG erhaltene Kurve bezeichnet, die die Verteilung der Proteine angibt. Die Aktivitäten der Enzyme wurden in einzelnen Fraktionen getrennt bestimmt. Kurve PA—Proteinase, Kurve AIE—Amidase/Esterase, Kurve Kx — Kollagenase 1 (Clostridiopeptidase A,EC 3.4.4.19), Kurve K2-Kollagenase 2, Pi-Pigmente.
Aus diesem Beispiel geht nochmals eindeutig hervor, daß durch die vorliegende Erfindung ein einfaches und einwandfrei arbeitendes Verfahren und Elutionssystem angegeben wird. Gleichzeitig wird jedoch zusätzlich der wesentliche Vorteil erhalten, daß die Konzentrationsverhältnisse der aufgetrennten Fraktionen im Eluat denjenigen im Gel selbst entsprechen. Hierdurch können Elutionskurven erhalten werden, die die Gestalt von Extinktionskurven besitzen, wie sie bei der direkten Photometrierung der Verteilung im Gel gewonnen werden. Gleichzeitig kann jedoch gemäß der vorliegenden Erfindung auch eine analytische Auswertung der isolierten Fraktionen durchgeführt werden.
35

Claims (15)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung und präparativen Gewinnung von Fraktionen eines Substanzgemisches, die in einem von Pufferlösung durchsetzten Trägermaterial wandern und die beim Austreten aus dem Trägermaterial mittels einer Eluierungslösung eluiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Eluierungsgeschwindigkeit der Eluierungslösung (EP) zur Erhaltung einer dem wahren Anteil der Fraktion im Gemisch proportionalen Konzentration an die Wanderungsgeschwindigkeit der Fraktion angepaßt und der Anteil der Fraktion am Gemisch anschließend in bekannter Weise bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anpassung der Eluierungsgeschwindigkeit durch Veränderung der Strömungsgeschwindigkeit der Eluierungslösung (EP) vorgenommen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anpassung der Eluierungsgeschwindigkeit durch Veränderung einer an dem Trägermaterial angelegten elektrischen Spannung vorgenommen wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anpassung der Eluicrungsgcschwindigkeit durch Veränderung eines magnetischen Feldes vorgenommen wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Anpassung der Eluierungsgeschwindigkeit durch Veränderung der Temperatur der Eluierungslösung (EP) vorgenommen wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Anpassung der Eluierungsgeschwindigkeit durch Veränderung der Temperatur der Pufferlösung in einer Trennkammer (EK) vorgenommen wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Anpassung der Eluierungsgeschwindigkeit durch Veränderung des Mischungsverhältnisses der Eluierungslösung (EP) durch allmähliche Verminderung des einen Anteils der Eluierungslösungsmischung, der für eine rasche Eluierung geeignet ist, im Laufe des Eluieningsvorganges vorgenommen wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Eluierungslösung nach dem Eluierungsvorgang durch ein Durchlaufregistrierphotometer (DSP) geleitet und dabei die Vorschubgeschwindigkeit des Registriermaterials eines Registriergerätes (RG) in Abhängigkeit von der Wanderungsgeschwindigkeit der jeweils zu messenden Fraktion verändert wird. '
9. Vorrichtung zum Durchführen des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 8 mit einer mit Trägermaterial und Pufferlösung gefüllten Trennkammer, mit einer an einem Ende dieser Trennkammer vorgesehenen Aufgabeeinrichtung für das Substanzgemisch und mit einer am anderen Ende dieser Trennkammer anschließenden EIutionskammer, einer Registriereinrichtung und einem Fraktionsteiler, gekennzeichnet durch eine Einrichtung zur Beeinflussung der Eluierungsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der vorbestimmten Wanderungsgeschwindigkeit der Fraktionen des Substanzgemisches.
10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur Beeinflussung der Eluierungsgeschwindigkeit aus einer Pumpe (P,) besteht, deren Drehzahl und damit deren Förderungsgeschwindigkeit für die Eluierungslösung (EP) im Laufe des Eluieningsvorganges kontinuierlich und stetig veränderbar ist.
11. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur Beeinflussung der Eluierungsgeschwindigkeit aus einem Drosselventil besteht, das in der Zuleitung der Eluierungslösung (EP) angeordnet ist und in Abhängigkeit von der Wanderungsgeschwindigkeit der Fraktionen kontinuierlich und stetig veränderbar ist.
12. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur Beeinflussung der Eluierungsgeschwindigkeit aus einem die Temperatur der Eluierungslösung (EP) während des Eluieningsvorganges fortlaufend verändernden Wärmeaustauscher (W1) besteht.
13. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur Beeinflussung der Eluierungsgeschwindigkeit aus zwei weiteren die Temperatur der Pufferlösung in der Trennkammer (TK) während des Eluierungsvorganges fortlaufend verändernden Wärmeaustauschern (W2, W3) besteht.
14. Vorrichtung nach Anspruch 9 mit an einer Gleichspannung liegenden Elektroden zu beiden Seiten der Trennkammer, dadurch gekennzeich-
net, daß die Einrichtung zur Beeinflussung der Eluierungsgeschwindigkeit aus einem Spannungsregler (RGL), durch den die Höhe der angelegten Spannung fortlaufend während des Eluierungsvorganges veränderbar ist, besteht.
15. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch ge-
kennzeichnet, daß die Registriereinrichtung aus einem Durchflußphotospektrometer (DSP) besteht, dessen Registriergerät (RG) einen in Abhängigkeit von der Wanderungsgeschwindigkeit der jeweils zu messenden Fraktion veränderbaren Vorschub des Registriermaterials aufweist.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

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