DE1598583C - Verfahren und Vorrichtung zur quan titativen Bestimmung und praparativen Ge winnung von Fraktionen eines Substanz gemisches - Google Patents
Verfahren und Vorrichtung zur quan titativen Bestimmung und praparativen Ge winnung von Fraktionen eines Substanz gemischesInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung und präparativen Gewinnung
von Fraktionen eines Substanzgemisches, die in einem von Pufferlösung durchsetzten Trägermaterial
wandern und die beim Austreten aus dem Trägermaterial mittels einer Eluierungslösung eluiert werden,
sowie eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.
Die elektrophoretische Auftrennung von Substanzgemischen in feinvernetzten Trägergelen, wie z. B.
Gele aus Stärke, Polyacrylamid, Gelatine und Proteinen, liefert gegenüber der Elektrophorese in freien
Lösungen sowie in festen, porösen .Trägern, wie z. B. Papier, Azetatzellulose, PVC-Kugeln,. Glaspulver
u. a., eine meist viel weitgehendere und schärfere Fraktionierung, da für die Trennung außer den
Unterschieden in der elektrischen Ladung der einzelnen Teilchen auch deren Unterschiede in der
Molekülgröße ausgenutzt werden. Bei der elektrophoretischen Wanderung durch die Poren der dreidimensionalen
Gelstruktur werden größere Moleküle durch den sogenannten Molekularsiebeffekt gegenüber
kleineren, gleichgeladenen Molekülen zusätzlich gebremst. Dadurch kann ein Substanzgemisch, welches
gleichgeladene, jedoch verschieden große Moleküle enthält, in weitere Fraktionen unterteilt werden.
Die Verwendung dieser Methoden ist zur Zeit jedoch lediglich auf den Bereich der analytischen
Feststellung beschränkt, da die Isolierung von Fraktionen nach der elektrophoretischen Auftrennung aus
dem Gel bisher technisch nicht befriedigend gelöst werden konnte. Meist werden die Gelbereiche, welche
die erwünschten Fraktionen enthalten, nach der Elektrophorese aus dem Gel herausgeschnitten und
die Substanzen mühselig und mit schlechten Ausbeuten herauseluiert oder extrahiert. Bekannte Vorrichtungen
arbeiten mit Substanzverlusten, oder es werden komplizierte Elutionssysteme verwandt, die
mit großen Verdünnungen der aufgefangenen Fraktionen verbunden sind.
Die vorliegende Erfindung strebt deshalb ein Verfahren
und eine Vorrichtung zu dessen Durchführung an, mit denen diese Nachteile vermieden werden
und mit denen eine genaue, schnelle und sichere Bestimmung der aufgetrennten Fraktion eines Substanzgemisches
durchgeführt werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß die Eluierungsgeschwindigkeit der
Hluicrungslösung zur Erhaltung einer dem wahren Anteil der Fraktion im Gemisch proportionalen Konzentration
an die Wanderungsgeschwindigkeit der Fraktion angepaßt und der Anteil der Fraktion am
Gemisch anschließend in bekannter Weise bestimmt wird.
Ein solches Verfahren besitzt den großen Vorteil, ■ daß die einzelnen aufgefangenen Fraktionen unabhängig
von ihrer Wanderungsgeschwindigkeit in der Triigcrsubstan/ eine Konzentration in der Eluier.ungsflüssigkeit
aulweisen, die ihrem relativen Anteil in dem ursprünglichen Substanzgemisch proportional
ist. Außerdem können auf diese Weise auch von den Fraktionen mit kleiner Wanderungsgeschwindigkeit
von vornherein Eluate mit hoher Konzentration erhalten werden. Dies bringt den wesentlichen Vorteil
mit sich, daß die Menge der aufgefangenen Fraktion olini! weitere Verfahrensschritte sogleich bestimmt
werden kann.
Als besonders zweckmäßig hat es sich erwiesen, die Eluierungsgeschwindigkeit durch Veränderung
der Strömungsgeschwindigkeit der Eluierungsflüssigkeit anzupassen, indem man z. B. während des EIuierungsvorganges
die Strömungsgeschwindigkeit im Verhältnis von 30:1 verlangsamt.
Ebenso zweckmäßig kann es jedoch auch in manchen Fällen sein, die Eluierungsgeschwindigkeit
durch Veränderung einer am Trägermaterial angelegten elektrischen Spannung und damit der Austrittsgeschwindigkeit
der Fraktionen aus dem Trägermaterial anzupassen. Eine solche Anpassung der
Eluierungsgeschwindigkeit kann jedoch gegebenenfalls auch durch Veränderung des magnetischen
Feldes erreicht werden, durch die die Austrittsgeschwindigkeit der Fraktionen aus dem Trägermaterial
geändert wird.
Eine Anpassung der Eluierungsgeschwindigkeit kann gleichfalls auch dadurch vorgenommen werden,
daß die Temperatur der Eluierungsflüssigkeit und/ oder die Temperatur der Pufferlösung in der Trennkammer
verändert wird.
Eine weitere vorteilhafte Anpassung der Eluierungsgeschwindigkeit kann man durch Veränderung
des Mischungsverhältnisses der Eluierungslösung erreichen, indem man im Laufe des EIuierungsvorganges
einen Anteil der Eluierungslösungsmischung, der für eine rasche Eluierung geeignet ist,
allmählich vermindert.
Eine besonders schnelle und zuverlässige Messung der Eluatmenge läßt sich durchführen, wenn man
die Eluierungsflüssigkeit nach dem Eluierungsvorgang durch ein Durchlaufregistrierphotometer leitet und
dabei die Vorschubgeschwindigkeit des Registriergerätes in Abhängigkeit von der Wanderungsgeschwindigkeit
der zu messenden Fraktion verändert.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Vorrichtung mit einer mit Trägermaterial
und Pufferlösung gefüllten Trennkammer, mit einer an einem Ende dieser Trennkammer vorgesehenen
Aufgabeeinrichtung für das Substanzgemisch und mit einer am anderen Ende dieser Trennkammer anschließenden Elutionskammer, einer
Registriereinrichtung und einem Fraktionsteiler verwendet, die gekennzeichnet ist durch eine Einrichtung
zur Beeinflussung der Eluierungsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der vorbestimmten Wanderungsgeschwindigkeit
der Fraktionen des Substanzgemisches.
Die Einrichtung zur Beeinflussung der Eluierungsgeschwindigkeit besteht vorzugsweise aus einer
Pumpe, deren Drehzahl und Förderungsgeschwindigkeit für die Eluierungslösung im Laufe des EIuierungsvorganges
kontinuierlich und stetig veränderbar ist.
Ebenso kann mit Erfolg als Einrichtung zur Beeinflussung der Eluierungsgeschwindigkeit ein Drosselventil
verwendet werden, das in der Zuleitung der Eluierungslösung angeordnet ist und in Abhängigkeit
von der Wanderungsgeschwindigkeit der Fraktionen kontinuierlich und stetig veränderbar ist.
Ausgezeichnete Ergebnisse werden gleichfalls mit einer Vorrichtung erhalten, bei der die Einrichtung
zur Beeinflussung der Eluierungsgeschwindigkeit aus einem die Temperatur der Eluierungslösung während
des Eluierungsvorganges fortlaufend verändernden Wärmeaustauscher bestellt.
Eine gute Beeinflussung der Eluierungsgeschwin-
3 . 4
digkeit läßt sich gleichfalls durch eine Vorrichtung über die Trennsäule TS und die halbdurchlässige
erreichen, bei der die Einrichtung zur Beeinflussung Membran M in das untere Elektrodengefäß UEG
der Eluierungsgeschwindigkeit aus zwei weiteren die strömen kann. · Die Pufferlösungsniveauhöhen N1
Temperatur der Pufferlösung in der Trennkammer und N2 werden durch einen Kreislauf über die Leiwährend
des Eluierungsvorganges fortlaufend ver- 5 tung K aufrechterhalten, durch die über eine Auslaßändernden
Wärmeaustauschern besteht. leitung L2, die im unteren Teil des unteren Elek-
Bei einer Vorrichtung, bei der zu beiden Seiten trodengefäßes UEG angeordnet ist, Pufferlösung aus
der Trennkammer an einer Gleichspannung liegende dem unteren Elektrodengefäß UEG abgezogen und
Elektroden vorgesehen sind, besteht die Einrichtung durch eine Einlaßleitung L1, die im oberen Elek-
zur Beeinflussung der Eluierungsgeschwindigkeit io trodengefäß OEG unterhalb der Niveauhöhe Nx an-
zweckmäßigerweise aus einem Spannungsregler, geordnet ist, in das obere Elektrodengefäß OEG ein-
durch den die Höhe der angelegten Spannung fort- geführt wird. Die Niveauhöhe N1 der Pufferlösung
laufend während des Eluierungsvorganges veränder- kann zusätzlich durch ein Überlaufrohr UR ganz
bar ist. genau und konstant eingestellt werden. Durch dieses
Die Registriereinrichtung besteht vorteilhafter- 15 Überlaufrohr werden das Niveau N1 übersteigende
weise aus einem Durchflußphotospektrometer, dessen Pufferlösungen in das untere Elektrodengefäß UEG
Registriergerät einen in Abhängigkeit von der Wan- abgeleitet.
derungsgeschwindigkeit der jeweils zu messenden Sowohl in dem oberen als auch in dem unteren
Fraktion veränderbaren Vorschub des Registrier- Elektrodengefäß OEG, UEG ist in der Pufferlösung
materials aufweist. 20 je eine Elektrode E angeordnet, zwischen denen die
Im folgenden soll die Erfindung an Hand von in Gleichspannung einer nicht gezeigten Gleich-
der Zeichnung dargestellten beispielsweisen Ausfüh- Spannungsquelle angelegt werden kann, wobei die
rungsformen näher erläutert werden, in der Polung der Elektroden E je nach dem zu unter-
F i g. 1 in einer schematischen Darstellung eine suchenden Substanzgemisch gewählt wird. Die AnVorrichtung
für die präparative Gel-Elektrophorese 25 Ordnung der Elektroden E in dem oberen und untezur
Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens ren Elektrodengefäß OEG, UEG kann beliebig sein,
zeigt; jedoch werden beide Elektroden E vorzugsweise auf
Fig. 2 zeigt in schematischer Darstellung eine er- der Mittellinie der Trennsäule TS angeordnet. .
weiterte Anordnung zur Durchführung des erfin- Bei der Auftrennung eines zu untersuchenden
dungsgemäßen Verfahrens; 30 Substanzgemisches wird die Pufferlösung zunächst
Fig. 3 zeigt ein Diagramm, wie es bei der Durch- durch Einschalten des Kreislaufes über die Leitung K
führung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten auf die Niveauhöhen N1 und N2 gebracht. Sodann
wurde. ■ wird das zu untersuchende Substanzgemisch in die
In F i g. 1 ist mit TS eine Trennsäule bezeichnet, Trennsäule TS eingebracht, in der die einzelnen Teildie
zum Teil oder ganz mit einem Trägergel TG ge- 35 chen des Gemisches unter der Wirkung der Schwerfüllt
ist, das z. B. aus Stärkegel oder Polyacrylamidgel kraft verschieden schnell durch das Trägergel TG
bestehen kann. Am unteren Ende der Trennsäule ist hindurchwandern, wobei sie sich in Fraktionen, wie
eine Elutionskammer EK angeordnet. Diese EIu- z. B. F1 und F2, auftrennen. Bevor die erste Fraktionskammer
steht mit der Trennsäule TS in Verbin- tion die Elutionskammer EK erreicht, wird mit der
dung, und ihre Form wird vorzugsweise so gewählt, 40 Elution dieser Kammer EK durch die Eluierungsdaß
ihr Querschnitt größer als der Querschnitt der lösung EP begonnen, so daß die einzelnen Fraktionen
Trennsäule TS ist und daß nur eine minimale Menge zeitlich aufeinanderfolgend von diesem Eluierungs-Eluierungsflüssigkeit
bzw. Eluierungslösung EP für lösungsstrom EP aufgenommen werden, sobald sie
die Isolierung der aufgetrennten Fraktionen verwandt aus dem Trägergel TG in die Elutionskammer EK
zu werden braucht. Auf der der Trennsäule TS gegen- 45 austreten. Die Eluierungslösung EP bewegt sich hierüberliegenden
Seite der Elutionskammer EK ist eine bei senkrecht zu der Wanderungsrichtung der einzelhalbdurchlässige
Membran M angeordnet, die für nen Fraktionen.
die Stoffe des zu trennenden Substanzgemisches un- Wird gleichzeitig eine Auftrennung des Substanzdurchlässig ist. gemisches nach elektrischen oder magnetischen Ge-
Der obere, offene Teil der Trennsäule TS ragt in 50 sichtspunkten gewünscht, so wird nach Einfüllen des
ein oberes Elektrodengefäß OEG hinein, und der Substanzgemisches in die Trennsäule TS dem Gra-
Boden dieses oberen Elektrodengefäßes OEG ist vitationsfeld ein elektrisches Feld durch Anlegen
dicht mit der Wand der Trennsäule TS verbunden. einer Gleichspannung an die Elektroden E oder ein
Das obere Elektrodengefäß OEG ist vorzugsweise Magnetfeld, insbesondere ein inhomogenes Magnet-
durch einen Deckel D verschließbar. 55 feld, durch eine nicht gezeigte Einrichtung überlagert,
Der untere Teil der Trennsäule TS, an dem die so daß das Substanzgemisch je nach seinen elektri-
Elutionskammer EK, die mit einer Zuführungs- und sehen- Ladungen bzw. Ladungsverhältnissen oder
einer Abführungsleitung für die Eluierungslösung EP seinem Magnetismus zusätzlich in verschiedene Frak-
ausgestattet ist, befestigt ist, ragt in ein unteres Elek- tionen aufgetrennt wird. Um eine Schädigung der
trodengefäß UEG hinab. Das obere und das untere 60 aufzutrennenden Substanzen durch die entstehende
Elektrodengefäß OEG, UEG können starr oder lös- Joulsche Wärme zu vermeiden, wird die Puffer-
bar oder relativ gegeneinander verschiebbar mitein- lösung in den Elektrodengefäßen OEG, UEG durch
ander verbunden sein. eine in der F i g. 1 nicht gezeigte Kühlschlange ge-
Das obere und das untere Elektrodengefäß OEG, kühlt.
UEG sind bis zu einer Höhe Nt bzw. Ns mit Puffer- 65 In F i g. 2 ist in schematischer Darstellung eine bei-
lösung gefüllt, wobei die Höhe N1 über dem oberen, spielsweise Gesamtanordnung zur Isolierung von
offenen Rand der Trennsäule TS liegt, so daß die elektrischphoretisch in einem Trägergel aufgetrenn-
Puflerlösung von der oberen Elektrodenkammer OEG ten Fraktionen eines Substanzgemisches gezeigt, bei
der die in F i g; 1 gezeigte Trennsäulenvorrichtung
verwandt ist, die allgemein mit A bezeichnet ist.
Die gezeigte Vorrichtung wird, wie bereits an Hand der Fig.l zum Teil erläutert wurde, so betrieben,
daß der Kreislauf der Pufferlösung durch geeignete Wahl der Fördermenge einer Pumpe P2 so eingestellt
wird, daß die Niveauhöhen N1 und N2 konstant bleiben.
Nach dem Einfüllen des Substanzgemisches in die Trennsäule TS wird an die Elektroden E eine
Gleichspannung angelegt, die durch eine Gleichspannungsquelle GL erzeugt wird. Bevor die am
schnellsten wandernde Fraktion des Substanzgemisches die unterste Schicht des Trägergels TG in der
Trennsäule TS erreicht hat und in die Elutionskammer
EK eingetreten ist, wird durch die Elutionskammer EK ein sodann bis zum Ende der Elektrophorese
kontinuierlich fließender Strom von Eluierungslösung EP geführt. Dieser Strom wird durch eine Pumpe P1
erzeugt, die Eluierungslösung EP aus einem Vorratsbehälter B für Eluierungslösung EP entnimmt und in
die Elutionskammer EK einführt.
Die aus dem Trägergel TG im Laufe der Zeit nacheinander in die Elutionskammer EK austretenden
Fraktionen werden fortlaufend von der Eluierungslösung EP aufgenommen und zusammen mit dieser
Eluierungslösung EP durch ein Durchflußphotospektrometer DSP geleitet. Durch dieses Durchflußphotospektrometer
wird mit Hilfe einer Lichtquelle Q und einer lichtempfindlichen Vorrichtung PZ, wie z. B.
einer Photozelle, kontinuierlich die Absorption oder die Durchlässigkeit des durch die Vorrichtung hindurchfließenden
Eluatstromes gemessen. Die beobachteten Werte werden gleichzeitig kontinuierlich
von einem Registriergerät RG aufgezeichnet. In F i g. 2 ist schematisch eine Registrierkurve C angedeutet.
Die aus dem Durchflußregistrierphotometer DSP austretenden Eluate werden schließlich in einzelnen
Behältern eines Fraktionsteilers FT aufgefangen.
Mit der vorliegenden Vorrichtung ist es möglich, nicht nur die einzelnen Fraktionen des ursprünglichen
Substanzgemisches getrennt aufzufangen, sondern es ist auch gleichzeitig möglich, die einzelnen Fraktionen
sogleich so aufzufangen, daß jede Eluatflüssigkeit eine dem wahren Anteil der Fraktion im ursprünglichen
Substanzgemisch proportionale Konzentration aufweist.
Zu diesem Zweck wird die Eluierungsgeschwindigkeit der Wanderungsgeschwindigkeit der einzelnen
Fraktionen angepaßt.-Dies kann z. B. dadurch ausgeführt werden, daß die Eluierungsgeschwindigkeit
stufenförmig für jede zeitlich nacheinander austretende Fraktion geändert wird, wobei die Eluierunssgeschwindigkeit
während des Eintritts einer Fraktion in die Elutionskammer EK konstant gehalten
wird. Zweckmäßigerweise wird jedoch die Eluierungsgeschwindigkeit kontinuierlich verändert. Diese
Änderung der Eluierungsgesclnvindigkeit, ob sie nun stufenförmig oder kontinuierlich durchgeführt wird,
erfolgt dabei so, daß jede Fraktion unabhängig von ihrer Wanderungsgeschwindigkcit von der gleichen
Menge Eluierungslösung EP aufgenommen wird.
Eine solche Forderung kann zweckmäßigerweise dadurch erfüllt werden, daß die Menge der Eluierungslösung
EP, die durch die Elutionskammer EK geleitet wird, kontinuierlich, insbesondere linear mit
der Zeit verringert wird. Zu diesem Zweck ist in F i g. 2 eine Elutionssteucrung ES vorgesehen, die die
Fördermenge der Pumpe P1 nach einem vorgegebenen Zeitplan, der in Form einer programmierten oder
mechanisch zwangläufigen Steuerung vorliegen kann, steuert, insbesondere kontinuierlich verringert. Die
Fördermenge der Pumpe P1 kann z. B. dadurch verringert werden, daß die Umlaufgeschwindigkeit der
. Pumpe P1 verändert wird.
Eine Anpassung der Eluierungsgeschwindigkeit an die Wanderungsgeschwindigkeit der Fraktionen kann
αο jedoch auch ohne eine zeitliche Änderung der Menge
der Eluierungslösung EP dadurch vorgenommen werden, daß man bei konstanter Menge an Eluierungslösung
EP, die pro Zeiteinheit durch die Elutionskammer EK fließt, kontinuierlich die Gleichspannung
an den Elektroden E derart ändert, insbesondere kontinuierlich erhöht, daß die Zeit, die vom Eintritt
der nach unten weisenden, vorderen Front der Fraktionsschicht F1 (s. F i g. 1) in die Elutionskammer EK
bis zum Eintritt der nach oben weisenden, hinteren Front der Fraktionsschicht F1 vergeht, genauso lang
ist wie die Zeit, die die Fraktion F2 für ihren genauso
definierten Eintritt in die Elutionskammer EK benötigt. Dies wird vorzugsweise durch eine lineare Erhöhung
der Wanderungsgeschwindigkeiten der Fraktionen mit der Zeit erreicht. Für die Durchführung
eines solchen Schrittes eignet sich.z.B. ein Regler RaL, der zwischen die Gleichspannungsquelle GL und
die Elektroden E geschaltet ist und der die Spannung der Elektroden E kontinuierlich ändert, insbesondere
erhöht.
Ein ähnliches Verfahren kann angewandt werden, wenn die Fraktionen auf Grund ihres Magnetismus
in einem Magnetfeld aufgetrennt werden. In diesem Fall kann z. B. der elektrische Strom, mit dem das
Magnetfeld erzeugt wird, so geregelt werden, daß durch die Änderung der Wanderungsgeschwindigkeiten
der einzelnen Fraktionen dieselben Zeitbedingungen erfüllt, werden wie im Falle der oben beschriebenen
Änderung der Wanderungsgeschwindigkeit auf
Grund eines elektrischen Feldes. '
Eine weitere Möglichkeit, um die Eluierungsgeschwindigkeit an die Wanderungsgeschwindigkeit der
Fraktionen anzupassen, besteht darin, daß vorzugsweise bei konstanter elektrischer Spannung an den
Elektroden E und bei konstanter Flußmenge an Eluierungslösung EP durch die Elutionskammer EK
die Temperatur der Eluierungslösung EP verändert wird. Diese Temperaturänderung sollte in der Richtung
ausgeführt werden, daß sich eine größere Aufnahmefähigkeit
der Eluierung EP für die Fraktionen bzw. eine größere Löslichkeit der Fraktionen in der
Eluierungslösung EP ergibt, wodurch ein zunehmend schnelleres Eintreten der Fraktionen in die Elutionskammer
EK stattfindet. Dieselbe Wirkung kann durch eine Temperaturänderung der Pufferlösung in den
Elektrodengefäßen OEG und UEG erreicht werden.
Eine Anpassung der Eluierungsgeschwindigkeit an
die Wanderungsgescliwindigkeit der Fraktionen durch
eine Temperaturänderung der Eluierungslösung EP
oder der Pufferlösung braucht jedoch nicht bei konstant gehaltener elektrischer Spannung oder konstant
gehaltenem Magnetfeld bzw. konsumier Flußmenge an Eluitioiislösung zu erfolgen, sondern es kann eine
solche Anpassung auch durch gleichzeitige kontinuier-
liehe oder stufenweise Änderung aller oben beschriebenen
Größen oder einiger dieser Größen erfoljien.
Eine kontinuierliche oder stufenweise -Änderung der Temperatur der FJuicningslösung /:V oder dv.r
Pufferlösung kann z.B. durch einen Wärmeaustauscher Wx, der in die Leitung zwischen der Pumpe P1
und der Elutionskammer EK eingebaut ist, oder Wärmeaustauscher W2 und/oder W3 erfolgen, die im
unteren und/oder im oberen Elektrodengefäß UEK, OEK innerhalb der Pufferlösung angebracht sind.
Diese Wärmeaustauscher Wx, W2, Wa können durch
Regelvorrichtungen RWx bzw. RW2 derart nach einem
vorgegebenen Programm gesteuert werden, daß jede Fraktion von einer gleichgroßen Menge an Eluierungslösung
EP aufgenommen wird.
Eine Anpassung kann gleichfalls auch dadurch vorgenommen werden, daß die Eluierungslösung EP
aus zwei oder mehreren Komponenten besteht, von denen mindestens eine Komponente für die einzelnen
Fraktionen ein größeres bzw. weitaus größeres Aufnahmevermögen als die anderen Komponenten besitzt,
und daß das Verhältnis der Anteile der aufnahmefähigeren Komponente zu der für die Fraktionen
schlechter aufnahmefähigen Komponente in der Eluierungslösung EP kontinuierlich oder stufenweise
geändert wird. Ein solches Verfahren ist insbesondere dann gut geeignet, wenn der gesamte oder der überwiegende
Teil der Fraktionen von der besser aufnehmenden Komponente aufgenommen wird und diese
Komponente von der oder den anderen Komponenten der Eluierungslösung EP leicht abtrennbar ist.
Das Mischungsverhältnis der Anteile der beiden verschieden wirkenden Komponenten wird zweckmäßigerweise
linear geändert, wobei insbesondere bei konstanter Temperatur der Eluierungslösung EP und
konstantem elektrischem Feld und/oder Magnetfeld der Anteil der aufnahmefähigeren Komponente verringert
wird. Auch dieses Verfahren kann jedoch in Verbindung mit einem oder mehreren der vorherbeschriebenen
Verfahren angewandt werden.
Um eine möglichst optimale Anpassung im Bereich der zur Verfügung stehenden, nutzbaren Änderungsmöglichkeit
einer Größe, wie etwa der Eluierungslösungsmenge pro Zeiteinheit, der elektrischen
Spannung, des Magnetfeldes, der Temperatur oder des Mischungsverhältnisses der Eluierungslösung EP,
zu erhalten, wird zweckmäßigerweise zuerst ein Leerversuch mit einem Teil des Substanzgemisches durchgeführt,
durch den die Zeit festgestellt wird, in der auch die letzte Fraktion des Substanzgemisches in die
Elutionskammer EK gelangt ist. Auf Grund dieser festgestellten Zeit wird sodann je nach dem verwandten
Verfahren zur Anpassung die betreffende Regeleinrichtung zur Steuerung der zu ändernden Größe
so programmiert bzw. eingestellt, daß innerhalb dieser gemessenen Zeit die maximal nutzbare.Änderung der
betreffenden Größe durchlaufen wird. Vorzugsweise erfolgt, falls die zu ändernde Größe die Flußmenge
der Eluierungslösung EP pro Zeiteinheit ist, eine solche Einstellung der Elutionssteuerung ES, daß
diese Größe im Verhältnis 30 :1 während dieser Zeit verringert wird.
Ein Leerversuch zur Feststellung der Durchflußzeit des Substanzgemisches durch die Trennsäule TS ist
jedoch keineswegs notwendig. Vielmehr können die betreffenden Regeleinrichtungen zur Steuerung der
zu ändernden Größe auch von vornherein so eingestellt werden, daß die maximale, nutzvolle Änderung
der betreffenden Größe nach einer Zeit erreicht wird, die größer ist als die Zeit, die für den Durchlauf des
Substanzgemisches durch die Trennsäule TS schätzungsweise angenommen wird.
Durch das vorliegende Verfahren können gleichzeitig auch die relativen Anteile der einzelnen Fraktionen
am ursprünglichen Substanzgemisch direkt bestimmt werden. Dies wird dadurch erreicht, daß die
betreffenden Regeleinrichtungen, wie z. B. die Elutionssteuerung ES oder die Regeleinrichtungen RWi
bzw. RW2 oder R0L, zur Steuerung der zu ändernden
Größe direkt mit einer Steuerungseinrichtung SRG für das Registriergerät. RG verbunden ist, durch das
ίο die Vorschubgeschwindigkeit des Aufzeichnungsmediums des Registriergerätes RG proportional zu
der Änderungsgeschwindigkeit der zu steuernden Größe verändert wird.
In F i g. 2 ist z. B. die Elutionssteuerung ES durch eine elektrische Verbindungsleitung F1, die Regel-.
einrichtungen RWx bzw. Rw„ für den Wärmeaustauscher
W1 bzw. W2 oder W7, durch eine elektrische
Verbindungsleitung V2 bzw. V3 und die Regeleinrichtungen
RGL für die Gleichspannung der Elektroden E
durch eine elektrische Verbindungsleitung V4 mit der
Steuerungseinrichtung SRG des Registriergerätes verbunden.
Der relative Anteil der jeweiligen Fraktion am Substanzgemisch wird unter diesen Bedingungen sogleich
durch Integration der unter dem jeweiligen Peak der Kurve C, der durch Photometrierung des
Eluats einer bestimmten Fraktion hervorgebracht wird, liegenden Fläche erhalten.
Gleichzeitig neben dieser quantitativen Feststellung des relativen Anteils jeder Fraktion am ursprünglichen
Substanzgemisch kann jedoch auch das Eluat jeder Fraktion völlig getrennt von denjenigen der
nächstfolgenden Fraktionen ohne Hilfe durch eine Bedienungsperson aufgefangen werden. Dies wird
dadurch ermöglicht, daß der Fraktionsteiler FT (F i g. 2) vom Registrierphotometer DSP aus so gesteuert
wird, daß bei Erreichung eines Schwellenwertes der durch das Registriergerät RG aufgezeichneten
Kurve oder z. B. der durch die Photozelle PZ abgegebenen Signale, der den Beginn einer neuen Fraktion
anzeigt, mit der Füllung eines neuen Gefäßes des Fraktionsteilers FT begonnen wird. Durch diesen
Impuls, der bei der Überschreitung des Schwellenwertes abgegeben wird, wird durch die Steuerungsvorrichtung
SFT des Fraktionsteilers FT eine solche Relativbewegung zwischen dem Fraktionsteiler FT
und dem Ende einer aus dem Durchflußphotospektrometer DSP austretenden Zuflußleitung Z hervorgebracht,
daß das Eluat einer neuen Fraktion in ein neues Auffanggefäß einläuft.
Die Leistungsfähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens soll noch an Hand eines Beispieles näher
erläutert werden.
In einer Vorrichtung entsprechend der in Fig. 2,
bei der die Anpassung der Eluierungsgeschwindigkeit an die Wanderungsgeschwindigkeit der einzelnen
Fraktionen jedoch allein durch eine stetige lineare zeitliche Änderung der Eluierungslösungsflußmcnge
durch die Elutionskammer EK vorgenommen wurde, wurde eine Isolierung einzelner Enzym- und Proteinfraktionen
aus der Rohkollagenase durchgeführt.
Hierbei bestand die Probe aus 95 mg RohkoIIagcnase. Als Elektrodenpuffer wurden 3 g Tris -I- 14,4 g
Glycin, gepuffert mit 1 Mol NaOH bis pH 9,0 und mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt, vcr-
109 619/230
wandt. Der Gelpuffer bestand aus 40 g Tris in etwa 500 ml destilliertem Wasser gelöst, das mit 1 Mol
HCl auf pH 8,0 gebracht und mit destilliertem Wasser auf 1000 ml aufgefüllt worden war. Als Trägergel
wurde 7,5% Polyacrylamid im Gelpuffer verwandt.
Die Probe wurde in 1 ml Gelpuffer unter Zusatz von Glukose gelöst und auf das Trägergel aufgetragen.
Die Elektrophorese erfolgte bei 200 V und 60 mA bei einer Temperatur von 15° C über 52 Stunden.
Während dieser Zeit wurde die Elutionslösungsflußmenge pro Zeiteinheit im Verhältnis von 30:1
verringert.
In F i g. 3 ist mit P die im Registriergerät RG erhaltene
Kurve bezeichnet, die die Verteilung der Proteine angibt. Die Aktivitäten der Enzyme wurden
in einzelnen Fraktionen getrennt bestimmt. Kurve PA—Proteinase, Kurve AIE—Amidase/Esterase,
Kurve Kx — Kollagenase 1 (Clostridiopeptidase
A,EC 3.4.4.19), Kurve K2-Kollagenase 2, Pi-Pigmente.
Aus diesem Beispiel geht nochmals eindeutig hervor, daß durch die vorliegende Erfindung ein einfaches
und einwandfrei arbeitendes Verfahren und Elutionssystem angegeben wird. Gleichzeitig wird jedoch
zusätzlich der wesentliche Vorteil erhalten, daß die Konzentrationsverhältnisse der aufgetrennten
Fraktionen im Eluat denjenigen im Gel selbst entsprechen. Hierdurch können Elutionskurven erhalten
werden, die die Gestalt von Extinktionskurven besitzen, wie sie bei der direkten Photometrierung der
Verteilung im Gel gewonnen werden. Gleichzeitig kann jedoch gemäß der vorliegenden Erfindung auch
eine analytische Auswertung der isolierten Fraktionen durchgeführt werden.
35
Claims (15)
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung und präparativen Gewinnung von Fraktionen
eines Substanzgemisches, die in einem von Pufferlösung durchsetzten Trägermaterial wandern und
die beim Austreten aus dem Trägermaterial mittels einer Eluierungslösung eluiert werden, dadurch
gekennzeichnet, daß die Eluierungsgeschwindigkeit
der Eluierungslösung (EP) zur Erhaltung einer dem wahren Anteil der Fraktion
im Gemisch proportionalen Konzentration an die Wanderungsgeschwindigkeit der Fraktion
angepaßt und der Anteil der Fraktion am Gemisch anschließend in bekannter Weise bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anpassung der Eluierungsgeschwindigkeit
durch Veränderung der Strömungsgeschwindigkeit der Eluierungslösung (EP)
vorgenommen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anpassung der Eluierungsgeschwindigkeit
durch Veränderung einer an dem Trägermaterial angelegten elektrischen Spannung
vorgenommen wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Anpassung der Eluicrungsgcschwindigkeit
durch Veränderung eines magnetischen Feldes vorgenommen wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Anpassung der
Eluierungsgeschwindigkeit durch Veränderung der Temperatur der Eluierungslösung (EP) vorgenommen
wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Anpassung der
Eluierungsgeschwindigkeit durch Veränderung der Temperatur der Pufferlösung in einer Trennkammer
(EK) vorgenommen wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Anpassung der
Eluierungsgeschwindigkeit durch Veränderung des Mischungsverhältnisses der Eluierungslösung
(EP) durch allmähliche Verminderung des einen Anteils der Eluierungslösungsmischung, der für
eine rasche Eluierung geeignet ist, im Laufe des Eluieningsvorganges vorgenommen wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Eluierungslösung
nach dem Eluierungsvorgang durch ein Durchlaufregistrierphotometer (DSP) geleitet und dabei
die Vorschubgeschwindigkeit des Registriermaterials eines Registriergerätes (RG) in Abhängigkeit
von der Wanderungsgeschwindigkeit der jeweils zu messenden Fraktion verändert wird. '
9. Vorrichtung zum Durchführen des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 8 mit einer mit
Trägermaterial und Pufferlösung gefüllten Trennkammer, mit einer an einem Ende dieser Trennkammer
vorgesehenen Aufgabeeinrichtung für das Substanzgemisch und mit einer am anderen
Ende dieser Trennkammer anschließenden EIutionskammer,
einer Registriereinrichtung und einem Fraktionsteiler, gekennzeichnet durch eine
Einrichtung zur Beeinflussung der Eluierungsgeschwindigkeit in Abhängigkeit von der vorbestimmten
Wanderungsgeschwindigkeit der Fraktionen des Substanzgemisches.
10. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur Beeinflussung
der Eluierungsgeschwindigkeit aus einer Pumpe (P,) besteht, deren Drehzahl und damit
deren Förderungsgeschwindigkeit für die Eluierungslösung (EP) im Laufe des Eluieningsvorganges
kontinuierlich und stetig veränderbar ist.
11. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur Beeinflussung
der Eluierungsgeschwindigkeit aus einem Drosselventil besteht, das in der Zuleitung der
Eluierungslösung (EP) angeordnet ist und in Abhängigkeit von der Wanderungsgeschwindigkeit
der Fraktionen kontinuierlich und stetig veränderbar ist.
12. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
daß die Einrichtung zur Beeinflussung der Eluierungsgeschwindigkeit aus einem
die Temperatur der Eluierungslösung (EP) während des Eluieningsvorganges fortlaufend verändernden
Wärmeaustauscher (W1) besteht.
13. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zur Beeinflussung
der Eluierungsgeschwindigkeit aus zwei weiteren die Temperatur der Pufferlösung in der
Trennkammer (TK) während des Eluierungsvorganges fortlaufend verändernden Wärmeaustauschern
(W2, W3) besteht.
14. Vorrichtung nach Anspruch 9 mit an einer Gleichspannung liegenden Elektroden zu beiden
Seiten der Trennkammer, dadurch gekennzeich-
net, daß die Einrichtung zur Beeinflussung der Eluierungsgeschwindigkeit aus einem Spannungsregler
(RGL), durch den die Höhe der angelegten Spannung fortlaufend während des Eluierungsvorganges
veränderbar ist, besteht.
15. Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch ge-
kennzeichnet, daß die Registriereinrichtung aus einem Durchflußphotospektrometer (DSP) besteht,
dessen Registriergerät (RG) einen in Abhängigkeit von der Wanderungsgeschwindigkeit
der jeweils zu messenden Fraktion veränderbaren Vorschub des Registriermaterials aufweist.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
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