DE1517927A1

DE1517927A1 - Vorrichtung zur Dichtegradienten-Elektrophorse

Info

Publication number: DE1517927A1
Application number: DE19661517927
Authority: DE
Inventors: Allington Robert W
Original assignee: Instrumentation Specialties Co
Current assignee: Instrumentation Specialties Co
Priority date: 1966-05-25
Filing date: 1966-10-19
Publication date: 1970-05-21
Also published as: US3453200A; GB1169183A; FR1495824A; DE1517927B2; USRE27552E

Description

(UJ. 5S8.905 - prio 25·5. Znitiniaantatlon SpaolaUia« I966 · Cast 20 - 4456;

Company, Σηο. Matapaatca / V«8t»A«

17, OKt. 1966

Yorriehtung iur DicnteeradUntaa· Blaktroptera··

Erfindung betrifft varbaeearta Vorrichtungen tür Dicht·- &>adiantan*8ialrtrephopa«a* wtloh· tin· Abtt»«nnunf und Ιβο- !!•rung von jtloat^n B««t««lt«iX*n ko»pl«x«r NiCQhungtn «·-

dtr Wandtrunc von

T«ilch«n unt^r <3tr lintirlmiit «in·· «l«lctri«Qh«ik Feld·· kann im» Auf trennung von Stofftaaiaehan aufgrund dar •Qhiadanan Bawafllonkalt dap fallehan banutst wapdan· aHgaawinan apfolgt &t% Auftrannune an alnar in alnaa iaitan*

MadiuM «uapandtaptan fXtbitif·« Prob·. BaIa Anlagen alna· '

9aldaa an da« Trleemedtun wandern dta Tail« da« iu trannandan Matarial« in aina voa Vorsaionan ihrer eta«ktrt*chtn NettoXaciung abnMngiean Biantung» wob·! öle W»n<t«run«agQ«ch»findigiceit dap NefctoUdung direkt propor« t,lon»l uni dan Retbungakritften u»«eketirt isroportional ist« Di© RelbuogelcrKfte» welQhe dta fallohan i» u*eebend*n

stationär zu halten suchen« hingen von der Pom und QrOBe der Teilchen ab.

Ee sind bereite verschiedene Methoden mur Durchführung elektrophoretlsoher Trennungen vorgeschlagen «orden. Bei der IcI a sei schon Methode alt wandernden Orensfläohen wird von einer gleichmäßigen Mleohung dee su trennenden Materials mit einen Trägermedlum, gewöhnlich Wasser alt eines Oehalt an Puffereal sen ausgegangen. Das Medium wird in ein senk* rechtes Rohr eingebracht und Mittels an Rohr angebrachter Elektroden ein elektrisches Feld angelegt. Zur Aufrechterhaltung des hydrostatischen Oleichgewichtes und sur Vermeidung des Durohtretene von en den Elektroden gebildeten Bläschen durch den su beobachtenden Dereich let das Rohr U-förmig gebogen. Ib Verlaufe der Trennung wandern die einzelnen Bestandteile der Probe alt verschiedenen, von ihrer elektrophoretischen Beweglichkeit abhängenden Geschwindigkeiten durch das Trägermedium abwärts. Dabei bildet sieh am oberen Ende Jeder sich abwärts bewegenden SXuIe von BIn- ί seltellohen einer bestimmten Art eine Orenzfläohe aus. Venn das das Trägermedium enthaltende Rohr aus durohsiohtlgsei Material besteht, kann aan die oberen Enden der verschiedenen abwärts wandernden Säulen nach den Brechungsindexgradlenten-Verfahren bestimmen. Dieses Verfahren hat Jedoch unter anderem zwei schwerwiegende Nachteile. Einerseits 1st der Konzentrationsbereich der einseinen Tellohenarten· begrenzt» da zur Aufrechterhaltung einer stabilen ttrens-

0G3821/1S47

BAD ORlw-.VÄL

fläche die unter dieser liegende Flüssigkeit eine höhere Dichte besitzen muß, alu die Flüssigkeit oberhalb der Grenz fläche. Die Konzentration nufi daher genügend hoch sein« sodaB die Oesautdlchte der Flüssigkeit unterhalb der Orenzfläohe merklich gröBer ist· als die TrKgerflüsslgkeit oberhalb der QrensflKohe. Dies stellt infolge der Agglomeration der Probeteilchen bei hohen Konsentrationen häufig eine Schwierigkeit dar. Andererseits verwischen eioh die Grenzflächen leloht infolge der Diffusion der Teilohen. Sohlle811oh 1st es auoh sohwlerlg, die Vorrichtung so anzuordnen, daJ man die Wanderung von sowohl aufwärts als auch abwärts wandernden Orenzfläohen untersuchen kann.

Eine weitere bekannte Methode wird in allgemeinen als OeI-tsaulen-Elektrophorese bezeichnet. Bei dieser Anordnung wird die Probe am oberen oder unteren Ende oder in der Mitte einer leitfähigen Säule aue einem halbfesten Gel aufgegeben, Am oberen und unteren Ende des Oelee wird ein elektrisches PeId angelegt und die Teilchen wandern in einer Richtung und mit einer Geschwindigkeit, die von ihrer elektrophoretleohen Beweglichkeit abhängt. Bei dieser Methode wird das zu trennen- { de Material als schmales Band in das Gel eingebracht und nicht gleichmäßig durch das OeI verteilt. Diese Methode liefert daher Banden oder Zonen der Je nach dem Vorzeichen ihrer elektrophoretiechen Beweglichkeit aufwärts oder abwärts wandernden Stoffe. Diese Arbeitsweise hat den Vorteil, daß die Beeinträchtigung der Auflösung infolge von Diffusionseffekten

009821/1 547

BAD 0Rl3'.NW-

iai weaeotXlQhea ausgeschaltet wird. Bei Aufgabe der Probe in der HItte u«r a^lsMüIs lüt ferner sine gleichzeitige Trennung ve-· feterialien mit positiven und negativen Beweglioftk* - s«a -scSglieh. A«aerex*selt8 eig net sich diese Arbeitsweise nicht für eine überwachung der Abtrennung während des 1εufenden Verfangene. Die Lage der verschiedenem T«ili!häii£t.i^n kann naoft der Trennung durch geeignete Methoden, beispielsweise die Lichtabsorption bestimmt werden, Jedoch lassen eich solche Messungen kaum während der laufenden elektrophoretischen Trennung durchführen. Ein " weiterer Nachteil besteht darin, daß die Wanderungsgeschwindigkeit auch von Absorptions- und Desorptionseffekten zwischen den zu trennenden Teilohen und dem Trägergel abhängt. Die Wanderungsgeschwindigkeiten der Teilohen sind somit nicht notwendigerweise ihrer elektrophoretischen Beweglichkeit proportional. Dies stellt bei der Messung elelctiophoretischer Beweglichkeiten einen erheblichen Naohtell dar.

Ein weiteres bekanntes Verfahren ist die sogenannte Diohtegradlenten-Elektrophorese. Diese Arbeitsweise hat «war gewisse Ähnlichkeit mit der Qelsäulenoethode, Jedoch wird dabei anstelle einer Oelsäule eine Dichtegradienteneäule als Trägerraediuro verwendet. Die Vorteile dieses Verfahrene beruhen insbesondere auf der Tatsache, daß die Wanderungegeschwindigkeit der Banden oder Zonen der Teilchen aue deren elektrophoretischer Beweglichkeit berechnet werden kann.

009821/1547

BAD CP.iC-.H^

Die bekannten Vorrichtungen zur Dichtegradienten-Elektrophorese gestatten jedoch nur nach beendeter Trennung und Eivfci'e-pnung der Dichtegradientensäule aus der Apparatur eine Bestürmung der endgültigen Lage der Zonen und nicht eine überwachung der Lage der Zonen während der Durchführung der Trennung.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine verbesserte Vorrichtung zur Dichtegradienten-Elektrophorese vorzuschlagen« welche die vorstehend erwähnten Naohteile vermeidet, eine überwachung der erzielten Trennung während des Verfahrens ^-stattet und darüber hinaus sowohl eine bequeme Einführung der Dichtegradientensäule und der Probe in die Apparatur „ als auch ein getrenntes Abziehen der Fraktionen nach der Durchführung des elektrophoretisehen Verfahrens ermöglicht.

Dementsprechend v/ird erfindungsgemäfi eine Vorrichtung zur Dichtegradienten-Elektrophorese mit einem Rohr aus elektrisch isolierenden Material zur Aufnahme einer Dichtegradi- % en+enf3Ussigkelt und Vorrichtungen zur Erzeugung eines elektrischen Peldee zwischen mit axialem Abstand voneinander im Rohr gelegenen Punkten vorgeschlagen, welche gekennzeichnet ist, durch am Rohr zwischen dessen Enden angeordnete, auf die Konzentration der im Rohr enthaltenen Flüssigkeit ansprechende Vorrichtungen und Vorrichtungen zur reversiblen Verschiebung der Dichtegradientenflüssig-

009821/1547

keit relativ zu einem bestirnten Rohrabschnitt mittels einer Verdrängungsflüssigkeit.

Die erfindungsgeoiHfie Vorrichtung besitzt nach einer bevorzugten AuafUhrungsform ein senkrechtes Rohr, welches In seinem unteren Teil alt einer diohten Tr agar flüssigkeit, in den darüber liegenden Absohnitt mit einer die Testsub-8tanz enthaltenden Diohtegradientensäule und in seines oberen Abschnitt mit einer Flüssigkeit niederer Diohte beschickt ist. Am oberen und unteren Abschnitt des Rohres sind in elektrolytische Lösungen eintauchende Elektroden angeordnet. Diese elektrolytischen Lösungen sind von der Flüssigkeit la senkrechten Rohr durch semipermeable Membranen getrennt, die einen Ionenstrom zulassen. Zwisohen der unteren Elektrode und der Flüssigkeitssäule im Rohr sind zweckmäßig zwei elektrolytische Lösungen mit unterschied" sicher Dichte angeordnet, um einen Eintritt des Elektrolyten in die Flüssigkeitssäule durch Osmose zu verhindern. Die Konzentration der der Flüssigkeitssäule im Rohr benachbarten elektrolyt!sehen Lösung ist dabei so auf die Flüssigkeit im Rohr eingestellt, daß die osaotlschen Druoke gleich sind. An einer mittleren Stelle des Rohres sind Beobachtungsfenster angeordnet, durch welche die Lichtstrahlen t-ine? geeignaten Lichtquelle durch die Flüssigkeitssäule hindurch auf einen Lichturawandier fallen. Zur Fraktionierung einer Testsubstanz in ihre Bestandteile werden die Elektroder. an eine Gleichstromquelle angeschlossen, sodaß durch die

009821 / 1 5 A 7

BAD

Flüssigkeitssäule «In Strom flieSt. Hierdurch wird eine Wanderung der Te Hohen der Teetaubst anz erseugt, wobei die Wanderungsgeachwindigkeit der elektrophoretisehen Beweglichkeit der Teilchen entspricht. Während der Wanderung sammeln sich die Teilchen mit ähnlioher elektrophoretieeher Beweglichkeit in Zonen. Srfindungagemäß werden nun Vorrichtungen vorgesehen. Bit welchen das Auemaß der Fraktionierung der Testsubstanz in Zonen beobachtet werden kann. Hierzu dienen Vorrichtungen zur reversiblen Verschiebung der DlchtegradientenflUsslgkeit relativ zu den Beobachtungsfenstern. Vorzugsweise wird die Flüssigkeitssäule durch * Pumpvorrichtungen zur Zu- oder Abfuhr von dichter Trägerfllissigkelt zu jedem gewünschten Zeitpunkt während des elekvnphoretlochen Verfahrens durch den durch die Beobachtungsfenster geführten Lichtstrahl hindurchbewegt. Wenn die \ontrollvorrichtungen anzeigen, daB das gewünschte Frak-Monierungsausmaß erreicht ist, wird die DichtegradientenaHule vorteilhaft durch Zuführung weiterer dichter TrägerflUssigkelt In den unteren Teil des Rohres aus dem oberen Rohrende herausgedrückt und kann mittels eines herkömmlichen g Fraktionssammlers In Fraktionen getrennt aufgefangen werden. Im Folgenden werden einige bevorzugte Ausführungsforeen der Erfindung anhand der beigefügten Zeichnungen näher er-

Sutert. Es zeigen:
I'ig. 1 einen senkrechten, zentrischen Querschnitt durch eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungagemäflen Elektrophoresevorrichtung,

009821 /1547

BAD ORIGINAL

Pig. 2 einen vergrößerten Teilausschnitt des mittleren Teiles der in Pig. I dargestellten Vorrichtung,

Pig. 3 eine vereinfachte Darstellung gemäß Pig. I zur

Erläuterung der Lage der verschiedenen Flüssigkeitssäulen in einer Stufe des Elektrophoreseverfahrene»

PIg. 4 eine weitere vereinfachte Darstellung der Vorrichtung gemäß Pig. 1 zur Erläuterung der Lage der verschiedenen Flüssigkeitssäulen während einer anderen Stufe des Elektrophoreseverfahrens und

Pig. 5 eine schematische Darstellung der Oesamtanordnung w der erfindungsgemäßen Elektrophoresevorriohtung.

Die in Pig. 1 dargestellte Vorrichtung enthält ein senkrechtes Rohr 10 aus einem Material mit guter Wärmeleitfähigkeit beispielsweise A lumlnium. Die Innenwand des Rohres 10 1st durch zwei zueinander axial ausgerichtete Rohre. 11 und 11' r.us ei nein geeigneten, im wesentlichen nicht benetzbaren, keinen Wasserfilm absorbierenden und elektrisch nichtleitenden Kunststoff, beispielsweise Polypropylen, ausgekleidet. Die elektrophoretisch^ Trennung der Testsubstanz erfolgt in den Rohren 11 und 11*, wie welter unten In einzelnen beschrieben wird. Das äußere Metallrohr 10 1st duroh eine Bittlore öffnung eines Metallblockes 12 geführt. Zur Abdichtung sind Dichtungsringe 15 vorgesehen. Der Block 12 besteht ebenfalls aus einem Material mit guter Wärmeleitfähigkeit, beispielsweise Aluminium, und besitzt in seinen gegenüberliegenden Wandungen zueinander ausgerichtete Öffnungen 15 und 15*.

009821 / 1547

Die Öffnung 15 führt zu einer Bohrung größeren Durohmessers zur Aufnahme einer Lichtquelle, vorzugsweise eines Teiles einer Lampe 16« die zweoknäBig an elastischen Polstern 17 anliegen kann, um eine gleichbleibende Orientierung der Lichtquelle relativ zum optischen System aufrechtzuerhalten. Zur Abdeokung der Lampe 16 1st zweckmäßig am Metallblook ein QehKuse 18 mit geeigneten Mitteln befestigt, welches vorteilhaft Offnungen zur Wärmeabfuhr aufweist.

Wie insbesondere aus Pig. 2 zu ersehen ist, sind an gegenüberliegenden Stellen der Wandung des Metallrohres 10 öffnungen 20 und 20* vorgesehen, welche mit den öffnungen 15 und 15° im Block 12 verbunden sind. Zwischen den einander zugewandten Enden der Rohre 11 und II¹ 1st ein ringförmiges Quarzfenster 21 eingesetzt. In die mit einem Innengewinde versehene öffnung 15' ist ein mit einem entsprechenden Außengewinde versehenes Metallgehäuse 22 mit einer auf die öffnung 20» ausgerichteten Bohrung 25, einem dahinter angeordneten Lichtfilter 23 und einer Photozelle 24 eingeschraubt. Das Licht der Lampe 16 kann daher durch die öffnung 20, das Quarzfenster 21, die öffnungen 20* und 25 und das Lichtfilter 2jJ auf die Photozelle 24 fallen.

Im oberen Teil der erfindungsgemäßen Elektrophoresevorriohtung ist ein Rohr aus durchsichtigem, nicht benetzbarem Kunststoff, beispielsweise Polycarbonat mit seinem unteren Ende durch eine zentrische öffnung in einem oberen

009821 / 1547

Halterungsteil 29 vorzugsweise aus durchsichtigem, nichtleitendem Kunststoff, beispielsweise Polymethjfaethaorylat geführt. Zur Dichtung sind Diohtringe 28 vorgesehen. Die Rohre 11 und 27 haben den gleichen Innendurchmesser und stoßen mit ihren Enden unmittelbar aufeinander. Im unteren Absohnitt des Rohres 27 sind vier in einem Wlnkelabstand von 90° angeordnete öffnungen 30 vorgesehen, deren Jede über entsprechende radiale Hohlräume 31 mit radialen öffnungen 32 in der Außenwand des Halterungstelles 29 in Verbindung steht. Am Halterungsteil 29 1st eine ringförmige zylindrische Wanne 34, vorzugsweise aus durchsichtigem, nichtleitendem Kunststoff befestigt, welche eine Puffersalzlösung 35 enthält, in die eine obere Elektrode 36 eintaucht. Durch Entlüftungsöffnungen 37 im Halterungsteil kann die Luft beim Einfüllen der Puffersalzlösung 35 aus den Hohlräumen 3I entweichen, sodaß diese vollständig mit der Puffersalzlösung gefüllt sind. Die öffnungen 30 im Rohr 27 sind durch eine rohrförmige, semipermeable Membran 38, beispielsweise aus Cellophan abgedeckt. Der Ionenstrom ) von der Elektrode 35 wird durch die Puffersalzlösung geleitet und tritt durch die Membran 38 hindurch in die im Rohr 27 enthaltene Flüssigkeit über. Die Membran 38 dient dazu, eine Flüssigkeitsströmung zwischen dem Rohr 27 und der Puffersalzlösung 35 zu verhindern. Das Rohr 27 nimmt die Dichtegradientensäule auf und bietet den notwendigen Raum für eine elektrisch leitende Abdeckflüssigkeit oberhalb der Dichtegradientensäule.

009821/1547

Das obere Ende des Halterungeteile« 29 hat einen geringeren Durchmesser und trägt ein Gewinde zur Aufnahme des alt eine« Gewinde versehenen Endes eines KUhlmantelrohrea 40 aus durchsichtige» Kunststoff. Auf das obere Ende des Rohres 27 1st ein Kappenteil 41 aufgeschraubt, weloher eine mittlere Bohrung für das obere Ende des Rohres 27 und eine Sohlauohtülle 42 aufweist. In die Mittelbohrung des Kappenteiles 41 1st ein RohransohlußstÜck 43 eingeschraubt. Ein ähnliches KUhI-nantelrohr 44 aus durchsichtigen Kunststoff ist alt seinen Enden auf den verjüngten Endabsohnltten des Blockes 12 und des Halterungsteiles 29 befestigt. Das Halterungsteil 29 f besitzt ferner eine Mehrzahl von in Längsrichtung durchlaufenden Rohren 45 zum Durchtritt der Kühlflüssigkeit.

Im unteren Teil der erfindungsgemäSen Elektrophoresevorrichtung ist in ähnlicher Weise ein dem Rohr 27 entsprechendes Kunststoffrohr 47 angeordnet, dessen mit einen AuBengewinde versehenes Unterteil in einer mit einem Gewinde versehenen mittleren öffnung in einen unteren Halterungsteil 30 festliegt, das zweoknäfiig aus dem gleichen Material besteht, wie das obere Halterungsteil 29* In der Wandung des Rohres 47 sind ebenfalls 4 öffnungen 51 vorgesehen, deren Jede normalerweise Über einen entsprechenden Hohlraum 52 mit einer radialen öffnung 53 in Verbindung steht. Die öffnungen 51 sind ebenfalls durch eine rohrförmige, senipermeable Membran 55 abgedeckt. Das Halterungsteil 50 trägt einen inneren ringförmigen zylindrischen Trog 56 mit einer Mehr-

009821 / 1 547

zahl von In dessen Außenwandung angeordneten öffnungen 57, deren jede durch eine semipermeable Membran 58 verschlossen ist» Der Trog 56 enthält eine Pufferealzlösung 59 und 1st an seiner Außenseite von einem streiten ringförmigen zylindrischen Trog 60 umgeben, welcher eine Puffersaltlösung 6l enthält, in die eine Elektrode 46 eintaucht. Die Hohlräume 52 im Halterungeteil 50 stehen miteinander in Verbindung und weisen eine Entlüftungsöffnung 62 auf, um eine vollständige Pill lung mit der Puff er salzlösung 59 sicherzustellen«

Die Zwischenschaltung eines Inneren Troges 56 1st deswegen

erforderlich, weil die hohe Konzentration der dichten Lösung im Rohr 47 auf der Höhe der öffnungen 51 sonst eine osmotlsche Strömung aus dem Trog 56 in das Rohr 47 verursaohen würde, wenn nicht die Konzentration des Gelösten auch In Trog 56 hoch ist. Da eine derart hohe Konzentration Jedoch leicht zu einer Verschmutzung der Elektroden führt, wird die dichte Puffersalzlösung im inneren Trog 56 durch eine Membran 58 von einer Pufferlalzlösung 61 geringerer Dichte ) getrennt. Im Vergleich zu einer osmotisohen Strömung duroh die Membran 38 am oberen Rohr 27 1st eine oseotisohe Strömung duroh die Membran 55 am unteren Rohr 47 störend, da öle die Lage der Dichtegradientensäule innerhalb der Rohre M und 11^! verändert. Demgegenüber wird durch eine osmotlsehe Strömung durch die obere Membran 38 nicht die Stellung der Dichtegradientensäule,sondern lediglich die Höhe der auf der Dichtegradientensäule aufsitzenden Flüssigkeit

0Q9821 /1 547

geringerer Dichte beeinflusst. Zur Slcheratellung der photometrischen Ausmessung der Lage der getrennten Banden mitteIe des von der Lampe 16 duroh das Quarzfenster 21 und daa Lichtfilter 2} auf die Photocell· 24 fallenden Lichtes darf die Stellung der Dichtegradientensäule nicht verändert werden. Zur Verhinderung einer umgekehrten osaotisehen Strömung duroh die untere Membran 55 infolge des Druolres der Flüssigkeitssäule kann man die Konzentration des Gelüsten im inneren Trog 56 niedriger halten als in der Flüssigkeit in Rohr 47· Dies erzeugt ein osmotlsohes Druckgefälle an der Membran 55* j welche den Druck der Flüssigkeitssäule im Rohr 47 ausgleicht.

Zwischen dem unteren Halterungeteil 50 und dem Metallblook 12 ist ebenfalle ein KUhlmantelrohr 64 angeordnet· Der Mantolraum steht über innere Durchlässe im Halterungsteil 50 mit einer an diesem befestigten Sohlauchtülle 65 in Verbindung. Die Mantelrohre 40» 44 und 64 bestehen zweokmäBlg aus dem gleiohen Material. Während des Betriebes der erfindungsgemäßen Vorriohtung wird zweckmäßig eine Kühlflüssigkeit, insbesondere Biswasser duroh die KtIhImHnte 1 geleitet· Der f Metallblook 12 weist zu diesem Zweck ebenfalls in Lftngsrlch* tung verlaufende Durchlässe 66 auf. Das untere Ende des Rohres 47 endet in einem LeitungsanschluSteil 67·

Zur Beschickung der erfindungsgemäßen Vorriohtung kann das mittlere Rohr zunächst duroh das untere Anschlußteil 67 bis zur Höhe L mit einer Flüssigkeit hoher Dichte gefüllt werden.

009821 /1547

3AD cf.;g'.nal

Nach Aböehaser; das oberen ÄnaohluBtalles 43 kann die Diohtegradiantenflüsaigkeit auf die dichte Trägerfl'Jssigkeit aufpippetiert werden. Wenn die PlOesiglisitahöh* der DiohtegradienfcenflUsaigcelt etwa die lütt« des Rohres 27 erreloht, wird die Pipette entfernt und zunächst dine Testlösung oder Suspension 3 eingeführt, die hinreichende Mengen an Oelösteia enthält, aodafl ihre Dichte etwas geringer ist, als diejenige der unmittelbar darunterliegenden Diohtegradientens&ule. Die Pipette zur Einführung der Testlösung wird entfernt und auf die Probe eine weitere Dicht«gradientensäu-Ie aufgebracht, die in ihrem unteren Teil eine Diohte besitzt, die geringfügig kleiner ist, als die Diohte der Testlösung. Dia obere Grenzfläche diener Diohtegradientensäule entspricht dem Meniskus M*

Als nächstes wird durch das untere AnaohluBteil 67 eine hinreichende Menge der dichten Trägerflüssigkeit abgezogen, sodafl die Dlohtegradientenaäule und die Testlösung in die in Pig. 3 dargestellte Stellung gelangen. Pig. 3 entspricht der Pig 1, wobei jedoch die Schraffierung und gewisse sun Verständnis unwesentliche Teile fortgelassen wurden. An** schließend wird über die Diohtegradlentensäule eine Sohloht einer Pufferlösung mit geringerer Diohte aufpippetlert. Nachdem die Tröge 34, 56 und 60 ait elektrisch leitenden Puffersalzlösungen gefüllt wurden, wird durch Anlegen eines Potentials an die Elektroden 36 und $6 in der Diohtegradlentensttule ein elektrisches PeId erzeugt. Soweit siohl in der

009821/ 1547

BAD ORIGINAL

Umgebung der Elektroden Bläaohen bilden, werden diese durch die aemipermeablen Membranen 58, 55 und 58 an einer Beeintrachtigung der Dlchtegradientenaäule Im mittleren Rohr gehindert.

Nach einer zur tellweleen elelrtrophoretleohen Auftrennung der Testlösung hinreichenden Zelt wird da« Potential von den Elektroden abgeschaltet und die dlohte TrägerflUaslgkelt durch das Anaohlu8teil 67 langsam abgesogen. Auf diese Wels« wird die Diohtegradlentenaäule alt den teilweise getrennten Zonen der Testlusung abwärts durch den Lichtstrahl der aus f der Laape 16, dem Filter 2} und.der Photozelle 24 sowie eine« geeigneten Anzeigegerät bestehenden Vorrichtung zur Messung der Llohtabsorption hindurch bewegt. Die gesessenen Abeorptlonswerte können durch ein Aufzeichnungsgerät in Form eines Diagrammen aufgezeichnet werden, in welchem die Lichtabaorption und damit die Konzentration der fraktionierten Zonen gegen deren Lage in der Dichtegradientenaäule aufgetragen ist.

Die Stellung der Dlohtegradlentensäule nach dea ersten Durchgang durch das optlsohe Syatea 1st In Pig· 4 dargestellt. Bei Erreichen dieser Stellung wird die Puape zu« Abziehen der dichten Trägerflüssigkeit stillgesetzt und an die Dichtegrcdientenkolonne erneut das elektrische PeId angeschlossen. Nach einer hinreichenden Zeit weiterer Wanderung und Auftrennung wird das elektrische Feld wieder abgeschaltet und mlt-

009821 / 15 47

BAD

tele der Pumpe durch das Anschlußteil 67 weitere dlohte TrägerflUssigkeit in den unteren Teil dee mittleren Rohres eingedruckt. Hierdurch wird die weiter fraktionierte Dichte* gradientenkolonne erneut langsam an der photo«·trIschen Messanordnung vorbei aufwarte in die in Pig. 3 dargestellte Stellung versohoben. Während dieser Verschiebung zeichnet das Messgerät erneut die Lage der einzelnen Zonen In der Dichtegradientensäule auf« Diese Bestimmung der Lage der Zonen in der Dichtegradientensäule durch abwechselnde Auf- und Abwärtsbewegung derselben infolge der Zu- oder Abfuhr von diohter TrägerflUssigkeit kann beliebig oft wiederholt werden. Sobald das Aufzeichnungsgerät eine hinreichende Auftrennung anzeigt, kann mittels der Pumpe soviel weitere dichte TrägerflUssigkeit in das Mittelrohr eingeführt werden, daB die Dichtegradientensäule durch das obere AnschlußetUck 43 hinaus gedruckt und zweokmäBlg Über ein Verteilerrohr in die Auffanggefäße eines herkömmllohen Fraktionssammler geleitet wird.

Zur KUhlung der Flüssigkeit im mittleren Rohr kann durch den Mantel eine Kühlflüssigkeit, Insbesondere Elswasser geleitet werden. Dies 1st zweokmäBlg, da der durch die Flüssigkeitssäule fließende Strom eine Aufheizwirkung besitzt, welche ohne KUhlung zur Bildung von heißen Stellen führen würde, welche eine Konvektionsströ nung innerhalb des Rohres verursachen und dadurch die Reinheit der getrennten Zonen beeinträchtigen würde. Die durch die Schlaoh

009821 / 1 547

BAD OR)GiMAL

SchlauchtUlle 65 zügeführte Kühlflüssigkeit zirkuliert durch das untere Halterungeteil 50, weloheβ die Membran umgibt, durch die senkrechten Offnungen 66 in den die Photozelle und die Lichtquelle beherbergenden Metallblook 12 und die senkrechten Durchlässe 45 in Halterungsteil 29» welches die Membran 38 umgibt; und strömt dann durch die Schlauchtülle 42 ab. Die den äußeren Teil des Plttosigkeltsmantels bildenden Teile bestehen vorteilhaft aus durchsichtigem Kunststoff.

Pig. 5 zeigt eine schematisohe Darstellung der Gesamtanordnung der erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei welcher die aus dem oberen Anschlußteil 43 austretende Flüssigkeit mittels eines Verteilerrohres 71 in die Auffanggefäße eines herkömmlichen Fraktionssammlerβ 70 überführt wird. Eine durch einen Motor 73 mit umkehrbarer Drehrichtung angetriebene Kolbenvorrichtung 72 mit zugehöriger Leitspindel 74 fördert die dichte Trägerflüssigkeit über einen Dreiwegehahn 75 und Leitungen 76 und 77 zum unteren Ansohlußtell 67 der erfindungsgemHßen Vorrichtung. Die Photoselle | 24 ist über einen geeigneten Verstärker 79 mit einen Aufzeichnungsgerät 78 verbunden. Die in die zylindrischen Tröge 34 und 60 eintauchenden Elektroden sind an eine Gleichstromquelle 80 angeschlossen, die die erforderliche Spannung und Stromstärke zur Erzeugung eines elektrischen PeI-des in der Dichtegradientensäule liefert. In eine Leitung 34 zwischen dem Dreiweghahn 75 und einer herköonllohen

^009821/1547 _B,.D OKSMAL

Oradientenblldungevorrichtung 85 let eine duroh einen Motor 83 angetriebene Pumpe 82 eingebaut. Dieses System dient zur Einführung der DichtegradientenflUssigkeit in den Mittelteil des Rohres, anstatt diese in der welter oben beschriebenen Weise auf die diohte Trägerflüssigkeit aufzupippetieren.

Zur Inbetriebnahme der Vorrichtung wird zunächst der Dreiweghahn 75 so eingestellt, daß er die Leitungen 84 und 76 verbindet. Wenn mittels des Motors 83 die Hälfte des gewünschten Volumens an DichtegradientenflUasigkeit in die Leitung 76 eingeführt wurde, wird mittels eines Motors 86 und einer Nockenscheibe 87 die Testlösung aus einer Kolbenvorrichtung 88 in die Leitung 76 gedrückt. Die Nockenscheibe 87 ist vorzugsweise so geformt, daß die Verschiebungsgeschwindigkeit des Kolbens 88 in der Anfangsphase größer ist, al3 in der Endphftse.Dies trägt dazu bei, an der Grenzfläche unterhalb der Testlösungszone die Bildung eines umgekehrten Dichtegradienten zu verhindern. Stattdessen kann f die Bildung eines instabilen, umgekehrten Dichtegradienten an dieser Stelle auch durch Steigerung des durch die Vorrichtung 35 erzeugten Gradienten während der Einführung der Testsubetanz in die Leitung 76 gering gehalten werden. Die Leitung 77 wird durch einen von einem Motor 89 exzentrisch angetriebenen Arm 90 in Vibration versetzt und zu-9ammeη gedrückt, um eine gleichmäßige Vermischung der Testlösung und der Dichtegradientenflüssigkeit auf ihrem Wege

009821 /1 547

BAD ORIGINAL

tun mittleren Rohr der erflndungagemäSen Vorrichtung zu erKielen.

Nach KlnfGhrung einer hinreichenden Meng· an Testlösung in die Leitung 76 wird der Motor 86 abgeschaltet, wKhrend die Vorrichtung 9$ bis sur Vervollständigung der DichtegradientensXule weiterläuft. Dann wird der Dreiwegehahn 75 in die in Pig. 5 dargestellte Stellung gedreht und mittels der Kolbenvorrichtung 72 eine Flüssigkeit hoher Dichte zugeführt, bis die DlohtegradlentensKule die in Fig. 3 dargestellte Stel- ä lung erreicht hat. Die sur Erzeugung eines elektrischen Kontaktes alt der in oberen Trog ^4 enthaltenen Puffersalzlösung (über der Dlohtegradientensäule aufzubringende Flüssigkeit geringerer Dlohte kann durch die obere öffnung der Apparatur von Hand aufplppetiert oder durch eine geeignete Programmierung der Apparatur 85 zur Erzeugung des Diohtegradienten oder durch eine weitere in die Leitung 76 fördernde, motorbetriebene Kolbenvorriohtung zugeführt werden.

009821 / 1547

Claims

CU.Sf552,9O5.prio «5.5.1965 Case 20 «· 4A"^S ι Instrumentation Specialties <. ΤηΖi■ Coaany Ino ·, Linooln, Η·ηι... usa 17. Oktober 1966 Patentansprilohe

1. Vorrichtung sur Dlohtegradlenten-Blektrophorese alt einen Rohr aus elektrisoh isolierend·« Material sur

Aufnahme einer Diohtegradientenflüssigkelt und Vorrichtungen tür Erzeugung eines elektrischen Feldes mischen alt axialen Abstand voneinander la Rohr gelegenen Punkten, gekennzeichnet duroh aa Rohr «wisohen dessen Enden angeordnete, auf die Konsentration der la Rohr enthaltenen Flüssigkeit ansprechende Vorrichtungen und Vorrichtungen sur reversiblen Verschiebung der DichtegradlentenflUssigkeit relativ zu einen bestimmten Rohrabschnitt nlttels einer VerdrMngungnflOsslgkslt.

2. Vorrichtung n&oh Anspruoh 1, gekennselohntt duroh einen an Rohr (11,11*) angeordneten LichtdurohlaS (20,20*) und einen duroh diesen von einer Lichtquelle (16) bellohteten Lientumwandler (24).

3* Vorrichtung nach Anspruoh 1 und 2, gekennzeichnet duroh ein senkrecht stehendes Rohr (11, 11*.27» *7) und ua-

339821/1547

steuerbare Pimpvorrichtungen (72,73) zum Einfuhren oder Abziehen einer die DichtegradientensKule in Rohr ver sohlebenden VerdrHngungsflüssigkeit in das untere Rohrende (67)·

4. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet durch je ein mit den zugehörigen Bndabschnitt (27 bzw. 47) des Rohres Über durch eine semipermeable Membran (38, bzw. 33) verschlossene öffnungen (30 bzw·3X) verbundene« Elektrolytgefäß (34, bzw. 36) mit einer darin eintauchenden Elektrode (36, bzw. 46) und einer die Elektroden (2)6, 46) speisenden Gleichstromquelle (80).

5· Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeiohnet, daß die untere Elektrode (46) in ein ait de« Elektrolytgefäß (56) Über durch semipermeable Membranen (58) verschlossene öffnungen (57) verbundenes ElektrolytgefäU (60) eintaucht.

6. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 5* gekennzeichnet duroh einen Lichtdurchlaß (20, 20*) mit Quarzfenstern· insbesondere einem Quarzring (21) im Rohr (11, 11*)·

7. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet duroh einen mit dem oberen Ende (27) des Rohres Ober ein Abnahmerohr (71) verbundenen Fraktionssammler (70) zum Auffangen der durch die Verdrängungsflüssigkeit herausgedrückten Fraktionen.

009821/1 547

BAD OR!G!NAL

8. Vorrichtung naoh Anspruch 1 bis 7, gekennzeichnet durch einen Behälter (88) für eine die zu fraktionierende Substanz enthaltende Flüssigkeit» Vorrichtungen (85) zur Bildung einer DlohtegradientenflUsslgkelt, Vorrichtungen (82, $?, 86) zur Einführung kontrollierter Mengen an Diohtegradientenflüssigkelt und testsubstanzhaltlger Flüssigkeit in das untere Rohrende (*7) sowie Vorrichtungen (89, 90) zum Veraieohen der testsubstanzhaltigen Flüssigkeit und der DiohtegradientenflUssigkelt vor deren Einführung.

9« Vorrichtung naoh Anspruch 1 bis 8, gekennzeichnet durch Vorrichtungen (87) zur Steuerung der Zuführgeschwindigkeit der testsubstanzhaltigen Flüssigkeit auf eine ohne Inversion des Diohtegradlenten erzielbare Maxlnalnenge.

10. Vorrichtung naoh Anspruoh 1 bis 9» gekennzeichnet durch Vorrichtungen zur Erhöhung des Gradienten der DichtegradientenflUsslgkeit während der Zuführung der teetsubatanzhaltlgen Flüssigkeit.

11. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 10« gekennzeiohnet durch ein durch eine Öffnung eines Bio öle β β (12) geführtes senkrechtes Rohr (11, II¹) aus elektrisch isolierenden Material, einen durch den Block (12) und die Wandungen des Rohres (10) geführten Liohtdurchlaß (15, 13*» 20,20*) einen duroh diesen von einer an Block (12) befestigten

^009821/1547 ,Λ0 ORi(MNAL

43

Lichtquelle (l6) belichteten, an Block (12) angeordneten Llohtumwandler (24), ein zwlsohen diesen und den Rohr (10, 11, II¹) angeordnetes Lichtfilter (23), ein oberes Halterungeteil (29) aus elektrisch isolierenden Material nlt einer die aufeinander^stossenden Enden des »ittieren Rohres (10, 11, 11*) und eines oberen Rohres (27) aus elektrisch isolierend·· Material abnehmenden axialen öffnung,ein aa oberen Halterung» ^iI (29) befestigtes nlt des Inneren des oberen Rohres (27) Über ein oder nehrere Jeweils duroh eine senlpemetible Membran (58) verschlossene Offnungen (30) verbündet nee ™ ElektrolytgefKB (J4) nlt einer darin eintauchenden Elektrode (36), ein unteres Halterungsteil (50) ate elektrisch isolierenden Material nit einer die aufeinander^stossenden Enden des mittleren Rohres (10,11,11*) und eines unteren Rohres (47) aus elektrisch isolierendem Material aufnehmenden axialen Öffnung, ein an uiteren Halterungsteil (30) befestigtes, nlt dem Inneren des mittleren Rohres (47) über ein oder nehrere jeweils duroh eine semipermeable Membran (55) verschlossene M

Offnungen (51) verbundenes BlektrolytgeftB (56), ein mit diese* über ein oder nehrere Jeweils duroh eine semipermeable Membran (58) versohlossene Offnungen (57) verbundenes Elektrolytgefäfl (60) mit einer darin eintauchenden Elektrode (46), eine mit den Elektroden (36, 46) verbundene Gleichstromquelle (80) und Vorrichtungen zur Einführung einer vorbestimmten Menge an diohtem gelöstem Stoff in das mittlere Rohr (11,1I¹)

009821 /1547

BAD C>r.,Ci!NAL

I <J I I <J Λ. I

12. Vorrlohtung naob Anapruch 1 bis 11, gekennzeichnet durch einen flUeeigkeltedurohatr&aten Kühlmantel

. Vorrlohtung naoh Anspruch 1 bis 12« nekenmelohnet dluroh Vorrlohtungen aur Blnetellung der Konsentration an dichtem gelüstern Stoff auf einen Ausgleich des osaotlschen Druckes an der Membran (55)

BAD Q09821/15A7

4s

Leerseite