DE1517927C - Vorrichtung zur Dichtegradienten-Elektrophorse - Google Patents

Description

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Die Erfindung betrifft eine verbesserte Vorrichtung trisches Feld angelegt, und die Teilchen wandern in

zur Dichtegradienten-Elektrophorese, welche eine einer Richtung und mit einer Geschwindigkeit, die

Abtrennung und Isolierung von gelösten Bestand- von ihrer elektrophoretischen Beweglichkeit abhängt,

teilen komplexer Mischungen gestattet. Bei dieser Methode wird das zu trennende Material

Die Elektrophorese beruht auf der Wanderung von 5 als schmales Band in das Gel eingebracht und nicht geladenen Teilchen unter der Einwirkung eines elek- gleichmäßig durch das Gel verteilt. Diese Methode frischen Feldes und kann zur Auftrennung von liefert daher Banden oder Zonen der je nach dem Stoffgemischen auf Grund der verschiedenen Beweg- Vorzeichen ihrer elektrophoretischen Beweglichkeit lichkeit der Teilchen benutzt werden. Im allgemeinen aufwärts oder abwärts wandernden Stoffe. Diese erfolgt die Auftrennung an einer in einem leitenden io Arbeitsweise hat den Vorteil, daß die Beeinträch-Medium suspendierten oder gelösten flüssigen Probe. tigung der Auflösung infolge von Diffusionseffekten Beim Anlegen eines elektrischen Feldes an das im wesentlichen ausgeschaltet wird. Bei Aufgabe der Trägermedium wandern die Teilchen des zu trennen- Probe in der Mitte der Gelsäule ist ferner eine gleichden Materials in eine vom Vorzeichen ihrer elek- zeitige Trennung von Materialien mit positiven und trischen Ladung abhängigen Richtung, wobei die 15 negativen Beweglichkeiten möglich. Andererseits Wanderungsgeschwindigkeit der Ladung direkt eignet sich diese Arbeitsweise nicht für eine Überproportional und den Reibungskräften umgekehrt wachung der Abtrennung während des laufenden proportional ist. Die Reibungskräfte, welche die Teil- Verfahrens. Die Lage der verschiedenen Teilchenchen im umgebenden Medium stationär zu halten zonen kann nach der Trennung durch geeignete suchen, hängen von der Form und Größe der Teil- 20 Methoden, beispielsweise die Lichtabsorption bechen ab. stimmt werden; jedoch lassen sich solche Messungen

Es sind bereits verschiedene Methoden zur Durch- kaum während der laufenden elektrophoretischen

führung elektrophoretischer Trennungen bekannt- Trennung durchführen. Ein weiterer Nachteil besteht

geworden. Bei der klassischen Methode mit wandern- - darin, daß die Wanderungsgeschwindigkeit auch von

den Grenzflächen wird von einer gleichmäßigen 35 Absorptions- und Desorptionseffekten zwischen den

Mischung des zu trennenden Materials mit einem zu trennenden Teilchen und dem Trägergel abhängt.

Trägermedium, gewöhnlich Wasser mit einem Gehalt Die Wanderungsgeschwindigkeiten der Teilchen sind

an Puffersalzen ausgegangen. Das Medium wird in somit nicht notwendigerweise ihrer elektrophore-

ein senkrechtes Rohr eingebracht und mittels am tischen Beweglichkeit proportional. Dies stellt bei der

Rohr angebrachter Elektroden ein elektrisches Feld 30 Messung elektrophoretischer Beweglichkeiten einen

angelegt. Zur Aufrechterhaltung des hydrostatischen erheblichen Nachteil dar.

Gleichgewichtes und zur Vermeidung des Durch- Ein weiteres bekanntes Verfahren ist die sotretens von an den Elektroden gebildeten Bläschen genannte Dichtegradienten-Elektrophorese. Diese durch den zu beobachtenden Bereich ist das Rohr Arbeitsweise hat zwar gewisse Ähnlichkeit mit der U-förmig gebogen. Im Verlaufe der Trennung 35 Gelsäulenmethode, jedoch wird dabei an Stelle einer wandern die einzelnen Bestandteile der Probe mit ver- Gelsäule eine Dichtegradientensäule als Trägerschiedenen, von ihrer elektrophoretischen Beweglich- medium verwendet. Die Vorteile dieses Verfahrens keit abhängenden Geschwindigkeiten durch das beruhen insbesondere auf der Tatsache, daß die Trägermedium abwärts. Dabei bildet sich am oberen Wanderungsgeschwindigkeit der Banden oder Zonen Ende jeder sich abwärts bewegenden Säule von 40 der Teilchen aus deren elektrophoretischer Beweg-Einzelteilchen einer bestimmten Art eine Grenzfläche lichkeit berechnet werden kann,
aus. Wenn das das Trägermedium enthaltende Rohr Die bekannten Vorrichtungen zur Dichteaus durchsichtigem Material besteht, kann man das gradienten-Elektrophorese gestatten jedoch nur nach obere Ende der abwärts wandernden Säule nach beendeter Trennung und Entfernung der Dichtedem Brechungsindexgradienten-Verfahren bestim- 45 gradientensäule aus der Apparatur eine Bestimmung men. Dieses Verfahren hat jedoch unter anderem der endgültigen Lage der Zonen und nicht eine Überzwei schwerwiegende Nachteile. Einerseits ist der wachung der Lage der Zonen während der Durch-Konzentrationsbereich der einzelnen Teilchenarten führung der Trennung. y begrenzt, da zur Aufrechterhaltung einer stabilen Es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine verGrenzfläche die unter dieser liegende Flüssigkeit eine 50 besserte Vorrichtung zur Dichfegradienten-Elektrohöhere Dichte besitzen muß als die Flüssigkeit ober- phorese anzugeben, welche die vorstehend erwähnten halb der Grenzfläche. Die Konzentration muß daher Nachteile vermeidet und sowohl, eine bequeme Eingenügend hoch sein, so daß die Dichte der Flüssigkeit führung der Dichtegradientensäule und der Probe in unterhalb der Grenzfläche merklich größer ist als die die Apparatur als auch ein getrenntes Abziehen der Trägerflüssigkeit oberhalb der Grenzfläche. Dies stellt 55 Fraktionen nach der Durchführung des elektroinfolge der Agglomeration der Probeteilchen bei phoretischen Verfahrens ermöglicht,
hohen Konzentrationen häufig eine Schwierigkeit dar. Diese Aufgabe wird mit einer Vorrichtung zur Andererseits verwischen sich die Grenzflächen leicht Dichtegradienten-Elektrophorese mit einem vertikal infolge der Diffusion der Teilchen. Schließlich ist es angeordneten Rohr aus elektrisch isolierendem Maauch schwierig, die Vorrichtung so anzuordnen, daß 60 terial zur Aufnahme einer Dichtegradientenflüssigkeit man die Wanderung von sowohl aufwärts als auch und Vorrichtungen zur Erzeugung eines elektrischen abwärts wandernden Grenzflächen untersuchen kann. Feldes zwischen mit axialem Abstand voneinander im Eine weitere bekannte Methode wird im allge- Rohr gelegenen Punkten dadurch gelöst, daß die meinen als Gelsäulen-Elektrophorese bezeichnet. Bei Elektroden zur Erzeugung des elektrischen Feldes dieser Anordnung wird die Probe am oberen oder 65 jeweils in durch semipermeable Membranen vom unteren Ende oder in der Mitte einer leitfähigen Innenraum des Rohres getrennte Elektrolytgefäße Säule aus einem halbfesten Gel aufgegeben. Am eingetaucht sind und daß eine Vorrichtung zur reveroberen und unteren Ende des Geles wird ein elek- siblen Verschiebung der Dichtegradientenflüssigkeit

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mittels einer Verdrängungsflüssigkeit relativ zu einem Metallrohr 10 ist durch eine mittlere öffnung eines

bestimmten Rohrabschnitt vorgesehen ist. Metallblockes 12 geführt. Zur Abdichtung sind

Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird also Dichtungsringe 13 vorgesehen. Der Block 12 besteht das vertikal angeordnete Rohr mit einer Dichte- ebenfalls aus einem Material mit guter Wärmeleit-

gradientenflüssigkeit beschickt, und im unteren Teil 5 fähigkeit; beispielsweise Aluminium, und besitzt in

des Rohres wird an die Dichtegradientenflüssigkeit seinen gegenüberliegenden Wandungen zueinander

anschließend eine dichte Verdrängungsflüssigkeit ein- ausgerichtete Öffnungen 15 und 15'. Die Öffnung 15

gebracht. Die Elektroden tauchen in elektrolytische führt zu einer Bohrung größeren Durchmessers zur

Lösungen ein, die von dem Rohr durch semiper- Aufnahme einer Lichtquelle, vorzugsweise eines

meable Membranen getrennt sind, so daß durch diese io Teiles einer Lampe 16, die zweckmäßig an elastischen

ein Ionenstrom hindurchtreten kann. Zur Frak- . Polstern 17 anliegen kann, um eine gleichbleibende

tionierung einer Testsubstanz in ihre Bestandteile Orientierung der Lichtquelle relativ zum optischen

werden die Elektroden an eine Gleichstromquelle System aufrechtzuerhalten. Zur Abdeckung der

angeschlossen, so daß durch die Flüssigkeitssäule ein Lampe 16 ist zweckmäßig am Metallblock 17 ein

Ström fließt. Hierdurch wird eine Wanderung der 15 Gehäuse 18 mit geeigneten Mitteln befestigt, welches

Teilchen der Testsubstanz erzeugt, wobei die Wände- vorteilhaft Öffnungen zur Wärmeabfuhr aufweist,

rungsgeschwindigkeit der elektrophoretischen Beweg- Wie insbesondere aus F i g. 2 zu ersehen ist, sind

lichkeit der Teilchen entspricht. Während der Wan- an gegenüberliegenden Stellen der Wandung des Me-

derung sammeln sich die Teilchen mit ähnlicher tallrohreslO öffnungen 20 und 20' vorgesehen,

elektrophoretischer Beweglichkeit in Zonen. 20 welche mit den öffnungen 15 und 15' im Block 12

In einer Ausgestaltung der Erfindung ist am Rohr verbunden sind. Zwischen den einander zugewandten zwischen den den beiden Elektroden zugeordneten Enden der Rohre 11 und 11' ist ein ringförmiges Membranen eine auf die Konzentration der im Rohr Quarzfenster 21 eingesetzt. In die mit einem Innenenthaltenen Flüssigkeit ansprechende Vorrichtung gewinde versehene öffnung 15' ist ein mit einem angeordnet, so daß das Ausmaß der Fraktionierung 35 entsprechenden Außengewinde versehenes Metallgeder Testsubstanz in den Zonen beobachtet werden häuse 22 mit einer auf die öffnung 20' ausgerichteten kann. Bohrung 25, einem dahinter angeordneten Lichtfilter

Diese auf die Konzentration der Flüssigkeit an- 23 und einer Photozelle 24 eingeschraubt. Das Licht

sprechende Vorrichtung enthält vorzugsweise einen der Lampe 16 kann daher durch die Öffnung 20, das

Lichtwandler sowie eine Lichtquelle, deren Licht 30 Quarzfenster 21, die öffnungen 20' und 25 und das

durch im Rohr vorgesehene Lichtdurchlässe hindurch Lichtfilter 23 auf die Photozelle 24 fallen,

auf den Lichtwandler fällt. Damit ist eine photo- Im oberen Teil der erfindungsgemäßen Elektro-

metrische Ausmessung der fraktionierten Dichte- phoresevorrichtung ist ein Rohr (27) aus durch-

gradientenflüssigkeit möglich. sichtigem, von Wasser nicht benetzbarem Kunststoff,

Besonders exakte Meßergebnisse lassen sich mit 35 beispielsweise Polycarbonat, mit seinem unteren Ende

der erfindungsgemäßen Vorrichtung erzielen, wenn durch eine zentrische Öffnung in einem oberen

die Innenwand des Rohres aus einem nicht benetz- Halterungsteil 29 vorzugsweise aus durchsichtigem,

baren Material besteht. · nichtleitendem Kunststoff, beispielsweise Polymethyl-

Die Erfindung wird im folgenden an Hand der methacrylat geführt. Zur Dichtung sind Dichtringe

Ausführungsbeispiele zeigenden Figuren näher er- 40 28 vorgesehen. Die Rohre 11 und 27 haben den

läutert. Es zeigt gleichen Innendurchmesser und stoßen mit ihren

Fig. 1 einen senkrechten, zentrischen Querschnitt Enden* unmittelbar aufeinander. Im unteren Abdurch eine bevorzugte Ausführungsform der erfin- schnitt des Rohres 27 sind vier in einem Winkelabdungsgemäßen Elektrophoresevorrichtung, stand von 90° angeordnete öffnungen 30 vorgesehen,

F i g. 2 einen vergrößerten Teilausschnitt des mitt- 45 deren jede über entsprechende radiale Hohlräume 31

leren Teiles der in F i g. 1 dargestellten Vorrichtung, mit radialen öffnungen 32 in der Außenwand des

F i g. 3 eine vereinfachte Darstellung gemäß F i g. 1 Halterungsteiles 29 in Verbindung steht. Am Halte-

zur Erläuterung der Lage der verschiedenen Flüssig- rungsteil 29 ist eine ringförmige zylindrische Wanne

keitssäulen in einer Stufe des Elektrophoresever- 34, vorzugsweise aus durchsichtigem, nichtleitendem

fahrens, 50 Kunststoff befestigt, welche eine Puffersalzlösung 35

F i g. 4 eine weitere vereinfachte Darstellung der enthält, in die eine obere Elektrode 36 eintaucht.

Vorrichtung gemäß F i g. 1 zur Erläuterung der Lage Durch Entlüftungsöffnungen 37 im Halterungsteil 29

der verschiedenen Flüssigkeitssäulen während einer kann die Luft beim Einfüllen der Puffersalzlösung,

anderen Stufe des Elektrophoreseverfahrens und 35 aus den Hohlräumen 31 entweichen, so daß diese

F i g. 5 eine schematische Darstellung der Gesamt- 55 vollständig mit der Puffersälzlösung gefüllt sind. Die anordnung der erfindungsgemäßen Elektrophorese- öffnungen 30 im Rohr 27 sind durch eine rührvorrichtung, förmige, semipermeable Membran 38, beispielsweise

Die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung enthält ein aus Cellophan abgedeckt. Der Ionenstrom von der senkrechtes Rohr 10 aus einem Material mit guter Elektrode 35 wird durch die Puffersalzlösung geleitet Wärmeleitfähigkeit, beispielsweise Aluminium. Die 60 und tritt durch die Membran 38 hindurch in die im Innenwand des Rohres 10 ist durch zwei zueinander Rohr 27 enthaltene Flüssigkeit über. Die Membran 38 axial ausgerichtete Rohre 11 und 11' aus einem ge- dient dazu, eine Flüssigkeitsströmung zwischen dem eigneten, im wesentlichen nicht benetzbaren, keinen Rohr 27 und der Puffersalzlösung 35 zu verhindern. Wasserfilm absorbierenden und elektrisch nichtleiten- Das Rohr 27 nimmt die Dichtegradientensäule auf den Kunststoff, beispielsweise Polypropylen, ausge- 65 und bietet den notwendigen Raum für eine elektrisch kleidet. Die elektrophoretische Trennung der Test- leitende Abdeckflüssigkeit oberhalb der Dichtesubstanz erfolgt in den Rohren 11 und 11', wie weiter gradientensäule.
unten im einzelnen beschrieben wird. Das äußere Das obere Ende des Halterungsteiles 29 hat einen

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geringeren Durchmesser und trägt ein Gewinde zur Strömung durch die untere Membran 55 infolge des

Aufnahme des mit einem Gewinde versehenen Endes Druckes der Flüssigkeitssäule kann man die Konzen-

eines Kühlmantelrohres 40 aus durchsichtigem Kunst- tration des Gelösten im inneren Trog 56 niedriger

stoff. Auf das obere Ende des Rohres 27 ist ein halten als in der Flüssigkeit im Rohr 47. Dies erzeugt

Kappenteil 41 aufgeschraubt, welcher eine mittlere 5 ein osmotisches Druckgefälle an der Membran 55,

Bohrung für das obere Ende des Rohres 27 und eine welche den Druck der Flüssigkeitssäule im Rohr 47

Schlauchtülle 42 aufweist. In die Mittelbohrung des ausgleicht.

Kappenteiles 41 ist ein Rohranschlußstück 43 einge- Zwischen dem unteren Halterungsteil 50 und dem

schraubt. Ein ähnliches Kühlmantelrohr 44 aus Metallblock 12 ist ebenfalls ein Kühlmantelrohr 64

durchsichtigem Kunststoff ist mit seinen Enden auf io angeordnet. Der Mantelraum steht über innere

den verjüngten Endabschnitten des Blockes 12 und Durchlässe im Halterungsteil 50 mit einer an diesem

des Halterungsteiles 29 befestigt. Das Halterungsteil befestigten Schlauchtülle 65 in Verbindung. Die

29 besitzt ferner eine Mehrzahl von in Längsrichtung Mantelrohre 40, 44 und 64 bestehen zweckmäßig aus

durchlaufenden Rohren 45 zum Durchtritt der Kühl- dem gleichen Material. Während des Betriebes der

flüssigkeit. . 15 erfindungsgemäßen Vorrichtung wird zweckmäßig

Im unteren Teil der erfindungsgemäßen Elektro- eine Kühlflüssigkeit, insbesondere Eiswasser durch phoresevorrichtung ist in ähnlicher Weise ein dem die Kühlmantel geleitet. Der Metallblock 12 weist zu Rohr 27 entsprechendes Kunststoffrohr 47 ange- diesem Zweck ebenfalls in Längsrichtung verlaufende ordnet, dessen mit einem Außengewinde versehenes Durchlässe 66 auf. Das untere Ende des Rohres 47 Unterteil in einer mit einem Gewinde versehenen 20 endetin einem Leitungsanschlußteil 67.
mittleren öffnung in einem unteren Halterungsteil 50 Zur Beschickung der erfindungsgemäßen Vorrichfestliegt, das zweckmäßig aus dem gleichen Material tung kann das mittlere Rohr zunächst durch das besteht wie das obere Halterungsteil 29. In der Wan- untere Anschlußteil 67 bis zur Hphe .L mit einer dung des Rohres 47 sind ebenfalls vier öffnungen 51 - Flüssigkeit hoher Dichte gefüllt werden. Nach Abvorgesehen, deren jede normalerweise über einen as nehmen des oberen Anschlußteiles 43 kann die entsprechenden Hohlraum 52 mit einer radialen öff- Dichtegradientenflüssigkeit auf die dichte Trägernung 53 in Verbindung steht. Die öffnungen 51 sind flüssigkeit aufpipettiert werden. Wenn die Flüssigebenfalls durch eine rohrförmige, semipermeable keitshöhe der Dichtegradientenflüssigkeit etwa die Membran 55 abgedeckt. Das Halterungsteil 50 trägt Mitte des Rohres 27 erreicht, wird die Pipette enteinen inneren ringförmigen zylindrischen Trog 56 30 fernt und zunächst eine Testlösung oder Suspension S mit einer Mehrzahl von in dessen Außenwandung an- eingeführt, die hinreichende Mengen an Gelöstem geordneten öffnungen 57, deren jede durch eine enthält, so daß ihre Dichte etwas geringer ist, als diesemipermeable Membran 58 verschlossen ist. Der jenige der unmittelbar " darunterliegenden Dichte-Trog 56 enthält eine Puffersalzlösung 59 und ist an gradientensäule. Die Pipette zur Einführung der Testseiner Außenseite von einem zweiten ringförmigen 35 lösung wird entfernt und auf die Probe eine weitere zylindrischen Trog 60 umgeben, welcher eine Puffer- Dichtegradientensäule aufgebracht, die in ihrem salzlösung 61 enthält, in die eine Elektrode 46 ein- unteren Teil eine Dichte besitzt, die geringfügig taucht. Die Hohlräume 52 im Halterungsteil 50 kleiner ist, als die Dichte der Testlösung. Die obere stehen miteinander in Verbindung und weisen eine Grenzfläche dieser Dichtegradientensäule entspricht Entlüftungsöffnung 62 auf, um eine vollständige 40 dem Meniskus M.
F_üllung mit der Puffersalzlösung 59 sicherzustellen. Als nächstes wird durch das untere Anschlußteil

Die Zwischenschaltung eines inneren Troges 56 67 eine hinreichende Menge der dichten Trägerflüs-

ist deswegen erforderlich, weil die hohe Konzentra- sigkeit abgezogen, so daß die Dichtegradientensäule

tion der dichten Lösung im Rohr 47 auf der Höhe und die Testlösung in die in F i g. 3 dargestellte

der öffnungen 51 sonst eine osmotische Strömung 45 Stellung gelangen. Fig. 3 entspricht der Fig. 1, wo-

aus dem Trog 56 in das Rohr 47 verursachen würde, bei jedoch die Schraffierung und gewisse zum Ver-

wenn nicht die Konzentration des Gelösten auch im ständnis unwesentliche Teile fortgelassen wurden.

Trog 56 hoch ist. Da eine derart hohe Konzentration Anschließend wird über die Dichtegradientensäule,,

jedoch leicht zu einer Verschmutzung der Elektroden eine Schicht einer Pufferlösung mit geringerer Dichte

46 führt, wird die dichte Puffersalzlösung im 50 aufpipettiert. Nachdem die Tröge 34, 56 und 60 mit inneren Trog 56 durch eine Membran 58 von einer elektrisch leitenden Puffersalzlösungen gefüllt wurden, Puffersalzlösung 61 geringerer Dichte getrennt. Im wird durch Anlegen eines Potentials an die Elek-

. Vergleich zu einer osmotischen Strömung durch die troden 36 und 46 in der Dichtegradientensäule ein Membran 38 am oberen Rohr 27 ist eine osmotische elektrisches Feld erzeugt. Soweit sich in der UmStrömung durch die Membran 55 am unteren Rohr 55 gebung der Elektroden Bläschen bilden, werden diese

47 störend, da sie die Lage der Dichtegradientensäule durch die semipermeablen Membranen 38, 55 und 58 innerhalb der Rohre 11 und 11' verändert. Dem- an einer Beeinträchtigung der Dichtegradientensäule gegenüber wird durch eine osmotische Strömung im mittleren Rohr gehindert.

durch die obere Membran 38 nicht die Stellung der Nach einer zur teilweisen elektrophoretischen Auf-Dichtegradientensäule, sondern lediglich die Höhe 60 trennung der Testlösung hinreichenden Zeit wird das der auf der Dichtegradientensäule aufsitzenden Flüs- Potential von den Elektroden abgeschaltet und die sigkeit geringerer Dichte beeinflußt. Zur Sicherstel- dichte Trägerflüssigkeit durch das Anschlußteil 67 lung der photometrischen Ausmessung der Lage der langsam abgezogen. Auf diese Weise wird die Dichtegetrennten Banden mittels des von der Lampe 16 gradientensäule mit den teilweise getrennten Zonen durch das Quarzfenster 21 und das Lichtfilter 23 auf 65 der Testlösung abwärts durch den Lichtstrahl der aus die Photozelle 24 fallenden Lichtes darf die Stellung der Lampe 16, dem Filter 23 und der Photozelle 24 der Dichtegradientensäule nicht verändert werden. sowie einem geeigneten Anzeigegerät bestehenden Zur Verhinderung einer umgekehrten ■ osmotischen Vorrichtung zur Messung der Lichtabsorption hin-

Claims (11)

1. ι οι/ yz/

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   durch bewegt. Die gemessenen Absorptionswerte 60 eintauchenden Elektroden sind an eine Gleichkönnen durch ein Aufzeichnungsgerät in Form eines stromquelle 80 angeschlossen, die die erforderliche Diagrammes aufgezeichnet werden, in welchem die Spannung und Stromstärke zur Erzeugung eines Lichtabsorption und damit die Konzentration der elektrischen Feldes in der Dichtegradientensäule fraktionierten Zonen gegen deren Lage in der Dichte- 5 liefert. In eine Leitung 34 zwischen dem Dreiwegegradientensäule aufgetragen ist. hahn 75 und einer herkömmlichen Gradientenbil-

   Die Stellung der Dichtegradientensäule nach dem dungsvorrichtung 85 ist eine durch einen Motor 83 ersten Durchgang durch das optische System ist in angetriebene Pumpe 82 eingebaut. Dieses System Fig. 4 dargestellt. Bei Erreichen dieser Stellung kann zur Einführung der Dichtegradientenflüssigkeit wird die Pumpe zum Abziehen der dichten Träger- io in den Mittelteil des Rohres dienen, anstatt diese in flüssigkeit stillgesetzt und. an die Dichtegradienten- der weiter oben beschriebenen Weise auf die dichte kolonne erneut das elektrische Feld angeschlossen. Trägerflüssigkeit aufzupipettieren. Nach einer hinreichenden Zeit weiterer Wanderung Zur Inbetriebnahme der Vorrichtung wird zu- und Auftrennung wird das elektrische Feld wieder nächst der Dreiwegehahn 75 so eingestellt, daß er die abgeschaltet und mittels der Pumpe durch das An- 15 Leitungen 84 und 76 verbindet. Wenn mittels des schlußteil 67 weitere dichte Trägerflüssigkeit in den Motors 83 die Hälfte des gewünschten Volumens an unteren Teil des mittleren Rohres eingedrückt. Hier- Dichtegradientenflüssigkeit in die Leitung 76 eingedurch wird die weiter fraktionierte Dichtegradientenr führt wurde, wird mittels eines_> Motors 86 und einer kolonne erneut langsam an der photometrischen Meß- Nockenscheibe 87 die Testlösung aus einer Kolbenanordnung vorbei aufwärts in die in F i g. 3 darge- ao vorrichtung 88 in die Leitung 76 gedrückt. Die stellte Stellung verschoben. Während dieser Ver- Nockenscheibe 87 ist vorzugsweise so geformt, daß Schiebung zeichnet das Meßgerät erneut die. Lage der die Verschiebungsgeschwindigkeit des Kolbens 88 in einzelnen Zonen in der Dichtegradientensäule auf. der Anfangsphase größer ist, als in der Endphase. Diese Bestimmung der Lage der Zonen in der Dichte- Dies trägt dazu bei, an der Grenzfläche unterhalb der gradientensäule durch abwechselnde Auf- und Ab- 25 Testlösungszone die Bildung eines umgekehrten wärtsbewegung derselben infolge der Zu- oder Dichtegradienten zu verhindern. Statt dessen kann die Abfuhr von dichter Trägerflüssigkeit kann beliebig oft Bildung eines instabilen, umgekehrten Dichtewiederholt werden. Sobald das Aufzeichnungsgerät gradienten an dieser Stelle auch durch Steigerung des eine hinreichende Auftrennung anzeigt, kann mittels durch die Vorrichtung 85 erzeugten Gradienten der Pumpe soviel weitere dichte Trägerflüssigkeit 30 während der Einführung der Testsubstanz in die in das Mittelrohr eingeführt werden, daß die Dichte- Leitung 76 gering gehalten werden. Die Leitung 77 gradientensäule durch das obere Anschlußstück 43 wird durch einen von einem Motor 89 exzentrisch hinaus gedrückt und zweckmäßig über ein Verteiler- angetriebenen Arm 90 in Vibration versetzt und zurohr in die Auffanggefäße eines herkömmlichen sammengedrückt, um eine gleichmäßige Vermischung Fraktionssammlers geleitet wird. 35 der Testlösung und der Dichtegradientenflüssigkeit

   Zur Kühlung der Flüssigkeit im mittleren Rohr auf ihrem Wege zum mittleren Rohr der erfindungskann, wie schon erwähnt, durch den Mantel eine gemäßen Vorrichtung zu erzielen. Kühlflüssigkeit, insbesondere Eiswasser geleitet Nach Einführung einer hinreichenden Menge an werden. Dies ist zweckmäßig, da der durch die Flüs- Testlösung in die Leitung 76 wird der Motor 86 absigkeitssäule fließende Strom eine Aufheizwirkung 40 geschaltet, während die Vorrichtung 85 bis zur Verbesitzt, welche ohne Kühlung zur Bildung von heißen vollständigung der Dichtegradientensäüle weiterläuft. Stellen führen würde, welche eine Konvektionsströ- Daan wird der Dreiwegehahn 75 in die in F i g. 5 darmung innerhalb des Rohres verursachen und dadurch gestellte Stellung gedreht und mittels der Kolbenvordie Reinheit der getrennten Zonen beeinträchtigen richtung 72 eine Flüssigkeit hoher Dichte zugeführt, würde. Die durch die Schlauchtülle 65 zugeführte 45 bis die Dichtegradientensäule die in F i g. 3 darge-Kühlflüssigkeit zirkuliert durch das untere Halte- stellte Stellung erreicht hat. Die zur Erzeugung eines rungsteil 50, welches die Membran 55 umgibt, durch elektrischen Kontaktes mit der im oberen Trog 34 die senkrechten Öffnungen 66, in dem die Photozelle enthaltenen Puffersalzlösung über der Dichte- und die Lichtquelle beherbergenden Metallblock 12 gradientensäule aufzubringende Flüssigkeit geringerer ·> und die senkrechten Durchlässe 45 im Halterungsteil 50 Dichte kann durch die obere öffnung der Apparatur 29, welches die Membran 38 umgibt und strömt von Hand aufpipettiert oder durch eine geeignete dann durch die Schlauchtülle 42 ab. Die den äußeren Programmierung der Apparatur 85 zur Erzeugung Teil des Flüssigkeitsmantels bildenden Teile bestehen des Dichtegradienten oder durch eine weitere in die vorteilhaft aus durchsichtigem Kunststoff. Leitung 76 fördernde, motorbetriebene Kolbenvor-

   F i g. 5 zeigt eine schematische Darstellung der 55 richtung zugeführt werden. Gesamtanordnung der erfindungsgemäßen Vorrichtung, bei welcher die aus dem oberen Anschlußteil

   43 austretende Flüssigkeit mittels eines Verteiler- Patentansprüche· rohres 71 in die Auffanggefäße eines herkömmlichen

   Fraktionssammlers 70 überführt wird. Eine durch 60

   . einen Motor 73 mit umkehrbarer Drehrichtung ange- 1. Vorrichtung zur Dichtegradienten-Elektrotriebene Kolbenvorrichtung 72 mit zugehöriger Leit- phorese mit einem vertikal angeordneten Rohr spindel 74 fördert die dichte Trägerflüssigkeit über aus elektrisch isolierendem Material zur Aufeinen Dreiwegehahn 75 und Leitungen 76 und 77 . nähme einer Dichtegradientenflüssigkeit und zum unteren Anschlußteil 67 der erfindungsgemäßen 65 Vorrichtungen zur Erzeugung eines elektrischen Vorrichtung. Die Photozelle 24 ist über einen ge- Feldes zwischen mit axialem Abstand voneineigneten Verstärker 79 mit einem Aufzeichnungsgerät ander im Rohr gelegenen Punkten, dadurch 78 verbunden. Die in die zylindrischen Tröge34 und gekennzeichnet, daß die Elektroden (36;

   46) zur Erzeugung des elektrischen Feldes jeweils in durch semipermeable Membranen (38; 55) vom Innenraum des Rohres (11, 11', 27, 47) getrennte Elektrolytgefäße (34; 56) eingetaucht sind und daß eine Vorrichtung zur reversiblen Verschiebung der Dichtegradientenflüssigkeit mittels einer Verdrängungsflüssigkeit relativ zu einem bestimmten Rohrabschnitt vorgesehen ist.
2. 2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß am Rohr (11, 1Γ, 27, 47) zwischen den den beiden Elektroden (36, 46) zugeordneten Membranen (38, 55) eine auf die Konzentration der im. Rohr enthaltenen Flüssigkeit ansprechende Vorrichtung (16, 24) angeordnet ist. ·.
3. 3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Innenwand des Rohres (11, 11', 27, 47) aus einem nicht benetzbaren Material besteht.
4. 4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die untere Elektrode (46) in ein Elektrolytgefäß (60) eingetaucht ist, das über eine semipermeable Membran (38) mit einem inneren, über eine semipermeable Membran (55) mit dem Rohrinnenraum verbundenes Elektrolytgefäß (56) verbunden ist.
5. 5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die auf die Konzentration der Flüssigkeit ansprechende Vorrichtung einen Lichtwandler (24) sowie eine Lichtquelle aufweist, deren Licht durch im Rohr (11, 11', 27, 47) vorgesehene Lichtdurchlässe (20, 20') hindurch auf den Lichtwandler (24) fällt.
6. 6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Lichtdurchlässe (20, 20') aus Quarzfenstern, insbesondere aus einem Quarzring (21) bestehen.
7. 7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch einen über ein Abnahmerohr (71) mit dem oberen Ende (27) des Rohres verbundenen Fraktionssammler (70) zum Auffangen der durch die Verdrängungsflüssigkeit herausgedrückten Fraktionen.
8. 8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet durch einen Behälter (88) für eine die zu fraktionierende Substanz enthaltende Flüssigkeit, durch Vorrichtungen (85) zur Bildung einer Dichtegradientenflüssigkeit, durch Vorrichtungen (83, 86) zur gesteuerten Zufuhr von Dichtegradientenflüssigkeit und testsubstanzhaltiger Flüssigkeit in das untere Ende (47) des Rohres sowie durch Vorrichtungen (89, 90) zum Vermischen der testsubstanzhaltigen Flüssigkeit und der Dichtegradientenflüssigkeit vor deren Einführung.
9. 9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, gekennzeichnet durch Vorrichtungen (87) zur Steuerung der Zufuhrgeschwindigkeit der testsubstanzhaltigen Flüssigkeit.
10. 10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, gekennzeichnet durch Vorrichtungen zur Erhöhung des Gradienten der Dichtegradientenflüssigkeit während der Zuführung der testsubstanzhaltigen Flüssigkeit.
11. 11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, gekennzeichnet durch einen flüssigkeitsdurchströmten Kühlmantel (40, 44, 64).

    Hierzu 2 Blatt Zeichnungen