DE2616887A1

DE2616887A1 - Vorrichtung zur isoelektrischen fokussierung

Info

Publication number: DE2616887A1
Application number: DE19762616887
Authority: DE
Inventors: William Donner Denckla
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1975-04-24
Filing date: 1976-04-15
Publication date: 1976-11-18
Also published as: SE7604674L; FR2308413B1; FR2308413A1; JPS51129881A; NL7603963A; GB1513204A; US3962058A

Description

F. HofFmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz

Vorrichtung zur isoelektrischen Fokussierung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine flachgebaute Vorrichtung zur isoelektrischen Fokussierung von kleinen Volumen (ungefähr 6 ml) an Lösungen von Proteinen oder Polypeptiden, sowie ein Verfahren zur isoelektrischen Fokussierung unter Verwendung dieser Vorrichtung.

Die isoelektrische Fokussierung ist ein wertvolles Verfahren zur Trennung von Proteinen und Polypeptiden in Lösung. Dieses Verfahren beruht auf der Tatsache, dass derartige Verbindungen Zwitterionen sind und somit bei einem bestimmten pH-Wert keine Nettoladung besitzen (isoelektrischer Punkt). Es ist dementsprechend möglich Proteine und Polypeptide in einer Vorrichtung zur isoelektrischen Fokussierung durch Herstellung eines pH-Gradients mit Hilfe von niedermolekularen Zwitterionen (Trägerampholyten) zu trennen, da die verschiedenen Verbindungen jeweils zu ihren spezifischen isoelektrischen Punkten wandern und sich an diesen Stellen des Gradients ansammeln.

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Hen/25.3.1976

In den bekannten Vorrichtungen gibt es jedoch Einschränkungen hinsichtlich der trennbaren Menge an Probe. Die kleinsten Vorrichtungen benötigen Volumen an Probe von mindestens 20 ml. Falls nur geringe Mengen an Proteinen und an Polypeptiden vorliegen, sind derartige Volumen zu gross. Eine Verdünnung würde nämlich zu geringen, für die Analyse unbrauchbaren Konzentrationen führen.

Eine der grössten Schwierigkeiten, welche bei der Verwendung von Vorrichtungen mit kleinen Volumen auftauchen, entsteht durch das Auftreten einer elektro-osmotischen Strömung. Diese verhältnismässig starke Wasserströmung von einer Elektrode zur anderen, verdrängt die getrennten Verbindungen von ihren richtigen isoelektrischen Punkten. Wenn die Verbindung eine relativ geringe Ladungsdichte besitzt, kann die Verlagerung bis zur Stelle, an welcher die Ladung der Verbindung eine elektrostatische Kraft ergibt, welche die Kraft der osmotischen Strömung ausgleicht, ziemlich gross sein. Weiter erfolgt die osmotische Strömung hauptsächlich im Zentrum des Kanals und nimmt in Richtung der Wände sehr stark ab. Dies hat zur Folge, dass der Konzentrationsgradient eine kugelförmige Form besitzt und sich nicht - wie für eine maximale Auflösung erwünscht - senkrecht zur Längsachse erstreckt. Eine derartige Deformation ist verhältnismässig grosser in Vorrichtungen von kleinerem Volumen und hindert diese Vorrichtungen effektiv für präparative oder für analytische Zwecke verwendet zu werden.

Ein bekanntes Verfahren zur Trennung von kleinen Mengen an Proteinen oder Polypeptiden erfolgt unter Verwendung eines festen Trägermaterial für die gelösten Verbindungen. Auf diese Weise ist nur ein dünner Flüssigkeitsfilm vorhanden und die Effekte der elektro-osmotischen Strömung sind nicht kritisch. Die verwendeten Trägermaterialien,wie z.B. Acrylamidgel, Sephadex und dergleichen, sind jedoch sehr teuer. Weiter sind die in diesen Vorrichtungen durchgeführten Trennungen verhältnismässig langsam und die Rückgewinnung der getrennten Verbindungen ist umständlich oder sogar unmöglich.

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Die vorliegende Erfindung betrifft nun eine flachgebaute Vorrichtung zur isoelektrischen Fokussierung, welche eine schnelle und leistungsfähige Trennung von kleinen Volumen an Proteinen oder an Polypeptiden ermöglicht. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die erfindungsgemässe Vorrichtung für die Verwendung von Volumen unterhalb 10 ml konstruiert. Die nachteiligen Effekte der elektro-osmotischen Strömung werden durch Auswahl von kritischen dimensionalen Parametern auf ein Minimum reduziert.

Erfindungsgemäss wurde festgestellt, dass man Vorrichtungen zur isoelektrischen Fokussierung, welche sich für kleine Volumen eignen, herstellen kann, indem man dem Raum, welcher die Protein- oder die Polypeptidlösung enthält, die Form eines langen, schmalen Trogs gibt. Die kritischen Grossen, welche bei dieser Ausgestaltung berücksichtigt werden müssen, sind das Verhältnis der Länge zur Breite, (15:1 oder mehr) und die Höhe des Wasserfilms, die weniger als 4 mm und vorzugsweise mehr als 2 mm betragen soll (die unterste Grenze wird durch die Oberflächenspannung der Flüssigkeit bestimmt).

Genauer, gesagt, betrifft die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zur isoelektrischen Fokussierung enthaltend eine rechteckige Trennungskammer mit zwei Seitenwänden, zwei Stirnwänden und einem Boden, dadurch gekennzeichnet, dass die Länge dieser Kammer mindestens fünfzehn Mal grosser ist als seine Breite und die Höhe der Seiten- und Stirnwände zwischen, ungefähr 2 mm und 4 mm liegt; der Boden mit mindestens zehn symmetrisch angeordneten Zwischenwänden, welche sich von einer Seitenwand zur anderen senkrecht zur Längsachse der Trennungskammer erstrecken und ungefähr halb so hoch wie die Seiten- und Stirnwände sind, versehen ist; zwei Elektroden in die Trennungskammer hineinragen.

Weiter betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur isoelektrischen Fokussierung einer Lösung von höchstens 10 ml Volumen, welche Substanzen enthält, die unter dem- Ein-

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fluss eines elektrischen Feldes wandern, dadurch gekennzeichnet, dass man diese Lösung in die Trennungskammer einer oben erwähnten Vorrichtung einbringt? mit Hilfe von Trägerampholyten in dieser Trennungskammer einen gewünschten pH-Gradient erzeugt; diese Trennungskammer einer elektrischen Spannung unterwirft, wobei die verschiedenen Substanzen jeweils zu ihren spezifischen isoelektrischen Punkten wandern und getrennte, Substanzen enthaltende Zonen bilden; und die Substanzen aus den verschiedenen Zonen gleichzeitig und separat voneinander entfernt.

Die erfindungsgemasse flachgebaute Vorrichtung zur isoelektrischen Fokussierung und das erfindungsgemasse Verfahren werden in der folgenden Beschreibung unter Berücksichtigung der beiliegenden Zeichnung näher erläutert.

Eine rechteckige Trennungskammer 10 besitzt vier Seitenwände 11, 12, 13 und 14. Die Wände 11 und 13 sind die "kurzen" Seitenwände und die Wände 12 und 14 die "langen" Seitenwände. Die Dimensionen dieser Wände werden so ausgewählt, dass das Verhältnis der inneren Länge der Kammer 10 zur inneren Breite dieser Kammer grosser als 15 und vorzugsweise grosser als 30 ist. Die Wände können aus irgendeinem steifen, wasserundurchlässigen, nicht leitungsfähigen Material bestehen_o Kunststoffe wie Acrylpolymere, Polystyrol, Polypropylen, usw. sind für diesen Zweck besonders geeignete Materialien. Die genaue Art •der Konstruktion ist nicht kritisch. Dementsprechend können alle vier Wände als ein Einzelteil gegossen oder geformt werden oder diese Wände können einzel unter Verwendung eines geeigneten Klebstoffs verbunden werden.

Damit die zur Reduzierung der Effekte der elektro-osmotischen Strömung notwendige kritische Wasserhöhe erreicht wird, besitzen die Seitenwände eine Höhe von ungefähr 2 bis 4 mm, vorzugsweise ungefähr 2 mm. Mit zunehmender Höhe der Wände über 2 mm, scheint die Geschwindigkeit der Trennung der Probe in ihre Komponenten abzunehmen. So wurde z.B. festgestellt, dass

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ein typischs Protein, Cytochrome C, zum Erreichen seines isoelektrischen Punktes in einer Vorrichtung mit einer Wandhöhe von 4 ram zehnmal mehr Zeit benötigt als in einer Vorrichtung mit einer Wandhöhe von 2 mm. Bei Verwendung von Wänden mit einer Höhe von 2 mm hatte das Wasser in der Trennungskammer eine geometrisch lineare und konstante Durchschnittsfläche.

Um einen guten Wärmeaustausch zu gewährleisten, besteht der Boden 15 der Vorrichtung vorzugsweise aus einer Glasplatte. Um diesen Wärmeaustausch auf ein Maximum zu bringen, kann der Boden Teil eines hohlen Glasblocks sein, welcher über die Exntrxttsleitung 16 und die Austrittsleitung 17 mit Kühlwasser oder irgendeinem anderen für einen Wärmeaustausch geeigneten Medium, durchflossen wird.

Um einen zu schnellen Durchfluss der Vorrichtung zu vermeiden und die Rückgewinnung der getrennten Komponenten zu erleichtern, ist es erwünscht, die Trennungskammer mit einer Reihe von Zwischenwänden 18, welche sich in einer symmetrischen Anordnung senkrecht zur Längsachse der Kammer erstrecken, zu versehen. Diese Zwischenwände sind in dem Boden 15 - entweder als Bestandteil dieses Bodens oder durch Fixierung der einzelnen Zwischenwänden an diesen Boden auf bekannter Weise angebracht. Diese Zwischenwände erstrecken sich von der Seitenwand 12 bis zur Seitenwand 14 und sind ungefähr halb so hoch wie. diese Seitenwände, d.h. sie sind vorzugsweise ungefähr 1 mm hoch. Die Verx^endung von Zwischenwänden dient zur besseren Trennung der Zonen, in welchen die getrennten Komponenten sich ansammeln und trägt zur Vermeidung von -Schwanzbildung bei. Bei Gebrauch kann beobachtet werden, dass die Proteine der Probe klar sichtbare Streifen bilden, deren Ränder sich senkrecht zur Längsachse erstrecken. Dies zeigt, dass die Anordnung des pH-Gradients symmetrisch und linear ist. Die Anzahl der .verwendeten Zwischenwände bestimmt den Grad bis zu welchem der pH-Gradient unterteilt werden kanne In der-Regel werden mindestens IG ZvjLsdhen^'an&a benutzt, obwohl in der Zeichnung

der Einfachkeit halber nur zwei dieser Zwischenwände dargestellt werden. Da ein Kompromiss zwischen der mit einer zunehmenden Menge an Zwischenwänden erreichbaren Verbesserung des Auflösungsvermögens und der erhöhten Schwierigkeiten bei der Konstruktion gefunden werden muss, werden vorzugsweise ungefähr 20 Zwischenwände verwendet.

In einer weiteren Ausfuhrungsform, welche durch die Zeichnung nicht veranschaulicht ist, wird ein Deckel von geeigneten Dimensionen benützt, um bei Gebrauch das Verdampfen in der Trennungskammer zu vermeiden. Ein derartiger Deckel kann mit einer Reihe von Zwischenwänden, welche sich in einer symmetrischen Anordnung senkrecht zur Längsachse des Deckels erstrecken, versehen sein. Diese Zwischenwände sind so angeordnet, dass sie mit den bereits erwähnten Zwischenwänden 18, welche am Boden angebracht sind, alternieren. Die am Deckel angebrachten Zwischenwände besitzen die gleiche Höhe wie die am Boden angebrachten Zwischenwände 18. Die Verwendung von Zwischenwänden, die am Deckel angebracht sind, dient als eine weitere Massnahme zur Reduzierung der Volumen der Zonen der Vorrichtung, in welchen die getrennten Komponenten sich ansammeln. Auf diese Weise wird in der Verteilung der Kompo-.nenten das Verhältnis der Höhe zur Breite eines ^HPeak" vergrössert.

Die zur Durchführung der elektrophoretischen Trennung notwendige Spannung wird mit Hilfe der Elektroden 19 und 20 erzeugt. Diese Elektroden stehen unter Bildung eines üblichen Stromkreises in Verbindung mit einer konventionellen Stromquells mit hoher Spannung (in der Zeichnung nicht dargestellt).

In einer bevorzugten Ausfuhrungsform bestehen die Elektroden aus einem leitfähi'gen Metalldraht, vorzugsweise aus einem Platinäraht. Weiter ist es vorteilhaft, dass die Zone der Vorrichtung, worin sich eine Elektrode befindet und welche dem Raum zwischen der Elektrode und der ersten Zwischenwand entspricht, so klein wie möglich gehalten wird.

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Der Betrieb einer spezifischen Ausführungsform der erfindungsgemässen flachgebauten Vorrichtung zur isoelektrischen Fokussierung wird nachstehend beschrieben. Die Vorrichtung besitzt eine Trennungskammer mit einem Volumen von 6 ml und die folgenden inneren Abmessungen:
Länge : 300 mm; Breite: 10 mm; Höhe: 2 ram.

Die Trennungskammer ist mit 20 Zwischenwänden von 1 mm Höhe versehen. Das Abdampfen wird mit Hilfe eines Deckels vermieden. Die Räume, welche die Elektroden enthalten, werden mit destilliertem Wasser gefüllt. Anschliessend wird die Probelösung - 1% Protein in Wasser (Gew./Vol.) - welche Trägeratttpholyten enthält, in die Trennungskammer geschüttet. Eine Spannung von

1000 Volt wird angelegt. Bei Fokussierung unter Verwendung eines pH-Gradients von 3-10 wird eine Gesamtzeit von 3 Stunden benötigt, bis die Trennung vollendet ist. In der Regel kann das Verfahren als beendet betrachtet werden, wenn man eine konstante niedrige Leitfähigkeit beobachtet. Dies ist nämlich das Zeichen, dass alle Ampholyte ihre isoelektrischen Punkte erreicht haben und somit eine minimale Ladung besitzen.

Damit die Reinheit der getrennten Komponenten gewährt wird, werden alle Zonen, welche den Räumen zwischen den verschiedenen Zwischenwänden entsprechen, gleichzeitig entleert. Dies erfolgt zweckmässigerweise durch Verwendung einer für 'diesen Zweck geeigneten Entleerungsvorrichtung. Eine derartige Entleerungsvorrichtung enthält eine Anzahl von biegsamen •Röhrchen (die Anzahl dieser Röhrchen ist mindestens so gross wie die Anzahl der durch die Zwischenwände in der Trennungskammer definierten Zwischenräume), versehen mit einem Saugkopf wie z.B. eine Mündung oder ein Mundstück von kleinen Volumen» Jedes dieser Röhrchen führt in separate Aufnahmebehälter, welche-ihrerseits über ein Ansaugrohr mit Verzweigung mit einer gemeinsamen Vakuumquelle verbunden sind. Die Röhrchen ■ werden dann in die Trennungskanraer eingeführt, wenn die Trennung beendet ist und die Vorrichtung nicht mehr unter Spannung steht.

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Durch Einschalten der Vakuumquelle werden die Flüssigkeiten in den verschiedenen Zwischenräumen gleichzeitig und separat, voneinander entfernt und für analytische und präparative Zwecke getrennt aufbewahrt.

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Claims

Patentanspräche

1. Vorrichtung zur isoelektrischen Fokussierung enthaltend eine rechteckige Trennungskammer mit zwei Seitenwänden/ zwei Stirnwänden und einem Boden, dadurch gekennzeichnet, dass die Länge dieser Kammer mindestens fünfzehnmal grosser ist als seine Breite und die Höhe der Seiten- und Stirnwände zwischen ungefähr 2 mm und 4 mm liegt; der Boden mit mindestens zehn symmetrisch angeordneten Zwischenwänden, welche sich von einer Seitenwand zur anderen senkrecht zur Längsachse der Trennungskammer erstrecken und ungefähr halb so hoch wie die Seiten- und Stirnwände sind, versehen ist; zwei Elektroden in die Trennungskammer hineinragen.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Länge der Kammer mindestens dreissigmal grosser ist als ihre Breite.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Höhe der Seiten- und Stirnwände ungefähr 2 mm beträgt.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, dass der Boden mit 20 Zwischenwänden versehen ist.

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Seiten- und die Stirnwände aus steifem Kunststoff und der Boden aus Glas bestehen.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, dass der Boden Wärmeaustauschelemente enthält.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-6, dadurch gekennzeichnet, dass das Totalvolumen der Trennungskammer weniger als 10 ml ist.

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8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-7, dadurch gekennzeichnet, dass sie mit einem Deckel zur Vermeidung des Abdampfens bei Gebrauch versehen ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Deckel mit einer Reihe von Zwischenwänden,die ungefähr halb so hoch wie die Seiten- und die Stirnwände sind, versehen ist und diese Zwischenwände mit den Zwischenwänden, welche am Boden angebracht sind, alternieren.

10. Verfahren zur isoelektrischen Fokussierung einer Lösung von höchstens 10 ml Volumen, welche Substanzen enthält, die unter dem Einfluss eines elektrischen Feldes wandern, dadurch gekennzeichnet, dass man diese Lösung in die Trennungskammer einer Vorrichtung gemäss einem der Ansprüche 1-9 einbringt? mit Hilfe von Trägerampholyten in dieser Trennungskammer einen gewünschten pH-Gradient erzeugt; diese Trennungskammer einer elektrischen Spannung unterwirft, wobei die verschiedenen Substanzen jeweils zu ihren spezifischen isoelektrischen Punkten wandern und getrennte, Substanzen enthaltende Zonen bilden; und die Substanzen aus den verschiedenen Zonen gleichzeitig und separat voneinander entfernt.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Lösung ein oder mehrere Proteine und ein TrägeramphoIyt enthält.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein in einer Konzentration von 1% vorhanden ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10-12, dadurch gekennzeichnet, dass die Spannung solange angelegt wird bis eine konstante geringe Leitfähigkeit beobachtet wird.

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14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10-13, dadurch gekennzeichnet, dass während der Dauer der isoelektrischen Fokussierung ein Wärmeaustausch stattfindet.

15. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-9 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 10-14.

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