DE1923613B2 - Vorrichtung zum isoelektrischen Trennen von ampholytischen Mischungen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum isoelektrischen Trennen von Ampholyten. Die isoelektrische Trennung ist ein bei der Trennung von Ampholyten seit langem bekanntes und auch in praxi benutztes Verfahren. Dieses Trennungsverfahren erlangt deswegen besondere Bedeutung, weil Proteine zum großen Teil Ampholyte sind. Das Verfahren beruht auf der Tatsache, daß, wenn durch eine mehrere verschiedene Ampholyte enthaltende Lösung ein Gleichstrom geleitet wird, indem zwei Elektroden in die Lösung eingesetzt und diese mit einer Gleichstromquelle verbunden werden, die am stärksten sauren Ampholyte sich an der Anode und die am stärksten basischen Ampholyte sich an der Kathode ansammeln, während sich die übrigen in der Lösung entsprechend ihrer isoelektrischen Punkte pi dazwischen anordnen. Zugleich tritt ein pH-Wert-Gradient zwischen den Elektroden auf, wobei der niedrigste pH-Wert an der Anode und der höchste an der Kathode anzutreffen sind. Der pH-Gradient ist beständig, und es läßt sich zeigen, daß der pH-Wert an einer Stelle, an derein bestimmter Ampholyt seine höchste Konzentration hat, dem isoelektrischen Wert pi des Ampholyten entspricht. Enthält die Lösung neben Ampholyten auch noch ein Salz, so dissoziiert dieses, und das positive Kation wandert zur Kathode, das negative Anion, der Säurerest, zur Anode, während die verschiedenen Ampholyte in dem Abstand dazwischen in der durch ihren pl-Wert bestimmten Folge verbleiben. Folglich ist jeder Ampholyt einer eiektrophoretischen Wanderung zu dem Punkt zwischen den Elektroden unterworfen, der seinem jeweiligen pl-Wert entspricht. Dieser Wanderung wirkt jedoch die Diffusion entgegen, durch welche die Ampholyte in beiden Richtungen von diesen Punkten fortstreben. Aus dem Grunde sind zwei niedermolekulare Ampholyte mit nahe beieinander liegenden isoelektrischen Punkten niemals vollständig voneinander zu trennen, wenn die Lösung nicht zusätzlich noch einen weiteren Ampholyt enthält, dessen isoelektrischer Punkt zwischen diesen beiden Komponenten liegt. Die Diffusion ist besonders stark für niedermolekulare Ampholyte und gering für hochmolekulare Ampholyte, so daß letztere stärkere Konzentrationsmaxima an den isoelektrischen Punkten ergeben. Es läßt sich auch daraus schließen, daß eine ampholytisohe Mischung mit einer großen Anzahl niedermolekularer Ampholyte unterschiedlicher jedoch dicht beieinander liegender isoelektrischer Punkte einen sehr stabilen und linearen pl 1-Gradienlcn in einem bestimmten Bereich zwischen den zwei Elektroden aufweisen kann, wenn die verschiedenen Ampholyte in der Mischung günstig ausgewählt sind bezüglich ihrer isoelektrischen Punkte und wenn sie in der Mischung im richtigen Mengenverhältnis zueinander enthalten sind. Wird durch eine derartige bekannte Mischung aus niedermolekularen Ampholyten, einer sogenannten Awnpholyt-Trägermischling, ein stabiler pH-Gradient erzeugt, so ist es theoretisch möglich, eine sehr gute Trennung tier Bestandteile einer unbekannten Mischung von wolligen oder mehreren hochmolekularen Ampholyien zu erreichen. Wegen ihrer Eigenschaft, mirsehr wenig zu diffundieren im Vergleich zur Diffusion tier Trägcrampholyten konzentrieren sich die hochmolekularen Ampholyte sehr dicht um die Punkte in tier pi I-Gradicntcnskala, die durch die I riigerampholytmischimg hervorgerufen ist, entsprechend ihrer isoeleklrischen Punkte, so daß die veischiedenen hochmolekularen Ampholyte vollständig voneinander getrennt werden können. Es ist daher möglich, ein derartiges Trennungsverfahren mit Erfolg bei der Trennung von verschiedenen Eiweißen

vorzunehmen. Als Trägerampholyte können z. B. Aminosäuren oder Polypeptide verwendet werden. Zu diesem besonderen Zweck werden auch besondere Trägerampholytmischungen mit sehr guten Eigenschaften hergestellt, die aliphatische Polyamino-Polycarbon Säuren enthalten.

Bei der Durchführung einer isoelektrischen Trennung sind jedoch die praktischen Schwierigkeiten, die auftreten, erheblich. Eine einfache Vorrichtung von der vorbeschriebenen Art kann nur für sehr grobe und ungenügende Trennung verwendet werden, denn es treten bereits Störungen durch die thermische Konvektion auf, die sich infolge des Erwärmens der Lösung durch den hindurchtretenden elektrischen Strom einstellt. Diese Konvektion ist wesentlich stärker als

»0 die elektrophoretische Wanderung und muß deshalb verhindert werden, wenn eine zufriedenstellende Trennung erzielt werden soll. Es wurde versucht, dieses Problem zu lösen, indem die Trennungszelle in eine Vielzahl von Kammern aufgeteilt wurde, und

»5 zwar rr.it Hilfe halbdurchlässiger Wände, die senkrecht zur Strombahn zwischen die zwei Elektroden angebracht wurden. Sicher reduzieren die halbdurchlässigen Membranwände die thermische Konvektion zwischen den einzelnen Kammern, jedoch rufen sie wiederum einen elektro-osmotischen Fluß zwischen den Kammern hervor, der die einzelnen Teile wiederum miteinander vermischt. Außerdem zeigen die hochmolekularen Ampholyte bei einer derartigen Vorrichtung die Tendenz, auf den Boden der Trenn-

gefäße zu sinken, so daß sie sich der isoelektrischen Trennung entziehen. Um dies zu verhindern, ist es nötig, in jeder Kammer eine Zirkulation zu erzeugen oder den Inhalt aufzurühren, wodurch wiederum die Trennvorrichtung kompliziert wird und die Gefahr eingegangen wird, daß sich die einzelnen Teile miteinander vermischen. Eine weitere Schwierigkeit liegt darin, daß ein großer Teil hochmolekularer Ampholyte, die in einer bestimmten Kammer konzentriert sind, eine erhöhte Tendenz zeigen, unter der Einwirkung der Schwerkraft durch die benachbarten halbdurchlässigen Wände in die angrenzenden Kammern mit geringer Konzentration hochmolekularer Ampholyte und damit geringerer Dichte hindurchzusinken. Eine weitere Schwierigkeit stellt sich ein, wenn bei Beendigung der Trennung die Spannungsquelle von den Elektroden getrennt wird, denn dann ist die elektrophoretische Wanderung der Ampholyten augenblicklich unterbrochen, während die Diffusion andererseits anhält. Es ist deshalb nötig, die einzelnen aufgeteilten Bestandteile der verschiedenen Ampholyte so schnell wie möglich aus den Trennzellen herauszunehmen, bevor sie infolge der Diffusion wieder miteinander vermischt sind. Es war aus diesen genannten Gründen bisher nicht möglich, eine zufriedensiellende isoelektiische Trennung mit Von ichlun gen der genannten Art zu erzielen.

Sehr gute Ergebnisse der isoelektrischen Trennung von Proteinen wurden jedoch mit einer besonderen Vorrichtung erzielt, die in den let/ten .Jahren entwikkell wurde Diesi Voirichlung besteht ims einer senkrecht angeordneten Trennsäule, in welehei die beiden Elektroden am oberen bzw. unteren Ende- angebracht sind. In diesel Säule wird ein stabiler naiürlicliei pi I

Gradient mit Hilfe einer geeigneten Mischung von Trägerampholyten hergestellt, und außerdem wird ein spezieller Dichtc-Gradicnt in der Lösung erzeugt, wobei die Dichte gegen die oberen Elektroden zu geringer wird, was mit Hilfe einer Zuckerlösung erreicht wird. Die Säule enthält also keine festen Körper, welche Elektroosmose hervorrufen könnten, jedoch stabilisiert der durch die Zuckerlösung erreichte Dichte-Gradient die Säule wirksam gegen thermische Konvektion. In einer solchen Säule können also sehr dichte Konzentrationen hochmolekularer Ampholyte wie etwa Eiweiße erzeugt werden, und zwar an den Pegelwerten in der Säule, an denen die pH-Werte in dem durch die Trägcrampholytmischung erzeugten pH-Gradienten den isoelektrischen Punkten der hochmolekularen Ampholyte entspricht. Jedoch auch diese Trennsäule hat ernst zu nehmende Nachteile. Es können nämlich nur sehr kleine Mengen hochmolekularer Ampholyte in einem stabilen Zustand in der Säule enthalten sein. Wenn die Mengen zu groß werden, so sinken sie unter dem Einfluß der Schwerkraft ab. Die Säule kann also nur für sehr kleine Proben Verwendung finden. Außerdem sind die bei der Trennung erhaltenen Bestandteile nicht nur durch die Trägcrampholyte, sondern auch durch die Zuckerlösung verunreinigt, die zur Erzeugung des Dichtegradienten benötigt wird. Es läßt sich auch feststellen, daß dieses Verfahren verhältnismäßig umständlich und zeitaufwendig ist, da der spezielle benötigte Dichtegradient erzeugt werden muß, und dci Vorgang muß für jede einzelne Trennung wiederholt werden. Es bleibt weiterhin die Schwierigkeit, daß, sobald die Spannungsquelle von den Elektroden entfernt wird, die elektrophoretisch^ Wanderung und damit die Konzentra tionsbildung der einzelnen Ampholytbcstandteilc unterbrochen wird, wogegen die Diffusion anhält und trachtet, die Ansammlungen wieder zu zerstreuen. Folglich muß die Säule so schnell wie möglich entleert werden, wogegen wiederum eine zu starke Strömung dabei dazu fuhren kann, daß sich die einzelnen Bestandteile wieder untereinander mischen.

Ziel der Erfindung ist es deshalb, eine verbesserte Vorrichtung fur isoelektrische Trennung von Ampholytcn zu schaffen, bei der die Trennung ohne Anwendung von Membranen, Zuckerlösungen od. dgl. durchgeführt werden kann, die ein starkes Trennungsvermögen hat und die getrennten Bestandteile in hoher Konzentration anfallen läßt, die auch für wirksame Trennung niedermolekularer Ampholyte brauchbar ist. indem sie in einer Weise gestaltet wird, daß die Diffusion verhindert wird, nachdem die Trennung durch Abschalten der Spannungsquelle beendet ist und die für Durchlaufbetrieb wie z. B. für vorbereitende Trennung großer Probenmengen oder für analytische Trennung unterschiedlicher Proben, die der Trennvorrichtung nacheinander zugeführt werden, verwendbar ist, was verglichen mit den bekannten Trennvorrichtungen, die jeweiis immer nur eine bestimmte Menge zu trennen vermögen, ein sehr wesentlicher Vorteil ist.

Ausgehend von einer Vorrichtung hierfür mit einem horizontalen, im wesentlichen kasten- oder trogförrnig gestalteten Behälter zur Aufnahme der Lösung einer aufzutrennenden Arnpholytmischung, welcher einen Boden, Endwände und Seitenwände mit elekirisch nichtleitenden Innenflächen und zwei elektrische Elektroden nahe den einander gegenüberliegenden Endwandcn aufweist, die an eine Gleichstromanschließbar sind, ist die Erfindung dadurch gekennzeichnet, daß am Boden eine Vielzahl undurchlässiger und elektrisch nichtleitender Querwände aufwärts stehend angebracht sind, die senkrecht zu den Scitcnwänden verlaufen, so daß die gesamte Länge des Behälters nahe am Boden in eine Vielzahl von Abteilungen aufgeteilt ist, die sich von einer Endwand bis zur anderen aneinanderreihen, wobei in jedem Abteil wenigstens eine gekühlte Fläehe vorhanden ist.

In einer derartigen Vorrichtung ist das System gegen thermische Konvektion dadurch stabilisiert, daß in jedem Abteil des Behälters ein Dichte-Gradient erzielt wird, wobei die größere Dichte im Abteil zuuntcrst vorhanden ist. Wie nachfolgend im einzelnen erläutert wird, wird dieser Dichte-Gradient zum Teil durch den Einfluß der Wärmediffusion in der aufgeheizten Lösung gegenüber der in jedem Abteil vorgesehenen Kühlfläche und zum Teil durch den Einfluß

•o der Schwerkraft erreicht, wodurch ein bestimmter Ampholytbestandteil, der in einem Abteil konzentriert wird, in den unteren Abschnitt dieses Abteils sinkt. Diese Erscheinung sorgt auch dafür, daß der bestimmte Ampholyt, der in einem Abteil konzen-

»5 triert enthalten ist, unter dem Einfluß der Schwerkraft oder der Diffusion nicht in ein benachbartes Abteil ausweichen kann. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann also auch für die Trennung sehr großer Mengen verwendet werden. Die Auflösungsfähigkeit der Vorrichtung kann durch Anordnung einer sehr großen Anzahl von Abteilen sehr hoch sein.

Die gekühlten Flächen in den einzelnen Abteilen am Boden des Behälters können aus Kühlröhren bestehen, die durch die Abteile hindurch verlaufen oder aus den Querwänden, die die Abteile trennen, selbst, in dem ein Kühlkanal für das Kühlmedium unmittelbar unterhalb des Bodens des Behälters verläuft, so daß der Boden gekühlt wird. Im letzten Fall ist der Behälterboden vorzugsweise mit Rippen versehen, die im gleichen Abstand verlaufen wie die Stege senkrecht zu den Seitenwänden im Behälter, so daß die aufwärts vorspringenden Rippen die Querwände und die Räume dazwischen die Abteile bilden. Mit einem solchen Boden wird eine besonders wirksame Kühlung

erreicht, insbesondere der nach oben vorspringenden Stege durch das unterhalb des Bodens im Kühlmiltclkanal strömende Kühlmittel.

Um den elektrischen Strom, der durch die Lösung hindurchtritt, zu zwingen, auch in den unteren Teil der Abteile einzutreten, so daß die gesamte ampholytische Masse an der isoelektrischcn Trennung teilnimmt, ist die Vorrichtung nach der Erfindung vorzugsweise mit einer Vielzahl zweiter undurchlässiger Querwände von der gleichen Zahl wie die Abteile ausgestattet, die ebenfalls quer zu den Seitenwänden des Behälters verlaufen und von oben in jedes der Abteile hineinragen, wobei ihre Unterkanten einen gewissen Abstand vom Behälterboden innerhalb jedes Abteils haben. Diese zusätzlichen Querwände crstrecken sich nach abwärts in die Abteile hinein und können auf der Unterseite eines Deckels des Behälters angebracht sein. Ist der Boden des Behälters mit Stegen versehen, wie dies voranstehend beschrieben ist, so kann die Unterseite eines derartigen Abschlußdck-

kcls in der gleichen Weise mit Stegen ausgestattet sein, so daß die abwärts vorstehenden Stege auf der Unterseite des Deckels die in die Abteile im Boden des Be halters hineinragenden Querwände bilden.

In solchem Fall kann auch der Deckel als Kühlkanal ausgebildet sein, so daß auch seine Querwände, die nach unten in die Abteile hineinragen, Kühlflächen darstellen.

Eine derartige Vorrichtung gemäß der Erfindung kann für portionsweise Behandlung oder auch für Durchlaufverfahren ausgelegt sein. Im letzteren Fall wird eine Seitenwand des Behälters mit einer Vielzahl von Eintrittsöffnungen für die kontinuierliche Zufuhr einer Lösung der ampholytiseh.cn Mischung, die getrennt werden soll, ausgestattet, während die gegenüberliegende Seitenwand des Behälters mit einer Anzahl von Auslaßöffnungen versehen ist, die der Abtcilezahl entspricht, wobei jedem Abteil für die Abgabe der aus der Ampholytmischung abgeschiedenen Ampholylbestandleile eine Öffnung zugeordnet ist. In diesem Fall ist die Breite des Behälters zwischen den beiden Seitenwänden und die Durchflußmenge der Ampholytlösimg durch den Behälter in der Weise aufeinander abgestimmt, daß vollständige Trennung der Ampholyte aus der zugenihrten Lösung erzielt ist, wenn diese die gegenüberliegende Ausflußseitenwand erreicht hat.

Aus der nun folgenden Beschreibung von in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbcispielen der Erfindung werden die Vorteile, Merkmale und Eigenschaften der Erfindung noch deutlicher offenbar. Es zeigt

Fig. 1 schematise!! eine Draufsicht auf ein erstes Ausführungsbeispiel der Trennvorrichtung nach der Erfindung,

Fin. 2 einen senkrechten Schnitt durch die Vorrichtung gemäß Fig. 1 nach der Linie Π-Π,

Fig. 3 einen Querschnitt durch dieselbe Vorrichtung nach der Linie III-III in Fig. 2,

Fig. 4 und 5 schematisch besondere Ausgestaltungen des Behälterbodens und der nach oben vorstehenden Querwände, die den Behälter in einzelne Abteile unterteilen,

Fig. 6 einen Längsschnitt durch ein zweites Ausführungsbeispiel der Trennvorrichtung nach der Erfindung parallel zu den Seilenwänden,

Fig" 7 einen Längsschnitt durch ein weiteres Ausführungsbeispiel einer erfiiidungsgcmäßen Vorrichtung,

Fig. 8 die Vorrichtung gemäß Fig. 7 in Ansicht von ohen,

Fig. 9 die Draufsicht auf eine Trennvorrichtung gemäß der Erfindung für Durchlaufbetrieb,

Fig. 10 einen Schnitt durch die Vorrichtung nach Fig. y gemäß der Linie X-X, und

Fig.W einen senkrechten Schnitt durch dieselbe Vorrichtung nach der Linie XI-XI in Fig. 9.

Die isoelektrischc Trennvorrichtung nach der Erfindung, die in den Fig. 1,2 und 3 dargestellt ist, weist einen rechteckigen, im wesentlichen kasten- oder irogförmigen Behälter auf, der insgesamt mil I bezeichnet ist und einen Boden 2. zwei Scitenwände 3, 4 und zwei Endwände 5, 6 hat. Der Behälter besteht aus einem elektrisch nichtleitenden Werkstoff oder hat zumindest elektrisch nichtleitende Innenflächen. Nahe den Endwänden 5 und f> sind in den Behälter zwei Elektroden 7 und 8 eingelagert. Bei Betrieb der Trennvorrichtung sind diese Elektroden mit den Polen einer Gleichstromquelle, die in der Zeichnung nicht dargestellt ist. verbunden. Der Boden 2 des Behälters ist mit einer Zahl aufwärts vorspringender, senkrechter Trennwände 9 auscestattet, die senkrecht zu den Seitenwänden 3 und 4 verlaufen und undurchlässig sind und aus einem elektrisch nichtleitenden Werkstoff bestehen oder wenigstens elektrisch nichtleitende Oberflächen haben. Diese Querwände 9 teilen den Behälter nah am Boden 2 in eine Anzahl Abteile 10 auf, die sich von der Elektrode 7 bis zur Elektrode 8 aneinanderreihen. In jedes dieser Abteile 10 ragt überdies von oben eine weitere Querwand 11 hinein, deren Unterkante vom Boden 2 des Behälters

ίο einen gewissen Abstand hat. Auch diese zusätzlichen Querwände 11 verlaufen senkrecht zu den Seitenwänden 3 und 4, und sie können an den Scitcnwänden 3 und 4 befestigt sein. Innerhalb jedes Abteils 10 befindet sich ein Kühlrohr 12, durch das ein Kühlmedium wie etwa gekühltes Wasser strömt, wenn die Vorrichtung in Betrieb ist. Die Höhe der Querwände 9, die die einzelnen Abteile voneinander trennen, kann z. B. 5 bis 10 ι.·'"·! sein, und innerhalb cities Behälters sind etwa 50 bis 100 derartige Abteile hintereinander an-

2" geordnet.

Im Betrieb wird in die Trennvorrichtung eine Lösungeiner ampholylischen Mischung, die aufgetrennt werden soll, eingefüllt, so daß der Flüssigkeitsspiegel 13 etwa die in der Fig. 3 angedeutete Höhe einnimmt.

Wie bereits vorstehend erwähnt, besteht die ampholytische Lösung vorzugsweise aus einer bekannten Mischung niedermolekularer Trägerampholytc, mit deren Hilfe ein gewünschter pH-Gradient in der Trennzelle erzeugt wird sowie eine Probe höhermolekularer Ampholyte, die getrennt werden sollen. 1st der Behälter mit der Ampholytlösimg gefüllt, so wird der Stromkreis an die zwei Elektroden 7 und 8 angeschlossen. Es wird dadurch in der Lösung zwischen den beiden Elektroden 7 und 8 ein elektrisches Feld erzeugt, und durch clektrophoretische Wanderung in diesem elektrischen Feld ordnen sich die Ampholyte in der Lösung selbst zwischen den Elektroden 7 und 8 in der voranstehend beschriebenen Weise an, so Weise daß der Ampholyt mit dem niedrigsten isoclekirischen Punkt - also der »sauerste« Arnpholyl - sich am nächsten bei der Elektrode 8 und der Ampholyt mit dem höchsten isoelektrischen Punkt - das ist also der am meisten basische Ampholyt - sich an der Kaihodc 7 ansammelt, während die übrigen Ampholyte

in der Folge, die durch ihre jeweiligen isoelckirischcn Punkte gegeben ist, dazwischen anordnen.

Die niedrigmolekularen Trägerampholytc haben eine starke Pufferaktivität und erzeugen deshalb einen stabilen pH-Gradienten zwischen den Elektroden 7 und 8. wobei der niedrigste pH-Wert nahe der Anode 8 vorzufinden ist. In diesem pH-Gradienten konzentrieren sich die verschiedenen hochmolekularen Ampholyte der Lösung an den Punkten, an denen der pH-Wert ihren isoclektrischen Punkten entspricht. Da der Diffusionsgrad der hochmolekularen Ampholyte wesentlich geringer ist als die Diffusion der niedermolekularen Tragcrampholyte, sind die hochmolekularen Ampholyte an ihren isoelcktrischcn pH-Punkten sehr dicht konzentriert.

Wie bereits früher dargelegt, kann diese isoelektrische Aufteilung durch thermische Konvektion in der Lösung stark gestört werden, wobei diese Konvektion durch das Erwärmen der Lösung infolge des hindurchfließcndcn Stroms hervorgerufen wird. Bei der Trennvorrichtung nach der Erfindung ist die Lösung gegenüber thermischer Konvektion in jedem Abteil 10 auf die Weise geschützt, daß in der Lösung eine thermische Diffusion erzeugt wird, und zwar auf die

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Kühlfläche zu, die im vorliegenden Fall durch die Kühlrohre 12 im Abieil gebildet wird. Es ist bekannt, daß, wenn eine heiße Lösung mit einer kalten Flache in Berührung ist, die gelösten Substanzen in der Lösung sich durch thermische Diffusion an der kalten Fläche ansammeln. In der Trennvorrichtung nach der Erfindung also werden die in einem Abteil enthaltenen Ampholyte durch thermische Diffusion an den Kühlflächen, die von den Kiihlrohren 12 gebildet weiden, gesammelt. Folglich wird die Lösung nahe der Kühlrohre noch konzentrierter und sinkt wegen ihrer höheren Dichte auf den Boden des Abteils ab, so daß dadurch in jedem Abteil ein Dichte-Gradient erzeugt wird, wobei der höhere Dichtewert sich unten im Abteil befindet. Ist der Temperaturunterschied zwischen der Lösung und der gekühlten Fläche groß und der Weg der gelösten Substanzen in der Lösung bis zur gekühlten Fläche kurz, so läßt sich dieser Vorgang verhältnismäßig schnell durchführen. Diese thermische Diffusion und der dadurch in jedem Abteil entstehende Dichte-Gradient wirken der thermischen Konvektion zwischen den einzelnen Abteilen wirksam entgegen. Zu gleicher Zeit wird natürlich auch die elektrophoretische Wanderung der Ampholyte zu ihren exakten Lagestellen in dem Trennbehälter zu ein;m gewissen Grad behindert. Ein Ampholyt jedoch, der von seiner endgültigen Lage in der Trcnnzelle zunächst weit entfernt ist, wird durch eine große elektrophoretische Kraft angetrieben, so daß er entgegen der thermischen Diffusion und dem wirkenden Dichte-Gradienten in jedem einzelnen Abteil in Richtung auf seine endgültige Stellung in der Trcnnzelle wandert. Ein Ampholyt, der seinen endgültigen Platz in der Trennzelle jedoch erreicht hat, ist durch die thermische Diffusion und den Dichte-Gradienten wirksam gegen die thermische Konvektion, welche ihn aus dem Abteil herausdrängen möchte, geschützt. Es ist noch zu erwähnen, daß die thermische Diffusion zu Beginn des Trennvorganges, wenn die durchschnittlichen Entfernungen der verschiedenen Ampholyte zu ihren endgültigen Lagepunkten in der Trennzelle noch groß sind, am größten ist. In diesem Zustand ist die Leitfähigkeit der Lösung groß und damit auch der Strom, der durch die Lösung fließt, so daß die Lösung dann auf eine höhere Temperatur erwärmt wird. Je mehr die verschiedenen Ampholyte sich ihren endgültigen Stellungen nähern, also ihren isoelektrischen pH-Werten, um so mehr nimmt die Leitfähigkeit der Lösung und damit die Größe des Stromes und also auch die Wärmezuiuhr ab.

Es ist jedoch noch ein zusätzlicher Mechanismus vorhanden, der den gewünschten stabilen Dichte-Gradienten in jedem Abteil 10 hervorruft. Ein Ampliolytbestandteil und insbesondere ein Ampholytbestandteil eines hochmolekularen Ampholyten, der in einem bestimmten Abteil konzentriert ist, hat die Tendenz, unter dem Einfluß der Schwerkralt auf den Boden des Behälters zu sinken, wodurch der Ampholytbestandtei! aus sich selbst den Dichte-Gradienten innerhalb des Abteils erzeugt. Dieser Dichte-Gradient wird ersichtlich noch mehr betont, je höher die Konzentration des Ampholylbcstandteils in dem Abteil ist. und er ist folglich am stärksten gegen Ende des Trennvorgangs ausgebildet. Dieser Dichte-Gradient verhindert wirksam, daß der Ampholytbestandteil,derim Abteil konzentriert enthalten ist. sich unter dem Einfluß thermischer Konvektion in die Nachbarabteile verteilt und so mit den übrigen, bereits in diesen Abteilen konzentrierten Ampholytbestandteilei sich vermischt. Es versteht sich auch, daß ein hoch konzentrierter Bestandteil in einem bestimmten Ab teil unter dem Einfluß der Schwerkraft nicht in da:

benachbarte Abteil hinüberfallen kann, sondern e sinkt im Gegenteil unter dem Einfluß der Schwerkraf in das ihm zugeordnete Abteil hinein. Aus diesen Grunde kann die erfindungsgemäße Vorrichtung mi viel Erfolg bei der Trennung sehr großer Mengen ver

ίο wendet werden. Der in den einzelnen Abteilen durcl Konzentration der Einzelbestandteile hervorgerufeni Dichte-Gradient wirkt also sehr stark der Dispersioi der einzelnen Bestandteile unter dem Einfluß dei thermischen Konvektion entgegen, und zwar auch wenn am Ende desTrennvoiganges der Strom zu der Elektroden 7 und 8 unterbrochen wird.

Aufgabe der Querwände 11, die von oben in die Abteile 10 hineinstellen, ist es vornehmlich, den elektrischen Strom zu zwingen, auch bis zum Boden eine:

jeden Abteils wirksam zu werden, so daß die gesamk ampholytisehe Masse in der Lösung an der isoelektrischcn Trennung teilnimmt.

Die Trennvorrichtung nach der Erfindung, wie sie in den Fig. 1 bis 3 gezeigt ist, ist hauptsächlich dafüi

ausersehen, die Trennung und Konzentration vor Ampholyten in vergleichsweise großen Flüssigkeits mengen durchzuführen, weswegen der Flüssigkcits spiegel 13 relativ hoch oberhalb der Ouerlrennwände 9 steht. Aus diesem Grunde kann es vorzuziehen sein, die verschiedenen Abteile IO voneinander zusätzlich dadurch zu trennen, daß die Querwände 9 nach oben durch feine Siebflächen oder halb durchlässige Membranen 14 verlängert werden. Wie allgemein dem Fachmann bekannt, helfen die halbdurchlässigen Querwände, die thermische Konvektion zu unterbinden wie auch die Diffusion zwischen den verschiedenen Abteilen 10. Wie jedoch auch bereit vorher erwähnt, wird durch die halbdurchlässig^; Querwände eine bestimmte Elektroosmose erzeugt.

weswegen sie aus diesem Grunde weniger vorteilhaft sind. Wird die Trennvorrichtung für geringere Men gen von Lösung verwendet, so daß der Flüssigkeit·· spiegel 13 nur wenig oberhalb der Oberkanten de: undurchlässigen Querwände 9 liegt, so können die

halbdurchlässigen Querwände 14 ohne Nachteil fort gelassen werden.

Bei Beendigung der Trennung müssen die Abteile 10 unmittelbar und so schnell wie möglich entleer! werden, um eine Rückmischung der getrennten Am-

pholytbestandteile, die in den einzelnen Abteiler. konzentriert enthalten sind, zu verhindern. Bei dem in den Fig. 1 bis 3 dargestellten Ausführiingsbeispiel wird dies mit Hilfe einer Leitung 15 vorgenommen die in jedes Abteil 10 eintaucht und kurz über dessen

Boden endet. Das andere Ende dieser Leitungen 15 ist mit einer Pumpeneinheit 16 verbunden, die eine Pumpe für jede Leitung 15 vorsieht. Vorzugsweise bestehen diese Pumpen aus handbetätigten oder motorgetriebenen perislaltischen Pumpen. Mit Hilfe der

Pumpen in der Pumpeneinheit 16 wird jedes in den einzelnen Abteilen 10 enthaltene Lösungsvolumen in ein entsprechendes Proberöhrehen, Reagenzglas od. dgl. ahnliches Gefäß 17 gepumpt, in denen "die verschiedenen Bestandteile der Ampholytmischung

dann gesammelt werden. Jedes Reagenzglas enthält dann einen Ampholythestandteil, der aus wenigstens einem niedermolekularen Trägerampholvtcn und möglicherweise einem hochmolekulnn-n Amnhnkt.-n

Il

aus der getrennten Probe enthüll. Die Mengenverhältnisse dcler auch die Mengen der einzelnen hochmolekularen Ampholyte in der Probe können dann einfach durch Analyse der Lösungen in den einzelnen Reagenzglasern 17 festgestellt werden. Besteht die zu untersuchende Probe beispielsweise aus einer Proleinmischung, so kann dies durch photonicItische Analyse mit Hilfe der Ultraviolclt-Absorblion der einzelnen Lösungsbestandteile in den verschiedenen Reagenzgläsern 17 vorgenommen werden. Außerdem ist es einfach, den pl-Wcrt jedes Bestandteils der getrennten Probe durch Bestimmung des pH-Wcrtesdcr Lösung im Reagenzglas 17 festgestellt werden, da jeder Bestandteil der Prolic, wie bereits an früherer Stelle ausgeführt, sich bei der Trennung im Behälter dort anordnet, wo im pH-Gradienten, der durch die I rägerampholylmischung hergestellt ist, sich der seinem pl-Werl entsprechende pH-Wert befindet.

Die hochmolekularen Ampholylbcslandtcile können von den niedermolekularen Trägerampholyten durch Dialyse oder Gclfiltcrung vollständig getrennt werden, falls weitere Analysen oder Untersuchungen mil den hochmolekularen Ampholythcstandteilen durchgeführt werden sollen. Weitere Verunreinigungen der aufgetrennten Ampholyte, wie z. B. eine Zukkerlösung, sind nicht vorhanden.

Fig. 4 zeigt schematisch und in senkrechtem Längsschnitt,dcrmil Fig. 2 vergleichbar ist, eine weitere sehr brauchbare Gestaltung des Bodens 2 des Behälters. Der Boden 2 ist gerippt, wobei sich diese Rippen senkrecht zu den Seilenwändcn des Behälters erstrecken; dabei bilden clic Furchen zwischen den Rippen die Abteile 10, und die nach oben vorstehenden Rippenkanlcn trennen die Abteile 10 voneinander und bilden undurchlässige Querwände entsprechend den Querwänden 9 in dem in den Fig. 1 bis 3 gezeigten Ausführungsbeispicl. Bei einem derart gerippten Boden 2 können die schräg verlaufenden Rippenllanken die kühlenden Flächen der Abteile »0 darstellen, indem cm Kuhlkanal, durch den ein Kühlmedium hindurchströmt, unmittelbar unterhalb des Bodens 2angebracht ist. Die Kühlrohre 2 im Behälter können dann fortgelassen werden, wodurch die I rcnnvorrichtung beträchtlich einfacher wird.

Fig. 5 zeigt in vergleichbarer Darstellung wie Fig. 4 ein weiteres Ausführungsbeispiei mit geripptem Behälterboden 2, das in derselben Weise arbeilet wie das in Fig. 4 gezeigte.

Fin gemäß Fig. 4 und 5 gestalteter Behälterboden hat gegenüber dem in den Fig. I bis 3 gezeigten Beispiel seine Vorteile darin, daß der elektrische Strom It.'ichlcr durch die gesamte ampliolylischc Masse gezwungen werden kann, so daß alle Ampholyte an der isoelektrischen Trennung teilnehmen. Bei der Ausführung gemäß Fig. 1 bis 3 besieht eine gewisse Gefahr, daß sich in den Kanten, die von den Querwänden 9 und dem Boden 2 gebildet werden, gewisse Ampholyte ansammeln und an der isoclcktrisehcn I rennung nicht teilnehmen.

In Fi g. <i ist ein senkrechter Längsschnitt durch einen Behälter nach einem zweiten Aiisfülirungsbeispiel der Lrfindung parallel zu den Scitcnwänden gezeigt, in welchem der Boden 2 des Behälters in der vorgeschriebenen Weise gerippt und mit einem Kühlkanal IX versehen ist. durch den ein Kühlmittel, z. B. kaltes Wasser, im Betrieb der Vorrichtung hindurchstromen kann, der Behälter ist außerdem mit einem insgesamt mit I*) bezeichneten Deckel abgedeckt, der gleichfalls über sieh einen Kühlkanal 20 hat, durch den im Betrieb der Vorrichtung ein Kühlmedium hiiulurchfließt Die Unterseite 21 des Deckels 19 ist in gleicher Weise gerippt wie der Boden 2 des Behälters, so daß die nacl unten vorstehenden Rippen der Dcckelunterseite 21 undurchlässige Querwände darstellen, die in die Abteile 10 in ähnlicher Weise hineinstellen wie die Querirennwändc II bei dem Ausführungsbeispiel nacl· Fig. I bis 3. Bei dem in Fig. 6 gezeigten Ausfüh-

«o ningsheispiel sind also die schräg stehenden Seitenflächen der Rippen sowohl des Behälterbodens 2 ah auch der Dcckcluiilcrf lache 21 Kühlflächen, die eine thermische Diffusion und damit einen stabilisierenden Dichtegradienten in jedem Abtei! lü hervorrufen Der Deckel 19 ist abnehmbar. Die Rippen im Boden 2 des Behälters und in der Unterfläche 21 des Deckels sowie der Zwischenraum zwischen dem Boden 2 und der Deekclunterflächc 21 sind so bemessen, daß, wenn die Abteile 10 im Boden 2 des Behälters vollständig

ao mit einer Lösung gefüllt sind, während der Deckel abgenommen ist, der Flüssigkeitsspiegel 13 sieh beim Aufsetzen des Deckels über die Oberkanten der Rippen im Boden 2 des Behälters erhebt und in die Zwischenräume zwischen den Rippen des Deckels hincinsteigt, eine Trennvorrichtung dieser Art kann 100 bis 200 Abteile bei einer Rippenbreite von etwa 5 bis 10 mm und einer Höhe des Flüssigkeilsspiegels 13 über dem Behälterboden von etwa 5 bis 10 mm während des Betriebes der Vorrichtung haben. Die Dicke der Flüssigkeitsschicht zwischen dem gerippten Boden 2 und der Unterseite 21 des Deckels 19 kann ungefähr 0,5 bis 3 mm betragen; sie ist in der Zeichnung aus Gründen der Deutlichkeit übertrieben stark dargestellt.

Die isoclektrischc Trennung der Ampholyte in der Ampholytlösung, die in clic Vorrichtung eingefüllt ist, erfolgt in derselben Weise wie im Zusammenhang mit den Fig. 1 bis 3 beschrieben, wobei die Stabilisierung gegen thermische Konvektion durch den Dichlcgra-

4*: dienten erfolgt, der in jedem Abteil teils durch thermische Diffusion und teils durch die konzentrierten Ampholylbestandteile selbst erfolgt. Am linde des Trennvorganges werden die Elektroden 7 und K vom Stromkreis getrennt und zugleich der Deckel 19 abgehoben. Wie sich aus voranstellender Beschreibung ergib!, sinkt dann der Flüssigkeitsspiegel 13 bis auf die Rippenoberkanten der Bodeiirippcn ab. Auf diese Weise wird verhindert, daß sich die in den einzelnen Aliteilen 10 enthaltenen Ampholytbestandleile wieder rückmischen, sie es durch Diffusion oder thermische Konvektion, und die Entnahme der Ampholytbestandleile aus den einzelnen Abteilen 10 kann ohne Hast erfolgen, wobei in beliebiger Reihenfolge ein Bestandteil nach dem anderen entnommen und seine Menge iuu\ sein pl-Werl in der vorbeschriebenen Weise bestimmt werden kann. Da nach Beendigung iles Trennvorganges keine Diffusion mehr stattfinden kann, kann diese Trennvorrichtung nach der Erfindung vorzugsweise fiir die Auftrennung niedermolckularer Ampholyte verwendet werden, z. B. zur Er zcugung von Trägernmpholytmi'vhungen mit be stimmten pll-Bereichen.

Vor Beginn des Trenner«' .p.j'ls. wenn die Abteile 10 des gerippten Bodens 2 iicieiis mit einei nicht aufgeteilten Ampholyllösun,: gelullt sind, kann das Abteil 10, das der Kathode 7 unmittelbar benachbart liegt, vorzugsweise mit einer schwachen basischen Flüssigkeit und das Abteil 10 unmittelbar neben der

Anode 8 mit einer schwachen Säure statt einer Ampholytlösung gefüllt werden. Auf die Weise wird verhindert, daß während des Trennvorganges die Ampholyte die Elektroden berühren, wodurch gewisse Arten von Ampholyten möglicherweise verlegt werden. Der Deckel 19 ist überdies mit Entlüftungsöffnungen 21 in der Nähe der zwei Elektroden 7 und 8 ausgestaltet, so daß an den Elektroden während des Trennvorganges entstehende Gase abziehen können.

Die Fig. 7 und 8 zeigen ein weiteres Ausführungsbeispiel der Erfindung, das ein hohes Auflösungsvermögen hat und vorzugsweise für schnelle Anaiysen-'rennung kleiner Proteinproben bestimmt ist. Wie bei den vorherigen Beispielen ist der Boden 2 mit vertikal vorspringenden Querwänden oder Stegen 9 ausgestattet, welche den Behälter nahe am Boden 2 in eine Vielzahl von Abteilen 10 unterteilen. Der Boden 2 des Behälters ist mit Hilfe eines Kühlkanals, der sich unmittelbar unterhalb des Bodens 2 befindet, gekühlt. Der Einfachheit halber ist der Kühlkanal in der F i g. 7 nicht gezeigt. Bei diesem Ausführungsbeispiel ist der Kühlkanal vorzugsweise so beschaffen, daß er vom Boden 2 des Behälters nach Beendigung des Trennvorganges abgenommen werden kann. Auch bei diesem Ausführungsbeispiel ist ein Deckel 19 vorgesehen, der jedoch eine ebene Unterseite hat, so daß der Raum zwischen dem Boden 2 des Behälters und dem Deckel 19 vollständig mit der zu trennenden Ampholytlösung gefüllt werden kann. Der Deckel 19 braucht nicht abnehmbar zu sein, sondern kann ständig auf dem Behälter aufliegen. Der Abstand zwischen der Unterseite des Deckels 19 und dem Behälterboden 2 beträgt etwa 1 mm, und die Querwände oder Stege 9 haben ungefähr eine Höhe von 0,5 mm und einen gegenseitigen Abstand von 1 mm. Wegen dieser sehr kleinen Abmessungen sind auch keine nach unten vorstehenden Querwände, die in die Behälter 10 hineinragen, um den elektrischen Strom in den Abteilen in Richtung auf den Behälterboden zu lenken, vonnötcn. Die Zahl der Abteile kann sehr groß sein, z. B. 200, so daß das entsprechend hohe Auflösungsvermögen beim Trennvorgang erzielt wird. Die Breite der Trennvorrichtung senkrecht zu den Seitenwänden 3 und 4 beträgt etwa 0,5 bis 1,5 cm, so daß die Vorrichtung für die Untersuchung sehr kleiner Probemengen geeignet ist.

Der Boden 2 und der Deckel 19 des Behälters sind aus einem Werkstoff hergestellt, z. B. Quarzglas, der für ultraviolettes Licht durchlässig ist. Außerdem ist die Trennvorrichtung mit einer automatischen Meßeinrichtung für Ultraviolcttabsorption versehen, die eine Ultraviolettlichtquclle 22 oberhalb des Deckels 19 aufweist, welche einen Strahl ultravioletten Lichtes auf den Deckel 19 und auf eine Photozelle 22 sendet, die unterhalb des Bodens 2, der Lichtquelle 22 gegenüber, angeordnet ist. Die Lichtquelle 22 und die Photozelle 23 sind auf einer Trägervorrichtung 24 befestigt, die auf einer Führungsbahn 25 verschiebbar ist, welche parallel zu den Seitenwänden 3 und 4 der Trennzelle verläuft. Bei dem dargestellten Ausfiihrungsbeispiel bestellt die Führungsbahn aus einer Zahnstange, in tier ein niotorgetriebcnes Zahnrad der Trägervoirichtung 24 läuft. Nach beendetem Trennvorgang kann die Photometereinheit 22, 23, 24 auf der Führungsbahn 25 die Trenn/eile entlanggefahren werden, wobei dann die von ler Photozelk¹ 23 ausgehenden Signale von einer Aufzeichnungsanordnung, die in der Zeichnung nicht wiedergegeben ist, als Funktion des von der Photometereinheit zurückgelegten Weges aufgezeichnet werden. Die mit der Ph;>tozelle 23 verbundene Aufzeichnungsanordnung stellt dann ein Diagramm her, das die Mengen und die !ag,. -

mußige Anordnung der verschiedenen Beständige der ifttrennten Proteinprobe ist.

Es ist verständlich, daß der Trennvorgang um! die Analyse sehr schnell durchgeführt werden könn·.·;·,. Jenn das Trennen ist wegen der kleinen Abmessungen

ίο der Trennvorrichtung sehr schnell durchgeführt, und die Analyse der verschiedenen Bestandteile kan;> ebenfalls sehr schnell durchgeführt werden, ohne a:\ii deshalb die einzelnen Bestandteile aus der TrenruetL· herausgenommen werden müssen. Weiterhin is«, es nicht erforderlich, dabei den Strom zu den Eleküoden 7 und 8 zu beenden, bevor die Photometermossuiiii durchgeführt wird, weshalb nicht befürchtet /u werden braucht, daß sich die einzelnen Ampholyihesfandrdle, die sich an verschiedenen Punkten der Trennzelle angesammelt haben, durch Diffusion wieder verteilen und rückmischen, bevor die phometrische Messung durchgeführt ist. Dieses Ausführungsbeispiel imn der Erfindung ermöglicht es jedoch nicht, gleichzeitig die pl-Werte der einzelnen aufge-

tcilteirprotcinbestandteile zu messen. Wird jedoch eine bekannte Ampholytträgermischung verwendet und ist der pH-Gradient, der durch diese Ampholytträgermischung in der Trennzelle vorhanden ist, vorher exakt bestimmt worden, so kann der pl-Wert der ein/einen ProteinL-estandteile ziemlich genau aus der Lage in der Trennzelle abgelesen werden.

Sämtliche vorteilend beschriebenen Vorrichtungen nach der Erfindung können nur für portionsweise Behandlung von Proben verwendet werden. Es ist je-

doch auch möglich, eine Trennvorrichtung nach der Erfindung zu schaffen, bei der die Behandlung im Durchlauf erfolgt. Fig. 9, 10 und 11 zeigen eine derartige Vorrichtung schematisch. Fig. 9 ist eine Ansicht dieser Vorrichtung von oben, von der der Deckel aus Gründen der Deutlichkeil abgenommen ist, wogegen Fig. 10 und 11 senkrechte Schnitte durch die Vorrichtung gemäß Linien X-X und XI-XI der Fig. 9 sind. Die Trennzelle ist zur Hauptsache so aufgebaut wie diejenige in Fig. 6, d. h. der Boden 20des Trennbehälters ist gleichförmig gerippt und von einem Kühlkanal 18 beaufschlagt, und der Deckel 19 hat entsprechende Rippen auf seiner Unterfläche 21 und ebenfalls einen Kühlkanal 20. Bei dem dargestellten Ausführungsbeispiel sind die Rippen des Behälterboso de ns 2 und der Unterfläche 21 des Deckels etwa so ausgebildet, wie sie in der Fig. 5 gezeigt sind; sie können jedoch auch die in Fig. 6 gezeigte Gestalt haben. Es ist auch möglich, für die Trennzelle einen Boden 2 zu verwenden, wie ihn die F i g. 7 zeigt, und dazu einen Deckel mit ebener Unterfläche. Bei einem solchen Ausführungsbeispiel braucht der Deckel 19 während des Durchlaufbetriebes der Vorrichtung nicht abgenommen zu werden, und der gesamte Hohlraum zwischen dem Boden 2 der Trcnnzcllc und der Unterfläehe 21 lies Deckels ist mit der Lösung gefüllt, wie dies nachfolgend noch beschrieben wird. Der Deckel t«) kann also an der Trennzelle dauerhaft befestigt sein. Wie aus der Fig. K) am einfachsten ersichtlich ist, enden die Kühlkanüle 18 und 20 für den Boden

t>5 bzw. den Deekel mit gewissem Abstand von der Seilenwand 4 der Trennzelle. Die Abschnitte der Trenn-/eile, die aus den Külilkanälen 18 und 20 hervorstehen, können aus einem für Ultravioleltlicht durchlas-

sigem Werkstoff bestehen. Es sei hier erwähnt, daß aus Gründen der Deutlichkeit in der Zeichnung wesentlich weniger Rippen und damit Abteile in der Trennzelle gezeichnet sind, als in Wirklichkeit vorhanden sind. Die Vorrichtung kann etwa 100 bis 200 verschiedene Abteile und einen Größtabstand zwischen Boden 2 und l'nterflüche 21 des Deckels von etwa 2 mm haben.

Für die kontinuierliche Zufuhr der Ampholytlösung zur Trennzelle ist die Seitenwand 3 mit einer Anzahl Einlaßöffnungen für die Ampholytlösung versehen. Eine dieser Einlaßöffnungen ist durch eine Leitung 26 mit einem Behälter 27 verbunden, in dem die zu trennende Probe enthalten ist, während die übrigen Einlaßöffnungen durch Rohrleitungen 28 mit einem Behälter 29 für die Trägerampholytlösung verbunden sind. Nahe der Endwand 5 weist die Seitenwand 3 eine weitere Einlaßöffnung auf, die durch ein Rohr30mit einem Behälter 31 für eine basische Flüssigkeit, z.B. We Natriumhydroxyd (NaOH) verbunden ist. Am gegenüberliegenden Ende nahe der Endwand 6 ist eine ähnliche Einlaßöffnung vorgesehen, die über eine Leitung 32 mit einem Behälter 33 für eine Säure, z. B. 1Tige Phosphorsäure (HjPO₄), verbunden ist. Wie die Fig. 9 und 11 zeigen, ist der Abschnitt nahe der Kathode 7 von dem übrigen Teil der Trennzelle durch eine Querwand 34, bestehend aus einer halbdurchlässigen Membran, abgeteilt. In derselben Weise ist die Trennzelle im Bereich der Anode 8 von dem übrigen Teil durch eine halbdurchlässige Membran 35 abgeteilt. Zweck dieser halbdurchlässigen Trennwände 34 und 35 ist es, zu verhindern, daß das an den Elektroden 7 und 8 sich bildende Gas mit den Ampholyten derTrennzclle in Berührung kommt. Die Ampholyte sind so auch daran gehindert, direkt mit den Elektroden 7 und 8 in Berührung zu kommen, was durch Zufuhr einer basischen Lösung in den Kathodenraum aus dem Behälter Sl durch die Leitung30 und durch Zufuhr einer Säure in den Anodenraum durch die Leitung 32 aus dem Behälter 33 bewirkt wird. Die gegenüberliegende Seitenwand der Trennzclle ist mit einer Anzahl Austrittsöffnungen 36 (siehe Fig. 11) gleich der Zahl der Abteile der Zelle selbst ausgestattet, wobei die Austrittsöffnungen mittig zu den Abteilen angeordnet sind. Außerdem sind Alistrittsöffnungen 37 und 38, den Anoden bzw. Kaihodcnräumen zugeordnet, vorgesehen. Diese Austrittsöffnungcn sind durch Leitungen 39 mit einer Pumpeneinheit 40, die für jede Leitung 39 eine getrennte Pumpe aufweist, verbunden. Vorzugsweise ist die Pumpeneinheit 40 mit M motorgetriebenen peristaltischen Viclkanalpumpen ausgestattet. Mit Hilfe dieser Pumpen werden Bestandteile der Amphoiytlösung, die im Bereich der Seitenwand 4 in den einzelnen Abteilen enthalten sind, einzelnen Reagenzgläsern oder ähnlichen Sammelbehältern 41 zugeführt. Die basische Flüssigkeit und die Säure aus dem Kathoden- bzw. Anodenraum werden durch zugeordnete Pumpen in tier Pumpeneinheit 40 in eigene Ablaufbehallci gepumpt, die in der Zeichnung nicht wiedergegeben sind.

Die Pumpen der Piimpeneinheil 40 werden ununterbrochen angetrieben, so daß ein kontinuierlicher Strom einer Ampholytlösnng durch die Trennzelle von der Seilenwand 3 in Richtung auf die Seitenwand 4 aufrechterhalten wird, das ist senkrecht /tu Richtung des elektrischen Stroms zwischen den Elektroden 7 und 8. I¹OlJiIiCh tritt Trennung der Ampholytlösung, die der Trennzelle an der Seitenwand 3 zugeführt wird, auf, solange die Lösung in Richtung auf die Seitenwand 4 der Zelle strömt. Die Pumpgeschwindigkeit und die Breite der Trennzelle zwischen

den beiden Seitenwänden 3 und 4 sind so aufeinander eingestellt, daß die Verweilzeit der Lösung in der Trennzelle wenigstens so groß ist wie erforderlich, um eine vollständige Trennung der Ampholyte, die in der Lösung enthalten sind, zu erreichen. Infolgedessen

ίο werden in den einzelnen Reagenzgläsern 41 die verschiedenen Bestandteile einer unbekannten Ampholytmischung, die der Vorrichtung eingegeben wird, erhalten zusammen mit den Bestandteilen der Trägerampholytmischung, die zu dem Verfahren verwendet

wurde. Solange dieselbe Trägerampholytmischung verwendet wird, sind die pH-Werte in den einzelnen Reagenzgläsern 41 immer dieselben, so daß sie nur einmal bestimmt und dann nur in größeren Zeitabständen überprüft zu werden brauchen. Die Mengen

und die örtliche Lage der verschiedenen Bestandteile der aufgeteilten Probe können in derselben Weise bestimmt werden, wie dies in Zusammenhang mit F i g. 7 bereits dargestellt ist, nämlich mit Hilfe eines Ultraviolett-Absorptions-Photometers, der eine Ultraviolettlichtquelle 42 aufweist, die entlang einer Führungsbahn 43 oberhalb des für ultraviolettes Licht durchlässigen Abschnittes der Trennzelle nahe der Ausgangsseite 4 verfahrbar ist, und einer Photozelle 44, die der Lichtquelle 42 gegenüber synchron mit dieser entlang einer Führungsbahn 45 unterhalb der Trennzelle bewegt wird.

Die kontinuierlich arbeitende Trennvorrichtung nach der Erfindung, die voranstehend beschrieben ist, kann entweder für vorbereitende Trennung großer Proben oder für eine analytische Trennung einer großen Anzahl verschiedener Proben, die der Vorrichtung eine nach der anderen zugeführt werden, verwendet werden. Für eine Vortrennung großer Mengen einer bestimmten Ampholytmischung braucht kein zu großes Auflösungsvermögen vorhanden zu sein, weswegen dann die Trennzelle mit einer geringeren Anzahl von Abteilen, die für eine große Durchflußmenge bestimmt sind, ausgestattet sein, so daß die innerhalb einer bestimmten Zeit der Behandlung unterwerf bare Flüssigkeitsmenge groß ist. Es ist auch die Ultraviolett-Absorptions-Pholomctervorrichtung dann nicht erforderlich, denn ohne große Schwierigkeit kann die Menge und der isoelekuische Punkt der einzelnen Bestandteile der Probe durch Analyse der Bestandteile in den Vorlagen 41 auf gewöhnliche Weise festgestellt werden. Auch der besondere Behälter 27 des dargestellten Ausführungsbeispiels kann entfallen, denn ohne Schwierigkeit kann die Probe im Trägerampholyten im Behälter 29 beigemischt und der Zelle zusammen mit den Trägerampholyten zugeführt werden.

Bei Verwendung der Vorrichtung für die analytische Trennung einer großen Anzahl verschiedener Proben wird jedoch der Ultraviolett-Absorptions-Photometer wie er beschrieben ist und der besondere Behälter 27 für die Proben benötigt. Die Arbeitsweise der Vorrichtung ist dann die, daß die Trägerampholytlösung aus dem Behälter 29 kontinuierlich der Trenn/eile zugeführt wird, während die verschiedenen Ampholytproben, z. B. Proteinproben, die analysiert werden sollen, in bestimmten Zeitintervallen dem Behälter 27 eingegeben werden, so daß sie in bestimmter Folge und zu bestimmten Augenblicken der Trenn-

zelle zufließen. Die Photometereinrichiung 42, 44 wird synchron mit der Zugabe neuer Proben in den Behälter 27 betätigt, so daß jede Probe durch die Photometereinrichtung in dem Augenblick aufgenomir."n wird, in dem sie die Ausgangsseite 4 der Trennzelle in aufgetrenntem Zustand erreicht. In jedem Augenblick kann also die Trennzelle verschiedene Proben enthalten, die hintereinander in Flußrichtung durch die Zelle hindurchströmen und einen verschiedenen Aufieilungsgrad erreicht haben. Da die pl-Werte der i verschiedenen Vorlagen 41 und alr.o auch der vcr-

schiedenen Ausgangsröhrchen 39 konstant bleiben, solange dieselbe Trägerarnpholytlosung verwende, wird und folglich dies nur innerhalb größerer Zeuabstände Überp7üft werden muß, und da das Zufuhren von Proben ohne besondere Schwierigkeiten automatisiert und mit dem Aufnahmevorgang der Photonic^ tereinrichtun» und der Pumpene.nheit 40, die d.e Durchflußmenge bestimmt, synchronisiert weraen kann ist eine Vorrichtung gesehaffen, mit deren Hui, eine «roße Anzahl verschiedener Proben voll automa tisch^etrennt und analysiert werden kann.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (1)

1. Patentansprüche:

   1. Vorrichtung zur isoelektrischen Trennung von ampholytischen Mischungen mit einem im wesentlichen rechteckigen, waagerechten und im wesentlichen kasten- oder trogförmigen Behälter zur Aufnahme einer aufzuspaltenden Ampholytmischung, der einen Boden, zwei gegenüberliegende Endwände und zwei sich gegenüberliegende Seitenwände mit elektrisch nichtleitenden Innenflächen aufweist, und zwei in dem Behälter nahe an den beiden Endwänden eingesetzten, im Betriebszustand der Vorrichtung an eine Gleichstromquelle anschließbaren Elektroden, d adurch gekennzeichnet, daß der Boden mit einer Vielzahl undurchlässiger, vom Boden nach oben vorspringender und senkrecht zu den Seitenwänden verlaufender Querwände (9) ausgestattet ist, die den Raum innerhalb des Behälters nahe a° dem Boden in eine Vielzahl von hintereinander zwischen den Endwänden (5, 6) liegenden Fächer (10) unterteilen, in jeder von denen wenigstens eine gekühlte Fläche vorgesehen ist.

   2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch ge- ^a5 kennzeichnet, daß die gekühlten Flächen in den Fächern (10) aus durch die Fächer verlaufenden, von einem Kühlmittelstrom durchgeflossenen Rohrleitungen (12) bestehen.

   3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die gekühlten Flächen der Fächer (10) durch die vom Boden (2) des Behälters

   (1) nach oben vorspringenden Querwände (9) gebildetsind, und daß unmittelbar unterhalb des Bodens ein von einem Kühlmittelstrom durchgeflossener Kühlmantel (18) vorgesehen ist.

   4. Vorrichtung nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß für jedes Fach (10) eine zweite, undurchlässige, senkrecht zu den Seitenwänden (3,4) verlaufende Querwand (H) vorgesehen ist, die von oben abwärts in das Fach (10) hineinragt und mit Abstand oberhalb des Bodens

   (2) des Behälters (1) endet.

   5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis

   4, dadurch gekennzeichnet, daß die ersten, undurchlässigen vom Boden (2) des Behälters (1) nach oben vorspringenden Querwände (9) durch durchlässige Membranen (1.4) nach oben verlängert sind.

   6. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Boden (2) des Behälters gleichförmig gewellt ist mit den Wellenkämmen und den dazwischenliegenden Wellentälern senkrecht zu den Seitenwänden (3 und 4) verlaufend, wobei die Wellenkämme die erwähnten, ersten, undurchlässigen, vom Boden nach oben vorspringenden Querwände bilden und die Wellentäler die Fächer (10) darstellen.

   7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis

   6, gekennzeichnet durch eine Abdeckung (19) des Behälters mit einer elektrisch nichtleitenden Unterfläche.

   8. Vorrichtung nach dun Ansprüchen 4 und 7. dadurch gekennzeichnet, daß die zweiten, von oben abwärts in die Fächer (10) hineinragenden Querwände (11) an der Unterflächc der Abdckkimg (19) vorgesellen sind.

   9. Vorrichtung nach den Ansprüchen 6 und 8,

   dadurch gekennzeichnet, daß die Unterfläche (21) der Abdeckung (19) in entsprechender Weise wie der Behälterboden (2) gleichförmig gewellt ist, mn den Wellenkämmen senkrecht zu den Seitenwänden verlaufend, wobei die nach unten weisenden Wellenkämme auf der Unterfläche der Abdekkung die zweiten, undurchlässigen, von oben .abwärts in die Fächer (10) hineinragenden Querwände darstellen.

   10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Abdekkung (19) mit einem Kühlmantel (20) für den Durchfluß eines Kühlmediums ausgestattet ist.

   11 Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Abdeckung (19) vom Behälter abnehmbar ist.

   12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, gekennzeichnet durch zwei halbdurchlässige, senkrecht zu den Seitenwänden (3 und 4) innerhalb des Behälters nahe den Endwänden (5 und 6) verlaufende Querwände (34, 35), die die Elektrodenräume des Behälters vom Hauptteil des Behälters abtrennen.

   15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Boden (2) und die Abdeckung (19) aus einem für ultraviolettes Licht durchlässigen Werkstoff bestehen und daß eine Absorptionsmeßeinrichtung vorgesehen ist mit einer Ultraviolettstrahlungsquelle (22 oder 42), die auf der einen Seite des Behälters einen Ultraviolettlichtstrahl senkrecht auf den Behälter richtet, und einer Photozelle (23 oder 44), die der Lichtquelle gegenüber auf der anderen Seite des Behälters angeordnet ist, wobei Lichtquelle und Photozelle gegenüber dem Behälter parallel zu seinen Seitenwänden (3, 4) verschiebbar sind.

   14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, gekennzeichnet durch eine Mehrzahl mit Pumpen verbundener Rohrleitungen (15), die in je eines der Fächer (10) nahe dem Boden (2) des Behälters münden.

   15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß in eine der Seitenwände (3) eine Zahl von Einlaßöffnungen zur Zuführung einer Lösung aus einer aufzutrennenden Ampholytmischung vorgesehen sind und die gegenüberliegende Seitenwand (4) mit einer Zahl von Auslaßöffnungen (36) entsprechend der Zahl der Fächer (10) ausgestattet ist, aus denen die Bestandteile der aufgetrennten Ampholytlösung, die in den Fächern enthalten sind, abgegeben werden.

   16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Auslaßöffnungen (36) durch getrennte Rohrleitungen (39) mit Pumpen (40) verbunden sind.

   17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens eine der Einlaßöffnungen über eine Rohrleitung (26) mit einem ersten Behälter (27) verbunden ist, der zur Aufnahme einer unbekannten aufzutrennenden Ampholytmisehung dient, und die übrigen Einlaßöffnungen über Rohrleitungen (28) mit einem zweiten Behälter (29) verbunden sind, der eine Lösung einer bekannten Ampholytmischung enthält.