CN110639365B - 一种用于混合蛋白分离的具有支持介质的制备型垂直流电泳系统 - Google Patents

一种用于混合蛋白分离的具有支持介质的制备型垂直流电泳系统 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物化工技术领域，提供了一种用于混合蛋白分离的具有支持介质的制备型垂直流电泳系统，包括制备型垂直电泳装置、样品进样系统、背景缓冲液进样系统、电极缓冲液循环系统、冷却循环系统以及样品收集系统。利用该装置通过实验探索确定合适的电源电压、背景缓冲液流量和浓度、样品缓冲液流量等参数后，能实现模拟的混合蛋白分离。本发明的制备性保证了能在短时间内连续处理大批量的样品，同时具有较好的回收率和分辨率，通过控制分离条件可以在保留待分离样品理化性质条件下满足不同的制备需求。

Description

一种用于混合蛋白分离的具有支持介质的制备型垂直流电泳 系统
技术领域
本发明属于生物化工技术领域，具体涉及一种用于混合蛋白分离的具有支持介质的制备型垂直流电泳系统。
背景技术
蛋白质在生物体内含量丰富、种类繁多且功能强大，在细胞和生物体的生命活动中(起着重要的作用，蛋白质组的研究的对象往往是诸如血清、植物提取液发酵产物、体内免疫产物等，在对其进行应用研究过程中，需要提取出较纯的蛋白质有机物，这就涉及到蛋白质的分离提纯，分离提纯过程不仅需要大规模处理高度复杂的混合体系，而且更需要制备出一系列具有生物活性且纯度较高的物质，在降低样本复杂度的同时，尽可能保留样本珍贵而又稀少的生物信息，但往往由于其自身稳定性较差，不易于分析。传统的分离制备方法中常用的是沉淀、透析、液相色谱以及凝胶电泳等，这些方法虽各有优势，但在实际样本处理过程中仍存在很多问题。相较于常规的蛋白纯化技术，电泳分离由于其高分辨率在生物产品分离中广泛应用，特别是在产品的分析检测中发挥了重要作用。
电泳过程就是利用电场的作用，因待分离样品中各种分子(可以是大分子蛋白质，细胞，细胞器，病毒粒子，或是分子量较小的氨基酸、核苷等)带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯。1809年俄国的物理学家Reuss首先发现了电泳现象，20世纪初，电泳技术开始发展，早期的电泳常采用滤纸及醋酸纤维膜为支持介质，后来逐渐出现凝胶形式的支持介质以及无支持介质的毛细管电泳和自由流电泳，但是上述各种电泳多为不连续或者微型化，常常由于连续处理样品量较少限制了技术应用的规模化，具备较高上样量的连续型制备型电泳可以更好的满足现今分离纯化手段在批量化生产过程中的需求，进而更广泛应用于复杂生物样本的前处理过程。
基于上述问题，提出了一种具有支持介质的垂直流制备型电泳分离装置，该装置可以用于混合蛋白的分离纯化，在短时间内连续处理大批量的样品，同时具有较好的回收率和分辨率，通过控制分离条件可以在保证待分离样品理化性质条件下满足不同的制备需求。
发明内容
本发明内容在于更新现有技术，提供一种新型的具有支持介质的制备型垂直流电泳装置，该装置在应用于混合蛋白的的分离过程中，能保证分离结果在较好分辨率和回收率的条件下，克服目前电泳在分离纯化过程中上样量较少的问题，易于操作，实用性强。
本发明的技术方案：
一种用于混合蛋白分离的具有支持介质的制备型垂直流电泳系统，包括制备型垂直电泳装置、样品进样系统、背景缓冲液进样系统、电极缓冲液循环系统、冷却循环系统以及样品收集系统；
所述的制备型垂直电泳装置包括分离室1、离子交换膜2、电极室3、支持介质4、进样口6、出水口7、挡板8和冷却循环进水室22；两冷却循环进水室22平行、间隔固定在支架间，二者底部设置有下密封板，共同围成的空间即为分离室1，三者形成“三明治夹心”结构，“三明治夹心”结构顶部设置有上密封板；上密封板上设置有与分离室1位置对应的进样口6，下密封板上设置有与分离室1位置对应的出水口7；下密封板上还固定有多个挡板8，挡板8与出水口7间隔布置；所述的电极室3分为阴极室和阳极室，分别固定在两支架外表面，其位置与分离室1对应，确保分离室1与电极室3相通，相通处设置有离子交换膜2；离子交换膜2分为阴离子交换膜和阳离子交换膜，对应设置在阴极室和阳极室与分离室1之间，允许H和OH离子通过，阻止其他电解产物(废物离子和气泡)进入分离室1，目的是为了维持分离室分离过程不受多余电解产物和气泡影响稳定，保证了分离室1的稳定性；离子交换膜2两侧分别垫有垫片，保证系统的整体性，不漏液；电极室3中配有钌铱合金的电极板5；支持介质4装填在分离室1；
所述的样品进样系统包括单通道蠕动泵11、枪头12和样品溶液储液瓶18，样品溶液储液瓶18中的样品溶液通过单通道蠕动泵11，利用枪头12过进样口6向分离室1中注入样品溶液，枪头12的作用主要是为了实现蠕动泵输样管和装置进样口之间的过渡，精准将样品溶液注入填料，有效避免了样品泵入后在不同进液口之间的混合；
所述的背景缓冲液进样系统包括四通道蠕动泵13和背景缓冲液储液瓶19，背景缓冲液储液瓶19中的背景缓冲液通过四通道蠕动泵13，利用枪头12过进样口6向分离室1中注入背景缓冲液，枪头12作用同上，四通道的背景缓冲液确保分离室1中pH稳定；
所述的电极缓冲液循环系统包括双通道蠕动泵14和储液瓶15，储液瓶15分为阳极缓冲液储液瓶和阴极缓冲液储液瓶；双通道蠕动泵14将阳极缓冲液储液瓶和阴极缓冲液储液瓶分别从阴极室和阳极室底部的电极缓冲液进液孔24向电极室3中泵入缓冲液，溢流后缓冲液再从阴极室和阳极室顶部的电极缓冲液溢流孔25回到阳极缓冲液储液瓶和阴极缓冲液储液瓶，不定时测试储液瓶15内缓冲液的pH，偏离初始值较大时及时更换；
所述的冷却循环系统包括磁力搅拌泵9和冷凝水槽10，磁力搅拌泵9将冷凝水槽10中的冰水混合物分为两路分别从两冷却循环进水室22底部入口进入，换热后从两冷却循环进水室22顶部出口循环至冷凝水槽10中；
所述的样品收集系统包括简易流量控制器16和收集管17，简易流量控制器16连接在出水口7处，其出口端连接有收集管17，实现样品的收集；
所述的稳压稳流电源20用于给系统提供电源。
本发明的有益效果：利用该装置在进行混合蛋白的分离纯化过程中，可以保证理想分辨率和回收率的条件下，实现较大的进样量；背景缓冲液可以稳定分离室内的pH，温和的反应条件较好的保证待分离样品的生物活性。本发明提出的具有支持介质的制备型垂直电泳装置可以在保证长时间连续进样的条件下稳定运行；与传统的垂直凝胶电泳相比，可以大大降低停留时间；操作简单，实用性强：利用重力和电场力作用实现分离，对装置密封性要求较低。
附图说明
图1为本发明所阐述的具有支持介质的制备型垂直电泳系统示意图。
图2为本发明所提出的制备型垂直电泳装置本体及局部拆分示意图。
图中：1分离室；2离子交换膜；3电极室；4支持介质(惰性石英砂)；5钌铱合金的电极板；6进样口；7出水口；8挡板；9磁力循环泵；10冷凝水槽；11单通道蠕动泵；12枪头；13四通道蠕动泵；14双通道蠕动泵；15电极缓冲液储液瓶；16简易流量控制器；17收集管；18样品溶液储液瓶；19背景缓冲液储液瓶；20稳压稳流电源；21冷凝水进水管；22冷却循环进水室；23法兰孔；24电极缓冲液进液孔；25电极缓冲液溢流孔。
具体实施方式
以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。
组装垂直流电泳装置，其具体结构见附图2，支持介质用背景缓冲液浸泡1-2小时，湿法装填，静置1小时使填料充分沉降。搭建具有支持介质的垂直流电泳系统，详细组合方式如附图1，该电泳系统可用于混合蛋白的分离。电泳反应体系受多种因素影响，如：电压、电流、焦耳热、电渗流、缓冲液浓度等，控制合理的反应条件，使分离效果达到最佳，是案例实施的前提。
实施实例1具有支持介质的垂直流电泳系统进出口对应性实验考察
进出口对应性考察体系对样品在反应器内运行的线性稳定性，具体过程如下：以未溶解样品的溴酚蓝(BPB)溶液作为样品，开启冷凝系统，设定背景缓冲溶液流量为0.183mL/min，开启背景缓冲液进液泵，无样品进样稳定1h，设置进样流量0.04mL/min，开启样品进样泵，进样1h后可以看到样品大部分从进样口下正对应的出水口流出，无较大偏移，实验结果表明，装置的线性流出效果较好。
实施实例2具有支持介质的垂直流电泳系统电压电流线性实验和装置运行稳定性实验
开启冷凝水循环系统，开启背景缓冲液，设置背景流量为0.183mL/min，通过实验确定50V到175V的电压浮动范围，电压太低分离效果不明显，电压升高(200V运行10min，体系温度就略有上升)造成焦耳热控制不理想，电压-电流线性曲线会出现一定程度的正偏移，电压继续升高(约350V)，电压-电流线性实验出现一定程度的负偏移，负偏移的出现是因为电解副产物的产生。
选择区间范围内50V、75V、100V、125V、150V、175V作为考察点，从50V开始，每个电压点运行30min，每隔10min记录一次对应电压下的电流值及离子交换膜内侧的电压值，平均电流值用来绘制电压-电流线性曲线，以评价体系焦耳热变化；离子交换膜内侧的电压值用来绘制电压利用率曲线，以评价电源电压利用率。结果证明在50～175V内，电压-电流线性效果良好，30min内电流基本无变化，表明在选定电压范围内，焦耳热没有对体系产生影响，装置可以长时间稳定的运行；电源电压利用率基本维持在70％～75％，表明体系的能量利用率较高。
改变背景流量分别为0.163mL/min、0.175mL/min、0.191mL/min、0.200mL/min，同上过程考察了电压-电流的线性效果和电源电压利用率，发现背景流量对运行结果基本无影响；选择0.183mL/min作为背景流量，改变背景缓冲液浓度为0.5x40mM、0.75x40mM、1.25x40mM、1.5x40mM，电极缓冲液浓度为背景浓度的2倍，同样条件考察了电压-电流线性效果和电源利用率，体系较稳定，线性效果和电源电压利用率较理想，变化条件对结果影响不大。
实施实例3混合蛋白在具有支持介质的制备型垂直流电泳中的分离。进样口选择为从负极数第三个，进样口选择是综合了装置本身和填料等的影响，发现选择该口进样更好的协调了BSA和Cyt C在体系中的运动距离。混合蛋白为人工配置的牛血清白蛋白(BSA)和细胞色素(Cyt C)混合溶液，再利用该装置进行混合蛋白分离过程中，针对混合蛋白分离过程，引入两个条带的分辨率Rs作为参数来评价分离效果，其定义为：两个条带中间位置迁移距离之差与两个条带带宽之和一半的比值，即：
Rs＝(2×(d1-d2))/(W1+W2)，
其中，d1和d2表示样品1和样品2迁移后的中心位置，W1和W2表示样品1和样品2的带宽。
优选的最佳电源电压为100V。
优选的最佳背景流量为0.183mL/min。
优选的最佳背景浓度为0.5x40mM。
优选的最佳样品流量为0.04mL/min。
混合蛋白分离的具体步骤如下：
(1)配置40mM的pH为8.5左右的Tris-乙酸为电极缓冲液和背景缓冲液，其中背景缓冲液为电极缓冲液稀释一倍得到。
(2)称取0.050mg的溴酚蓝(BPB)溶解在10mL背景缓冲液，配置浓度为0.050mg/mL的BPB，继续加入10.000mg BSA充分混合均匀，之后加入16.00mg/mL的Cyt C，配制成浓度为2.000mg/mL的BSA和1.600mg/mLCyt C混合蛋白液，该混合液的总蛋白浓度为3.600mg/mL。在混合蛋白液中加入BPB，是因为一方面BPB可以在电泳过程中起指示剂作用；另一方面，BPB可以和BSA以一种特殊的结合方式结合在一起使BSA呈蓝色。
(3)通过蠕动泵将混合蛋白样品引入装置分离室，设置电源电压为100V，电极缓冲液的浓度约为80mM，电极液循环流量为5mL/min，背景浓度为40mM，背景缓冲液流量为0.183mL/min，进样流量为0.04mL/min，因为BSA等电点为4.7，Cyt C等电点为10，在缓冲溶液pH下，BSA带负电，向正极移动；Cyt C带正电，向负极移动，每隔10min记录一次混合蛋白的分离状态，约70min，在靠近正极的出水口收集到BSA，在靠近负极的出水口收集到Cyt C。在电泳过程中，BSA的蓝色条带和Cyt C的红色条带使整个分离过程可视化。
本发明提出一种用于混合蛋白分离的制备型垂直流电泳技术，以上应用实例主要是对装置本身部分性能以及其在蛋白分离过程展开，混合蛋白的电泳制备分离纯化过程解决了现今大规模处理高度复杂的混合体系的需求，温和可控的实验条件可以制备出一系列具有生物活性的物质，在降低样本复杂度的同时，尽可能保留样本珍贵而又稀少的生物信息。另外，需要说明的是该装置不仅仅可用于蛋白质的分离纯化过程，而且可以广泛的适用于不同质荷比物质的分离纯化，不论是大分子或者是小分子，有机物或者是无机物，诸如多糖、氨基酸、染料、细胞等。另外该装置通过设计条件，还可以实现不同形式的电泳过程，如等电聚焦，区带电泳等。

Claims (1)

1.一种用于混合蛋白分离的具有支持介质的制备型垂直流电泳系统，其特征在于，该制备型垂直流电泳系统包括制备型垂直电泳装置、样品进样系统、背景缓冲液进样系统、电极缓冲液循环系统、冷却循环系统以及样品收集系统；
所述的制备型垂直电泳装置包括分离室(1)、离子交换膜(2)、电极室(3)、支持介质(4)、进样口(6)、出水口(7)、挡板(8)和冷却循环进水室(22)；两冷却循环进水室(22)平行、间隔固定在支架间，二者底部设置有下密封板，共同围成的空间即为分离室(1)，三者形成“三明治夹心”结构，“三明治夹心”结构顶部设置有上密封板；上密封板上设置有与分离室(1)位置对应的进样口(6)，下密封板上设置有与分离室(1)位置对应的出水口(7)；下密封板上还固定有多个挡板(8)，挡板(8)与出水口(7)间隔布置；所述的电极室(3)分为阴极室和阳极室，分别固定在两支架外表面，其位置与分离室(1)对应，确保分离室(1)与电极室(3)相通，相通处设置有离子交换膜(2)；离子交换膜(2)分为阴离子交换膜和阳离子交换膜，对应设置在阴极室和阳极室与分离室1之间，允许H和OH离子通过，阻止其他电解产物进入分离室(1)，保证了分离室(1)的稳定性；离子交换膜(2)两侧分别垫有垫片，保证系统的整体性，不漏液；电极室(3)中配有钌铱合金的电极板(5)；支持介质(4)装填在分离室(1)中，支持介质(4)为惰性石英砂；
所述的样品进样系统包括单通道蠕动泵(11)、枪头(12)和样品溶液储液瓶(18)，样品溶液储液瓶(18)中的样品溶液通过单通道蠕动泵(11)，利用枪头(12)过进样口(6)向分离室(1)中注入样品溶液；
所述的背景缓冲液进样系统包括四通道蠕动泵(13)和背景缓冲液储液瓶(19)，背景缓冲液储液瓶(19)中的背景缓冲液通过四通道蠕动泵(13)，利用枪头(12)过进样口(6)向分离室(1)中注入背景缓冲液，四通道的背景缓冲液确保分离室(1)中pH稳定；
所述的电极缓冲液循环系统包括双通道蠕动泵(14)和储液瓶(15)，储液瓶(15)分为阳极缓冲液储液瓶和阴极缓冲液储液瓶；双通道蠕动泵(14)将阳极缓冲液储液瓶和阴极缓冲液储液瓶分别从阴极室和阳极室底部的电极缓冲液进液孔(24)向电极室(3)中泵入缓冲液，溢流后缓冲液再从阴极室和阳极室顶部的电极缓冲液溢流孔(25)回到阳极缓冲液储液瓶和阴极缓冲液储液瓶，不定时测试储液瓶(15)内缓冲液的pH，偏离初始值较大时及时更换；
所述的冷却循环系统包括磁力搅拌泵(9)和冷凝水槽(10)，磁力搅拌泵(9)将冷凝水槽(10)中的冰水混合物分为两路分别从两冷却循环进水室(22)底部入口进入，换热后从两冷却循环进水室(22)顶部出口循环至冷凝水槽(10)中；
所述的样品收集系统包括简易流量控制器(16)和收集管(17)，简易流量控制器(16)连接在出水口(7)处，其出口端连接有收集管(17)，实现样品的收集；
稳压稳流电源(20)用于给系统提供电源。
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