CN101011643A - 由膜分隔的多个特异性亚室构成的连续自由流电泳设备 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种由膜分隔的多个特异性亚室构成的连续自由流电泳设备，包括电泳主分离室、主分离室两侧部的阳、阴电极室和杂蛋白室，其特征在于：所述杂蛋白室与设于杂蛋白室外用于控制跨膜液流的闭式缓冲液循环管路的进、出管相连通，所述闭式缓冲液循环管路上的密闭储液容器与缓冲液更新机构相连通，所述缓冲液更新机构包括一端伸入所述密闭储液容器的进、出液管、具有补液和排液功能的双动泵、盛液容器和新鲜缓冲液容器，所述进、出液管的另一端分别与双动泵补液室的出液阀和排液室的进液阀相连通，所述新鲜缓冲液容器和盛液容器分别与双动泵补液室的进液阀和排液室的出液阀相连通，本发明可根据蛋白质的等电点和分子量两种参数进行分离纯化。
Description
技术领域：
本发明涉及一种分离蛋白类生物活性物质的连续自由流电泳设备。
背景技术：
连续自由流电泳是一种可以连续进样、连续收集产品的制备规模的电泳方式，目前用于分离蛋白质的连续自由流电泳主要包括自由流区带电泳和自由流等电聚焦。
自由流区带电泳是将含蛋白质的料液从与电场垂直的方向连续加入分离室的一端，样品中迁移率不同的蛋白质在电场的作用下既获得平行于电场方向的不同的迁移速度，又在连续输入的液流推动下获得垂直于电场方向的相同的移动速度，于是迁移率不同的蛋白质将以不同的方向在分离室中移动，最终被设置于分离室另一端的收集管阵列中不同的收集管连续收集。
自由流等电聚焦的液流及收集方式与自由流区带电泳相同，所区别的是蛋白质平行于电场方向的迁移方式是基于不同等电点的蛋白质最终都会聚焦于由载体两性电解质构成的pH梯度中的pH值等于该蛋白等电点的位置。
连续自由流电泳从发明到现在已经数十年了，在此期间，学者们做了许多创新性的工作，大部分工作是研究如何使分离室中的各区带保持清晰，研究方向大致分为两类：
一是设法在一个分离室中分离不同的蛋白质，相应的技术见于美国专利3616453，1971年；美国专利4309268，1982年；美国专利4394246，1983年；美国专利4465582，1984年；美国专利5277774，1994年等。
近两年已进入中国市场的自由流电泳仪就属于该类，它能够在一个分离室中分离出96种组分。但是，若用该类型仪器进行自由流区带电泳，因只能在分离室的某一处点状加样，处理量仍显太小；进行自由流等电聚焦，因需要使用载体两性电解质，导致制备成本高昂；再加上此类仪器对分离室内液体的流动状态要求非常高，导致设备的价格极其昂贵。因此它们多用于蛋白质组学研究之前的蛋白质初级分组，实际上并没有应用在某个生物活性物质的工业化或半工业化制备。
另有一些学者致力于用膜将电泳室隔成多个亚室，以此抑制区带间的扩散。其中诶金(Egen)在1992年的美国专利5173164和1994年的美国专利5336387中介绍了一种由膜分隔的多室电泳仪，其分离室为十余个0.1～0.4cm厚的由硅胶薄片构成的亚室排列而成，备有冷却管，亚室间由可透过蛋白质的尼绒膜隔开，各亚室靠左右两排插捎准确地装配在一起，这些硅胶薄片既构成各亚室的前后壁，又作为防止液体溢漏的垫圈。该电泳仪使用多通道精密蠕动泵精确控制各亚室的输入、输出液量。由于分离室被众多相互平行的膜隔成小区间，从而抑制了蛋白质在亚室间的对流混合与浓差扩散。该仪器可以进行区带电泳、等电聚焦电泳、等速电泳、移动界面电泳以及诶金(Egen)所发明的逆流聚焦电泳。但是，多通道精密蠕动泵是一种价格昂贵的设备。同时由硅胶薄片构成的亚室虽然易于密封，但当各亚室间相互锁紧时，缺乏刚性物体支撑的硅胶由于硬度与弹性的不均一，难以避免地产生不均匀形变(特别是多次使用后)，以致分离室的前后壁不容易成为平面，出现凹入和凸起，从而影响了电场在溶液中的均匀分布。
格里兹呐(Gritzner)在1976年的美国专利3989613与1977年的美国专利4043895中介绍了一种“连续平衡流固定界面电泳仪”，该仪器类似于板框式电渗析器(框内不设隔网)，由两个板框构成一个组件，组件间设置蛋白质不通透但离子可通透的膜(如：透析膜)，一个或多个组件叠成电泳的分离室，组件内由可透过蛋白质的微孔膜(如：滤纸)将两板框分隔成A室与B室。调节溶液的pH值，由A室进样，通过等电点电泳的方法，将目标蛋白泳入B室或留在A室。该发明只是一种二元分离法，只能将混合蛋白质依等电点的不同分成两组组分。同时由于组件内与组件间的膜面积大，通电后常常发生膜的变形，干扰膜两侧液流状态。其分离室的高度较小，液体的流程不足，液体需要在分离室中来回循环才能将其中的蛋白质分离。而且，由于该方法非常忌讳A、B两室间的液体跨膜净流动，因此格里兹呐(Gritzner)使用蠕动泵控制各室液体的输出速度，使之等于输入速度，或用平衡池内液面高度所产生的压差来对抗A、B两室的跨膜液流。但该发明只考虑压差导致的跨膜液流，忽略了跨膜电渗流，而且利用平衡池内液面的高度来抑制A、B两室间的跨膜液流是不够完善的。此外，普通的蠕动泵无法精确控制液流量，其液流量除受泵头转速及硅胶管内径的控制外，还受到硅胶管在泵头上被压紧的程度、硅胶管多次使用后变形的程度、硅胶管的弹性等多种不确定因素的明显影响，所以，“用蠕动泵控制液体的输出速度，使之等于输入速度”是很难做到的，即使一时调节好了，该效果也是不稳定的。
发明内容：
鉴于现有的由膜分隔的自由流电泳技术存在着跨膜液流控制不好或控制成本太高、只能按物质的迁移率或等电点进行分离的不足，本发明提供一种能有效控制跨膜液流和在同一过程中能同时按照等电点和分子量进行蛋白质分离的由膜分隔的多个特异性亚室构成的连续自由流电泳设备。
本发明可通过以下技术方案来实现：
本发明包括设置于中部的电泳主分离室、设置于主分离室两侧部的阳、阴电极室和设置于主分离室与阳极室或阴极室之间的杂蛋白室，所述主分离室设有物料进口和排料口，所述主分离室与杂蛋白室之间、杂蛋白室与阴极室或阳极室之间以及主分离室与阳极室或阴极室之间设有滤膜，其特征在于：所述杂蛋白室与设于杂蛋白室外用于控制跨膜液流的闭式缓冲液循环管路的进、出管相连通，所述闭式缓冲液循环管路上的密闭储液容器与缓冲液更新机构相连通，所述缓冲液更新机构包括一端伸入所述密闭储液容器的进、出液管、具有补液和排液功能的双动泵、盛液容器和新鲜缓冲液容器，所述进、出液管的另一端分别与双动泵补液室的出液阀和排液室的进液阀相连通，所述新鲜缓冲液容器和盛液容器分别与双动泵补液室的进液阀和排液室的出液阀相连通。
本发明通过使用闭式缓冲液循环管路与缓冲液更新机构解决了诶金(Egen)使用多通道精密蠕动泵成本太高的问题，并克服了所有的自由流电泳只能根据蛋白质的迁移率或等电点一种参数进行分离纯化的局限性。
本发明可同时根据蛋白质的等电点和分子量两种参数进行分离纯化。
附图说明：
图1为本发明实施例一的构造原理图
图2为本发明实施例二的构造原理图
图3为本发明滤膜、密封圈与电泳设备部件的压紧前的构造示意图
图4为本发明滤膜、密封圈与电泳设备部件的压紧后的构造示意图
具体实施方式：
本发明的电泳设备包含一些独立的含相应电泳室的部件，各电泳室所属的部件可以根据分离不同蛋白质的需要以不同方式组合使用。
本发明可以包含两级电泳设备，一级进行等电点电泳，二级进行等电点电泳与电超滤的综合，两级电泳可以序贯使用或单独使用。
两级电泳的阴、阳两电极室与其它室间的膜都是截留分子量500～1000的透析膜，此类膜孔半径小于1nm，不但液流阻力大，而且，能产生电渗的扩散层几乎不存在，跨膜液流极弱。
本发明的实施例一只包含一级电泳设备，该一级电泳设备包括设置于中部的电泳主分离室1、设置于主分离室两侧部的阳、阴两电极室2、3和设置于主分离室与阳极室或阴极室之间的杂蛋白室4，所述主分离室设有物料进口22和排料口20，所述主分离室与杂蛋白室之间、杂蛋白室与阴极室或阳极室之间以及主分离室与阳极室或阴极室之间设有滤膜，其特征在于：所述杂蛋白室4与设于杂蛋白室外用于控制跨膜液流的闭式缓冲液循环管路的进、出管7、8相连通，所述闭式缓冲液循环管路上的密闭储液容器5与缓冲液更新机构相连通，所述缓冲液更新机构包括一端伸入所述密闭储液容器的进、出液管9、10、具有补液和排液功能的双动泵11、盛液容器12和新鲜缓冲液容器13，所述进、出液管9、10的另一端分别与双动泵补液室18的出液阀15和排液室19的进液阀14相连通，所述新鲜缓冲液容器和盛液容器分别与双动泵补液室的进液阀16和排液室的出液阀17相连通。所述主分离室1与杂蛋白室4之间所设的滤膜为微孔滤膜，阴极室或阳极室与其它室之间设的膜为截留分子量500-1000的超滤膜或透析膜。该级电泳可通过调节缓冲液的pH，使目标蛋白留在主分离室，而将带电性质与目标蛋白不同的杂蛋白通过等电点电泳分离到一侧或两侧的杂蛋白室。
本发明实施例二比实施例一增加了二级电泳设备，其中的二级电泳设备与一级电泳设备区别在于：杂蛋白室只位于主分离室的一侧，并在主分离室和杂蛋白室之间还设有副分离室。所述杂蛋白室与副分离室都含有设于相应室之外的与一级电泳设于杂蛋白室之外的的闭式缓冲液循环管路及缓冲液更新机构相同的系统，它们在循环相应室的缓冲液、带出其中的高浓度的蛋白质的同时，还分别具有消除杂蛋白室与副分离室间、副分离室与主分离室间跨膜液流的作用。该级电泳可通过调节缓冲液的pH并且在主分离室与副分离室之间设置一定截留分子量的超滤膜，将大分子以及虽然分子量小，但是不带电或与目标蛋白带相反电荷的杂蛋白截留在主分离室，而随目标蛋白到达副分离室的分子量明显小于目标蛋白、带电性质与目标蛋白相同的杂蛋白，继续通过在副分离室与杂蛋白室间设置适当截留分子量的超滤膜，被分离入杂蛋白室。最后在副分离室得到目标蛋白，从而实现了蛋白质的等电点和分子量两种方式的分离纯化。
其结构特征在于所述主分离室和杂蛋白室之间设有副分离室21，所述副分离室21与设于副分离室外用于控制跨膜液流的另一套闭式缓冲液循环管路的进、出管701、801相连通，所述闭式缓冲液循环管路上的密闭储液容器501与另一套缓冲液更新机构相连通，所述缓冲液更新机构包括一端伸入所述密闭储液容器501的进、出液管901、1001、具有补液和排液功能的双动泵1101、目标蛋白质盛装容器1201和新鲜缓冲液容器1301，所述进、出液管901、1001的另一端分别与双动泵1101补液室1801的出液阀1501和排液室1901的进液阀1401相连通，所述新鲜缓冲液容器1301和目标蛋白质盛装容器1201分别与双动泵1101补液室1801的进液阀1601和排液室1901的出液阀1701相连通；主分离室与阳极室或阴极室之间、杂蛋白室与阴极室或阳极室之间所设的膜为用于截留分子量500-1000的超滤膜或透析膜，主分离室与副分离室之间设有截留分子量易于通过目标蛋白的超滤膜，副分离室与杂蛋白室之间设有截留分子量不允许通过目标蛋白的超滤膜。
由于本发明跨膜液流控制方法的特殊性，要求各室间的膜的形变应尽量接近于零，这不但要求各电泳室的厚度较小、电泳室间的接缝较小，以使滤膜较窄，而且还需要密封时，密封圈应该尽量紧靠在所在电泳室的边缘，使滤膜未受支撑的部分少，才可减小滤膜的松弛度，减轻滤膜在电渗压的作用下向一侧膨出的幅度；同时只有密封圈紧靠在所在电泳室的边缘，才可尽量减小滤膜的无效面积(超出相应室边缘部分的面积)，减小滤膜在压差作用下的滤过量。但若对密封圈在两室之间被压紧而形变后的形状未准确把握，可能出现密封圈向电泳室内形变凸出，部分甚至完全将电场挡住。可以采用以下结构来解决上述矛盾：本发明位于两相邻室之间的滤膜25侧部设有设置于电泳设备部件23边缘定位槽道26内的密封圈24，所述定位槽道26具有与密封圈中部凹陷配合定位的凸嵴27。
当各室间相互锁紧时，密封圈在压力的方向上被压缩，而在与之垂直的方向上将发生膨胀，总体积保持不变，密封槽的深度决定了密封圈在压力的方向上被压缩的程度，又决定了密封圈向垂直于压力的方向上膨胀出的程度，通过上述合理的结构和尺寸设计不但可以保证密封的完善，而且可以保证密封圈形变后的边缘位置恰好与所在室的边缘平齐。为了保证装配时，各亚室能准确吻合，在各亚室的吻合面刻有保证相互准确契合的结构。
本发明的缓冲液更新机构构造还可以为由上述双动泵补液室18的出液阀15、进液阀16和补液室内腔构成的三通阀M，所述三通阀M的固定通端与补液室内腔连通，所述三通阀M另两个活动端分别与新鲜缓冲液容器13和密闭储液容器5相连通；所述双动泵排液室19的进液阀14、出液阀17和排液室内腔构成三通阀N，所述三通阀N的固定通端与补液室内腔连通，所述三通阀N另两个活动端分别与盛液容器12和密闭储液容器5相连通。
本发明在各亚室的两侧部部件内设置有冷却室29，以利各亚室的冷却；阳极室产生的酸与阴极室产生的碱在分别与阴、阳两电极室连通的容器中相互中和，并再循环输送回两电极室中，从而保证了两电极室内稳定的pH值。
本发明实施例一的工作过程：将缓冲液的pH调节到目标蛋白质的等电点，若只在主分离室一侧设置杂蛋白室，则缓冲液的pH可偏离目标蛋白质的等电点，使目标蛋白带上与被清除的杂蛋白相反的电荷，使物料通过进口22进入主分离室内，在电场的作用下，目标蛋白留在主分离室内，并从排料口20排出，带电性质与目标蛋白不同的杂蛋白往两侧移动，若在主分离室两侧都设有杂蛋白室，则往两侧移动的杂蛋白都穿过微孔滤膜进入其中，并通过闭式缓冲液循环管路循环入密闭储液容器5内，后由缓冲液更新机构将在密闭储液容器5内的含高浓度杂蛋白的液体等压、等量替换成新鲜缓冲液。若只在主分离室一侧设有杂蛋白室，则只能清除往该侧移动的杂蛋白，往另一侧移动的杂蛋白会被透析膜截留在主分离室，并与目标蛋白一起从排料口20排出，但它们中的大部分可在第二级电泳时被清除。
本发明实施例二的工作过程与实施例一区别在于，在主分离室和杂蛋白室之间增设了副分离室，且目标蛋白质是迁移到副分离室内；副分离室通过闭式缓冲液循环管路和缓冲液更新机构将目标蛋白质获取且盛装在目标蛋白质盛装容器1201内，并保证了副分离室内的压力平衡，从而控制了跨膜液流的产生。该级电泳应调节缓冲液的pH使偏离目标蛋白等电点0.5pH单位左右，让目标蛋白带上能往副分离室方向迁移的电荷，并在主分离室与副分离室之间设置易于透过目标蛋白的超滤膜，在副分离室与杂蛋白室间设置能截留目标蛋白的超滤膜，将大分子以及虽然分子量小，但是不带电或与目标蛋白带相反电荷的杂蛋白留在主分离室，而随目标蛋白到达副分离室的分子量明显小于目标蛋白、带电性质与目标蛋白相同的杂蛋白，被继续迁移入杂蛋白室，最后在副分离室得到目标蛋白，从而实现了蛋白质的等电点和分子量两种方式的分离纯化。
虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，但并非用以限定本创作，任何熟悉此技艺者，在不脱离本创作之精神和范围内所作之各种更动与润饰，亦属本创作之范围。
Claims (6)
1.一种由膜分隔的多个特异性亚室构成的连续自由流电泳设备，包括设置于中部的电泳主分离室(1)、设置于主分离室两侧部的阳、阴电极室(2、3)和设置于主分离室与阳极室或阴极室之间的杂蛋白室(4)，所述主分离室设有物料进口(22)和排料口(20)，所述主分离室与杂蛋白室之间、杂蛋白室与阴极室或阳极室之间以及主分离室与阳极室或阴极室之间设有滤膜，其特征在于：所述杂蛋白室(4)与设于杂蛋白室外用于控制跨膜液流的闭式缓冲液循环管路的进、出管(7、8)相连通，所述闭式缓冲液循环管路上的密闭储液容器(5)与缓冲液更新机构相连通，所述缓冲液更新机构包括一端伸入所述密闭储液容器(5)的进、出液管(9、10)、具有补液和排液功能的双动泵(11)、盛液容器(12)和新鲜缓冲液容器(13)，所述进、出液管(9、10)的另一端分别与双动泵补液室(18)的出液阀(15)和排液室(19)的进液阀(14)相连通，所述新鲜缓冲液容器(13)和盛液容器(12)分别与双动泵补液室(18)的进液阀(16)和排液室(19)的出液阀(17)相连通。
2、根据权利要求1所述的由膜分隔的多个特异性亚室构成的连续自由流电泳设备，其特征在于：所述主分离室和杂蛋白室之间还设有副分离室(21)，所述副分离室(21)与设于副分离室外用于控制跨膜液流的另一套闭式缓冲液循环管路的进、出管(701、801)相连通，所述闭式缓冲液循环管路上的密闭储液容器(501)与另一套缓冲液更新机构相连通，所述缓冲液更新机构包括一端伸入所述密闭储液容器(501)的进、出液管(901、1001)、具有补液和排液功能的双动泵(1101)、目标蛋白质盛装容器(1201)和新鲜缓冲液容器(1301)，所述进、出液管(901、1001)的另一端分别与双动泵(1101)补液室(1801)的出液阀(1501)和排液室(1901)的进液阀(1401)相连通，所述新鲜缓冲液容器(1301)和目标蛋白质盛装容器(1201)分别与双动泵(1101)补液室(1801)的进液阀(1601)和排液室(1901)的出液阀(1701)相连通。
3、根据权利要求1所述的由膜分隔的多个特异性亚室构成的连续自由流电泳设备，其特征在于：所述主分离室(1)与杂蛋白室(4)之间所设的滤膜为微孔滤膜，主分离室与阳极室或阴极室之间、杂蛋白室与阴极室或阳极室之间所设的膜为截留分子量500～1000的超滤膜或透析膜。
4、根据权利要求2所述的由膜分隔的多个特异性亚室构成的连续自由流电泳设备，其特征在于：主分离室与阳极室或阴极室之间、杂蛋白室与阴极室或阳极室之间所设的膜为截留分子量500～1000的超滤膜或透析膜，主分离室与副分离室之间设有截留分子量易于通过目标蛋白的超滤膜，副分离室与杂蛋白室之间设有截留分子量不允许通过目标蛋白的超滤膜。
5、根据权利要求1、2、3或4所述的由膜分隔的多个特异性亚室构成的连续自由流电泳设备，其特征在于：位于两相邻室之间的滤膜(25)侧部设有设置于电泳设备机体(23)边缘定位槽道(26)内的密封圈(24)，所述定位槽道(26)具有与密封圈中部凹陷配合定位的凸嵴(27)。
6、根据权利要求1所述的由膜分隔的多个特异性亚室构成的连续自由流电泳设备，其特征在于：所述双动泵补液室(18)的出液阀(15)、进液阀(16)和补液室内腔构成三通阀M，所述三通阀M的固定通端与补液室内腔连通，所述三通阀M另两个活动端分别与新鲜缓冲液容器(13)和密闭储液容器(5)相连通，所述双动泵排液室(19)的进液阀(14)、出液阀(17)和排液室内腔构成三通阀N，所述三通阀N的固定通端与补液室内腔连通，所述三通阀N另两个活动端分别与盛液容器(12)和密闭储液容器(5)相连通。
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