DE1913411C3 - MembcanzeUe zur Elektrophorese von Substanzgemischen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung in Form einer Membranzelle zur kontinuierlichen Trennung, Reinigung oder Anreicherung von hochmolekular oder kolloidal gelöste.', oder in suspendierter Form in Pufferlösungen enthaltenen Subr'anzgemischen, die elektrisch geladene Teilchen bilden, durch Elektrophorese und Sedimentation in senkrecht angeordneten Zellen mit halbdurchlässigen Membranen. Diese Membranzcllen werden mit den zu trennenden Substanzen und einer Pufferlösung gefüllt. Die Membranzelle befindet sich in einem mit der gleichen Pufferlösung gefüllten Gefäß mit seitlich angebrachten Elektroden und .Stromzuleitungen, die das zur Elektrophorese notwendige, angenähert homogene elektrische Feld herstellen.

Die präparative Trennung oder Anreicherung von Substanzgemischen wird im folgenden an Hand der Fig. 1 bis 3 geschildert. Die Fig.4 und 5 zeigen die erfindungsgemäße Vorrichtung im Betriebszustand. F i g. 6 stellt verschiedene Elektrophoresestreifen dar.

Ein Proteingemisch soll als Beispiel für ein hochmolekular oder kolloidal gelöstes Substanzgemisch dienen.

Diese im folgenden beschriebene, diskontinuierlich durchführbare Methode Methode wurde von K i r k wood (J. Am. ehem. Soc. 71 [1949]) entwickelt. Das Proteingemisch wird mit einer Pufferlösung zusammengegeben, deren pH-Wert so eingestellt wurde, daß nur ein Proteinbestandteil in dieser Lösung elektrisch neutral bleibt, während alle anderen Proteine eine mehr oder weniger große, meist negative (selten eine positive) elektrische Ladung annehmen. Bringt man eine derartige Lösung in ein elektrisches Feld, so wandern die elektrisch geladenen Proteine in diesem Feld (Fig. I). Befindet sich nun vor der Elektrode, zu der die geladenen Proteine wandern, einen Membran, die nur für die Pufferionen, nicht aber für die Proteine durchlässig ist, so reichern sich die herangeführten und geladenen Proteine an dieser halbdurchlässigen Membran an. Infolgedessen steigt die Dichte der Lösung vor der Membran und dieser mit den geladenen Proteinen angereicherte Lösungsteil sinkt in den unteren Teil der Zelle ab. Im oberen Teil bleibt die an elektrisch geladenen Proteinen verarmte Lösung übrig.

Eine kontinuierliche, elektrophoretische Trennung, Reinigung oder Konzentrierung wurde von Bier (Science 125, 1084 [1957]) und von Poison (Biochem.

et Biophys. Acta II, 315 [1953], britische Patentschrift 7 26 186) ausgearbeitet.

Die von Bier vorgeschlagene Methode benu'zt drei

ίο parallel zueinander angeordnete Membranen (Fig.2). Die beiden äußeren Membranen grenzen den das zu trennende Proteingemisch enthaltenden Raum gegen den nur Pufferlösung enthaltenden Außenraum ab, in dem sich die Elektroden zum Anlegen des elektrischen

ι.s Feldes befinden. Die mittlere, kürzere Membran teilt aas Flüssigkeitsvolumen, nur im unteren Teil besteht eine direkte Verbindung. Im oberen Teil der anodenseitigen Hälfte wird das aufzutrennende Proteingemisch zugeführt. Die elektrisch geladenen Proteine sedimentieren an der anodenseiiigen Außenmembran, während die ungeladenen Proteine unter der verkürzten mittleren Membran in den kathodenseitigen Raum gelangen. Diese Anordnung hat den Nachteil, daß bewegliche Proteine, die im anodenseitigcn Raum noch nicht

2s abgetrennt wurden, im kathodenseitigen Raum zur mittleren Membran wandern. Dort haben sie ebenfalls das Bestreben zu sedimentieren. müssen jetzt aber dem in diesem Teil aufwärts gerichteten Flüssigkeitsstrom entgegenwandern. Der kathodenseitige Raum hat deswegen eine verminderte Trennwirkung. Der Trennvorgang im anodcnseitigen Raum wird durch eine instabile Schichtung von Flüssigkeitsanteilen unterschiedlicher Dichte ebenfalls behindert. Die Dichte des oben zugeführten zu trennenden Gemisches ist nämlich höher als die Dichte der von den geladenen Proteinen abgereicherten Flüssigkeit, die im unteren Teil vom anöden- zum kathodenseitigen Raum fließen soll. Infolgedessen kommt es in der anodenseiiigen Kammer zu unbeabsichtigten, den Trennvorgang störenden Umschichtungen.

Weiterhin sind Trennzellen bekannt, die zusätzlich aufwendige Filtervorrichtungen benötigen, ohne die störenden Umschichtungen zu beseitigen.

Bei der Trenneinrichtung nach Poison wird ein Paket von vielen, im geringen Abstand parallel zueinander angeordneten Membranen in einer säulenförmigen Anordnung verwendet (Fig. 3). Zwei äußere Membranen grenzen das Membrainpaket gegen den nur von Puffer durchströmten Elektrodenraum ab. Ober- und unterhalb des Membranpaketes ist je ein für das ganze Paket gemeinsamer Raum. Das Membranpaket hat den Nachteil, daß die Joulesche Wärme, die beim Anlegen des elektrischen Feldes zwangsläufig entsteht, aus dem Innern des Pakts schlecht abgeführt werden kann. Schon bei einer geringen elektrischen Feldstärke nimmt deswegen das Innere des Pakets eine höhere Temperatur an als das durch den umgebenden Puffer gekühlte Äußere. Die dadurch verusachte Konvektionsströmung stört den Trennvorgang erheblich. Außerdem strömt das aufzutrennende Gemisch aufwärts entgegen den aus diesem Gemisch abgetrennten geladenen Proteinen, die nach unten absinken. Dadurch wird ebenfalls die Trennwirkung beeinträchtigt.

Es wurde nun eine Membranzelle mit einem Rahmen gefunden, der mit zwei halbdurchlässigen Membranen bespannt und mit einer Einflußöffnung und zwei Ausfiußöffnungen versehen ist. zur kontinuierlichen Trennung, Reinigung oder Anreicherung von Substanz-

gemischen durch Elektrophorese und Sedimentation, die dadurch gekennzeichnet ist, daß Verbindungslinien der drei öffnungen ein Dreieck bilden, wobei der Abstand zwischen den an einer Seite befindlichen AusfluBöffnungen kleiner ist als die dreifache Länge des Lotes von de EinfluBöffnung auf diese Seite.

Bevorzugt ist eine Membranzelle, deren Rahmen die Form eines gleichschenkligen, rechtwinkligen Dreiecks aufweist. Die EinfluQöffnung soll sich dabei im Bereich des Scheitelwiukels und die AusfluBöffnungen jeweils im Bereich der beiden Basiswinkel befinden. Der Abstand zwischen den beiden halbdurchlässigen Membranen — und damit die Rahmenhöhe — beträgt etwa 1,5 bis 3 mm.

Bei dem Einsatz dieser dreieckigen Membrsnzelle mit einem Scheitelwinkel von 90° zur elektrophoretischen Trennung wird die Membranzelle so in die Pufferlösung eingebracht, daß die Hypothenuse senkrecht steht.

Eine erfindungsgemäße Membranzelle ist in F i g. 4 im einzelnen dargestellt, dabei befindet sich die Membranzelle in einem mit Pufferlösung gefülltem Gefäß.

Der Rahmen I mit der Einrlußöffnung 2 und den Ausflußöffnungen 3 und 4 liegt innerhalb des nomogenen elektrischen Feldes zwischen den Elektroden 6. Die Membran 5 ist auf dem Rahmen befestigt. Die Membran besteht aus den üblichen Dialysiermaterialien, die z. B. aus Zellulosehydrat, präpariertem Zelluloseacetat oder aus tierischen Materialien hergestellt sind.

Der Vorteil einer dieser erfindungsgemäßen Membranzellen wird deutlich, wenn man die Bewegung der Teilchen durch diese Vorrichtung betrachtet. Die Teilchen treten bei der Einflußöffnung in die Membranzelle ein und fließen in Richtung der V-Achse. Auf diese Teilchen wirken gleichzeitig die Schwerkraft in Z-Richtung und das elektrische Feld in A'-Richtung. Der Flüssigkeitsstrom (in V-Richtung), der Sedimentationsstrom (in Z-Richtung) und die elektrophoretische Bewegung (in A'-Richtung) können unabhängig voneinander ohne gegenseitige Störungen verlaufen; so ergibt sich ein optimales Trennvermögen dieser Membranzelle.

Überraschenderweise können in dieser Membranzelle auch undialysierte Seren aufgetrennt werdeiv.

Durch paralleles Nebeneinandersetzen vieler Membranzellen dieser Art, wie die F i g. 5 zeigt, lassen sich auch größere Mengen von Substanzgemischen trennen. Die einzelnen Zellen 7 werden dabei von gekühlter Pufferlösung 8 umströmt, die entstehende Joulesche Wärme kann daher gut abgeführt werden. Bei einer derartigen Ausführung der Erfindung dienen Abstandshalter 9 zwischen den Membranzellen zur Befestigung. Zweckmäßigerweise wird der Druck innerhalb der Membranzeilen gegenüber dem Druck der äußeren Pufferlösung im geringen Maße erhöht. Die Membranen stützen sich dann auf die Abstandshalter und behalten so eine stabile Lage.

Die Trennwirkung läßt sich weiter verbessern, wenn man mehrere Membranzellen hintereinander anordnet.

Beispiel 1

Eine Membranzelle in Form eines gleichschenkligen, rechtwinkligen Dreiecks mit 200 mm Kathetenlänge und 2 mm Membranabstand mit einer Dialysiermembran aus Zellulose wird mit senkrecht stehender Hypothenuse in ein homogenes elektrisches Feld mit einer Feldstärke von 10 V/cm in einer auf 8° C gekühlten Pufferlösung befestigt. Die Pufferlösung ist ein 0,67 molarer Phosphatpuffer (nach Sörensen) mit einem pH-Wert von 6,8. Diese Pufferlösung dient nicht nur als umgebende Kühllösung, sondern ebenfalls zum Verdünnen des zu trennenden undialysierten Serums, das im wesentlichen aus Albumin und vier verschiedenen Globulinen besteht. Dazu werden 500 ml des Serums, das 15 g Gesamtprotein enthält, mit 500 ml Pufferlösung verdünnt.

Dieses so verdünnte undialysdierte Serum wird gleichmäßig in die Membranzelle mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 25 ml Serum in der Stunde eingespeist. Durch eine an den Ausflußöffnungen angebrachte Regulierung wird das Verhältnis des Flüssigkeitsstromes an der oberen und an der unteren Ausflußöffnung auf 4 :1 eingestellt. Durch das Teilverhältnis von 4 :1 ergibt sich eine Ausbeute von 80% der ursprünglichen Flüssigkeitsmenge, die das abgetrennte Gamma-Globulin enthält. Diese Lösung wird an der oberen Ausflußöffnung entnommen. Das gewonnene y-Globulin hast eine Reinheit von über 95%. Die in Fig.6 abgebildeten Elektrophoresesueifen, die zur Analyse der Proteingemische dienen, zeigen deutlich, wie rein das gewonnene Serum ist (Streifen cJL Als Vergleich sind noch die Elektrophoresestreifen von dem an der unteren Ausflußöffnung entnommenen Serum (b) und von dem ursprünglichen Serum fajabgebildet. Diese als Analysenmethode verwendete Streifenelektrophorese ist z. B. in Milan Bier, Elektrophoresis, Academic Press Inc., New York 1959, ausführlich beschrieben.

Beispiel 2

Ein mit Poliomyelitis-Viren infiziertes Gewebe wird zerkleinert und mit einem Puffer von pH 6,5 zu einer Suspension verarbeitet

Diese Suspension wird in die in Beispiel 1 beschriebene Trennzelle mit einer Durchflußgeschwindigkeit von 20 ml/h eingespeist. Die Feldstärke beträgt etwa 6 V/cm; der pH der gekühlten (6-8⁰C) Pufferlösung beträgt 6,5. Es ergibt sich, daß die Konzentration der Viren an der unteren Ausflußöffnung mehr als verdoppelt wird, während der Gewebeanteil stark verringert ist.

Beispiel 3

Einp kolloidale Lösung von 0,5 g Platin pro Liter Lösung wird in der Membranzelle analog Beispiel 1 bei einer Feldstärke vor. 10 V/cm und einer Durchflußgeschwindigkeit von 20 ml/h auf das 4fache der Ausgangskonzentration angereichert.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Membranzelle mit einem Rahmen, der mit zwei halbdurchlässigen Membranen bespannt und mit einer Einflußöffnung und zwei Abflußöffnungen versehen ist zur kontinuierlichen Trennung, Reinigung oder Anreicherung von Substanzgemischen durch Elektrophorese und Sedimentation, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindungslinien der drei Öffnungen ein Dreieck bilden, wobei der Abstand kleiner ist als die dreifache Länge des Lotes von der Einflußöffnung auf diese Seite.

2. Membranzelle nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rahmen die Form eines gleichschenkligen, rechtwinkligen Dreiecks aufweist, und daß die Einflußöffnung im Bereich des Scheitelwinkels und die Ausflußöffnungen im Bereich der beiden Basiswinkel angebracht sind.

3. Membranzelle nach den Ansprüchen I und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand zwischen den haibdurchlässigen Membranen im Bereich zwischen etwa 1,5 und etwa 3 mm liegt.