JP2004150899A - 二次元電気泳動法 - Google Patents
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Abstract
【課題】マイクロチップ上で微量の試料を簡便かつ迅速に分析しうるタンパク質の二次元電気泳動法を提供することを目的とする。
【解決手段】ローディングチャネルと、該ローディングチャネルに交差する分離用チャネルとを備え、かつ該ローディングチャネルの一端に試料リザーバーが配置され、該ローディングチャネルの他端にアウトレットが配置されたマイクロチップであって、該ローディングチャネルおよび分離用チャネルのそれぞれに泳動用緩衝液が充填されたマイクロチップにおいて、
（ａ） 泳動用緩衝液のｐＨとは少なくとも２異なるｐＨを有し、かつタンパク質を含有した試料を該試料リザーバーに供するステップ、
（ｂ） 該ローディングチャネル内を加圧することにより、該試料リザーバー中の該試料を分離用チャネルに導入するステップ、および
（ｃ） 該分離用チャネルに泳動電場を負荷して該試料を分離チャネル内で泳動させるステップ
を含む、タンパク質の分子量による分離および等電点による分離を同時に行う二次元電気泳動法。
【選択図】 なし
【解決手段】ローディングチャネルと、該ローディングチャネルに交差する分離用チャネルとを備え、かつ該ローディングチャネルの一端に試料リザーバーが配置され、該ローディングチャネルの他端にアウトレットが配置されたマイクロチップであって、該ローディングチャネルおよび分離用チャネルのそれぞれに泳動用緩衝液が充填されたマイクロチップにおいて、
（ａ） 泳動用緩衝液のｐＨとは少なくとも２異なるｐＨを有し、かつタンパク質を含有した試料を該試料リザーバーに供するステップ、
（ｂ） 該ローディングチャネル内を加圧することにより、該試料リザーバー中の該試料を分離用チャネルに導入するステップ、および
（ｃ） 該分離用チャネルに泳動電場を負荷して該試料を分離チャネル内で泳動させるステップ
を含む、タンパク質の分子量による分離および等電点による分離を同時に行う二次元電気泳動法。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、マイクロチップ上でのタンパク質の二次元電気泳動法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
分子量の差異により複数のタンパク質を分離する（以下、分子量分離という）ゲル電気泳動法では、ほぼ同一の分子量を有する複数の分子が存在する場合、それらがゲル上で重なって分離しないことがある。このような場合、ゲル電気泳動での分解能の向上のため、２段階に分けて別種の電気泳動法を組み合わせて行う電気泳動法（二次元電気泳動法という）が用いられている。
【０００３】
現在一般に使用されている分子量分離と等電点の差異による分離（以下、等電点分離という）とを組み合わせた二次元電気泳動法では、まず比較的細いガラス管を用いて等電点ゲル電気泳動（一次元目）を行い、次にそのゲルをスラブゲル電気泳動の開始線に埋め込んで分子量分離による電気泳動（二次元目）を行う（例えば、非特許文献１参照）。しかし、この方法は、ゲルの調製に煩雑な工程を必要とする、微量の試料の分離および検出が困難である、分析に長時間を要する、および一次元目の分離の後に二次元目の分離を行うため手順が煩雑になり自動化が困難である等の欠点を有する。
【０００４】
一方で、微量のタンパク質を迅速に解析するための手段として、マイクロチップ型電気泳動が近年注目されている（例えば、非特許文献２および３参照）。しかし、マイクロチップ型電気泳動においてほぼ同一の分子量を有する複数のタンパク質を分離することは分解能の点から困難であった。また、マイクロチップ型電気泳動において分子量分離と等電点分離とを１つのチャネルで同時に行うことは困難であった。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ， Ｐ．Ｈ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． １９７５， ２５０， ４００７−４０２１
【非特許文献２】
Ｙａｏ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９９９， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９６， ５３７２−５３７７
【非特許文献３】
Ｂｏｕｓｓｅ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． ２００１， Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． ７３， １２０７−１２１２
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、マイクロチップ上で微量の試料を簡便かつ迅速に分析しうるタンパク質の二次元電気泳動法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明の要旨は、
［１］ ローディングチャネルと、該ローディングチャネルに交差する分離用チャネルとを備え、かつ該ローディングチャネルの一端に試料リザーバーが配置され、該ローディングチャネルの他端にアウトレットが配置されたマイクロチップであって、該ローディングチャネルおよび分離用チャネルのそれぞれに泳動用緩衝液が充填されたマイクロチップにおいて、
（ａ） 該泳動用緩衝液のｐＨとは少なくとも２異なるｐＨを有し、かつタンパク質を含有した試料を該試料リザーバーに供するステップ、
（ｂ） 該ローディングチャネル内を加圧することにより、該試料リザーバー中の該試料を分離用チャネルに導入するステップ、および
（ｃ） 該分離用チャネルに泳動電場を負荷して該試料を分離チャネル内で泳動させるステップ
を含む、タンパク質の分子量による分離および等電点による分離を同時に行う二次元電気泳動法、
［２］ ステップ（ｃ）において、分離用チャネルに泳動電場を負荷する前に該分離用チャネル内を０．５〜２ｋＰａで２〜８秒間加圧することを含む、前記［１］記載の二次元電気泳動法、
［３］ 泳動用緩衝液のｐＨと試料のｐＨとの差が、２〜９である、前記［１］または［２］記載の二次元電気泳動法、
［４］ ステップ（ｂ）の加圧が、２〜７ｋＰａで１〜３０秒間の加圧である、前記［１］〜［３］いずれか記載の二次元電気泳動法、
［５］ 泳動したタンパク質を検出するステップをさらに含む、前記［１］〜［４］いずれか記載の二次元電気泳動法、
に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の二次元電気泳動法は、マイクロチップ上で泳動用緩衝液のｐＨとは少なくとも２異なるｐＨを有する試料を、該試料と泳動用緩衝液とが急激に混合しないように比較的に低い圧力で加圧することにより分離用チャネルに導入し、泳動電場を負荷して泳動させることを１つの特徴とする。かかる特徴を有することにより本発明の二次元電気泳動法は、タンパク質の分子量分離および等電点分離を１チャネル上で１回の電気泳動で達成することができる。これにより、分子量がほぼ同一で等電点が異なるタンパク質、特に翻訳後修飾（例えば、リン酸化等）の分離を迅速に達成することができるため、翻訳後修飾の解析を容易に行うことができる。かかる電気泳動法はまた、従来必要とされていた２段階の電気泳動を行うことなく、迅速かつ容易にタンパク質の分離を達成することができる。かかる電気泳動法はまた、マイクロチップ上で分析を行うため、分析に必要とされる試料の量は従来の二次元電気泳動法で使用される試料の量と比べてごく少量であるという利点を有し、少量しか得られないタンパク質の発現解析にも適する。
【０００９】
本明細書において、タンパク質とは、複数のアミノ酸がペプチド結合により連結された化合物をいい、天然由来物、合成物、および短鎖のペプチドをも含むことを意味する。
【００１０】
本発明の二次元電気泳動法において解析されうるタンパク質としては、特に限定されることなく、天然由来物、合成物、およびアミノ酸以外の構成成分を含む核タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質等が挙げられるが、水溶性タンパク質が特に好適である。
【００１１】
本発明の二次元電気泳動法では、マーカーを適宜設定することによりあらゆるサイズのタンパク質が解析可能であるが、６ｋＤａ〜２１０ｋＤａのタンパク質が特に好適に解析されうる。なお、膜結合したタンパク質等は可溶化した後に本発明の電気泳動法に適用するのが好ましい。前記可溶化処理としては、塩溶液やＥＤＴＡ等のキレート化剤での処理、超音波等の機械的処理、および界面活性剤での処理等が挙げられる。
【００１２】
本発明の二次元電気泳動法に使用する分離用担体としては、特に限定されるものではなく、通常のマイクロチップ型ゲル電気泳動等においてタンパク質の分子量分離分析用に使用される、ポリアクリルアミド、ポリアクリルアミドゲル、ポリジメチルアクリルアミド、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、β−シクロデキストリン、α−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン等の分離用担体が挙げられ、また、β−１，３グルカン構造を含むカードラン、ラミナランや海藻抽出物等も適用可能である。分離用担体の添加剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ε−アミノカプロン酸、３−〔（３−コラミドプロピル）−ジメチルアミノ〕−１−プロパン、ＣＨＡＰＳ、６〜８Ｍ尿素、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、ヘキシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＨＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＤＴＡＢ）等が挙げられる。
【００１３】
泳動用緩衝液としては、例えば、トリス−グリシンバッファー、トリス−ホウ酸バッファー、トリス−塩酸バッファー、トリス−トリシンバッファー、トリス−リン酸二水素ナトリウムバッファー、ホウ酸バッファー、リン酸バッファー等のような一般にタンパク質の電気泳動用緩衝液として使用される緩衝液が挙げられ、市販のタンパク質電気泳動用キット中に提供されている緩衝液等を使用することもできる。前記泳動用緩衝液は、一般にタンパク質の電気泳動用緩衝液として使用される濃度で使用されうる。
【００１４】
泳動用緩衝液は、前記分離用担体を含有していてもよい。分離用担体を泳動用緩衝液に添加して用いることにより、操作を簡便にすることができ、解析をより高速で行うことができる。
【００１５】
泳動用緩衝液のｐＨは、泳動用緩衝液と分析対象のタンパク質を含有する試料溶液との間で、分析対象のタンパク質の等電点分離が可能なｐＨ勾配が発生するように適宜設定されるが、適切な電気浸透流およびタンパク質の好適な電気泳動の観点から、３〜１２が好ましく、７．５〜９．８がさらに好ましい。
【００１６】
泳動用緩衝液のｐＨの調整は、水酸化ナトリウム、塩酸、ホウ酸、グリシン−塩酸緩衝液、クエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液、β−β’ジメチルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、フタル酸水素カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、マレイン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液等やキャリアアンフォライト（バイオライト；バイオラットラボラトリーズ社製）等により行う。
【００１７】
分析対象のタンパク質を含有する試料の調製用溶液としては、水、ＳＤＳ溶液、またはＳＤＳ−トリスホウ酸溶液等に２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールを添加したもの等を使用することができる。ピーク強度の向上、ピーク分離度の向上、検出限界の向上、測定精度の向上の観点から、水が特に好ましい。
【００１８】
水としては、超純水、脱イオン水等のタンパク質の電気泳動に通常使用される水が使用されうるが、超純水が特に好ましい。
【００１９】
また、水を試料調製用溶液として使用する場合、ピーク強度の増強、検出限界の向上の観点から、タンパク質を水溶解させることが好ましい。
【００２０】
分析対象のタンパク質を含有する試料のｐＨは、泳動用緩衝液と分析対象のタンパク質を含有する試料溶液との間で、分析対象のタンパク質の等電点分離が可能なｐＨ勾配が発生するように適宜設定されるが、適切な電気浸透流およびタンパク質の好適な電気泳動の観点から、３〜８が好ましく、４〜７がさらに好ましい。
【００２１】
試料のｐＨの調整は、水酸化ナトリウム、塩酸、ホウ酸、グリシン−塩酸緩衝液、クエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液、β−β’ジメチルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム、フタル酸水素カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、マレイン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液等やキャリアアンフォライト（バイオライト；バイオラットラボラトリーズ社製）等により行う。
【００２２】
泳動用緩衝液と試料溶液とのｐＨの差は、等電点分離を達成するのに充分なｐＨ勾配を発生させる観点から、少なくとも２であり、好ましくは２〜９であり、さらに好ましくは３〜５．５である。泳動用緩衝液のｐＨは、試料溶液のｐＨと比べてアルカリ性側でも酸性側でもよい。
【００２３】
試料中のタンパク質の濃度としては、測定精度の観点から、０．０５〜２０００ｎｇ／μｌが好ましく、０．１〜２０００ｎｇ／μｌがより好ましく、０．５〜２００ｎｇ／μｌが特に好ましい。
【００２４】
本発明に使用されるマイクロチップは、ローディングチャネルと、該ローディングチャネルに交差する分離用チャネルとを備え、かつ該ローディングチャネルの一端に試料リザーバーが配置され、該ローディングチャネルの他端にアウトレットが配置されたマイクロチップである。
【００２５】
マイクロチップの材質としては、例えば、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス、ソーダガラス、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ジメチルシロキサンなどが挙げられる。なかでも、試料の吸着が少なく、チップ加工が容易である観点から、ガラスまたはポリメチルメタクリレートが望ましい。また、キャピラリーと同様に内壁を加工処理したものも用いられる。
【００２６】
マイクロチップの大きさは、例えば、縦１０〜１２０ｍｍ、横１０〜１２０ｍｍ、厚さ５００〜５０００μｍである。
【００２７】
ローディングチャネルおよび分離用チャネルのそれぞれの形状は特に限定されるものではない。なお、前記チャネルが一枚のチップ上に３〜９６本設置された、同時に多チャネルを解析することができるチップを使用することもできる。多チャネルの並べ方は、並行、放射線状、円形状等があるが、その形状は特に限定されるものではない。
【００２８】
前記チャネルの幅は、マイクロチップの大きさ、使用目的などにより適宜設定されうる。具体的には、チャネルの幅は、十分な解析感度を得る観点から、０．１μｍ以上、好ましくは１０μｍ以上であり、十分な解析精度を得る観点から、１００μｍ以下、好ましくは５０μｍ以下であることが望ましい。また、前記チャネルの深さは、マイクロチップの大きさ、使用目的などにより適宜設定されうる。具体的には、十分な解析感度を得る観点から、０．１μｍ以上、好ましくは１０μｍ以上であり、十分な解析精度を得る観点から、１００μｍ以下、好ましくは５０μｍ以下であることが望ましい。さらに、前記分離用チャネルの長さは、マイクロチップの大きさ、解析対象の化合物に応じて適宜選択することができるが、有効長を、より長くすることが望ましい。有効長は、チャネル交差部から、高分子化合物の検出点（分離用チャネル上に配置）までの距離をいう。十分な分離能を得る観点から、０．１ｍｍ以上、好ましくは１０ｍｍ以上であり、高速分離の観点から、１００ｍｍ以下、好ましくは５０ｍｍ以下であることが望ましい。
【００２９】
また、前記リザーバーの大きさは、試料の容量に応じて適宜設定することができる。具体的には、試料導入のハンドリングおよび電極の太さの観点から、直径０．０５ｍｍ以上、好ましくは３ｍｍ以下であることが望ましい。
【００３０】
本発明の二次元電気泳動法は、ローディングチャネルおよび分離用チャネルのそれぞれに泳動用緩衝液を充填した前記マイクロチップにおいて、
（ａ） 泳動用緩衝液のｐＨとは少なくとも２異なるｐＨを有し、かつタンパク質を含有した試料を試料リザーバーに供するステップ、
（ｂ） ローディングチャネル内を加圧することにより、試料リザーバー中の試料を分離用チャネルに導入するステップ、および
（ｃ） 分離用チャネルに泳動電場を負荷して試料を分離チャネル内で泳動させるステップ、を含むプロセスにより行われる。
【００３１】
前記ステップ（ａ）は、より具体的には、試料リザーバーに好ましくは１〜１０μｌ、より好ましくは２〜５μｌの試料を供給することにより行われる。
【００３２】
前記ステップ（ｂ）は、より具体的には、泳動時間の短縮、分離度向上および検出感度向上の観点から、アウトレットに泳動用緩衝液をセッティングしない条件下で試料を試料リザーバーから、加圧、好ましくは２〜７ｋＰａ、より好ましくは３〜６ｋＰａ、特に好ましくは５〜５．５ｋＰａで加圧することによりローディングチャネルと分離用チャネルとの交差部に試料を泳動させることが望ましい。ここで、前記加圧は、好ましくは１〜３０秒間、より好ましくは１〜１０秒間、特に好ましくは１〜２秒間行うことが望ましい。
【００３３】
前記ステップ（ｃ）において、試料を分離チャネル内で泳動させるための泳動電場は、良好な分解能を得、移動時間を短縮する観点から、好ましくは２０Ｖ／ｃｍ〜５０ｋＶ／ｃｍであり、より好ましくは５０〜５ｋＶ／ｃｍであり、特に好ましくは１００Ｖ／ｃｍ〜１ｋＶ／ｃｍであることが望ましい。
【００３４】
分離用チャネルに泳動電場を負荷する前に、より高速で高分離能を得る観点から、分離用チャネルを、好ましくは０．５〜２ｋＰａ、より好ましくは０．８〜１．５ｋＰａ、特に好ましくは１〜１．２ｋＰａで加圧してもよい。ここで、前記加圧は、好ましくは２〜８秒間、より好ましくは２．３〜５秒間、特に好ましくは２．５〜３．５秒間行うことが望ましい。
【００３５】
本発明の二次元電気泳動法においては、分子量マーカーおよび／または等電点マーカーをタンパク質試料と共に電気泳動に供することもできる。分子量マーカーとしては、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｎｏ．５０６５−４４３０の分子サイズ６ｋＤａ、分子サイズ２１０ｋＤａのミオシン、ＨＭＷ、ＬＭＷマーカーキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）等のタンパク質の電気泳動に通常使用される市販の分子量マーカーや、市販の分子量および濃度既知の標準試料のタンパク質や生体試料から精製および／または定量したタンパク質を含む分子量マーカーを用いることができる。これらの分子量マーカーは組み合わせて使用することもできる。等電点マーカーとしては、キャリアアンフォライト（バイオライト；日本バイオラットラボラトリーズ社製）、固定化ｐＨ勾配プレキャストゲル（日本バイオラットラボラトリーズ社製）、アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、フォルマライト（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、サルバライト（コスモバイオ社製）等がある。
【００３６】
電気泳動に供したタンパク質の検出法としては、例えば、ＵＶ波長光による吸収、蛍光、レーザー、ランプ、ＬＥＤなどによる検出、電気化学的検出、化学発光検出などが挙げられる。具体的には、タンパク質またはペプチドの場合、２００ｎｍにおける吸収を測定すること；ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅとタンパク質またはペプチドとを反応させ、４６０〜５５０ｎｍで励起させ、５５０〜６５０ｎｍで蛍光を測定すること、あるいはタンパク質と蛍光マーカー（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｎｏ．５０６５−４４３０）と反応させ、６３０〜６５０ｎｍで励起させ、６７０〜７００ｎｍで蛍光を測定すること、および電気化学的測定、化学発光測定などにより、タンパク質またはペプチドを検出することができる。
【００３７】
また、分離用チャネル上に配置された検出点にＵＶ波長光の検出器を設置してもよく、あるいは、蛍光波長を発しうる装置と該蛍光波長を検出可能な検出器とを設置してもよい。また同時に多チャネルを検出可能である。
【００３８】
検出の際、タンパク質、ペプチド、アミノ酸等の同定を行う場合には、ＵＶ吸収、分子量マーカー、標品との移動時間の比較、マススペクトルの解析などにより行うことができる。
【００３９】
本発明の二次元電気泳動法において、未知のタンパク質を含有する試料を解析する場合には、異なる条件下にて多チャネルで並行して二次元電気泳動を行うことによりタンパク質の分子量分離と等電点分離とを判別することができる。
【００４０】
具体的には、解析対象の未知のタンパク質の分子量が予想できる場合には、例えば、分離用チャネル上の前記タンパク質の予想される分子量付近の位置に１チャネル目はｐＨ３〜４、２チャネル目はｐＨ５〜６、３チャネル目はｐＨ６〜７等のように種々の比較的小さなｐＨ勾配が形成されるように試料と緩衝液とのｐＨの組み合せおよび加圧条件を設定し、本発明の二次元電気泳動法により解析する。このとき対照として分子量分離のみの電気泳動を並行して行うことが好ましい。得られたそれぞれの電気泳動の結果を比較することにより分子量分離と等電点分離とを判別することができる。
【００４１】
また、解析対象の未知のタンパク質の分子量が予想できない場合には、例えば、１チャネル目は約６〜１４ｋＤａの位置にｐＨ４〜８、２チャネル目は約１４〜３１ｋＤａ付近の位置にｐＨ４〜８、３チャネル目は約３１〜４５ｋＤａの位置にｐＨ４〜８等のように分離用チャネル上の種々の分子量の位置に比較的大きなｐＨ勾配が形成されるように試料と緩衝液とのｐＨの組み合せおよび加圧条件を設定し、本発明の二次元電気泳動法により解析する。このとき対照として分子量分離のみの電気泳動を並行して行うことが好ましい。得られたそれぞれの電気泳動の結果を比較することにより分子量分離と等電点分離とを判別することができる。
【００４２】
本発明の二次元電気泳動法は、前記のような特徴を有することから、分子量がほぼ同一で等電点が異なるタンパク質、特に翻訳後修飾（例えば、リン酸化等）の分離を、１チャネル上で１回の電気泳動により迅速に達成することができるため、翻訳後修飾の解析を容易に行うことができる。本発明の二次元電気泳動法はまた、ターゲットプロテイン（病気診断用マーカープロテイン）の分離にも適用可能であり、今後のプロテオミクス研究への応用が期待されるものである。
【００４３】
【実施例】
調製例（被検試料の調製）
ヒト白血病細胞、ジャルカット細胞（Ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ， Ｊｕｒｋａｔ ｃｅｌｌｓ ）を、ＲＰＭＩ―１６４０（Ｓｉｇｍａ社製）、１０％ ウシ胎児血清（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ社製）中で培養した。使用する１時間前に、培地を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを補充した血清フリーのＲＰＭＩ−１６４０に交換した。
【００４４】
熱ショック処理タンパク質試料と非熱ショック処理タンパク質試料とを調製した。非熱ショック処理タンパク質試料の調製のために、１×１０７ 個の前記ジャルカット細胞を１００ｍｍディシュに播種し、３７℃、３０分間インキュベートした。また、熱ショック処理タンパク質試料の調製のために、１×１０７ 個の前記ジャルカット細胞を、５１℃、３０分間ウォーターバスでインキュベートした。その後、それぞれの細胞を２００×ｇで５分間遠心分離した。得られたペレットを１ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄した。洗浄したペレットを、１％ Ｎｏｒｉｄｅｔ Ｐ−４０（コスモバイオ社製）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）に溶解し、タンパク質を抽出した。細胞溶解液を、２００００×ｇで１０分間遠心分離後、上清をタンパク質の混合物サンプルとして供した。以下では、非熱ショック処理タンパク質試料をサンプルＡ、熱ショック処理タンパク質試料をサンプルＢと呼ぶ。
【００４５】
比較例１
サンプルＡを従来の二次元電気泳動法で解析した。二次元電気泳動法はＯ’Ｆａｒｒｅｌｌ法（Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｐ．Ｈ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． １９７５， ２５０， ４００７−４０２１ ）の改良法を用いた。ポリアクリルアミドキャピラリーゲル（４％Ｔ、５．４％Ｃ、２％ Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ ｐＨ３．５−１０；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、長さ６２ｍｍ、直径１．２ｍｍを１次元電気泳動の等電点電気泳動（以下、ＩＥＦという）として用いた。１６℃、２４時間、４００Ｖで用いた。５０μｇのタンパク質を含有するサンプルをＩＥＦにロードし、１６℃で電圧を段階的に増加させた（２００Ｖで１５分、４００Ｖで１５分、８００Ｖで３０分、２５００Ｖで２８８分）。二次元目の電気泳動，ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動は、８５ｍｍ（Ｗ）×６０ｍｍ（Ｈ）×１ｍｍ（Ｔ）スラブタイプゲル（１５％Ｔ、２．６７％Ｃ）を用いて行った。１プレートあたり１５ｍＡで１次元目に１２時間、２次元目に３時間、トータル１５時間泳動した。二次元電気泳動の終了後、ゲル中のタンパク質を、０．０５％クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ Ｒ−２５０；日本バイオラット・ラボラトリーズ社製）を用いて染色した。ＩＥＦ中のｐＨ勾配はＩＥＦゲルの５ｍｍ各から抽出したｐＨをマイクロｐＨメーター（ｐＨ Ｂｏｙ Ｐ−２；Ｓｈｉｎ Ｄｅｎｇｅｎ社製）で測定することで決定した。その結果を図１に示す。図１において、スポットＩとスポットＩＩａとを検出した。
【００４６】
比較例２
上記サンプルＢを、比較例１と同様にして二次元電気泳動に供した。その結果を図２に示す。図２において、スポットＩとスポットＩＩａのほかにスポットＩＩｂを検出した。さらにスポットＩとスポットＩＩｂが図１のそれぞれより増加しているのが認められた。
【００４７】
比較例１および２の二次元電気泳動法においてタンパク質の解析に要した時間は、ゲルの作製に１時間、電気泳動に１５時間、スポットの染色および検出に２４時間であった。また、使用したタンパク質は５０μｇであり、使用した試薬（泳動用緩衝液）は１０ｍｌであった。
【００４８】
比較例３
上記比較例１で得られたゲルをポリビニリデンジフルオロライド（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ；Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社製）メンブランにセミドライブロッター（ＫＳ−８４６０；Ｍａｒｙｓｏｌ社製）を用いて１０ｍＭ ＣＡＰＳバッファーｐＨ１１、１５０ｍＡで２時間転写した。メンブラン上のペプチドをガスフェイズプロテインシークエンサー（ＰＰＳＱ−２１；Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）に供した。ペプチドのアミノ酸シークエンスのホモロジーサーチはインターネットホモロジーサーチプログラムＭＰサーチ（ｈｔｔ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｈｔｄｏｃｓ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ．ｈｔｍ）を用いた。これにより、図１のスポットＩは７ｋＤａのサイモシンβ４、スポットＩＩａはスタスミン（Ｍｗ１８ｋＤａ、ｐＩ ５．９）と同定された。
【００４９】
比較例４
比較例３と同様にして図２のスポットＩ、ＩＩａおよびＩＩｂは、それぞれサイモシンベータ４（７ｋＤａ）、スタスミン（Ｍｗ １８ｋＤａ、ｐＩ ５．９）、リン酸化スタスミン（Ｍｗ １８．５ｋＤａ、ｐＩ ５．６）と同定された。
【００５０】
実施例１
サンプルＡを本発明の二次元電気泳動法で解析した。２．７μｇ／μｌのタンパク質濃度を有する２μｌのサンプルＡをＨＣｌでｐＨ５に調整した。泳動用緩衝液をホウ酸でｐＨ９．３に調整した。電気泳動には、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社製のマイクロチップ電気泳動装置ｃｏｓｍｏ−ｉ １１００およびＨｉｔａｃｈｉｃｈｅｍｉｃａｌ社製のｉ−ｃｈｉｐ３のキット内のマイクロチップを用いた。泳動用緩衝液をローディングチャネルおよび分離用チャネルそれぞれに満たし、サンプルＡを試料用リザーバーに入れ、ローディングチャネル内を２．５〜５ｋＰａで１秒間加圧することによりサンプルＡをローディングチャネルと分離用チャネルとの交差部に移動させた。その後、分離用チャネル内を１ｋＰａで３秒間加圧し、８９０Ｖ／ｃｍの泳動電場で１５秒間分離を行った。その結果を図３に示す。比較例１で見出されたスポットＩの７ｋＤａおよびスポットＩＩａの１８ｋＤａのそれぞれのピークを検出した。
【００５１】
実施例２
サンプルＢを実施例１と同様にして二次元電気泳動に供した。その結果を図４に示す。７ｋＤａ付近（スポットＩ）に１本のピークおよび１８ｋＤａ付近に比較例２と同様にスポットＩＩａ（ｐＩ ５．９、Ｍｗ １８ｋＤａ）およびＩＩｂ（Ｍｗ １８．５ｋＤａ）の２本のピークの出現が認められた。これは、ｐＨ５の試料とｐＨ９．７のバッファーとを使用することにより分離用チャネル内にｐＨの勾配が形成されたためであると思われる。本発明の二次元電気泳動法により、分子量分離と等電点分離との両方が１チャネル内で達成されたことがわかる。
【００５２】
実施例１および２の二次元電気泳動法においてタンパク質の解析に要した時間は、１５秒であった。また、使用したタンパク質は５．４μｇであり、使用した試薬（泳動用緩衝液）は３５μｌであった。このことから、本発明の二次元電気泳動法は、比較例１および２の従来の二次元電気泳動法と比べて極めて迅速に、かつ少量の試薬によりタンパク質の分離を行いうることがわかる。
【００５３】
比較例５
電気泳動装置（Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いてサンプルＡを従来のマイクロチップ型電気泳動に供した。泳動用緩衝液およびマイクロチップはマイクロチップキット（ｐｒｏｔｅｉｎ２００ Ｐｌｕｓ；ｃａｌｉｐｅｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた。電気泳動の条件は、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒに添付のマニュアルに従った。サンプルのｐＨは７、バッファーのｐＨは７．６であった。結果を図５に示す。７ｋＤａおよび１８ｋＤａのそれぞれのピークが分子量マーカーまたはシステムピークと重なるため、図１で得られたスポットＩおよびＩＩａのそれぞれサイモシンベータ４およびスタスミンのピークを確認することはできなかった。
【００５４】
比較例６
サンプルＢを比較例５と同様にして従来のマイクロチップ型電気泳動に供した。その結果を図６に示す。７ｋＤａおよび１８ｋＤａのピークが分子量マーカーまたはシステムピークと重なるため、図２で得られたスポットＩ、ＩＩａおよびＩＩｂのそれぞれサイモシンベータ４、スタスミン（Ｍｗ １８ｋＤａ、ｐＩ ５．９）およびリン酸化スタスミン（Ｍｗ １８．５ｋＤａ、ｐＩ ５．６）のピークを確認することはできなかった。これらの結果より、従来型のマイクロチップ型電気泳動法では、分子量分離と等電点分離を１チャネルで１回の電気泳動で行うことは不可能であった。
【００５５】
【発明の効果】
本発明により、分子量がほぼ同一で等電点が異なるタンパク質を１チャネル上で１回の電気泳動により迅速に分離しうる二次元電気泳動法が提供される。かかる電気泳動法は、リン酸化等の翻訳後修飾の解析やターゲットプロテイン（病気診断用マーカープロテイン）の分離に適用可能であり、今後のプロテオミクス研究への応用が期待されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、従来の二次元電気泳動法によりジャルカット細胞由来のタンパク質を分離した結果を示す図である。
【図２】図２は、従来の二次元電気泳動法によりジャルカット細胞由来のタンパク質を分離した結果を示す図である。
【図３】図３は、本発明の二次元電気泳動法によりジャルカット細胞由来のタンパク質を分離した結果を示す図である。
【図４】図４は、本発明の二次元電気泳動法によりジャルカット細胞由来のタンパク質を分離した結果を示す図である。
【図５】図５は、従来のマイクロチップ型電気泳動法によりジャルカット細胞由来のタンパク質を分離した結果を示す図である。
【図６】図６は、従来のマイクロチップ型電気泳動法によりジャルカット細胞由来のタンパク質を分離した結果を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、マイクロチップ上でのタンパク質の二次元電気泳動法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
分子量の差異により複数のタンパク質を分離する（以下、分子量分離という）ゲル電気泳動法では、ほぼ同一の分子量を有する複数の分子が存在する場合、それらがゲル上で重なって分離しないことがある。このような場合、ゲル電気泳動での分解能の向上のため、２段階に分けて別種の電気泳動法を組み合わせて行う電気泳動法（二次元電気泳動法という）が用いられている。
【０００３】
現在一般に使用されている分子量分離と等電点の差異による分離（以下、等電点分離という）とを組み合わせた二次元電気泳動法では、まず比較的細いガラス管を用いて等電点ゲル電気泳動（一次元目）を行い、次にそのゲルをスラブゲル電気泳動の開始線に埋め込んで分子量分離による電気泳動（二次元目）を行う（例えば、非特許文献１参照）。しかし、この方法は、ゲルの調製に煩雑な工程を必要とする、微量の試料の分離および検出が困難である、分析に長時間を要する、および一次元目の分離の後に二次元目の分離を行うため手順が煩雑になり自動化が困難である等の欠点を有する。
【０００４】
一方で、微量のタンパク質を迅速に解析するための手段として、マイクロチップ型電気泳動が近年注目されている（例えば、非特許文献２および３参照）。しかし、マイクロチップ型電気泳動においてほぼ同一の分子量を有する複数のタンパク質を分離することは分解能の点から困難であった。また、マイクロチップ型電気泳動において分子量分離と等電点分離とを１つのチャネルで同時に行うことは困難であった。
【０００５】
【非特許文献１】
Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ， Ｐ．Ｈ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． １９７５， ２５０， ４００７−４０２１
【非特許文献２】
Ｙａｏ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． １９９９， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ． ９６， ５３７２−５３７７
【非特許文献３】
Ｂｏｕｓｓｅ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． ２００１， Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ． ７３， １２０７−１２１２
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、マイクロチップ上で微量の試料を簡便かつ迅速に分析しうるタンパク質の二次元電気泳動法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
即ち、本発明の要旨は、
［１］ ローディングチャネルと、該ローディングチャネルに交差する分離用チャネルとを備え、かつ該ローディングチャネルの一端に試料リザーバーが配置され、該ローディングチャネルの他端にアウトレットが配置されたマイクロチップであって、該ローディングチャネルおよび分離用チャネルのそれぞれに泳動用緩衝液が充填されたマイクロチップにおいて、
（ａ） 該泳動用緩衝液のｐＨとは少なくとも２異なるｐＨを有し、かつタンパク質を含有した試料を該試料リザーバーに供するステップ、
（ｂ） 該ローディングチャネル内を加圧することにより、該試料リザーバー中の該試料を分離用チャネルに導入するステップ、および
（ｃ） 該分離用チャネルに泳動電場を負荷して該試料を分離チャネル内で泳動させるステップ
を含む、タンパク質の分子量による分離および等電点による分離を同時に行う二次元電気泳動法、
［２］ ステップ（ｃ）において、分離用チャネルに泳動電場を負荷する前に該分離用チャネル内を０．５〜２ｋＰａで２〜８秒間加圧することを含む、前記［１］記載の二次元電気泳動法、
［３］ 泳動用緩衝液のｐＨと試料のｐＨとの差が、２〜９である、前記［１］または［２］記載の二次元電気泳動法、
［４］ ステップ（ｂ）の加圧が、２〜７ｋＰａで１〜３０秒間の加圧である、前記［１］〜［３］いずれか記載の二次元電気泳動法、
［５］ 泳動したタンパク質を検出するステップをさらに含む、前記［１］〜［４］いずれか記載の二次元電気泳動法、
に関する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明の二次元電気泳動法は、マイクロチップ上で泳動用緩衝液のｐＨとは少なくとも２異なるｐＨを有する試料を、該試料と泳動用緩衝液とが急激に混合しないように比較的に低い圧力で加圧することにより分離用チャネルに導入し、泳動電場を負荷して泳動させることを１つの特徴とする。かかる特徴を有することにより本発明の二次元電気泳動法は、タンパク質の分子量分離および等電点分離を１チャネル上で１回の電気泳動で達成することができる。これにより、分子量がほぼ同一で等電点が異なるタンパク質、特に翻訳後修飾（例えば、リン酸化等）の分離を迅速に達成することができるため、翻訳後修飾の解析を容易に行うことができる。かかる電気泳動法はまた、従来必要とされていた２段階の電気泳動を行うことなく、迅速かつ容易にタンパク質の分離を達成することができる。かかる電気泳動法はまた、マイクロチップ上で分析を行うため、分析に必要とされる試料の量は従来の二次元電気泳動法で使用される試料の量と比べてごく少量であるという利点を有し、少量しか得られないタンパク質の発現解析にも適する。
【０００９】
本明細書において、タンパク質とは、複数のアミノ酸がペプチド結合により連結された化合物をいい、天然由来物、合成物、および短鎖のペプチドをも含むことを意味する。
【００１０】
本発明の二次元電気泳動法において解析されうるタンパク質としては、特に限定されることなく、天然由来物、合成物、およびアミノ酸以外の構成成分を含む核タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質等が挙げられるが、水溶性タンパク質が特に好適である。
【００１１】
本発明の二次元電気泳動法では、マーカーを適宜設定することによりあらゆるサイズのタンパク質が解析可能であるが、６ｋＤａ〜２１０ｋＤａのタンパク質が特に好適に解析されうる。なお、膜結合したタンパク質等は可溶化した後に本発明の電気泳動法に適用するのが好ましい。前記可溶化処理としては、塩溶液やＥＤＴＡ等のキレート化剤での処理、超音波等の機械的処理、および界面活性剤での処理等が挙げられる。
【００１２】
本発明の二次元電気泳動法に使用する分離用担体としては、特に限定されるものではなく、通常のマイクロチップ型ゲル電気泳動等においてタンパク質の分子量分離分析用に使用される、ポリアクリルアミド、ポリアクリルアミドゲル、ポリジメチルアクリルアミド、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルセルロース、β−シクロデキストリン、α−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン等の分離用担体が挙げられ、また、β−１，３グルカン構造を含むカードラン、ラミナランや海藻抽出物等も適用可能である。分離用担体の添加剤としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ε−アミノカプロン酸、３−〔（３−コラミドプロピル）−ジメチルアミノ〕−１−プロパン、ＣＨＡＰＳ、６〜８Ｍ尿素、テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）、ヘキシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＨＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（ＤＴＡＢ）等が挙げられる。
【００１３】
泳動用緩衝液としては、例えば、トリス−グリシンバッファー、トリス−ホウ酸バッファー、トリス−塩酸バッファー、トリス−トリシンバッファー、トリス−リン酸二水素ナトリウムバッファー、ホウ酸バッファー、リン酸バッファー等のような一般にタンパク質の電気泳動用緩衝液として使用される緩衝液が挙げられ、市販のタンパク質電気泳動用キット中に提供されている緩衝液等を使用することもできる。前記泳動用緩衝液は、一般にタンパク質の電気泳動用緩衝液として使用される濃度で使用されうる。
【００１４】
泳動用緩衝液は、前記分離用担体を含有していてもよい。分離用担体を泳動用緩衝液に添加して用いることにより、操作を簡便にすることができ、解析をより高速で行うことができる。
【００１５】
泳動用緩衝液のｐＨは、泳動用緩衝液と分析対象のタンパク質を含有する試料溶液との間で、分析対象のタンパク質の等電点分離が可能なｐＨ勾配が発生するように適宜設定されるが、適切な電気浸透流およびタンパク質の好適な電気泳動の観点から、３〜１２が好ましく、７．５〜９．８がさらに好ましい。
【００１６】
泳動用緩衝液のｐＨの調整は、水酸化ナトリウム、塩酸、ホウ酸、グリシン−塩酸緩衝液、クエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液、β−β’ジメチルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液、フタル酸水素カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、マレイン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液等やキャリアアンフォライト（バイオライト；バイオラットラボラトリーズ社製）等により行う。
【００１７】
分析対象のタンパク質を含有する試料の調製用溶液としては、水、ＳＤＳ溶液、またはＳＤＳ−トリスホウ酸溶液等に２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールを添加したもの等を使用することができる。ピーク強度の向上、ピーク分離度の向上、検出限界の向上、測定精度の向上の観点から、水が特に好ましい。
【００１８】
水としては、超純水、脱イオン水等のタンパク質の電気泳動に通常使用される水が使用されうるが、超純水が特に好ましい。
【００１９】
また、水を試料調製用溶液として使用する場合、ピーク強度の増強、検出限界の向上の観点から、タンパク質を水溶解させることが好ましい。
【００２０】
分析対象のタンパク質を含有する試料のｐＨは、泳動用緩衝液と分析対象のタンパク質を含有する試料溶液との間で、分析対象のタンパク質の等電点分離が可能なｐＨ勾配が発生するように適宜設定されるが、適切な電気浸透流およびタンパク質の好適な電気泳動の観点から、３〜８が好ましく、４〜７がさらに好ましい。
【００２１】
試料のｐＨの調整は、水酸化ナトリウム、塩酸、ホウ酸、グリシン−塩酸緩衝液、クエン酸−リン酸二ナトリウム緩衝液、β−β’ジメチルグルタル酸−水酸化ナトリウム緩衝液、酢酸−酢酸ナトリウム、フタル酸水素カリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、マレイン酸ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝液等やキャリアアンフォライト（バイオライト；バイオラットラボラトリーズ社製）等により行う。
【００２２】
泳動用緩衝液と試料溶液とのｐＨの差は、等電点分離を達成するのに充分なｐＨ勾配を発生させる観点から、少なくとも２であり、好ましくは２〜９であり、さらに好ましくは３〜５．５である。泳動用緩衝液のｐＨは、試料溶液のｐＨと比べてアルカリ性側でも酸性側でもよい。
【００２３】
試料中のタンパク質の濃度としては、測定精度の観点から、０．０５〜２０００ｎｇ／μｌが好ましく、０．１〜２０００ｎｇ／μｌがより好ましく、０．５〜２００ｎｇ／μｌが特に好ましい。
【００２４】
本発明に使用されるマイクロチップは、ローディングチャネルと、該ローディングチャネルに交差する分離用チャネルとを備え、かつ該ローディングチャネルの一端に試料リザーバーが配置され、該ローディングチャネルの他端にアウトレットが配置されたマイクロチップである。
【００２５】
マイクロチップの材質としては、例えば、石英ガラス、ホウケイ酸ガラス、ソーダガラス、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ジメチルシロキサンなどが挙げられる。なかでも、試料の吸着が少なく、チップ加工が容易である観点から、ガラスまたはポリメチルメタクリレートが望ましい。また、キャピラリーと同様に内壁を加工処理したものも用いられる。
【００２６】
マイクロチップの大きさは、例えば、縦１０〜１２０ｍｍ、横１０〜１２０ｍｍ、厚さ５００〜５０００μｍである。
【００２７】
ローディングチャネルおよび分離用チャネルのそれぞれの形状は特に限定されるものではない。なお、前記チャネルが一枚のチップ上に３〜９６本設置された、同時に多チャネルを解析することができるチップを使用することもできる。多チャネルの並べ方は、並行、放射線状、円形状等があるが、その形状は特に限定されるものではない。
【００２８】
前記チャネルの幅は、マイクロチップの大きさ、使用目的などにより適宜設定されうる。具体的には、チャネルの幅は、十分な解析感度を得る観点から、０．１μｍ以上、好ましくは１０μｍ以上であり、十分な解析精度を得る観点から、１００μｍ以下、好ましくは５０μｍ以下であることが望ましい。また、前記チャネルの深さは、マイクロチップの大きさ、使用目的などにより適宜設定されうる。具体的には、十分な解析感度を得る観点から、０．１μｍ以上、好ましくは１０μｍ以上であり、十分な解析精度を得る観点から、１００μｍ以下、好ましくは５０μｍ以下であることが望ましい。さらに、前記分離用チャネルの長さは、マイクロチップの大きさ、解析対象の化合物に応じて適宜選択することができるが、有効長を、より長くすることが望ましい。有効長は、チャネル交差部から、高分子化合物の検出点（分離用チャネル上に配置）までの距離をいう。十分な分離能を得る観点から、０．１ｍｍ以上、好ましくは１０ｍｍ以上であり、高速分離の観点から、１００ｍｍ以下、好ましくは５０ｍｍ以下であることが望ましい。
【００２９】
また、前記リザーバーの大きさは、試料の容量に応じて適宜設定することができる。具体的には、試料導入のハンドリングおよび電極の太さの観点から、直径０．０５ｍｍ以上、好ましくは３ｍｍ以下であることが望ましい。
【００３０】
本発明の二次元電気泳動法は、ローディングチャネルおよび分離用チャネルのそれぞれに泳動用緩衝液を充填した前記マイクロチップにおいて、
（ａ） 泳動用緩衝液のｐＨとは少なくとも２異なるｐＨを有し、かつタンパク質を含有した試料を試料リザーバーに供するステップ、
（ｂ） ローディングチャネル内を加圧することにより、試料リザーバー中の試料を分離用チャネルに導入するステップ、および
（ｃ） 分離用チャネルに泳動電場を負荷して試料を分離チャネル内で泳動させるステップ、を含むプロセスにより行われる。
【００３１】
前記ステップ（ａ）は、より具体的には、試料リザーバーに好ましくは１〜１０μｌ、より好ましくは２〜５μｌの試料を供給することにより行われる。
【００３２】
前記ステップ（ｂ）は、より具体的には、泳動時間の短縮、分離度向上および検出感度向上の観点から、アウトレットに泳動用緩衝液をセッティングしない条件下で試料を試料リザーバーから、加圧、好ましくは２〜７ｋＰａ、より好ましくは３〜６ｋＰａ、特に好ましくは５〜５．５ｋＰａで加圧することによりローディングチャネルと分離用チャネルとの交差部に試料を泳動させることが望ましい。ここで、前記加圧は、好ましくは１〜３０秒間、より好ましくは１〜１０秒間、特に好ましくは１〜２秒間行うことが望ましい。
【００３３】
前記ステップ（ｃ）において、試料を分離チャネル内で泳動させるための泳動電場は、良好な分解能を得、移動時間を短縮する観点から、好ましくは２０Ｖ／ｃｍ〜５０ｋＶ／ｃｍであり、より好ましくは５０〜５ｋＶ／ｃｍであり、特に好ましくは１００Ｖ／ｃｍ〜１ｋＶ／ｃｍであることが望ましい。
【００３４】
分離用チャネルに泳動電場を負荷する前に、より高速で高分離能を得る観点から、分離用チャネルを、好ましくは０．５〜２ｋＰａ、より好ましくは０．８〜１．５ｋＰａ、特に好ましくは１〜１．２ｋＰａで加圧してもよい。ここで、前記加圧は、好ましくは２〜８秒間、より好ましくは２．３〜５秒間、特に好ましくは２．５〜３．５秒間行うことが望ましい。
【００３５】
本発明の二次元電気泳動法においては、分子量マーカーおよび／または等電点マーカーをタンパク質試料と共に電気泳動に供することもできる。分子量マーカーとしては、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｎｏ．５０６５−４４３０の分子サイズ６ｋＤａ、分子サイズ２１０ｋＤａのミオシン、ＨＭＷ、ＬＭＷマーカーキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）等のタンパク質の電気泳動に通常使用される市販の分子量マーカーや、市販の分子量および濃度既知の標準試料のタンパク質や生体試料から精製および／または定量したタンパク質を含む分子量マーカーを用いることができる。これらの分子量マーカーは組み合わせて使用することもできる。等電点マーカーとしては、キャリアアンフォライト（バイオライト；日本バイオラットラボラトリーズ社製）、固定化ｐＨ勾配プレキャストゲル（日本バイオラットラボラトリーズ社製）、アンフォライン（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、フォルマライト（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、サルバライト（コスモバイオ社製）等がある。
【００３６】
電気泳動に供したタンパク質の検出法としては、例えば、ＵＶ波長光による吸収、蛍光、レーザー、ランプ、ＬＥＤなどによる検出、電気化学的検出、化学発光検出などが挙げられる。具体的には、タンパク質またはペプチドの場合、２００ｎｍにおける吸収を測定すること；ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅとタンパク質またはペプチドとを反応させ、４６０〜５５０ｎｍで励起させ、５５０〜６５０ｎｍで蛍光を測定すること、あるいはタンパク質と蛍光マーカー（ＡｇｉｌｅｎｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｎｏ．５０６５−４４３０）と反応させ、６３０〜６５０ｎｍで励起させ、６７０〜７００ｎｍで蛍光を測定すること、および電気化学的測定、化学発光測定などにより、タンパク質またはペプチドを検出することができる。
【００３７】
また、分離用チャネル上に配置された検出点にＵＶ波長光の検出器を設置してもよく、あるいは、蛍光波長を発しうる装置と該蛍光波長を検出可能な検出器とを設置してもよい。また同時に多チャネルを検出可能である。
【００３８】
検出の際、タンパク質、ペプチド、アミノ酸等の同定を行う場合には、ＵＶ吸収、分子量マーカー、標品との移動時間の比較、マススペクトルの解析などにより行うことができる。
【００３９】
本発明の二次元電気泳動法において、未知のタンパク質を含有する試料を解析する場合には、異なる条件下にて多チャネルで並行して二次元電気泳動を行うことによりタンパク質の分子量分離と等電点分離とを判別することができる。
【００４０】
具体的には、解析対象の未知のタンパク質の分子量が予想できる場合には、例えば、分離用チャネル上の前記タンパク質の予想される分子量付近の位置に１チャネル目はｐＨ３〜４、２チャネル目はｐＨ５〜６、３チャネル目はｐＨ６〜７等のように種々の比較的小さなｐＨ勾配が形成されるように試料と緩衝液とのｐＨの組み合せおよび加圧条件を設定し、本発明の二次元電気泳動法により解析する。このとき対照として分子量分離のみの電気泳動を並行して行うことが好ましい。得られたそれぞれの電気泳動の結果を比較することにより分子量分離と等電点分離とを判別することができる。
【００４１】
また、解析対象の未知のタンパク質の分子量が予想できない場合には、例えば、１チャネル目は約６〜１４ｋＤａの位置にｐＨ４〜８、２チャネル目は約１４〜３１ｋＤａ付近の位置にｐＨ４〜８、３チャネル目は約３１〜４５ｋＤａの位置にｐＨ４〜８等のように分離用チャネル上の種々の分子量の位置に比較的大きなｐＨ勾配が形成されるように試料と緩衝液とのｐＨの組み合せおよび加圧条件を設定し、本発明の二次元電気泳動法により解析する。このとき対照として分子量分離のみの電気泳動を並行して行うことが好ましい。得られたそれぞれの電気泳動の結果を比較することにより分子量分離と等電点分離とを判別することができる。
【００４２】
本発明の二次元電気泳動法は、前記のような特徴を有することから、分子量がほぼ同一で等電点が異なるタンパク質、特に翻訳後修飾（例えば、リン酸化等）の分離を、１チャネル上で１回の電気泳動により迅速に達成することができるため、翻訳後修飾の解析を容易に行うことができる。本発明の二次元電気泳動法はまた、ターゲットプロテイン（病気診断用マーカープロテイン）の分離にも適用可能であり、今後のプロテオミクス研究への応用が期待されるものである。
【００４３】
【実施例】
調製例（被検試料の調製）
ヒト白血病細胞、ジャルカット細胞（Ｈｕｍａｎ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ， Ｊｕｒｋａｔ ｃｅｌｌｓ ）を、ＲＰＭＩ―１６４０（Ｓｉｇｍａ社製）、１０％ ウシ胎児血清（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ社製）中で培養した。使用する１時間前に、培地を、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳを補充した血清フリーのＲＰＭＩ−１６４０に交換した。
【００４４】
熱ショック処理タンパク質試料と非熱ショック処理タンパク質試料とを調製した。非熱ショック処理タンパク質試料の調製のために、１×１０７ 個の前記ジャルカット細胞を１００ｍｍディシュに播種し、３７℃、３０分間インキュベートした。また、熱ショック処理タンパク質試料の調製のために、１×１０７ 個の前記ジャルカット細胞を、５１℃、３０分間ウォーターバスでインキュベートした。その後、それぞれの細胞を２００×ｇで５分間遠心分離した。得られたペレットを１ｍＬのＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄した。洗浄したペレットを、１％ Ｎｏｒｉｄｅｔ Ｐ−４０（コスモバイオ社製）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）に溶解し、タンパク質を抽出した。細胞溶解液を、２００００×ｇで１０分間遠心分離後、上清をタンパク質の混合物サンプルとして供した。以下では、非熱ショック処理タンパク質試料をサンプルＡ、熱ショック処理タンパク質試料をサンプルＢと呼ぶ。
【００４５】
比較例１
サンプルＡを従来の二次元電気泳動法で解析した。二次元電気泳動法はＯ’Ｆａｒｒｅｌｌ法（Ｏ’Ｆａｒｒｅｌｌ，Ｐ．Ｈ．， Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． １９７５， ２５０， ４００７−４０２１ ）の改良法を用いた。ポリアクリルアミドキャピラリーゲル（４％Ｔ、５．４％Ｃ、２％ Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ ｐＨ３．５−１０；Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）、長さ６２ｍｍ、直径１．２ｍｍを１次元電気泳動の等電点電気泳動（以下、ＩＥＦという）として用いた。１６℃、２４時間、４００Ｖで用いた。５０μｇのタンパク質を含有するサンプルをＩＥＦにロードし、１６℃で電圧を段階的に増加させた（２００Ｖで１５分、４００Ｖで１５分、８００Ｖで３０分、２５００Ｖで２８８分）。二次元目の電気泳動，ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動は、８５ｍｍ（Ｗ）×６０ｍｍ（Ｈ）×１ｍｍ（Ｔ）スラブタイプゲル（１５％Ｔ、２．６７％Ｃ）を用いて行った。１プレートあたり１５ｍＡで１次元目に１２時間、２次元目に３時間、トータル１５時間泳動した。二次元電気泳動の終了後、ゲル中のタンパク質を、０．０５％クマシーブリリアントブルー（ＣＢＢ Ｒ−２５０；日本バイオラット・ラボラトリーズ社製）を用いて染色した。ＩＥＦ中のｐＨ勾配はＩＥＦゲルの５ｍｍ各から抽出したｐＨをマイクロｐＨメーター（ｐＨ Ｂｏｙ Ｐ−２；Ｓｈｉｎ Ｄｅｎｇｅｎ社製）で測定することで決定した。その結果を図１に示す。図１において、スポットＩとスポットＩＩａとを検出した。
【００４６】
比較例２
上記サンプルＢを、比較例１と同様にして二次元電気泳動に供した。その結果を図２に示す。図２において、スポットＩとスポットＩＩａのほかにスポットＩＩｂを検出した。さらにスポットＩとスポットＩＩｂが図１のそれぞれより増加しているのが認められた。
【００４７】
比較例１および２の二次元電気泳動法においてタンパク質の解析に要した時間は、ゲルの作製に１時間、電気泳動に１５時間、スポットの染色および検出に２４時間であった。また、使用したタンパク質は５０μｇであり、使用した試薬（泳動用緩衝液）は１０ｍｌであった。
【００４８】
比較例３
上記比較例１で得られたゲルをポリビニリデンジフルオロライド（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ Ｐ；Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社製）メンブランにセミドライブロッター（ＫＳ−８４６０；Ｍａｒｙｓｏｌ社製）を用いて１０ｍＭ ＣＡＰＳバッファーｐＨ１１、１５０ｍＡで２時間転写した。メンブラン上のペプチドをガスフェイズプロテインシークエンサー（ＰＰＳＱ−２１；Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）に供した。ペプチドのアミノ酸シークエンスのホモロジーサーチはインターネットホモロジーサーチプログラムＭＰサーチ（ｈｔｔ：／／ｗｗｗ．ｄｎａ．ａｆｆｒｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｈｔｄｏｃｓ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ／ｈｏｍｏｌｏｇｙ．ｈｔｍ）を用いた。これにより、図１のスポットＩは７ｋＤａのサイモシンβ４、スポットＩＩａはスタスミン（Ｍｗ１８ｋＤａ、ｐＩ ５．９）と同定された。
【００４９】
比較例４
比較例３と同様にして図２のスポットＩ、ＩＩａおよびＩＩｂは、それぞれサイモシンベータ４（７ｋＤａ）、スタスミン（Ｍｗ １８ｋＤａ、ｐＩ ５．９）、リン酸化スタスミン（Ｍｗ １８．５ｋＤａ、ｐＩ ５．６）と同定された。
【００５０】
実施例１
サンプルＡを本発明の二次元電気泳動法で解析した。２．７μｇ／μｌのタンパク質濃度を有する２μｌのサンプルＡをＨＣｌでｐＨ５に調整した。泳動用緩衝液をホウ酸でｐＨ９．３に調整した。電気泳動には、Ｈｉｔａｃｈｉ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ社製のマイクロチップ電気泳動装置ｃｏｓｍｏ−ｉ １１００およびＨｉｔａｃｈｉｃｈｅｍｉｃａｌ社製のｉ−ｃｈｉｐ３のキット内のマイクロチップを用いた。泳動用緩衝液をローディングチャネルおよび分離用チャネルそれぞれに満たし、サンプルＡを試料用リザーバーに入れ、ローディングチャネル内を２．５〜５ｋＰａで１秒間加圧することによりサンプルＡをローディングチャネルと分離用チャネルとの交差部に移動させた。その後、分離用チャネル内を１ｋＰａで３秒間加圧し、８９０Ｖ／ｃｍの泳動電場で１５秒間分離を行った。その結果を図３に示す。比較例１で見出されたスポットＩの７ｋＤａおよびスポットＩＩａの１８ｋＤａのそれぞれのピークを検出した。
【００５１】
実施例２
サンプルＢを実施例１と同様にして二次元電気泳動に供した。その結果を図４に示す。７ｋＤａ付近（スポットＩ）に１本のピークおよび１８ｋＤａ付近に比較例２と同様にスポットＩＩａ（ｐＩ ５．９、Ｍｗ １８ｋＤａ）およびＩＩｂ（Ｍｗ １８．５ｋＤａ）の２本のピークの出現が認められた。これは、ｐＨ５の試料とｐＨ９．７のバッファーとを使用することにより分離用チャネル内にｐＨの勾配が形成されたためであると思われる。本発明の二次元電気泳動法により、分子量分離と等電点分離との両方が１チャネル内で達成されたことがわかる。
【００５２】
実施例１および２の二次元電気泳動法においてタンパク質の解析に要した時間は、１５秒であった。また、使用したタンパク質は５．４μｇであり、使用した試薬（泳動用緩衝液）は３５μｌであった。このことから、本発明の二次元電気泳動法は、比較例１および２の従来の二次元電気泳動法と比べて極めて迅速に、かつ少量の試薬によりタンパク質の分離を行いうることがわかる。
【００５３】
比較例５
電気泳動装置（Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ；Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いてサンプルＡを従来のマイクロチップ型電気泳動に供した。泳動用緩衝液およびマイクロチップはマイクロチップキット（ｐｒｏｔｅｉｎ２００ Ｐｌｕｓ；ｃａｌｉｐｅｒ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた。電気泳動の条件は、Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒに添付のマニュアルに従った。サンプルのｐＨは７、バッファーのｐＨは７．６であった。結果を図５に示す。７ｋＤａおよび１８ｋＤａのそれぞれのピークが分子量マーカーまたはシステムピークと重なるため、図１で得られたスポットＩおよびＩＩａのそれぞれサイモシンベータ４およびスタスミンのピークを確認することはできなかった。
【００５４】
比較例６
サンプルＢを比較例５と同様にして従来のマイクロチップ型電気泳動に供した。その結果を図６に示す。７ｋＤａおよび１８ｋＤａのピークが分子量マーカーまたはシステムピークと重なるため、図２で得られたスポットＩ、ＩＩａおよびＩＩｂのそれぞれサイモシンベータ４、スタスミン（Ｍｗ １８ｋＤａ、ｐＩ ５．９）およびリン酸化スタスミン（Ｍｗ １８．５ｋＤａ、ｐＩ ５．６）のピークを確認することはできなかった。これらの結果より、従来型のマイクロチップ型電気泳動法では、分子量分離と等電点分離を１チャネルで１回の電気泳動で行うことは不可能であった。
【００５５】
【発明の効果】
本発明により、分子量がほぼ同一で等電点が異なるタンパク質を１チャネル上で１回の電気泳動により迅速に分離しうる二次元電気泳動法が提供される。かかる電気泳動法は、リン酸化等の翻訳後修飾の解析やターゲットプロテイン（病気診断用マーカープロテイン）の分離に適用可能であり、今後のプロテオミクス研究への応用が期待されるものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、従来の二次元電気泳動法によりジャルカット細胞由来のタンパク質を分離した結果を示す図である。
【図２】図２は、従来の二次元電気泳動法によりジャルカット細胞由来のタンパク質を分離した結果を示す図である。
【図３】図３は、本発明の二次元電気泳動法によりジャルカット細胞由来のタンパク質を分離した結果を示す図である。
【図４】図４は、本発明の二次元電気泳動法によりジャルカット細胞由来のタンパク質を分離した結果を示す図である。
【図５】図５は、従来のマイクロチップ型電気泳動法によりジャルカット細胞由来のタンパク質を分離した結果を示す図である。
【図６】図６は、従来のマイクロチップ型電気泳動法によりジャルカット細胞由来のタンパク質を分離した結果を示す図である。
Claims (5)
- ローディングチャネルと、該ローディングチャネルに交差する分離用チャネルとを備え、かつ該ローディングチャネルの一端に試料リザーバーが配置され、該ローディングチャネルの他端にアウトレットが配置されたマイクロチップであって、該ローディングチャネルおよび分離用チャネルのそれぞれに泳動用緩衝液が充填されたマイクロチップにおいて、
（ａ） 泳動用緩衝液のｐＨとは少なくとも２異なるｐＨを有し、かつタンパク質を含有した試料を該試料リザーバーに供するステップ、
（ｂ） 該ローディングチャネル内を加圧することにより、該試料リザーバー中の該試料を分離用チャネルに導入するステップ、および
（ｃ） 該分離用チャネルに泳動電場を負荷して該試料を分離チャネル内で泳動させるステップ
を含む、タンパク質の分子量による分離および等電点による分離を同時に行う二次元電気泳動法。 - ステップ（ｃ）において、分離用チャネルに泳動電場を負荷する前に該分離用チャネル内を０．５〜２ｋＰａで２〜８秒間加圧することを含む、請求項１記載の二次元電気泳動法。
- 泳動用緩衝液のｐＨと試料のｐＨとの差が２〜９である、請求項１または２記載の二次元電気泳動法。
- ステップ（ｂ）の加圧が、２〜７ｋＰａで１〜３０秒間の加圧である、請求項１〜３いずれか記載の二次元電気泳動法。
- 泳動したタンパク質を検出するステップをさらに含む、請求項１〜４いずれか記載の二次元電気泳動法。
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|---|---|---|---|---|
| WO2008065986A1 (fr) * | 2006-12-01 | 2008-06-05 | Nec Corporation | Procédé de séparation de points isoélectrique et procédé de détermination de gradient de concentration d'ion hydrogène dans le champ de séparation |
-
2002
- 2002-10-29 JP JP2002315027A patent/JP2004150899A/ja active Pending
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