JP2005531756A - 電気泳動法 - Google Patents
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Abstract
Description
本明細書において、「ペプチド」という用語は、さらに小さいペプチド及びさらに長いポリペプチドの両方を含むことが理解される。従って、「タンパク質及び/又はペプチド」という用語は、本明細書において用いられる場合、ペプチド結合によって共有結合されるアミノ酸の鎖からなる任意の分子を包含する。
本発明の第一の局面は、試料の1以上のタンパク質及び/又はペプチド成分の電気泳動分離の方法であって、この方法は、
(a)上記試料を対流安定化分離媒体と接触させる工程と、
(b)この媒体の両側に電圧を印加する工程と、
(c)この分離媒体の1以上のセクションの分析によって得られた分離結果を観察する工程と
を含み、ここでジスルフィド含有化合物が、この分離手順の間にこの成分に過剰の反応性ジスルフィド基を提供するのに十分な量で添加される。工程(c)による観察は、得られた結果を評価する任意の従来の方法、例えば、定性的分析及び/又は定量的分析であってもよい。本明細書において、ジスルフィド含有化合物はときどき、単にジスルフィドと称される。
チオン型は、S−S結合の破壊を促進する、なぜなら、この遊離されたチオールは、ピリジンジスルフィドの高い反応性を説明するチオン型の共鳴によって安定化されるからである。チオピリジル化合物との反応は、pH値で進行し、ここでチオール−ジスルフィド交換は遅いか又は存在しない。実際、ピリジルジスルフィドでのチオール−ジスルフィド交換は、1〜9のpH値の範囲で実施することができる。
チオール−ジスルフィド交換によって、触媒量のチオールが存在する場合、ジスルフィド−ジスルフィド交換が生じることが可能になる。この反応は一般的な反応である。例えば、タンパク質−S−S基は、非タンパク質ジスルフィドとの反応に対して混成ジスルフィドを与える。この順序は、触媒性チオールとしてRSHを用いるのだが、以下の通りである:
図1は、従来技術の方法によって泳動したSDS電気泳動実験の結果と、ジヒドロキシエチルジスルフィドを含むゲル中で行なっている本発明の方法とを比較している。
本実施例は、例示の目的でのみ提供されており、添付の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲を限定するとして解釈すべきではない。本明細書において以下にいずれかに示される全ての引用文献は本明細書において参考として援用される。
Claims (28)
- 試料中の1以上のタンパク質及び/又はペプチド成分の電気泳動分離の方法であって、当該方法が、
(a)上記試料を対流安定化分離媒体と接触させる工程と、
(b)上記媒体の両側に電圧を印加する工程と、
(c)上記分離媒体の1以上のセクションの分析によって得られた分離結果を観察する工程と
を含み、分離処理時の上記成分に過剰の反応性ジスルフィド基を与えるのに十分な量のジスルフィド含有化合物を添加する、方法。 - ジスルフィド含有化合物が、工程(a)の前に分離媒体及び/又は試料に添加される、請求項1記載の方法。
- 前記分離媒体がキャピラリー寸法の1以上の表面又は空間を含む、請求項1又は請求項2記載の方法。
- 前記分離媒体がゲルを含む、請求項1乃至請求項3のいずれか1項記載の方法。
- 前記ゲルが工程(a)の前にジスルフィド含有化合物を含む液体で処理される、請求項4記載の方法。
- 電気泳動中の分離媒体のpH及びイオン強度の条件を実質的に一定に保持するために1以上の緩衝液を添加する、請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の方法。
- 前記試料を荷電界面活性剤で処理してその内部にタンパク質及び/又はポリペプチドの荷電をマスクした後で、試料を分離媒体とさせて、タンパク質及び/又はペプチドをそれぞれの分子量に応じて分離する、請求項6記載の方法。
- 対流安定化分離媒体の分離距離全体に荷電基又は荷電性基を提供することによって定常pH勾配を形成し、タンパク質/又はポリペプチドをそれぞれの等電点に応じて分離する、請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の方法。
- 前記荷電基又は荷電性基が非移動性でマトリックスに固着している、請求項8記載の方法。
- 前記マトリックスが分離媒体である、請求項9記載の方法。
- 前記分離媒体が両性電解質担体を含む、請求項8乃至請求項10のいずれか1項記載の方法。
- 当該方法が、メンブランで互いに隔てられた2以上のチャンバを備える装置で実施される、請求項11記載の方法。
- 荷電基又は荷電性基を対流安定化分離媒体の分離距離の一部に提供し、電場に輸送することによってpH及び/又はイオン強度勾配を形成し、タンパク質及び/又はポリペプチドをそれぞれの移動速度に応じて分離する、請求項1乃至請求項5のいずれか1項記載の方法。
- 分離媒体が両性電解質担体を含む、請求項13記載の方法。
- 前記ジスルフィド基が、分離が実施されるpH範囲では荷電しないジスルフィド含有化合物の添加によって与えられる、請求項1乃至請求項14のいずれか1項記載の方法。
- 前記ジスルフィド基が、システインのチオール基のpKaを上回るpKaをもつジスルフィド含有化合物の添加によって与えられる、請求項1乃至請求項15のいずれか1項記載の方法。
- 前記ジスルフィド基が、ビス−(2−ヒドロキシエチル)ジスルフィド、ビス−(2−ヒドロキシプロピル)ジスルフィド、3,3−ジプロピオンアミドジスルフィド及び2,2′−ジピリジルジスルフィドからなる群から選択されるジスルフィド含有化合物の添加によって与えられる、請求項1乃至請求項16のいずれか1項記載の方法。
- 電気泳動用ゲルを再水和するための、反応性ジスルフィド含有化合物を含む溶液の使用。
- 前記溶液が、尿素、非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤及び両性電解質担体の1種類以上をさらに含む、請求項18記載の使用。
- 前記溶液が、約8M尿素と、0.5〜2%の両性電解質担体、非イオン性界面活性剤又は両性界面活性剤と、還元剤とを含む、請求項19記載の使用
- 溶液中に反応性ジスルフィド含有化合物を含む、タンパク質及び/又はペプチドの電気泳動分離用試薬。
- ビス−(2−ヒドロキシエチル)ジスルフィド、ビス−(2−ヒドロキシプロピル)ジスルフィド、3,3−ジプロピオンアミドジスルフィド及び2,2′−ジピリジルジスルフィドからなる群から選択されるジスルフィド含有化合物を含む、請求項21記載の試薬。
- 過剰の反応性ジスルフィド基を含む、電気泳動用ゲル。
- 当該ゲルがポリアクリルアミドゲルである、請求項23記載のゲル。
- 当該ゲルに導入された反応性ジスルフィド基を含む、請求項23又は請求項24記載のゲル。
- 当該ゲルがアガロースゲルであって、その固化前にジスルフィド基が導入されている、請求項23記載のゲル。
- 電気泳動用乾燥ゲルと前処理用再水和溶液を備える、キット。
- 過剰の反応性ジスルフィド含有化合物に触媒量の還元剤を補充した、タンパク質及び/又はペプチド用の安定化溶液。
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