KR100647054B1 - 단백질의 전기영동법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 열변성의 전처리 공정을 실시하지 않고 네이티브한 상태에서 단백질을 신속하게 해석할 수 있으며, 고감도인 전기영동법을 제공한다. 본 발명의 단백질의 전기영동법은, 프로테오솜 해석 및 의료 진단에 유용하다.

Description

단백질의 전기영동법{METHOD OF ELECTROPHORESING PROTEIN}

본 발명은, 단백질의 고속이면서 고감도인 전기영동법에 관한 것이다.

단백질은, 일반적으로는 SDS-PAGE (폴리아크릴아미드 겔 전기영동) 법에 근거하여, 사이즈 분리되고, 검출된다. 이것을 캐필러리 전기영동 (capillary electrophoresis) 에 응용한 것이 SDS-CGE (캐필러리 겔 전기영동) 이고, 이것을 또한 마이크로 칩형 전기영동에 응용한 방법으로서, Protein 200 키트를 사용한 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies 사 제조) 에서의 해석을 들 수 있다. 단백질은 네이티브한 상태에서는 각종 전하를 가지고 있어, 플러스로 하전된 단백질은 플러스 전기장에서는 이동이 일어나지 않는 것을 알 수 있다. 이 때문에, 상기 종래법에서는, 통상 모든 피검 단백질이 마이너스 전하를 갖도록 전처리로서 단백질의 열변성 처리를 실시할 필요가 있다. 열변성 처리는 통상, 계면활성제 도데실황산나트륨 (SDS) 용액과 2-메르캅토에탄올 또는 디티오스레이톨 등의 환원제 중에서 단백질을 95∼100℃ 에서 수분간 가열함으로써 달성된다. 2-메르캅토에탄올 또는 디티오스레이톨은 S-S 결합의 절단을 위해, 또한 SDS 는 모든 단백질의 전하를 마이너스 전하로 하기 위해 사용된다.

이 때문에, 마이크로 칩형 전기영동에 의해 분석 공정이 고속화되었다고 해 도, SDS-PAGE 법이나 SDS-CGE 법 등의 종래법에서는 이 전처리 공정의 시간이 단축되지 않고, 조작이 번잡하다는 결점을 가지고 있다. 이 때문에, 보다 신속한 단백질의 전기영동법이 요망되고 있다. 또한, 생체 시료를 해석하는 경우, 시료 중의 극히 미량의 단백질을 해석할 필요가 있어, 보다 고감도의 전기영동법이 요망되고 있다.

발명의 개시

본 발명은, 열변성의 전처리 공정을 실시하지 않고 네이티브한 상태에서 단백질을 신속하게 해석할 수 있으며, 게다가 고감도인 전기영동법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

즉, 본 발명의 요지는,

[1] 단백질을 열변성 처리하지 않고 사이즈 분리의 전기영동에 제공하는 것을 특징으로 하는 전기영동법,

[2] 물에 용해시킨 단백질을 전기영동에 제공하는 것을 특징으로 하는 상기 [1] 에 기재된 전기영동법,

[3] 2 개 또는 그 이상의 분자량 마커를 단백질과 함께 전기영동에 제공하고, 그 마커 중 적어도 하나를 표준 농도와 비교하여 저농도로 하는 것을 특징으로 하는 상기 [1] 또는 [2] 에 기재된 전기영동법,

[4] 2 개 또는 그 이상의 분자량 마커를 단백질과 함께 전기영동에 제공하고, 그 마커의 하나를 피검 단백질 농도의 1/10∼10 배의 농도로 하는 것을 특징으로 하는 상기 [1] ∼ [3] 중 어느 한 항에 기재된 전기영동법,

[5] 전기영동의 형태가, 캐필러리 전기영동법, 마이크로 칩형 전기영동법 및 나노 채널형 전기영동법으로 이루어지는 군에서 선택된 것인 상기 [1] ∼ [4] 중 어느 한 항에 기재된 전기영동법,

에 관한 것이다.

도 1 은, 마이크로 칩형 전기영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.

도 2 는, 마이크로 칩형 전기영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.

도 3 은, 마이크로 칩형 전기영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.

도 4 는, 마이크로 칩형 전기영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.

도 5 는, 마이크로 칩형 전기영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.

도 6 은, 마이크로 칩형 전기영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.

도 7 은, 마이크로 칩형 전기영동에 있어서, 영동 조건을 검토한 결과를 나타내는 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명의 단백질의 전기영동법은, 단백질을 열변성 처리하지 않고 사이즈 분리를 목적으로 한 전기영동에 제공하는 것을 하나의 큰 특징으로 한다. 본 발명의 전기영동법은, 열변성 처리를 하지 않음으로써 전기영동의 분석 시간을 단축할 수 있고, 조작을 간편화할 수 있다는 이점을 갖는다.

본 명세서에 있어서, 단백질이란, 복수의 아미노산이 펩티드 결합에 의해 연결된 화합물을 말하고, 천연 유래물, 합성물 및 단쇄의 펩티드도 포함하는 것을 의미한다.

본 발명의 전기영동법에 있어서 해석될 수 있는 단백질로는 특별히 한정되지 않고, 천연 유래물, 합성물 및 아미노산 이외의 구성 성분을 함유하는 핵 단백질, 당 단백질, 리포 단백질 등을 해석할 수 있지만 수용성 단백질에 특히 바람직하게 사용된다. 측정 가능한 분자 사이즈는, 마커를 적절히 설정함으로써 모든 사이즈의 단백질이 해석 가능해지지만, 특히 6kDa∼210kDa 의 단백질이 바람직하게 해석될 수 있다. 또, 막 결합된 단백질 등은 가용화 후에 본 발명의 전기영동법에 적용시키는 것이 바람직하다. 이를 위한 가용화 처리는 염 용액이나 EDTA 등의 킬레이트제, 초음파 등의 기계적 처리, 또는 계면활성제에서의 처리 등에 의해 달성된다.

본 발명의 전기영동법에 사용하는 분리용 담체로는 특별히 한정되지 않고, 통상적인 캐필러리 겔 전기영동 또는 마이크로 칩형 겔 전기영동 등에 있어서 단백질의 분자 사이즈 분리 분석용으로 사용되는, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴아미드 겔, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시메틸프로필셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰 로오스, 메틸셀룰로오스, β-시클로덱스트린, α-시클로덱스트린, γ-시클로덱스트린 등의 분리용 담체를 들 수 있고, 또한, WO 02/097421 에 기재된 β-1, 3 글루칸 구조를 함유하는 커드란 (curdlan), 라미나란 (laminaran) 이나 해조 추출물 등에도 적용 가능하다. 분리용 담체의 첨가제로는, 도데실황산나트륨 (SDS), Triton X-100, ε-아미노카프론산, 3-[(3-코라미드프로필)-디메틸아미노]-1-프로판, CHAPS, 6∼8M 우레아, 테트라메틸에틸렌디아민 (TEMED), 헥실트리메틸암모늄브로마이드 (HTAB), 도데실트리메틸암모늄브로마이드 (DTAB) 등을 들 수 있다.

영동용 완충액으로는, 예를 들어, 트리스-글리신 버퍼, 트리스-붕산 버퍼, 트리스-염산 버퍼, 트리스-트리신 버퍼, 트리스-인산이수소나트륨 버퍼 등이나, 일반적으로 단백질의 전기영동용 완충액으로 사용되는 완충액을 들 수 있고, 시판되는 단백질 전기영동용 키트 중에 제공되는 완충액 등도 사용할 수 있다. 상기 영동용 완충액은, 일반적으로 단백질의 전기영동용 완충액으로서 사용되는 농도로 사용할 수 있다.

영동용 완충액은, 상기 분리용 담체를 함유하고 있어도 된다. 분리용 담체를 영동용 완충액에 첨가하여 사용함으로써, 조작을 간편하게 할 수 있고, 해석을 보다 고속에서 실시할 수 있다.

영동용 완충액의 pH 는, 적절한 전기 침투류 및 단백질의 바람직한 전기영동의 관점에서 2.0∼9.0 이 바람직하고, 6.8∼8.6 이 보다 바람직하다.

시료 조제용 용액으로는, 물, SDS 용액, 또는 SDS-트리스붕산 용액 등에 2-메르캅토에탄올 또는 디티오스레이톨을 첨가한 것 등을 사용할 수 있다. 피크 강도의 향상, 피크 분리도의 향상, 검출 한계의 향상 및 측정 정밀도의 향상의 관점에서 물이 특히 바람직하다.

물로는, 초순수, 탈이온수, Milli Q 수(水) 등, 단백질의 전기영동에 통상적으로 사용되는 물을 사용할 수 있고, Milli Q 수가 특히 바람직하다.

또한, 물을 시료 조제용 용액으로서 사용하는 경우, 피크 강도의 증강, 검출 한계 향상의 관점에서 단백질을 물에 용해시키는 것이 바람직하다.

시료 용액 중의 단백질의 농도로는, 측정 정밀도의 관점에서, 0.05∼2000ng/㎕ 가 바람직하고, 0.1∼2000ng/㎕ 가 보다 바람직하며, 0.5∼200ng/㎕ 가 특히 바람직하다.

본 발명의 전기영동법이 사용될 수 있는 바람직한 형태로는, 캐필러리 전기영동, 마이크로 칩형 전기영동, 및 나노 채널형 전기영동을 들 수 있다.

캐필러리 전기영동은, 통상 내경이 100㎛ 이하인 캐필러리 안에 영동용 완충액을 충전하고, 일단측에 시료를 도입한 후, 양단 사이에 고전압을 인가하여 피검 단백질을 캐필러리 안에서 전개시키는 것이다. 캐필러리로는, 휴누드 실리카 캐필러리가 통상 사용되고, 그 내벽이 코팅되어 있지 않은 것, 내벽이 코팅되어 있는 것 (50% 페닐메틸폴리실록산, 폴리에틸렌글리콜, 폴리아민 등) 이 사용된다. 또한, 코팅되어 있지 않은 것에 PEO' (폴리에틸렌옥사이드) 등으로 처리한 것도 사용할 수 있다.

캐필러리 전기영동의 형태에서는, 본 발명의 전기영동법은, 구체적으로는, 단백질을 함유하는 시료를 열변성시키지 않고, 시료를 캐필러리에 인젝트한 후, 단 백질의 분리가 가능한 영동 전기장 하에 단백질을 이동시키는 공정, 및 영동 전기장에 의해 단백질을 영동시키는 공정을 포함하는 프로세스에 의해 실시된다.

시료를 캐필러리에 인젝트하고, 단백질의 분리가 가능한 영동 전기장 하에 단백질을 이동시키는 공정은, 보다 구체적으로는 전압법, 가압법, 낙차법에 의해 실시되지만, 장치의 종류나, 캐필러리의 굵기 (내부 직경) 나 길이 등에 따라서 전압이나 가해지는 압력의 크기 및 이들에 제공되는 시간이 적절히 정해진다. 또, WO 02/097421 에 기재된 방법도 적용 가능하다.

캐필러리 전기영동에 사용되는 캐필러리에 있어서, 내경, 외경, 전체 길이, 유효 길이는 특별히 한정되지 않고, 통상적으로 사용되는 사이즈의 것을 사용할 수 있다. 유효 길이에 관해서, 고속에서의 해석을 가능하게 한다는 관점에서 유효 길이가 짧은 캐필러리를 사용할 수 있다. 여기서, 캐필러리의 유효 길이란, 시료 주입구로부터 검출부까지의 거리를 말한다.

캐필러리 전기영동에 있어서의 영동 전기장은, 양호한 분리능을 얻고, 이동시간을 단축시키는 관점에서, 바람직하게는 20V/cm∼10kV/cm 이고, 보다 바람직하게는 50V/cm∼5kV/cm 이고, 특히 바람직하게는 100V/cm∼1kV/cm 이다.

마이크로 칩형 전기영동에 있어서는, 로딩 채널과, 그 로딩 채널에 교차하는 분리용 채널을 구비하고, 또한 그 로딩 채널의 일단에 시료 리저버가 배치되고, 그 로딩 채널의 타단에 아웃렛이 배치된 마이크로 칩을 사용할 수 있다.

마이크로 칩형 전기영동의 형태에서는, 본 발명의 전기영동법은, 구체적으로는, 단백질을 함유하는 시료를 열변성시키지 않고 시료 리저버에 시료를 제공하는 공정, 그 시료 리저버 중의 시료를 분리용 채널에 도입하는 공정, 및 분리용 채널에 있어서 시료를 영동시키는 공정을 포함하는 프로세스에 의해 수행된다.

시료 리저버에 시료를 제공하는 공정은, 보다 구체적으로는, 로딩 채널의 일단의 시료 리저버와 타단의 아웃렛에 전압을 가함으로써 달성된다. 전압의 강도는 장치에 따라 다르지만, SV1100 (히타치덴시사 제조) 의 경우, 50∼800V, 통상 300V 의 전압이 가해진다. 이것에 의해 시료가 로딩 채널과 분리용 채널의 교차부에 제공된다. 한편, WO 02/097421 에 기재된 방법도 적용 가능하다.

시료 리저버 중의 시료를 분리용 채널에 도입하는 공정은, 보다 구체적으로는, 로딩 채널의 일단의 시료 리저버와 타단의 아웃렛에 스퀴징 전압을 가하여 여분의 시료를 시료 리저버와 타단의 아웃렛측에 배출하는 공정 및 분리용 채널의 아웃렛측과, 그 반대측에 분리 전압을 가하는 공정이 동시에 달성된다. 전압의 강도는 장치에 따라 적절히 선택되지만, SV1100 (히타치덴시사 제조) 의 경우, 전자는 130V 전후, 후자는 700∼900V 에서 달성된다. 한편, WO 02/097421 에 기재된 방법도 적용 가능하다.

마이크로 칩의 재질로는, 예를 들어, 석영 유리, 붕규산 유리, 소다 유리, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리카보네이트, 디메틸실록산 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 시료의 흡착이 적고 칩 가공이 용이하다는 관점에서, 유리 또는 폴리메틸메타크릴레이트가 바람직하다. 또한, 캐필러리와 마찬가지로 내벽을 가공 처리한 것도 사용할 수 있다.

마이크로 칩형 전기영동에서는, 마이크로 칩의 크기는, 예를 들어 세로 10∼120㎜, 가로 10∼120㎜, 두께 500∼5000㎛ 이다.

마이크로 칩에 있어서의 로딩 채널 및 분리용 채널의 각각의 형상은 특별히 한정되지 않는다. 또, 상기 채널이 한 장의 칩 위에 3∼96 개 설치된, 동시에 다채널을 해석할 수 있는 칩을 사용할 수도 있다. 다채널의 나열 방법은, 병행, 방사선형상, 원형상 등이 있고, 그 형상이 특별히 한정되는 것이 아니다.

상기 채널의 폭은, 마이크로 칩의 크기, 사용 목적 등에 따라서 적절히 설정될 수 있다. 구체적으로는, 채널의 폭은 충분한 해석 감도를 얻는 관점에서, 0.1㎛ 이상, 바람직하게는 10㎛ 이상이고, 충분한 해석 정밀도를 얻는 관점에서, 100㎛ 이하, 바람직하게는 50㎛ 이하인 것이 바람직하다. 또한, 상기 채널의 깊이는, 마이크로 칩의 크기, 사용 목적 등에 따라서 적절히 설정될 수 있다. 구체적으로는, 충분한 해석 감도를 얻는 관점에서, 0.1㎛ 이상, 바람직하게는 10㎛ 이상이고, 충분한 해석 정밀도를 얻는 관점에서, 100㎛ 이하, 바람직하게는 50㎛ 이하인 것이 바람직하다. 또, 상기 분리용 채널의 길이는, 마이크로 칩의 크기 및 해석 대상인 화합물에 따라서 적절히 선택할 수 있지만, 유효 길이를 보다 길게 하는 것이 바람직하다. 유효 길이는, 채널 교차부에서 고분자 화합물의 검출점 (분리용 채널 위에 배치) 까지의 거리를 말한다. 충분한 분리능을 얻는 관점에서, 0.1mm 이상, 바람직하게는 10mm 이상이고, 고속 분리의 관점에서, 100㎜ 이하, 바람직하게는 50㎜ 이하인 것이 바람직하다.

또한, 상기 리저버의 크기는 시료의 용량에 따라 적절히 설정할 수 있다. 구체적으로는, 시료 도입의 핸들링 및 전극의 굵기의 관점에서, 직경이 0.05㎜ 이 상, 바람직하게는 3㎜ 이하인 것이 바람직하다.

마이크로 칩형 전기영동에서의 영동 전기장은, 양호한 분리능을 얻고, 이동 시간을 단축시키는 관점에서 20V/cm∼50kV/cm 이고, 바람직하게는 50V/cm∼20kV/cm 이고, 보다 바람직하게는 100V/cm∼10kV/cm 인 것이 바람직하다.

나노 채널형 전기영동이란, 나노미터 사이즈, 1nm∼1㎛, 바람직하게는 10∼500nm, 보다 바람직하게는 50∼100nm 의 채널폭으로 이루어지는 유로가 형성된 칩을 사용하여 수행되는 전기영동을 말한다. 이것에는 상기에 기재된 나노 사이즈의 구조체가 마이크로미터 사이즈의 채널에 형성되어 있는 것을 포함한다. 나노 사이즈의 구조체의 형상은 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 사각, 원(丸), 삼각 등의 것을 사용할 수 있고, 구조체의 설치 간격도 특별히 한정되지 않는다. 이들이 형성된 나노 채널 칩을 사용할 수 있다. 캐필러리 전기영동의 경우와 마찬가지로 동시에 다채널 해석이 가능한 칩도 포함된다.

나노 채널형 전기영동에서의 채널은, 사이즈가 나노미터라는 특징을 갖는 채널의 형상이 곡률을 가진 것, 구불구불한 형상, 지그재그형상 또는 이들의 조합 등 다양한 설계가 가능하다. 이것에 의해, 미소 스케일 내에 많은 채널을 형성할 수 있다. 또한, 이것에 의해 한번에 다수의 샘플을 처리할 수 있어 하이 스루풋화가 가능하다. 또한 나노 사이즈의 구조체가 마이크로미터 사이즈의 채널에 형성되는 경우, 그 형상을 자유롭게 바꿀 수 있고, 그 설치 간격도 자유롭게 변경할 수 있다는 이점을 갖는다. 동시에 다채널의 측정이 가능하다.

나노 채널형 전기영동에서도 마이크로 칩형 전기영동과 동일하게 로딩 채널, 그 로딩 채널에 교차하는 분리용 채널, 그 로딩 채널의 일단에 시료 리저버, 그 로딩 채널의 타단에 아웃렛이 배치된 것을 포함하고, 형상은 특별히 한정되지 않는다.

나노 채널형 전기영동에 사용되는 나노 채널 칩의 재질로는 마이크로 칩과 동일한 것을 사용할 수 있다. 예를 들어, 석영 유리, 붕규산 유리, 소다 유리, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리카보네이트, 디메틸실록산 등을 들 수 있다.

나노 채널형 전기영동에서의 나노 채널 칩의 크기는 마이크로 칩과 동일한 것을 적용할 수 있다. 예를 들어 세로 10∼120㎜, 가로 10∼120mm, 두께 500∼5000㎛ 이다. 나노 채널 칩의 채널의 깊이, 채널의 길이, 리저버의 크기 등은 마이크로 칩에 준한다.

본 발명의 단백질의 전기영동법에서는, 분자량 마커를 단백질 시료와 함께 전기영동에 제공할 수 있다. 분자량 마커로는, Agilent Technologies No. 5065-4430 의 분자 사이즈 6kDa, 분자 사이즈 210kDa 의 Myosin, HMW, LMW 마커 키트 (Amersham Pharmacia Biotech 사) 등의 단백질의 전기영동에 통상적으로 사용되는 시판되는 분자량 마커나, 시판되는 분자량 및 농도가 알려져 있는 표준 시료의 단백질이나 생체 시료로부터 정제 및/또는 정량한 단백질을 함유하는 분자량 마커를 사용할 수 있다. 이들 분자량 마커는 조합하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 단백질의 전기영동법에서는, 분자량 마커로서, 피검 단백질에 대하여 측정 가능한 범위 내에서 저분자량측 및 고분자량측이 되는 2 개의 분자량 마커를 사용할 수도 있다. 이것에 의해, 보다 양호한 이동 시간의 조정과 정량을 달성할 수 있다. 본 명세서 중에서는, 저분자량측의 분자량 마커를 「하부(Lower) 마커」라고 하고, 고분자량측의 분자량 마커를 「상부(Upper)마커」라고 한다.

하부 마커로는, 예를 들어, 분자 사이즈 6kDa 의 Agilent Technologies No.5065-4430 를 들 수 있다. 상부 마커로는, 예를 들어, 분자 사이즈 210kDa 의 Myosin 을 들 수 있다.

본 발명의 단백질의 전기영동법에서는, 하부 마커 및 상부 마커에 다른 분자량 마커를 조합하여 사용할 수도 있다.

분자량 마커의 사용량으로는, 단백질의 전기영동에서 일반적으로 사용되는 양으로 사용할 수 있다. 장치의 종류, 그 장치에서의 검출 한계, 검출 감도 및 측정 정밀도 등에 따라서 제조업자 또는 일반적인 프로토콜에 의해 권장되는 시료 용액 중의 분자량 마커의 농도를, 본 명세서 중에서는 단백질의 전기영동에 통상 사용되는 농도로서 「표준 농도」라고 부른다. 예를 들어, Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies 사 제조) 에 있어서는, 피검 농도, 검출 감도 및 측정 정밀도의 관점에서 시료 용액 중 74ng/㎖ 전후가 특히 바람직하고, 이 농도가 표준 농도가 된다.

본 발명의 단백질의 전기영동법에서는, 2 이상의 분자량 마커를 사용하는 경우, 적어도 하나의 분자량 마커를 표준 농도와 비교하여 저농도, 바람직하게는 표준 농도의 1/30∼1/2, 보다 바람직하게는 1/15∼1/3, 특히 바람직하게는 1/10∼2/7 의 농도로 사용함으로써 분석 대상인 단백질의 검출 감도를 향상시킬 수 있다. 이것은, 저농도 영역의 눈금을 확대함으로써 검출 감도가 검출 정밀도를 상회하기 때문이다. 또 희석 마커를 사용함으로써 이미 만들어 놓은 마커 용액 중의 이온을 희석할 수 있다. 한편, 영동 중의 이온 강도가 낮을수록 감도는 높기 때문에, 최종적으로 감도를 상승시킬 수 있다.

상기 태양에 있어서, 하부 마커 및/또는 상부 마커를 표준 농도와 비교하여 저농도로 하여 사용할 수도 있다. 하부 마커를 표준 농도와 비교하여 저농도로 사용하는 경우에는, 바람직하게는 표준 농도의 1/30∼1/2 의 농도, 보다 바람직하게는 1/15∼1/3 의 농도, 특히 바람직하게는 1/10∼2/7 의 농도로, 한편, 상부 마커를 표준 농도와 비교하여 저농도로 사용하는 경우에는, 바람직하게는 표준 농도의 1/20∼2/3 의 농도, 보다 바람직하게는 1/15∼1/3 의 농도, 특히 바람직하게는 1/10∼2/7 의 농도로 사용함으로써 분석 대상인 단백질의 검출 감도를 향상시킬 수 있다. 또한, 하부 마커 및/또는 상부 마커를 각각의 표준 농도보다도 저농도로 사용하고, 추가로 다른 마커를 조합하여 사용할 수도 있다.

또한, 본 발명의 단백질의 전기영동법에서는, 2 이상의 마커를 사용하는 경우, 그 중의 하나를 측정 시료에서의 피검 단백질의 농도와 실질적으로 동등 또는 근사한 농도로 함으로써, 피검 단백질의 검출 감도를 향상시킬 수 있다. 이것은, 피검 단백질과 실질적으로 동등 또는 근사한 농도로 분자량 마커의 농도가 설정되는 것, 및 마커의 눈금에 가까운 위치에서 측정이 이루어짐으로써, 양호한 정밀도로 측정할 수 있기 때문이다. 피검 단백질의 농도와 실질적으로 동등 또는 근사한 농도란, 구체적으로는, 측정 시료에서의 피검 단백질의 농도의 바람직하게 는 1/10∼10 배, 보다 바람직하게는 1/5∼5 배, 특히 바람직하게는 1/2∼2 배이다.

상기 태양에 있어서, 하부 마커 또는 상부 마커를 추가로 조합하여 사용할 수도 있다. 또, 하부 마커 또는 상부 마커를 피검 단백질의 농도와 동등 또는 근사한 농도로 하여 사용할 수도 있다. 또한, 피검 단백질과 동등 또는 근사한 농도로 하부 마커 또는 상부 마커를 사용하고, 추가로 다른 분자량 마커를 조합하여 사용할 수도 있다.

전기영동에 제공된 단백질의 검출법으로는, 예를 들어, UV 파장광에 의한 흡수, 형광, 레이저, 램프, LED 등에 의한 검출, 전기 화학적 검출, 화학 발광 검출 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 단백질 또는 펩티드의 경우, 200nm 에서의 흡수를 측정하는 것; SYPRO Orange 와 단백질 또는 펩티드를 반응시켜, 460∼550nm 에서 여기시키고, 550∼650nm 에서 형광을 측정하는 것, 또는 단백질과 형광 마커 (Agilent Technologies No. 5065-4430) 를 반응시켜, 630∼650nm 에서 여기시키고, 670∼700nm 에서 형광을 측정하는 것, 및 전기 화학적 측정, 화학 발광 측정 등에 의해 단백질 또는 펩티드를 검출할 수 있다.

캐필러리 전기영동에서는, 예를 들어, 캐필러리의 아웃렛에 UV 파장광을 발할 수 있는 장치와 그 UV 파장광의 검출기를 설치해도 되고, 또는 형광 파장을 발할 수 있는 장치와 그 형광 파장을 검출 가능한 검출기를 설치해도 된다.

마이크로 칩형 전기영동에서는, 예를 들어, 분리용 채널 위에 배치된 검출점에 UV 파장광의 검출기를 설치해도 되고, 또는, 형광 파장을 발할 수 있는 장치와 그 형광 파장을 검출 가능한 검출기를 설치해도 된다. 또 동시에 다채널을 검 출 가능하다.

나노 채널형 전기영동에서는, 마이크로 칩형 전기영동의 경우와 동일한 검출기 및 검출 방법이 적용된다. 또 나노 채널형 전기영동에서는, 동시 다채널 검출시, 마이크로 칩형 전기영동의 경우보다도 다수의 샘플을 동시에 검출 가능하다.

검출시, 단백질, 펩티드, 아미노산 등을 동정(同定)하는 경우에는, UV 흡수, 분자량 마커, 표품과의 이동 시간의 비교, 매스스펙트럼의 해석 등에 의해 동정할 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 조금도 한정되지 않는다.

실시예 중, 단백질의 전기영동은 모두 Agilent Technologies 사의 마이크로 칩형 전기영동 장치 Agilent 2100 Bioanalyzer 및 동 사의 Protein 200 Kit 를 사용하여 실시하였다. 종래법은, Agilent Technologies 권장의 프로토콜에 의해 실시하였다. 구체적으로는 다음의 1∼7 의 공정을 포함한다.

1. 3㎕ 의 상부 마커에 90㎕ 의 변성 처리용 완충액과 3㎕ 의 100mM 의 디티오스레이톨을 첨가하고, 볼텍스에 의해 5 초간 혼합한다.

2. 15㎕ 의 하부 마커 원액을 취하여, 1.0㎖ 의 milli Q 수와 혼합한다.

3. 3㎕ 의 래더(ladder)액 및 그와는 별도로 상기 1. 에서 제작한 변성 처리용 완충액의 혼합물 2㎕ 와 4㎕ 의 피검 단백질 샘플을 넣어 볼텍스에서 혼합하고, 1000×g 으로 5 초간 원심한다.

4. 상기 3 의 샘플을 100℃ 에서 5 분간 가열한다.

5. 가열 종료후 1∼2분간 방랭시킨다.

6. 가열ㆍ방랭 처리후의 래더액 및 피검 단백질액에 상기 2. 에서 조제한 하부 마커액을 84㎕ 씩 첨가하여 혼합한다.

7. 상기 6 의 조제물을 각 6㎕ 씩 피검 샘플로서 전기영동에 제공한다.

또, 본 발명의 단백질의 전기영동법에서는, 종래법과의 비교를 위해, 상기 Agilent Technologies 권장의 프로토콜을 토대로, 각 실시예에 기재된 변경점을 가하여 단백질의 전기영동을 실시하였다.

하부 마커로서, 분자 사이즈 6kDa 의 Agilent Technologies No. 5065-4430 을 사용하고, 상부 마커로서, 분자 사이즈 210kDa 의 미오신(myosin) 을 사용하였다.

또, 래더액이란, 분자 사이즈를 결정하기 위한, 분자량을 미리 알고 있는 표준 샘플이고, 다음의 것이 각각 74ng/㎖ 으로 함유된다:

리소자임 (14.3kDa), β-락토글로불린 (18.4kDa), 카르보닉안히드라아제 ( 29.0kDa), 오벌알부민 (43.0kDa), 혈청 알부민 (68.0kDa), 포스포릴라아제B (97.4kDa), 미오신 (210kDa).

실시예 1

도 1A∼D 는, 종래법에서의 단백질의 전처리 (열변성 처리) 를 실시한 후에 마이크로 칩형 전기영동을 실시한 경우의 일렉트로페로그램이고, 도 1E∼M 은 열변성 처리를 실시하지 않은 경우이다. 단백질로서 1㎍/㎕ 의 소혈청 알부민 (BSA) (SIGMA) 을 사용하였다.

이동 시간 20s 전후의 2 개의 피크는 하부 마커 유래의 것, 40s 부근의 하나의 피크는 상부 마커 유래의 것이다. BSA 의 피크는 25s∼30s 의 것이다.

종래법: 통상의 방법 (Agilent Technologies 권장 방법) 에 의한 결과를 도 1A 에 나타낸다. 이에 대하여, 도 1B 는 열변성 처리시, 디티오스레이톨을 첨가하지 않은 것이다. 또한 도 1C 는 열변성 처리시, 샘플 버퍼 (Agilent Technologies 의 키트 내의 것, SDS 가 함유된 완충액으로 생각된다) 대신에 SDS 가 함유되어 있지 않은 탈이온수 (ICN Biomedicals, Inc. 사 제조) 를 사용한 것이고, 도 1D 는, 탈이온수를 사용하고 디티오스레이톨을 첨가하지 않은 계이다.

그 결과, 탈이온수를 사용함으로써 강도 저하가 인정되었다. 이에 대하여, 열변성 처리를 실시하지 않은 경우에서 규정된 샘플 버퍼와 디티오스레이톨을 첨가한 것은, 강도가 도 1 보다 향상되었다 (도 1E). 이것은 디티오스레이톨에 기인하지 않았다 (도 1F).

한편, 열변성 처리를 실시하지 않고 샘플 버퍼 대신에 탈이온수에 단백질을 용해시키고, 디티오스레이톨을 첨가한 것은 극적인 강도 증가를 나타냈다 (도 1G). 이것은 디티오스레이톨을 첨가하지 않은 것에서도 동일하였다 (도 1H). 이들은, 상부 마커를 2 배 농도로 하여 사용한 경우도 완전히 동일하였다 (도 1L). 또한, 열변성 처리를 실시하지 않고 탈이온수를 사용한 계의 강도의 재현성은 양호하였다 (도 1M).

이들 결과로부터, 열변성 처리를 실시하지 않고, 단백질을 버퍼가 아니라 물 에 용해한 경우, 스펙트럼 강도를 8∼10 배 향상시킬 수 있었다.

실시예 2

도 2 는 스펙트럼 강도의 농도 변화를 열변성 처리한 것 (종래법) 과 처리하지 않은 것 (실시예 1E 기재) 에 의해 비교한 것이다. 도 2A∼J 는 열변성 처리한 것, 도 2K∼S 는 열변성 처리하지 않고, 실시예 1 에 기재된 물을 사용하며, 디티오스레이톨을 첨가하지 않은 것이다. 피검 단백질인 BSA 의 농도는, 도 2A, K: 5㎍/㎕, B, L: 2㎍/㎕, C, M: 1㎍/㎕, D, N: 0.5㎍/㎕, E: 0.2㎍/㎕, F, O: 0.1㎍/㎕, G, P: 0.05㎍/㎕, H, Q: 0.02㎍/㎕, I, R: 0.01㎍/㎕, J, S: 0.005㎍/㎕ 이다.

이들 결과로부터, 종래법 (반응 있음) 의 계에서는 검출 한계가 0.05㎍/㎕ 인 데 대하여, 본 발명 방법 (반응 없음) 은 0.005㎍/㎕ 로, 10 배의 감도 상승이 인정되었다.

실시예 3

도 3 는 실시예 2 의 스펙트럼 강도의 농도 변화를 열변성 처리한 것 (종래법) 의 재현성을 조사한 것이다. 피검 단백질인 BSA 의 농도는, 도 3A∼A''' 는 5㎍/㎕, B∼B''': 2㎍/㎕, C∼C''': 1㎍/㎕, D∼D''': 0.5㎍/㎕, E∼E''': 0.2㎍/㎕, F∼F''': 0.1㎍/㎕, G∼G''': 0.05㎍/㎕, H∼H''': 0.02㎍/㎕, I∼I''': 0.01㎍/㎕, J∼J''': 0.005㎍/㎕ 이다.

이들 결과로부터, 종래법 (반응 있음) 의 계의 재현성이 높고, 검출 한계가 0.05∼0.02㎍/㎕ 임을 알 수 있었다.

실시예 4

도 4 는 실시예 2 의 스펙트럼 강도의 농도 변화를 열변성 처리하지 않은 것 (실시예 1E 에 기재된 물을 사용하고, 디티오스레이톨을 첨가하지 않은 것) 의 재현성을 조사한 것이다. 도 4A∼A''' 는 BSA 5㎍/㎕, B∼B''': 2㎍/㎕, C∼C''': 1㎍/㎕, D∼D''': 0.5㎍/㎕, F∼F''': 0.1㎍/㎕, G∼G''': 0.05㎍/㎕, H∼H''': 0.02㎍/㎕, I, I', I'': 0.01㎍/㎕, J∼J''': 0.005㎍/㎕ 이다.

이들 결과로부터, 열변성 처리하지 않은 계에서는 재현성이 높고, 검출 한계가 0.01∼0.005㎍/㎕ 임을 알 수 있었다.

실시예 5

도 5 는 저농도에서의 검출을 나타낸다. 도 5A-C 는, 실시예 1 에 기재된 본 발명 방법의 물을 사용하고, 디티오스레이톨을 첨가하지 않은 것에, 추가로 하부 마커 또는 상부 마커 중 임의의 어느 한쪽의 마커를 표준 농도와 비교하여 저농도로 사용한 방법이다. 도 5A 는 0.01㎍/㎕ BSA 에서 통상의 하부 마커 농도, B: 0.005㎍/㎕ BSA 에서 하부 마커 농도를 종래의 1/2 로 사용한 것, C: 0.001㎍/㎕ BSA 에서, 하부 마커 농도 1/2 에 추가로 상부 마커 농도를 종래의 1/10 로 사용한 것이다.

도 5D-J 는, 하부 마커가 규정의 1/4 에 대하여, 피검 단백질과 동일한 농도의 인슐린 (소 췌장 유래, SIGMA) 을 하부 마커로서 추가로 첨가한 것이다. D: 0.5㎍/㎕, E: 0.05㎍/㎕, F: 0.01㎍/㎕, G: 0.005㎍/㎕, H: 0.001㎍/㎕, I: 0.0005㎍/㎕, J: 0.0001㎍/㎕ 이다. 이 방법에 의해, BSA 의 검출 한계가 0.0005㎍/ ㎕ 까지 가능해졌다.

실시예 6

다른 단백질에 대한 검출 한계를 실시예 5 와 동일하게 조사하였다. 도 6A-J 는 종래법 (열변성 처리함) 에 의한 미오글로빈 (말 골격근 유래, SIGMA) 이다. 도 6B', E', H', I' 는 동일한 재현성을 나타낸 것이다. 도 6K-O 는 종래법에 의한 트립신 (I 형, 소 췌장 유래, SIGMA) 이다. 각각의 농도는 A, K: 5㎍/㎕, B, B': 2㎍/㎕, C: 1㎍/㎕, D, L: 0.5㎍/㎕, E, E': 0.2㎍/㎕, F: 0.1㎍/㎕, M: 0.05㎍/㎕, H, H', N: 0.02㎍/㎕, I, I', O: 0.01㎍/㎕, J: 0.005㎍/㎕ 이다. 이 방법에 의해, 미오글로빈, 트립신의 검출 한계는 모두 0.05∼0.02㎍/㎕ 이다. 이것은, BSA 의 경우와 일치하였다.

실시예 7

미오글로빈 및 BSA 에 대해서, 열변성 처리한 계에서의 종래법과, 하부 마커로서 피검 단백질과 실질적으로 동등 또는 근사한 양의 마커 (여기서는 편의상, 가변 농도 마커라고 한다) 를 사용한 것을 비교하였다.

도 7A∼I 는 종래법 (열변성 처리함) 에 의한 미오글로빈이다. 도 7A'∼I' 는 열변성 처리한 것으로, 가변 농도 마커를 사용하고 있다. 도 7J-R 는 종래법 (열변성 처리함) 에 의한 BSA 이다. 도 7J'-R' 은 열변성 처리한 것으로, 가변 농도 마커를 사용하고 있다. 각각, 가변 농도 마커로서 인슐린을 사용하였다. 각각의 가변 마커의 농도는 A, A', J, J': 2㎍/㎕, B, B, K: 1㎍/㎕, C, C', L, L': 0.5㎍/㎕, D, D', M, M': 0.2㎍/㎕, E, E', N: 0.1㎍/㎕, F, F', O, O': 0.05㎍/㎕, G, G', P, P' : 0.02㎍/㎕, H, H', Q, Q': 0.01㎍/㎕, I, I', R': 0.005㎍/㎕ 이다.

종래법에서 미오글로빈, BSA 는 검출 한계 0.05㎍/㎕ 인 데 대하여, 가변 농도 마커를 사용한 경우에는 0.02㎍/㎕ 가 되었지만, 반응이 없는 실시예 6 의 계와 비교하여 극적인 향상은 아니었다. 그러나, 반응이 있는 경우에도 가변 농도 마커의 효과가 있음을 알 수 있었다.

본 발명에 의하면, 열변성의 전처리 공정을 실시하지 않고 네이티브한 상태에서 단백질을 신속히 해석할 수 있고, 또한 보다 고감도인 전기영동법이 제공된다. 따라서, 본 발명의 단백질의 전기영동법은, 프로테오솜 (proteosome) 해석 및 의료 진단에 유용하다.

Claims (5)

1. 시료조제용 용액으로서 물을 사용하고, 또한 단백질을 열변성 처리하지 않고 사이즈 분리의 전기영동에 제공하는 것을 특징으로 하는 전기영동법.
2. 제 1 항에 있어서, 물에 용해시킨 단백질을 전기영동에 제공하는 것을 특징으로 하는 전기영동법.
3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 2 개 또는 그 이상의 분자량 마커를 단백질과 함께 전기영동에 제공하고, 그 마커 중 적어도 하나를 표준 농도와 비교하여 저농도로 하는 것을 특징으로 하는 전기영동법.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 2 개 또는 그 이상의 분자량 마커를 단백질과 함께 전기영동에 제공하고, 그 마커의 하나를 피검 단백질 농도의 1/10∼10 배의 농도로 하는 것을 특징으로 하는 전기영동법.
5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 전기영동의 형태가, 캐필러리 전기영동법, 마이크로 칩형 전기영동법 및 나노 채널형 전기영동법으로 이루어지는 군에서 선택된 것인 전기영동법.

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