PL243041B1

PL243041B1 - Preparat do barwienia i oznaczania stężenia białek, jego zastosowanie, sposób barwienia białek, zwłaszcza na żelach poliakrylamidowych oraz sposób oznaczania stężenia białek w roztworach wodnych

Info

Publication number: PL243041B1
Application number: PL436998A
Authority: PL
Inventors: Paweł Pięta; Anna Jankowska; Aleksandra Śliwa
Original assignee: Univ Medyczny Im Karola Marcinkowskiego W Poznaniu
Priority date: 2021-02-16
Filing date: 2021-02-16
Publication date: 2023-06-12
Also published as: PL436998A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest preparat do barwienia i oznaczania stężenia białek charakteryzujący się tym, że składa się z chloroformu i wody dejonizowanej użytych w stosunku objętościowym 0,1 - 0,82: 100 oraz jego zastosowanie. Wynalazek dotyczy również sposobu barwienia białek, zwłaszcza na żelach poliakrylamidowych, który polega na tym, że żel poliakrylamidowy umieszcza się w preparacie do barwienia i oznaczania stężenia białek w czasie inkubacji 1 - 5 minut, a następnie naświetla się za pomocą źródła promieniowania UV pochodzącego z transiluminatora w czasie 1 - 5 minut.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest preparat do barwienia i oznaczania stężenia białek oraz jego zastosowanie.

Wynalazek dotyczy również sposobu barwienia białek zwłaszcza na żelach poliakrylamidowych oraz sposobu oznaczania stężenia białek w roztworach wodnych.

Elektroforeza w żelach poliakrylamidowych to jedna z rutynowych technik analizy białek stosowana w biochemii. Wizualizacja i analiza, zarówno jakościowa jak i ilościowa białek jest możliwa dzięki zastosowaniu odpowiednich barwników kolorymetrycznych czy też fluorescencyjnych. Wśród obecnie stosowanych metod wizualizacji białek na żelach poliakrylamidowych należy wymienić bardziej popularne metody takie jak: barwienie białek na żelu za pomocą srebra, barwienie białek odczynnikiem Coomassie Brilliant Blue czy też barwienie białek za pomocą roztworu koloidalnego Coomassie [1,2,3]. Barwienie na żelach poliakrylamidowych za pomocą ww. odczynników to procedura czasochłonna, trwająca około 3-5 godzin w zależności od wybranej metody.

Reakcja trihalogenków organicznych z tryptofanem została opisana w literaturze w 2002 roku przez Edwardsa i współpracowników. Jest to typowa reakcja rodnikowa, w której pod wpływem światła dochodzi do wybicia elektronu ze struktury pierścienia indolowego, który następnie atakuje cząstkę trihalogenku organicznego przyczyniając się do przyłączenia cząstki trihalogenku do pierścienia indolowego z uwolnieniem anionu chlorkowego. W kolejnych etapach zachodzi hydroliza dihalogenku oraz monohalogenku prowadząca do powstania pochodnej aldehydowej [4]. Przeprowadzone przez Edwardsa badania z wykorzystaniem N-acetylo-L-tryptofanamidu oraz różnych trihalogenków organicznych takich jak: chloroform, trichloroetan, trichloroetanol, bromoform wykazały najwyższą wydajność fluorescencji dla układów zawierających chloroform i trichloroetan, natomiast najniższą dla układu zawierającego trichloroetanol i bromoform [4].

W amerykańskim zgłoszeniu patentowym nr US2014262785 A1 ujawniono, że trichloroetanol oraz kwas trichlorocotowy lub chloroform może zostać użyty jako komponent żeli poliakrylamidowych. Wymienione halogenki będące komponentem żeli elektroforetycznych reagują z resztami tryptofanu tworząc związek fluorescencyjny.

Natomiast z amerykańskiego opisu patentowego nr US9470655 B2 znany jest sposób skonstruowania zestawu do wylewania żelu poliakrylamidowych zawierających halogenki organiczne. Żele przygotowane wg ww. patentu umożliwiają wizualizację wyników analiz elektroforetycznych w oparciu o reakcje trihalogenków organicznych z resztami tryptofanu.

Z europejskiego opisu patentowego nr EP3274000 B1 znana jest cząsteczka barwnika i preparaty barwnika, w szczególności do zastosowania w chirurgicznych metodach chirurgii okulistycznej i do barwienia białek. Cząsteczka barwnika o strukturze (I): gdzie R1 oznacza grupę SO3 - związaną z atomem wodom H lub innym atomem lub z grupą amonową NH4 lub z solą lizyny lub z solą argininy lub z innym jednowartościowym kationem, a R2 to grupa SO3, w szczególności do wytwarzania preparatów barwiących stosowanych w metodach leczenia ciał ludzi lub zwierząt, na przykład do barwienia wewnętrznej błony ograniczającej ILM i/lub błon epiretinalnych EPRM w metodzie chirurgicznej, która obejmuje późniejsze usunięcie odpowiednio ILM i / lub EPRM; a także preparat barwnikowy o gęstości powyżej 1,01 g/cm³, zawierający co najmniej jeden barwnik i co najmniej jeden środek zwiększający jego gęstość.

Wśród dostępnych na rynku odczynników biochemicznych nie znaleziono odczynników umożliwiających wizualizację białek na żelach poliakrylamidowych z wykorzystaniem reakcji opisanej przez Edwardsa [4].

Istotą wynalazku jest preparat do barwienia i oznaczania stężenia białek charakteryzujący się tym, że składa się chloroformu i wody dejonizowanej użytych w stosunku objętościowym 0,1-0,82 : 100.

Korzystnie preparat składa się z chloroformu i wody dejonizowanej użytych w stosunku objętościowym 0,82 : 100.

Istotą wynalazku jest również preparat do barwienia i oznaczania stężenia białek, określony powyżej do zastosowania jako środek diagnostyczny stosowany in vitro.

Sposób barwienia białek, zwłaszcza na żelach poliakrylamidowych polega na tym, że żel poliakrylamidowy umieszcza się w preparacie do barwienia i oznaczania stężenia białek określonym powyżej w czasie inkubacji 1-5 minut, a następnie naświetla się żel poliakrylamidowy za pomocą źródła promieniowania UV pochodzącego z transiluminatora w czasie 1-5 minut.

Korzystnie czas inkubacji wynosi 1 minutę dla białek zawierających mniej niż 2 reszty tryptofanu na cząsteczkę.

Korzystnie czas inkubacji wynosi 3 minuty dla białek zawierających więcej niż 3 reszty tryptofanu na cząsteczkę.

Korzystnie czas naświetlania wynosi od 1-2 minut dla białek zawierających 2 i mniej reszty tryptofanowe.

Korzystnie czas naświetlania wynosi od 3-5 minut dla białek zawierających 3 i więcej reszty tryptofanowe.

Sposób oznaczania stężenia białek w roztworach wodnych polega na tym, że do analizowanej próbki dodaje się preparat do barwienia i oznaczania stężenia białek określony powyżej w stosunku objętościowym w zakresie 1:1 - 1:100, a następnie próbkę naświetla się za pomocą źródła promieniowania UV pochodzącego z transiluminatora w czasie 1-5 minut, po czym dokonuje się analizy fluorescencji przy wzbudzeniu światłem z zakresu promieniowania UV.

Preparat do barwienia i oznaczania stężenia białek może być stosowany zarówno do barwienia żeli przygotowanych w laboratorium jaki gotowych żeli dostępnych komercyjnie. Dzięki zastosowaniu preparatu według wynalazku możliwe jest wybarwienie i wizualizacja żelu w czasie krótszym niż 5 minut.

Otrzymany preparat do barwienia i oznaczania stężenia białek przechowuje się w naczyniu chroniącym przed promieniowaniem słonecznym. Przed każdorazowym użyciem roztwór należy wstrząsnąć przez minimum 15 sekund, po czym umieścić w nim żel poliakrylamidowy. Żel należy inkubować w preparacie według wynalazku w czasie od 1-5 minut, ponieważ wydłużenie czasu barwienia niekorzystnie wpływa na proces wizualizacji białek na żelu poliakrylamidowym, poprzez istotny wpływ na intensywność sygnału do tła. Po inkubacji żel bezpośrednio przenosi się na zwilżoną powierzchnię transiluminatora, po czym poddaje się naświetlaniu światłem UV przez 1-5 minut - wydłużenie czasu barwienia niekorzystnie wpływa na proces wizualizacji białek na żelu poliakrylamidowym poprzez istotny wpływ na intensywność sygnału do tła. Po naświetlaniu żel poddaje się wizualizacji za pomocą protokołów stosowanych w wizualizacji DNA na żelach agarozowych, czy też poliakrylamidowych.

Przed przystąpieniem od analizy stężenia białka w badanej próbce przygotowuje się preparat do barwienia i oznaczania stężenia białek będący roztworem wody dejonizowanej z dodatkiem chloroformu. Następnie badaną próbkę białka miesza się z roztworem reakcyjnym w stosunku objętościowym (badana próbka:odczynnik reakcyjny) w zakresie: 1:1 - 1:100. Tak przygotowaną mieszaninę poddaje się naświetlaniu za pomocą promieniowania UV w czasie od 1-5 min. Po naświetlaniu dokonuje się analizy fluorymetrycznej przy wzbudzeniu światłem ultrafioletowym. Uzyskane wyniki analizuje się w odniesieniu do danych otrzymanych dla białka wzorcowego.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach wykonania nie ograniczając jednocześnie jego zakresu ochrony.

Przykład 1

W celu otrzymania preparatu do barwienia i oznaczania stężenia białek należy zmieszać 100 ml wody dejonizowanej z 0,1 ml chloroformu. Żel po przeprowadzonej analizie elektroforetycznej należy umieścić w ww. roztworze i inkubować przez 1 minutę. Po inkubacji żel należy umieścić na zwilżonej powierzchni transiluminatora i poddać naświetlaniu promieniowaniem UV przez 60 s. Po naświetlaniu żel poddaje się wizualizacji przy wzbudzeniu światłem UV. W przypadku nie satysfakcjonujących wyników proces naświetlania można powtórzyć, po czym żel ponownie wizualizować (procedurę tę można wykonać do 5 razy).

Przykład 2

W celu otrzymania preparatu do barwienia i oznaczania stężenia białek należy zmieszać 100 ml wody dejonizowanej z 0,1 ml chloroformu. Żel po przeprowadzonej analizie elektroforetycznej należy umieścić w ww. roztworze i inkubować przez 2 minuty. Po inkubacji żel należy umieścić na zwilżonej powierzchni transiluminatora i poddać naświetlaniu promieniowaniem UV przez 60 s. Po naświetlaniu żel poddaje się wizualizacji przy wzbudzeniu światłem UV. W przypadku nie satysfakcjonujących wyników proces naświetlania można powtórzyć, po czym żel ponownie zwizualizować (procedurę tę można wykonać do 5 razy).

Przykład 3

W celu otrzymania preparatu do barwienia i oznaczania stężenia białek należy zmieszać 100 ml wody dejonizowanej z 0,1 ml chloroformu. Żel po przeprowadzonej analizie elektroforetycznej należy umieścić w ww. roztworze i inkubować przez 3 minuty. Po inkubacji żel należy umieścić na zwilżonej powierzchni transiluminatora i poddać naświetlaniu promieniowaniem UV przez 60 s. Po naświetlaniu żel poddaje się wizualizacji przy wzbudzeniu światłem UV. W przypadku nie satysfakcjonujących wyników proces naświetlania można powtórzyć, po czym żel ponownie zwizualizować (procedurę tę można wykonać do 5 razy).

Przykład 4

W celu otrzymania preparatu do barwienia i oznaczania stężenia białek należy zmieszać 100 ml wody dejonizowanej z 0,4 ml chloroformu. Żel po przeprowadzonej analizie elektroforetycznej należy umieścić w ww. roztworze i inkubować przez 1 minutę. Po inkubacji żel należy umieścić na zwilżonej powierzchni transiluminatora i poddać naświetlaniu promieniowaniem UV przez 60 s. Po naświetlaniu żel poddaje się wizualizacji przy wzbudzeniu światłem UV. W przypadku nie satysfakcjonujących wyników proces naświetlania można powtórzyć, po czym żel ponownie zwizualizować (procedurę tę można wykonać do 5 razy).

P rzykład 5

W celu otrzymania preparatu do barwienia i oznaczania stężenia białek należy zmieszać 100 ml wody dejonizowanej z 0,4 ml chloroformu. Żel po przeprowadzonej analizie elektroforetycznej należy umieścić w ww. roztworze i inkubować przez 2 minuty. Po inkubacji żel należy umieścić na zwilżonej powierzchni transiluminatora i poddać naświetlaniu promieniowaniem UV przez 60 s. Po naświetlaniu żel poddaje się wizualizacji przy wzbudzeniu światłem UV. W przypadku nie satysfakcjonujących wyników proces naświetlania można powtórzyć, po czym żel ponownie zwizualizować (procedurę tę można wykonać do 5 razy).

Przykład 6

W celu otrzymania preparatu do barwienia i oznaczania stężenia białek należy zmieszać 100 ml wody dejonizowanej z 0,4 ml chloroformu. Żel po przeprowadzonej analizie elektroforetycznej należy umieścić w ww. roztworze i inkubować przez 3 minuty. Po inkubacji żel należy umieścić na zwilżonej powierzchni transiluminatora i poddać naświetlaniu promieniowaniem UV przez 60 s. Po naświetlaniu żel poddaje się wizualizacji przy wzbudzeniu światłem UV. W przypadku nie satysfakcjonujących wyników proces naświetlania można powtórzyć, po czym żel ponownie zwizualizować (procedurę tę można wykonać do 5 razy).

Przykład 7

W celu otrzymania preparatu do barwienia i oznaczania stężenia białek należy zmieszać 100 ml wody dejonizowanej z 0,82 ml chloroformu. Żel po przeprowadzonej analizie elektroforetycznej należy umieścić w ww. roztworze i inkubować przez 1 minutę. Po inkubacji żel należy umieścić na zwilżonej powierzchni transiluminatora i poddać naświetlaniu promieniowaniem UV przez 60 s. Po naświetlaniu żel poddaje się wizualizacji przy wzbudzeniu światłem UV. W przypadku nie satysfakcjonujących wyników proces naświetlania można powtórzyć po czym żel ponownie zwizualizować (procedurę tę można wykonać do 5 razy).

Przykład 8

W celu otrzymania preparatu do barwienia i oznaczania stężenia białek należy zmieszać 100 ml wody dejonizowanej z 0,82 ml chloroformu. Żel po przeprowadzonej analizie elektroforetycznej należy umieścić w ww. roztworze i inkubować przez 2 minuty. Po inkubacji żel należy umieścić na zwilżonej powierzchni transiluminatora i poddać naświetlaniu promieniowaniem UV przez 60 s. Po naświetlaniu żel poddaje się wizualizacji przy wzbudzeniu światłem UV. W przypadku nie satysfakcjonujących wyników proces naświetlania można powtórzyć po czym żel ponownie zwizualizować (procedurę tę można wykonać do 5 razy).

Przykład 9

W celu otrzymania preparatu do barwienia i oznaczania stężenia białek należy zmieszać 100 ml wody dejonizowanej z 0,82 ml chloroformu. Żel po przeprowadzonej analizie elektroforetycznej należy umieścić w ww. roztworze i inkubować przez 3 minuty. Po inkubacji żel należy umieścić na zwilżonej powierzchni transiluminatora i poddać naświetlaniu promieniowaniem UV przez 60 s. Po naświetlaniu żel poddaje się wizualizacji przy wzbudzeniu światłem UV. W przypadku nie satysfakcjonujących wyników proces naświetlania można powtórzyć po czym żel ponownie zwizualizować (procedurę tę można wykonać do 5 razy).

Przykład 10

Przed przystąpieniem od analizy stężenia białka w badanej próbce przygotowuje się preparat do barwienia i oznaczania stężenia białek będący roztworem wody z dodatkiem chloroformu o stężeniu 0,1%. Następnie badaną próbkę białka miesza się z preparatem w stosunku objętościowym (badana próbka:preparat) w zakresie: 1:1 Tak przygotowaną mieszaninę poddaje się naświetlaniu za pomocą promieniowania UV w czasie 1 min. Po naświetlaniu dokonuje się analizy fluorymetrycznej przy wzbudzeniu światłem ultrafioletowym. Uzyskane wyniki analizuje się w odniesieniu do danych otrzymanych dla białka wzorcowego.

Przykład 1 1

Przed przystąpieniem od analizy stężenia białka w badanej próbce przygotowuje się preparat do barwienia i oznaczania stężenia białek będący roztworem wody z dodatkiem chloroformu o stężeniu 0,1%. Następnie badaną próbkę białka miesza się z preparatem w stosunku objętościowym (badana próbka:preparat) w zakresie: 1:100. Tak przygotowaną mieszaninę poddaje się naświetlaniu za pomocą promieniowania UV w czasie 5 min. Po naświetlaniu dokonuje się analizy fluorymetrycznej przy wzbudzeniu światłem ultrafioletowym. Uzyskane wyniki analizuje się w odniesieniu do danych otrzymanych dla białka wzorcowego.

Przykład 12

Przed przystąpieniem od analizy stężenia białka w badanej próbce przygotowuje się preparat do barwienia i oznaczania stężenia białek będący roztworem wody z dodatkiem chloroformu o stężeniu 0,82%. Następnie badaną próbkę białka miesza się z preparatem w stosunku objętościowym (badana próbka:preparat) w zakresie: 1:1. Tak przygotowaną mieszaninę poddaje się naświetlaniu za pomocą promieniowania UV w czasie 1 min. Po naświetlaniu dokonuje się analizy fluorymetrycznej przy wzbudzeniu światłem ultrafioletowym. Uzyskane wyniki analizuje się w odniesieniu do danych otrzymanych dla białka wzorcowego.

Przykład 13

Przed przystąpieniem od analizy stężenia białka w badanej próbce przygotowuje się preparatu do barwienia i oznaczania stężenia białek będący roztworem wody z dodatkiem chloroformu o stężeniu 0,82%. Następnie badaną próbkę białka miesza się z preparatem w stosunku objętościowym (badana próbka:preparat) w zakresie: 1:1. Tak przygotowaną mieszaninę poddaje się naświetlaniu za pomocą promieniowania UV w czasie 5 min. Po naświetlaniu dokonuje się analizy fluorymetrycznej przy wzbudzeniu światłem ultrafioletowym. Uzyskane wyniki analizuje się w odniesieniu do danych otrzymanych dla białka wzorcowego.

Literatura:

Gauci, Victoria J., Matthew P. Padula, and Jens R. Coorssen. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics. Journal of proteomics 90 (2013): 96-106.

Dyballa, Nadine, and Sabine Metzger. Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels. JoVE (Journal of Visualized Experiments) 30 (2009): e1431.

Wray, Wayne, et al. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Analytical biochemistry 118.1 (1981): 197-203.

Edwards, Robert A., Glen Jickling, and Raymond J. Turner. The Light-induced Reactions of Tryptophan with Halocompounds. Photochemistry and photobiology 75.4 (2002): 362-368.

Claims

1. Preparat do barwienia i oznaczania stężenia białek znamienny tym, że składa się chloroformu i wody dejonizowanej użytych w stosunku objętościowym 0,1-0,82 : 100.

2. Preparat według zastrz. 1 znamienny tym, że składa się z chloroformu i wody dejonizowanej użytych w stosunku objętościowym 0,82 : 100.

3. Preparat do barwienia i oznaczania stężenia białek określony w zastrz. 1-2 do zastosowania jako środek diagnostyczny stosowany in vitro.

4. Sposób barwienia białek, zwłaszcza na żelach poliakrylamidowych znamienny tym, że żel poliakrylamidowy umieszcza się w preparacie do barwienia i oznaczania stężenia białek określonym w zastrz. 1-2 w czasie inkubacji 1-5 minut, a następnie naświetla się za pomocą źródła promieniowania UV pochodzącego z transiluminatora w czasie 1-5 minut.

5. Sposób barwienia białek według zastrz. 4 znamienny tym, że czas inkubacji wynosi 1 minutę dla białek zawierających mniej niż 2 reszty tryptofanu na cząsteczkę.

6. Sposób barwienia białek według zastrz. 4 znamienny tym, że czas inkubacji wynosi 3 minuty dla białek zawierających więcej niż 3 reszty tryptofanu na cząsteczkę.

6 PL 243041 B1

7. Sposób barwienia białek według zastrz. 4 znamienny tym, że czas naświetlania wynosi od 1-2 minut dla białek zawierających 2 i mniej reszty tryptofanowe.

8. Sposób barwienia białek według zastrz. 4 znamienny tym, że czas naświetlania wynosi od 3-5 minut dla białek zawierających 3 i więcej reszty tryptofanowe.

9. Sposób oznaczania stężenia białek, zwłaszcza w roztworach wodnych znamienny tym, że do analizowanej próbki dodaje się preparat do barwienia i oznaczania stężenia białek określony zastrz. 1-2 w stosunku objętościowym w zakresie 1:1 - 1:100, a następnie próbkę naświetla się za pomocą źródła promieniowania UV pochodzącego z transiluminatora w czasie 1-5 minut, po czym dokonuje się analizy fluorescencji przy wzbudzeniu światłem z zakresu promieniowania UV.