CN102016560A - 用毛细管电泳法分析dna - Google Patents

Abstract

本发明涉及检测核酸的方法。该方法采用毛细管电泳分离样品然后分析其中存在的核酸。注入和分离样品的条件使得该方法具有极高的灵敏度，可用于，例如为质控目的，测定含有治疗或疫苗用蛋白质样品中是否存在基因组DNA污染物，和其含量及/或大小。

Description

用毛细管电泳法分析DNA

本发明涉及检测核酸的方法，其中通过毛细管电泳分离待分析核酸存在情况的样品。注入和分离样品的条件使得该方法具有极高的灵敏度，该方法可用于，例如，为质控目的测定用于治疗或免疫接种(具体是抗流感)的样品中基因组DNA污染物的存在和/或其大小。

流感是由正粘病毒属病毒引起的疾病。所引起的疾病主要是A型流感，罕见B型流感，特别不可能的是C型流感。

预防流感的最好方法是接种疫苗，目前已有A型和B型流感疫苗。自1952年以来就知道流感疫苗。用鸡蛋增殖病毒的常规方法生产疫苗至少需要6个月。另一种用细胞培养病毒的方法比用鸡蛋有几个优点。

管理当局对细胞培养制备产品进行评估的一种参数是DNA残留量，因为用转化的宿主细胞培养可能残留有宿主细胞DNA成分。最大程度减少宿主细胞DNA所致相关危害的一种可行方法是减少疫苗中存在的DNA量。或者，可以证明最终产品中残留的核酸是丧失致癌潜能的DNA。

关于MDCK细胞(Madin-Darby狗肾细胞)，家犬(Canis familiaris)的基因组已于2004年完成测序，可从英特网上获得。研究诺华(Novartis)疫苗时，显示约25000个基因中只有13个具有特定功能，其长度不到500bp。发现这13个基因没有一个有致癌潜能。

此发现揭示需要开发高灵敏度方法来分析可能含有核酸的样品(例如疫苗)是否存在核酸及其大小分布。

为评估疫苗制品加工过程中核酸的含量和大小分布，可分析不同加工阶段的样品。这导致困难增加，因为这些加工过程中的样品的化学组成彼此不同。所含DNA的浓度差别很大，可高达三个数量级。因此，其分析方法的开发是一项具有挑战性的任务。

可采用几种方法实现核酸绝对浓度的定量测定。例如，用光度计检测280nm与260nm光密度可推断样品的核酸浓度和蛋白质含量。荧光染色试验更为灵敏。例如，孔雀绿(PicoGreen

)的检测下限低于约312pg/ml。然而此试验对样品中的杂质也非常敏感，其结果差异程度很高。域系统(ThresholdSystem

)试验能够定量6.2-400pg/ml浓度的DNA。然而，这些试验不能提供任何质量信息。

对于核酸，例如基因组DNA的定性分析，最常采用经典的琼脂糖凝胶平板电泳。因此，如下文实施例中所详述，最初尝试用琼脂糖凝胶电泳分析生产的流感疫苗样品。虽然可用此法检测初步纯化的样品，但因以后步骤的样品和最终产品的DNA浓度太低而不能分析。类似地，发现聚丙烯酰胺凝胶电泳不适合分析这种样品。

已知可用毛细管凝胶电泳分析的物质范围广泛，例如有寡核苷酸或DNA[C.Heller，Electrophoresis 629，Issue 2(2001)；Menzinger等，毛细管电泳的琼脂化学分析(Analysis of agrochemicals by capillary electrophoresis)，J.Chromatogr.A891(2000)，45；Mitchelson.，核酸的毛细管电泳(Capillay electrophoresis ofnucleic acids)，第2卷，毛细管电泳的实际应用(Practical applications of capillaryelectrophoresis)，Humana Press Totowa，新泽西，2001]。此法效率和灵敏度高，可快速实施。

本发明人惊喜地发现，毛细管凝胶电泳适合提供高灵敏度和可靠的试验来分析疫苗生产各步骤的核酸，特别是DNA。得到的方法可满足优先领域的需要和解决本发明的优先问题。

本发明人第一个开发了分析用毛细管凝胶电泳分离样品中核酸的存在和/或大小分布方法，包括：

a)按流体动力学法，以约7-35kPa压力，用水预先注入毛细管2-10秒，优选以约7kPa注入约5秒；

b)以5-15kV的电压，按电动力学法注入样品10-60秒，优选以约10kV注入约30秒；

c)然后按流体动力学法，以约3-14kPa，用水后注入2-10秒，优选以约7kPa注入约5秒；

d)用200-275V/cm，优选用225-250V/cm分离；

e)检测核酸。

为改进本法的可靠性和牢固性，推荐在步骤a、b和/或c之后通过使毛细管二末端接触水进行洗涤步骤。

此法显示，当用毛细管凝胶电泳分离的样品中DNA的存在和/或大小分布时分析的灵敏度和可靠性最优，包括：

a)按流体动力学法，以约21kPa，用水预先注入毛细管5秒；

b)以10kV按电动力学法注入样品90秒；

c)然后按流体动力学法，以约7kPa，用水后注入约5秒；

d)用250V/cm分离；

e)用激光诱导的荧光检测核酸，

其中，分离缓冲液含有嵌入性染料，如增强染料；在步骤a与b之间以21kPa压力，一起或分别注入内标和荧光溶液；在步骤b注入内标步骤后，和/或步骤c后进行洗涤步骤。

在毛细管入口处施加压力，如静水压，或在毛细管出口处产生真空或负压可实现流体动力学注射。通常依靠在样品小瓶与毛细管一端之间产生压力差来加样，此时样品小瓶的压力升高。优选将毛细管另一端也浸没在液体，如水或缓冲液中。为了靠静水压(重力影响)注入，可提高毛细管入口处的小瓶到一定高度。缓冲液水平面与样品水平面之间的差异，以及样品的密度可能影响加载。实施时，通过缓慢升高和降低水压，用产生的压力和注入时间来计算出注入的样品量。认为约7kPa对应于约1psi压力。

电动力学注射的基础是毛细管电场产生的电流移动和电渗移动。当将毛细管入口伸入样品瓶中时，施加电压几秒钟，使样品中的带电组分移动进入小瓶中。注入的样品成分浓度视注射时间或电压而不同。因此，在本发明内容中，可改变注射时间和电压以实现注入合适量的样品。注入的样品量还取决于毛细管中的电渗流和样品诸组分的移动。

本领域知道电动力学注射将导致分析物浓缩，可利用此来高灵敏度分析样品(Krivacsy等，Journal of Chromatography A，834(1999)21-44；Butler等，JChromatography B，658(1994)，271-280)。然而，在本发明上下文中，发明人惊喜地发现，对于DNA的CGE分析，可采用流体动力学注射来获得甚至更高的灵敏度。出乎意料的是，少见的将样品注入到毛细管有效长度(检测长度)的约20-40％中，虽相应减少了分离缓冲液的长度，但却导致极佳结果。与现有方法相比，本发明方法提高了可靠性和灵敏度。

因此，本发明提供分析核酸的存在和/或大小分布的方法，其中用毛细管凝胶电泳分离包含核酸的样品，该方法包括以下步骤：

i)通过流体动力学法注射将样品注入毛细管有效长度的20-40％，

ii)分离核酸，

iii)检测核酸。

优选地，所述核酸的DNA，优选dsDNA。本发明方法特别适合于分析基因组DNA和/或DNA的降解产物，具体是基因组DNA的降解产物。也可研究细菌基因组DNA、质粒DNA和/或病毒DNA及它们的降解产物。例如，本方法可用于检测大小不确的DNA降解产物的存在和/或其大小分布。

本发明人出乎意料地证明，当按流体动力学法将样品注入毛细管有效长度的20-40％时可获得良好结果。优选将样品注入毛细管有效长度的25％-35％，最优选注入毛细管有效长度的约30％。在本领域中，通常是将样品注入毛细管有效长度的最多0.5％(Butler等，J.Chromatogr.B，658(1994)，271-280)。一般，为提供一百万理论平板和5％峰宽，注入体积应为毛细管容积的0.2％[“毛细管电泳：理论与实践(Capillary electrophoresis：theory and practice)”，Patrickcamilleri主编，第2版，CRC出版社出版(CRC Press)，1998；ISBN084939127X，9780849391279；26页]。

技术人员不难确定注入样品的条件，样品注入毛细管的优选长度。例如，条件取决于所用毛细管的长度。宜采用长时间低压力注入样品。在一实施方式中，样品注入时间3分钟以上，例如，在14-35kPa压力下注入约3-4.5分钟，优选21-28kPa约3.5-4分钟，最优选约21kPa约4分钟。这些条件适合于，例如，有效长度约35-45cm，如约39cm的毛细管。

在优选的实施方式中，本方法包括在步骤i)之前，按流体动力学法用水预先注入毛细管，优选以1-34kPa注入2-10秒，更优选以7kPa注入5秒。

在一优选的实施方式中，本方法包括在步骤i)与ii)之间，按流体动力学法用水后注入毛细管，优选以1-34kPa注入2-10秒，更优选以7kPa注入5秒

本方法优选包括在步骤i)之前按流体动力学法用水预先注入毛细管，和在步骤i)与ii)之间，按流体动力学法用水后注入毛细管。

在本发明方法中，宜进行洗涤步骤，如在用水预先注入之前和/或注入样品之后进行洗涤以减少污染。例如，可通过使毛细管二端接触水进行洗涤。

在本发明方法中，宜用200-275V/cm，更优选约200-255V/cm或约250V/cm进行分离。

可用能达到所需应用要求的灵敏度的合适方法检测毛细管中的核酸。例如荧光检测，其检测下限的灵敏度和选择性极佳(即高灵敏度)，特别是如果激发光采用激光时(激光诱导的荧光，LIF)。LIF的灵敏度比UV检测高约2-100倍，可提供非常高的线性信号。在极端例子中，其灵敏度可延伸检测到单个分子。因此，在本发明方法中，宜用激光诱导的荧光检测。

对于DNA检测，可采用不同方式的LIF检测。第一种方法依据天然DNA在低等UV(激发下)发出的天然荧光。可用其分析天然环境中的DNA。例如，采用KrF 248nm脉冲激光或275nm的UV激光或此范围或类似范围波长的激光作为激发光源。第二种变化采用间接荧光。在核苷酸或DNA分离期间用激光(如325nm氦-镉激光)激发毛细管区带电泳系统的荧光。常用进一步方法对DNA测序并需要用合适的荧光团直接共价标记分析物。

在该方法的最广泛使用中，采用了能整合入核酸改变其分子长度、构象和电荷的嵌入性染料。该染料与核酸形成的复合物在激发波长光照射下可发出强荧光，而游离染料则不能。此法488nm的氩离子激光最适合。溴化乙锭是最常用的嵌入性染料。此外，也可购得其衍生物，常见为单体或二聚体嵌入剂。例如，噻唑黄染料(TO)有非常高的检测灵敏度。染料POPO-3、YOYO-3和YOYO-1甚至更灵敏。优选的染料是EnhanCE染料(BC公司(Beckman Coulter)，富勒顿(Fullerton)，美国)。其它有用的染料参见WO 03/089586。

在本发明上下文中，毛细管凝胶电泳的分离液宜含适合检测核酸的染料，优选嵌入性染料，最优选EnhanCE染料。毛细管柱中的核酸被染色。所用的EnhanCE染料浓度宜为每毫升(ml)分离液约0.25-1微升(μl)，最优选每毫升分离液约0.5微升染料。

在本发明一实施方式中，通过毛细管凝胶电泳分离待分析样品中DNA的存在，所述DNA优选基因组DNA或其降解产物，包括以下步骤：

i)以约21-28kPa压力，用流体动力学法注射约3-4.5分钟，优选以约28kPa压力注射约4分钟，将样品注入毛细管有效长度的约30％，

ii)在约255V/cm下分离核酸，

iii)用激光诱导的荧光检测核酸。

还包括在步骤i)前流体动力学法用水预先注入毛细管，宜用约7kPa注入约5秒，

还包括在步骤i)与ii)之间，流体动力学法用水后注入毛细管，优选约7kPa注入约5秒，

其中在用水预先注入水之前和/或注入样品后进行洗涤步骤，

其中分离缓冲液包含嵌入性染料，优选EnhanCE染料，例如其浓度为每毫升分离液0.5微升染料。

业已发现，如果采用内标来划分相对迁移率值，可进一步提高此法常规应用的可靠性。内标与样品一起分离，可在注入样品前将其直接注入，优选约7-35kPa，约1-20秒；最优选约20kPa或约21kPa，约10秒。然而，如下文所述，也可参考除迁移外的时间进行数据分析。所选择的内标应能最大程度减少0对检测样品中核酸的干扰风险。在分析流感疫苗产品的样品时，该ISTD可以是，例如单链或双链DNA片段，特别是长10-300bp，例如约20-200bp的双链DNA片段。ISTD也可以是不到50bp的单链DNA，例如23bp的单链DNA引物。在一实施方式中，ISTD是10bp的双链DNA。它通常在第一种核酸样品之前即检测到，因此它标志已开始检测核酸了，也可作为检测的对照。

为有利于分析核酸的大小，可在样品中加入至少一种大小明确的感兴趣核酸，例如长约200bp，约500bp和/或约2000bp的DNA。也可将这种大小明确的核酸掺入到内标中。

此外或或者，可在注入水塞子后和注入样品前，施加可检测荧光染料如荧光黄染料溶液，如用水1∶10稀释的荧光黄液。在约7-34kPa下，例如以流体动力学方法注入荧光黄液2-10秒，优选约21kPa，约5秒。在最小的标准品峰之前可检测到此峰作为两末端：首先，它是标准品的移动标志，其次，它可作为激光的对照。

可将ISTD和可检测荧光染料溶液一起或以任何一种顺序分别注入。也可将其一种或二种与样品混合。

对于含中性内涂层，优选聚丙烯酰胺涂层的融合二氧化硅毛细管，已测定了其样品加载和样品分离的最优选参数。毛细管内径宜为75-125μm，优选约100μm。

最优选采用BC公司eCAP dsDNA试剂盒中装的毛细管(eCap DNA毛细管，100μm内径，477477)。可将给定的参数转换为其它中性涂层毛细管的参数。对于其它毛细管，所需设置可在具体给定的范围内略微改变以获得最佳结果。本发明人已证明，可采用不同的毛细管和毛细管凝胶电泳系统进行，例如聚乙烯醇涂层(PVA)毛细管(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)，产品编号：G160U-61419)实施本发明方法。

为改善毛细管的稳定性，常存在聚酰亚胺外涂层。优选在毛细管两端外侧2mm没有此涂层以改善本方法的稳定性。此外，需要去除检测部位的外涂层。

分析前，必须洗涤毛细管并平衡以确保背景信号低和高质量检测样品。

虽然可采用较长的毛细管，例如有效长度为50cm的60cm毛细管，但发现如果有效长度约29-50cm，如39cm或约40cm(例如总长度为49cm或约50cm)不影响结果的质量。缩短毛细管长度导致分离时间缩短。根据有效长度，分离需要40分钟或更长。分离宜进行约40-55分钟，优选约45分钟，已证明此时间足以检测约10-10000bp的DNA。如果需要，可改变检测时间以检测感兴趣大小的核酸。

分离时该系统的温度约为17-30℃，优选约18-25℃。发现用约20℃可获得最佳结果。

为消除毛细管中形成微小气泡可能带来的问题，分离期间可向毛细管施加约14-69kPa，优选约34kPa的压力。

优选用于本发明方法的毛细管凝胶电泳系统是PACE MDQ分子特征分析系统或ProteomeLab PA 800蛋白特征分析系统(BC公司)。

优选的分离缓冲液是pH8-9.5，优选pH8.8的低粘度非交联生理凝胶缓冲液。该分离液含聚丙酰胺，可以是Tris-硼酸盐缓冲液(Tris-Borat Buffer)。例如，可采用BC公司eCAP dsDNA试剂盒中装的分离液。

所述样品溶于与毛细管凝胶电泳相容的样品缓冲液中，优选该缓冲液是Tris-HCI缓冲液(10mM，pH8-9最优选pH8.8)。

在本发明一优选实施方式中，待分析的样品是用于治疗或疫苗的药物组合物或给予哺乳动物，特别是人的其他组合物。待分析样品宜含基因组DNA和/或DNA的降解产物。最优选样品是加工过程中的样品或加工过程中的疫苗制品，具体是流感疫苗的最终产品，例如，这些制品可以是以下定义的B1-B8的任何一种，或是疫苗制品的单价或三价半成品。所述样品也可以是食物产品，如转基因植物生产的食物产品，例如，需要证明该食物产品不含有显著量的DNA，特别是某些大小的DNA。

优选所述疫苗是细胞培养，例如MDCK、PER.C6、Vero细胞培养制备的流感疫苗。所述疫苗可含完整的病毒颗粒，裂解的病毒颗粒或纯化的表面糖蛋白。

分析流感产疫苗产品，或通常是适合给予哺乳动物的组合物样品时，宜用本发明方法分析宿主细胞的DNA，优选基因组DNA和/或其降解产物。这种DNA和DNA降解产物的长度可以不明确，然而，本方法也可有利地应用于检测其它样品中的DNA，例如，分析长度明确的DNA、基因治疗用的载体、RNA或ssDNA。优选用本方法证明样品(例如疫苗制品)中不含潜在的致癌性DNA。

可有效地用本发明方法证明样品(如疫苗制品衍生的制品)没有潜在的致癌潜能，即不含长度500bp或更长，优选400bp或更长，更优选200bp或更长的DNA片段。

对于某些样品，特别是下文详述的含有显著量蛋白质或高浓度盐的那些样品而言，如果在毛细管电泳加样前用以下方法预处理样品可获得好得多的结果，预处理方法包括以下步骤：

i)优选在存在SDS时用蛋白酶K消化样品，和

ii)提取核酸。

这种预处理具体可提高注入方法的质量和灵敏度，特别是存在污染物，如蛋白质和/或盐时。也可利用核酸提取来浓缩样品，以提高本法的整个检测下限。采用提取核酸浓缩约10倍可获得可靠的结果。提取核酸后宜将其溶于合适的缓冲液，如上文所述的CGE的样品缓冲液中。

宜采用依据吸附于珠子，例如磁珠的核酸提取方法。可采用罗氏(Roche)的MagNA纯化

系统提取核酸。因此本发明提供的DNA分析方法联用了核酸提取和CGE。

宜用本发明方法定量分析核酸，对于一种尺寸的DNA片段灵敏度可达至少100pg/ml、至少80pg/ml、至少50pg/ml、至少10pg/ml、至少9pg/ml、至少5pg/ml、至少2pg/ml或至少1pg/ml。可采用约1pg的，例如200bp、500bp或2000bp一种大小的DNA加入样品中，以提供可良好识别的标记。检测下限宜至少为200fg的一种尺寸DNA，优选至少20fg的一种尺寸DNA。

一方面，本发明提供测定核酸大小的方法，包括实施上述方法。其中通过与内部或外部大小标准品或与加入样品中所用的核酸进行比较，测定核酸的大小分布。在一实施方式中，即分析流感疫苗产品时，应在电泳各系列样品之前和之后，电泳所用的外部大小标准品。

本发明也提供测定样品中核酸大小分布的方法，包括实施上述方法，其中，通过与内部或外部大小标准品或与加入样品中所用的核酸进行比较，测定核酸大小的分布。

优选将本方法检测到的信号转变成能显示强度和时间或迁移率的曲线，并与大小标准品或加入样品中所用核酸的时间或迁移率作比较，来评估核酸的大小。

如果对样品中的核酸大小分布感兴趣，可对其进行分析以测定在感兴趣大小范围内(如200bp或更多，250bp或更多，300bp或更多，400bp或更多，500bp或更多)的核酸。为此，可计算出感兴趣大小范围内(即感兴趣大小范围二端点之间的，如0-500bp)曲线下的面积，并与曲线下总面积相比，以获得大小在感兴趣范围的核酸的百分比。

由于本发明方法灵敏、可靠和牢固，故可有利地用于含治疗或疫苗用蛋白质或核酸样品的质控。因此，优选在制成疫苗，优选流感疫苗后或其制备的同时使用本方法。

一方面，本发明提供给予哺乳动物组合物的制备方法，其中用本发明方法分析这种组合物的样品。所述组合物优选药物组合物，最优选疫苗，例如流感疫苗。所述样品也可来自食品，例如转基因植物生产的食品，以证明该食品不含有显著量的DNA，特别是某些大小的DNA。

本发明还提供分析样品中核酸的存在和/或大小分布的方法，所述样品例如疫苗(如流感疫苗)制备不同阶段的样品，包括通过毛细管电泳分离样品并用激光诱导的荧光检测核酸。所述核酸优选基因组DNA和/或DNA的，特别是基因组DNA的降解产物。

所述样品可以是最终产品制备过程中的样品，例如流感疫苗制备中的单价或三价半成品。可有利地采用预处理和/或加载样品及进行分析的该优选方法，以实现该方法的最优灵敏度和可靠性。可有利地采用该方法来证明样品(例如给予哺乳动物的组合物，如疫苗制品，特别是通过细胞培养生产的流感病毒制品)不含有(或不含有某种有害量的)致癌潜能的核酸，这种核酸的长度，例如为200bp或更多，250bp或更多，300bp或更多，400bp或更多，500bp或更多。因此，可用本方法来检测样品的致癌潜能和/或功能性基因的存在。

本发明也提供检测组合物，特别是给予哺乳动物的组合物，例如疫苗制品致癌可能性的方法，其中，优选按本发明方法，用毛细管凝胶电泳分析该组合物中的基因组DNA或其降解产物。本发明也涉及用本发明方法分析疫苗。

在下文中描述了导致本发明的实验及其优选实施方式，目的是描述而不是限制本发明。技术人员不难明白，可对其作出修改，某些优化步骤可有利地与或不与其它方法一起使用。

本文引用的所有出版物的内容全部纳入本文。

附图

图1用毛细管凝胶电泳分析含大量DNA污染的流感疫苗发酵培养过程中的样品，以103kPa通过流体动力学方法注入不稀释的样品30秒。样品B3和B4的标尺小5倍。

图2.用毛细管凝胶电泳分析MDCK基因组DNA，与1kb标准品比较，以7kPa通过流体动力学方法注入样品10秒。括号内的号码表示校准峰的标准化时间点。

图3.用6.7/6.8所述的方法分析B3样品。图示测定的尺寸范围。图4用6.7所述的本发明方法分析含最低浓度DNA(用域试验Threshhold

assay)测定＜1ng/ml)的B8样品。图示测定的尺寸范围。没检测到大于21bp的核酸。

图5.用6.7所述方法分析1kb的标准品，以10kV注入样品30秒。

图6.分析不经处理(上面的曲线)和用β-丙内酯预处理16小时(下面的曲线)的10bp标准品(起始浓度10μg/ml)，以9kV注入样品5秒。纠正尺寸后，甚至在最低浓度时仍可检测到1668bp峰。

图7.按照1kb标准品和内标(23个碱基ssDNA)的迁移率校准后，诸峰的鉴定。

图8.十次发酵物8步加工过程中的DNA总含量比较(DNA含量μg，加工过程中的对照为B1-B8)。

图9.流体动力学注入(HD)样品(含1μg/ml的194bp片段)到不同长度毛细管中与窗口的比较。X轴：长度占窗口的％，Y轴：任意单位(32Karat软件提供的绝对值)，第一值：194bp峰的峰高，第二值：194bp峰的峰面积。

图10.CGE分离通过流体动力学注入毛细管加入了A：25％和B：50％的示范性样品(3psi/21kPa，A：3.75分钟，B：7.5分钟)与检测窗口的比较，各有三种浓度(上-3-：1ng/ml，中-2-：100pg/ml，下-1-：10pg/ml)。

图11.流感病毒株与标记物浓度的CGE分析。CGE分析(以3psi(21kPa)通过流体动力学方法注入检测器窗口的30％长度)：1-dsDNA 1000测试混合物，Beckman公司，标准品100pg/ml。2-所罗门毒株(Solomon)，3-马来西亚毒株(Malaysia)，4-威斯康辛毒株(Wisconsin)。

图12.用CGE分析添加的样品。以3psi(21kPa)通过流体动力学方法将样品注入检测器窗口的30％长度：1-经添加的dsDNA标准品；2+3-布里斯班毒株，添加了长度明确200bp、500bp和2000bp DNA片段的样品(重复2次)。

图13.用CGE分析提取自经蛋白酶K预处理的MDCK细胞的基因组DNA，和添加的DNA提取物。添加了200bp、500bp和2000bp明确长度DNA片段的基因组DNA(从下到上：1-经添加的dsDNA标准品；2+3-10ng/ml MDCKDNA；4+5-110ng/ml MDCK DNA)。以3psi(21kPa)通过流体动力学方法将样品注入检测器窗口的30％长度。

实施例

1.样品

为制备疫苗，按本领域已知方案采用MDCK细胞(Madin-Darby狗肾细胞)，例如，制备得到EMEA承认的Optaflu产品。优选采用悬浮细胞系MDCK-CDM(诺华疫苗)。

简言之，为制备该流感亚单位疫苗，在MDCK-CDM悬浮细胞培养物中培养流感病毒，通过包含几个步骤的方法纯化。

离心澄清收集的病毒，过滤(0.45μm)后进行阳离子交换层析。用NaCI溶液洗与脱层析柱结合的病毒，然后浓缩病毒。用β-丙内酯(BPL)灭活病毒也严重破坏了仍存在的MDCK DNA。

用CTAB(溴化十六烷基三甲基铵硝酸盐)促溶亚单位疫苗制品的表面抗原、血凝素和神经氨酸酶，超离心去除病毒核心。去除CTAB。然后用22μm膜过滤。这些步骤之后为离子交换层析和双向超滤。过滤后结束纯化。借此获得浓缩的抗原，也称为单价半成品或单价原料(monobulk)。将微膜过滤后的单价原料送到混合装置中配成疫苗。

该方法也可参见以下流程，其中给出了各步骤的体积，B1-B8表示在某确定步骤后采样：

●转瓶培养细胞，和

●培养病毒

●分离和过滤(B1)

●澄清收获的病毒

●阳离子交换层析(B2)

●第一次浓缩/透析(B3)

●灭活/水解(B4)

●CTAB-处理/超滤

●第一次除菌过滤(0.2μm)(B5)

●吸附处理(30升)

●第二次除菌过滤(0.2μm)(B6)

●阴离子交换层析(B7)

●第二次浓缩/透析(10升)

●浓缩抗原/单价半成品(10升)

获得单价半成品后，制备含三株不同病毒(通常2个A株，1个B株)抗原的三价半成品。现有的疫苗大多数为三价疫苗。如果遵从了所有的规范和安全性要求，该疫苗即可准备销售。注意，样品B8对于该疫苗的分析和质控有决定性的重要意义。

在标出的时间点采集的分析样品可用作加工过程中的“窗口”。显然，这些加工过程中的样品其化学组成互不相同。其所含DNA浓度的巨大差异可高达三个数量级。

在简单特征鉴定样品的组成后，提出可能要分析的问题(引用的DNA含量是10次连续分析的结果)是：

●B1：澄清的收获病毒污染有蛋白质。DNA含量在100-4500ng/ml之间，包括高含量的基因组DNA(高达40000bp)。蛋白质可能有干扰影响到测定。这种可变的高含量DNA可能导致凝胶超载。所选方法检测的DNA大小范围必须适合感兴趣DNA分子的大小。

●B2：第一次浓缩步骤经阳离子交换从CS下来的40％峰去除了部分DNA后，DNA含量在50-750ng/ml之间，但强污染蛋白质和盐(从柱上洗脱)。蛋白质可能有干扰影响到测定。

●B3：第二次浓缩步骤透析排除了500kDa大小的DNA并交换缓冲液。蛋白浓度1000-3000μg/ml。此外，样品含多达5μg/ml的非离子洗涤剂吐温80在加工至单价半成品过程中没有被去除可能会影响检测结果。加工过程中DNA的最高浓度是500-5500ng/ml，不同于B1。

●B4：与B3的差别只是加入了BLP和培养了几小时。DNA含量下降至50-1200ng/ml，其特征改变。蛋白质和洗涤剂含量类似于B3。

●B4：膜蛋白已被CTAB溶解并进行了超浓缩。CTAB含量在800-3000μg/ml之间。洗涤剂和蛋白浓度类似于B3。DNA含量降至5-26ng/ml。

●B6：CTAB已去除，样品已过滤除菌。洗涤剂和蛋白含量降低。DNA含量＜1-15ng/ml，直到加工结束不变。

●B7：已进行了最后的阴离子交换层析纯化步骤。其余物质含量类似于B6。

●B8：单价半成品。该物质已经过透析/超滤和缓冲液交换，导致蛋白浓度升高约2倍。这是分析DNA大小的最重要样品。蛋白含量1500μg/ml，DNA含量不到1ng/ml(低于常规检测下限)-15ng/ml。

2.样品预处理

根据要分析的样品，样品的预处理可以不同，例如可改变各步骤的顺序以获得最佳结果。

2.1蛋白酶K

对于某些实验(见下文)，用蛋白酶K消化样品，此步可去除干扰性蛋白质，特别是核酸酶。

1ml样品用20μl不稀释的酶贮存液(2mg/ml蛋白酶K，分类号19133，恰根公司(Qiagen))，56℃(水浴，±3℃)培育16-20小时。

发现如果存在SDS时进行消化可获得更好结果。将2％SDS液以1∶1加入蛋白酶K液(2mg/ml)中。用50μl此混合液消化500μl样品。混合后培育混合液过夜(56℃，16-20小时)。

2.2DNA提取

可利用DNA提取来纯化样品中的DNA，例如去除污染的蛋白质和盐，以及任选浓缩样品。

可用Wako纯化化学产业公司(Wako Pure Chemical Industries)的碘化钠法试剂盒，按照厂商说明书提取DNA。

或者，用罗氏的MagNA pure

系统，按照厂商说明书提取DNA。这样可以自动化进行该提取。可实现DNA浓缩10倍。

2.3浓缩

真空离心(Speedvak)60分钟完全干燥DNA提取物(500μl)纯化样品。用10μl水不能成功溶解沉淀物。提高溶剂体积至50μl(浓缩10倍)只导致部分成功。样品沉淀物中能很好溶解的DNA含量低，而样品的其它沉淀物不能完全溶解。以下实验不再采用此法。

接着，用滤膜浓缩，检测了排除分子大小为3kDa和10kDa的亲水性纤维素膜(密里博公司(Millipore)，Microcon YM-3和YM-10膜)。所用的最大载量为500μl。当滤膜上不再有液体流出时停止离心，然后，以推荐的时间最大速度离心滤器2次。如果滤膜上仍有液体，怀疑滤膜已堵塞不再适合浓缩各自样品。所用滤膜的死腔为10μl，因此理论上的浓缩了50倍。

离心时采用以下参数：

●3kDa膜：14000g，100分钟，25℃

●10kDa膜：14000g，30分钟，25℃

收集浓缩的样品时，倒置滤器盖上新盖子后离心(1000G，3分钟，25℃)。

发现含蛋白质的样品不经预处理时不大适合用此法浓缩。此例中两种膜均易堵塞。只用蛋白酶K消化的样品必须离心二倍时间。对于样品B1和B3，用3kDa膜仍堵塞。用10kDa膜时间缩短并获得了好得多的结果。比较性实验(数据未显示)证明不会丢失100-1000bp感兴趣的DNA片段，膜离心可实现浓缩40倍。

离心膜浓缩DNA可以用于或不用于本发明方法的样品预处理。

3.DNA的定量测定

可根据260nm吸光值测定核酸浓度(与之相比，蛋白质用280nm吸光值)。然而，其检测下限约为0.25μg/ml，因为其它几种物质也吸收同一波长光。

孔雀绿dsDNA定量试剂(分子探针公司)依据荧光染料的高灵敏度，其检测下限为约312pg/ml dsDNA。此法也适合检测RNA或ssDNA，该试验快速而且相当便宜。然而，取决于样品中污染物的浓度其结果差别高达30％。可利用此试验的结果估计样品的DNA浓度。

宜用Threshold系统[分子装置公司(Molecular Devices)的Threshold总DNA检测试剂盒]测定DNA浓度。

用小牛胸腺DNA作为标准品。疫苗产品加工过程各步骤的所有样品经过以下预处理：56℃蛋白酶K-SDS消化16-20小时(见上文)，用商品化试剂盒提取DNA。105℃变性对照品、标准品和样品15-30分钟，如此以后存在的样品为ssDNA。37℃培育所有样品与标记试剂(生物素化-SSB(单链结合蛋白)和偶联脲酶的DNA抗体60分钟。用含结合有链霉亲和素的硝酸纤维膜的专用滤器过滤获得反应复合物。洗涤步骤后，将滤膜放入充满底物液的电势检测器中开始检测。脲酶催化脲降解导致表面电势变化。电压随时间变化的曲线与样品中DNA的浓度成比例。动态记录数据并根据标准曲线定量。联用本发明方法检测核酸大小的分布，例如用Threshold

系统检测DNA的绝对含量，可用于定量特定大小的核酸。

4.琼脂糖凝胶平板电泳

按照厂商方案采用含溴化丙锭(EtBr)的即用型凝胶盒(因维曲根公司(Invitrogen))。根据DNA的大小范围，采用0.8％、1.2％、2％和4％浓度的凝胶。60V分离38分钟。采用1∶200稀释的1kb+DNA梯标准品(因维曲根公司)作为大小标记物。

为改进灵敏度，打开凝胶盒用SYBR

-金(分子探针公司(MolecularProbes)，尤金，美国)染色凝胶30-45分钟。按厂商说明书用TE缓冲液1∶10000稀释浓染料(分子探针公司，产品信息，2001综述)5天后更换稀释液。用SYBR

-金染色凝胶30-45分钟，灵敏度比EtBr染色提高5倍。采用含最高浓度DNA的系列产品。先分析含最高浓度DNA的二个样品，作为DNA浓度的参比品，采用Threshold

总DNA试验。所用的这二个样品不经预处理，或用蛋白酶K消化后不经DNA提取。发现经过预处理与不经预处理的差异显著是由于蛋白质与DNA之间发生相互反应所致(数据未显示)。有可能是形成的较大复合物不能迁移入凝胶中。可用酶消化解决这些问题。提取DNA不会导致此法进一步优化。因此，可证实对这些样品的预处理达到了改进检测的目的。

用同一系列的所有加工过程中的样品重复该试验。在此实验中发现DNA提取没有干扰化合物有助于获得清晰的结果(数据未显示)，单用蛋白酶K处理不能去除B2样品中的高浓度盐和B5样品中的CTAB(溴化十六烷基三甲基铵硝酸盐)干扰。DNA提取则去除了所有的这种干扰物质。

然而，分析显示取自加工后续步骤或终末产品的样品中的DNA浓度不够高不能用本方法检测。为获得关于灵敏度的清晰结果，分析了MDCK细胞基因组DNA的系列稀释液(数据未显示)。

发现可检测的最低DNA浓度为10ng/ml。这证明需要建立更灵敏的DNA分析方法，因为疫苗生产过程中，从样品B5开始，可能已经达到这种DNA浓度。

分析关注于DNA的大小分布。显示用1.2％琼脂糖凝胶电泳不能检测到任何样品中的小于100bp的片段。相反，用毛细管电泳可检测到许多小于100bp的片段，特别是用β-丙内酯处理后。

观察凝胶平板中的此大小范围，采用4％琼脂糖凝胶与0.8％琼脂糖凝胶相反，分析了2个单价半成品(B8)的样品。0.8％凝胶不适合分离小片段，它们滞留在胶的上端呈现为错误大小的条带。4％凝胶较适合检测小片段。因此，需要二种浓度的琼脂糖凝胶来分析全部大小范围的DNA。

5.聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺可制备成清澈的非常薄的凝胶(1mm)，产生非常清晰的细条带。

对于聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用4-20％TBE(Tris-Borat-EDTA缓冲液，Novex公司)的梯度胶。200V下分离35分钟。用SYBR

-金染色凝胶。采用1∶200稀释的1Kb+标准品作为大小标志。分析了加工过程中的全系列样品(B1-B8)(数据未显示)。

与琼脂糖平板凝胶相比，获得的条带更明确，特别是低于100kb的感兴趣范围的DNA片段。琼脂糖凝胶电泳对分析全范围大小的片段更佳。

然而，平板聚丙烯酰胺凝胶电泳对后续加工过程中样品的核酸检测不能达到所需灵敏度。此外，此法费用高还需要处理有毒性的丙烯酰胺。

6.毛细管凝胶电泳

6.1分离系统的基础设置

用BC公司的P/ACE分子特征系统进行分离。采用激发光波长为488nm的氩离子激光，滤去520nm的发射光进行检测。此系统所用的毛细管是融合的二氧化硅毛细管，内径100μm，内侧有中性涂层(eCap dsDNA试剂盒，BC公司)。也可采用其它材料的毛细管。该中性涂层(聚丙烯酰胺亲水表面)可以几乎完全抑制电渗流(EOF)和最大程度减少分析物与毛细管内表面的相互作用。这二种功能改善了条带的清晰度和重复性。

采用双涂层来覆盖毛细管内表面。第一涂层结合于融合二氧化硅毛细管的游离硅醇基团而覆盖内表面。亲水聚丙烯酰胺第二涂层降低了疏水相互反应。此涂层经过约200次或更多次分离后仍稳定，可利用其中分离的弯曲力作为稳定性丧失的指标。

检测时需要去除覆盖毛细管外表面约10μm厚的为改进毛细管机械稳定性的聚酰亚胺涂层，因为此涂层UV光不能透过。

最初使用的毛细管全长为60cm，有效长度为50cm。优化过程中将其长度改为50cm，有效长度为40cm(39cm)。用倒置电极，即检测器在阳极端进行所有的分离。所用分离液为pH8.8-8.9的-Tris-硼酸盐缓冲液。该缓冲液属于低粘度非交联生理凝胶所用，最适合本发明方法。它所含孔的动力学结构对加热不敏感。用前，以0.45μm针筒过滤器过滤并用超声浴除气10分钟以防形成气泡。

每次用后更换凝胶基质。第一次分离前，用新鲜缓冲液以136kPa(20psi(磅/平方英寸)条件化新的毛细管，1psi对应于6666894，75728034313Pa)。每次电泳前，用新鲜缓冲液以136kPa充填毛细管5分钟。每次分离后，用缓冲液以204kPa洗涤毛细管5分钟。优选洗涤步骤不用双蒸水，因为这样毛细管的条件化维持得更恒久，导致毛细管内涂层寿命更长。毛细管的容积为3.9μl，所需的缓冲液用量可忽略不计。厂商提议分离温度采用20℃。

LIF-检测器参数的设置如下：

-动力学范围：100RFU

-滤器：常规滤膜

-峰宽16-25

-数据速率4Hz

设置为“标准CE”并参比迁移时间进行集成算法。按厂商方案[P/ACE MDQLIF检测器手册，718113-AB，BC公司，富勒顿，美国]和利用获得的1.1因数进行LIF-单位的校正。

6.2优化

从一系列加工过程中的样品选择，采用DNA含量最高的二种样品(B3和B4)。如上所述采用该样品的提取纯化的DNA。

首先，采用按照[eCap dsDNA 1000，726412-C，BC公司的维护使用说明书]方案的标准方法。电场强度200V/cm，以3kPa流体动学注入样品19秒钟。所用时间共20分钟。研究了毛细管柱加样的参数和它们是否适合高灵敏度检测基因组DNA并对这2个选择的样品进行优化。

β-丙内酯处理疫苗制品的效果清晰可见。与B3样品相反，未测到基因组DNA峰，但观察到DNA降解成小片段(数据未显示)。

在长期贮存的B3-样品中，也观察到基因组DNA降解成较小片段。例如，比较了刚刚发酵生产的B3样品与4-8℃存4个月的B3样品(同一病毒株发酵生产的)。可能由于样品中的核酸酶活性最强使DNA降解成中等长度片段(20-25分钟)。如果样品中存在核酸酶由于这种作用，必须立即用蛋白酶K处理样品防止其降解才能分析。内切蛋白酶K特异性低，能降解和灭活所有的蛋白质。

后续加工过程的样品(B4-B8)没有观察到这种作用。可安全地设想下游加工中这些酶不起作用。

进一步分析了维持参数与最佳结果的联合效果。

对加工过程中的全系列样品进行DNA提取纯化并分析，以了解是否能测定所有样品中的核酸(图1)。

在这些初步实验中，出现了几个问题，主要是该分析的灵敏度不够高不能分析所有样品中的核酸。此外，如预计的那样，DNA不呈现为分开的细条带峰，难以作出精确的大小测定。此外，加工过程前3步样品的全部DNA测得值与作为参比试验的Threshold

试验(表明B3的DNA浓度比B1高5倍)不相关。然而，从图1可见，DNA含量为980ng/ml的B1样品的电泳图看来更类似于含12ng/m的B7样品。

6.3校准

为定了量分析，必须有大小合适的标准品，目的是用于完全分离时的参比品。比较了10bp标记(DNA梯，因维曲根公司，分类号10821-051)、1kb标记(eCAP 1000dsDNA测试混合物，ΦX-174HaeIII，BC公司，分类号477414)和2kb标记(20.000dsDNA测试混合物，λDNA/HindIII片段，BC公司，分类号477483)。评估的标准是二种大小相邻的DNA组分的基线能分开并能形成符合它们集成的峰。对分离时间只有微小兴趣。注意力集中在样品中全范围长度的DNA能否适当分离。用上述标记校准后显示，采用所选基质分离时，长约1000bp的DNA停留在线性区。较短的bp范围则延伸到约10bp(数据未显示)。

如预计的那样，对1000bp以上的DNA区分能力降低，该分离基质不大适合较大分子。用毛细管电泳分析了MDCK基因组DNA(图2)。宽大MDCK峰表明DNA没有分离，可能不易分析其大小。然而，重点是可检测存在的基因组DNA，这就足以解决本发明的问题。在所选条件下，良好检测基因组DNA需要35分钟。

如果将大小标准品与样品共同注入可获得最精确的定量结果。测试了在一次电泳中是否可能分离上述所有3种大小的标准品(数据未显示)，获得了分离良好的峰。如果已知样品中要分离的DNA长度，共同注入看来是分析的好方法。然而，在DNA片段的大小未知或大小与标记物的大小相对应时，此选项不宜，因为有样品峰与标记物峰堆叠形成高峰的危险。

在每次系列样品分离开始与结束时，可用标准品校准。对于本发明的分析，所有进一步的实验优选和采用1kb标准品(最小条带为72bp)。因为用所选基质分离时，线性范围为10bp，据此推知可用于检测72bp以下大小的DNA片段。

宜以贮藏液浓度(如200μg/ml)贮藏标准品。应每天制备新鲜稀释液。

6.4分离长度和电场强度

对于上述实验，以7kPa流体动力学注入样品15秒后，以200V/cm倒置电极进行分离，毛细管有效长度为50cm，分离温度20℃。用这些设置，可在约35分钟内分离1kb标准品。

然而发现用250V/em获得了非常好的结果，具体是分离效果较好，分析时间缩短。用更高的电压显著降低了分辨率。因此，优选用200-275V/cm分离，特别优选225-265或240-260V/cm。关于分析时间，所选的毛细管有效长度为40cm。这种变化不影响分离效率。

通过这些检测，可将分析时间从35分钟缩短至23分钟。

为了进一步减少所需时间，分析了温度对分离时间的影响。显示分离温度30℃可减少分离时间，然而也减少了271bp和281bp峰的分离。因此，分离温度宜用16-25℃。

选择较高分离温度时，应对参数或基质作进一步修改。

6.5改进分析的质量

分析了几种时间，样品所携带的污染物。此外，对同一样品反复分析所得结果存在显著差异。

为解决此问题，注入样品后，只简单流体动力学注入水。令人惊奇的是，仅此步骤就显著改善了该分析的再现性。

在毛细管每次接触样品小瓶之前和/或之后洗涤毛细管二端进一步改善了检测结果。洗涤优选将毛细管/电极二末端浸入小瓶的水中。为尽可能减少污染，应用不同小瓶装水洗涤和流体动力学注入水。

所述水优选纯水，特别是蒸馏水或去离子水或双蒸水。

另外，如果(例如用火焰)去除毛细管两端外面长约2mm的涂层将改善检测结果。

6.6灵敏度

灵敏度问题证明琼脂糖凝胶电泳的检测结果和琼脂糖凝胶电泳的初步结果(不满意)，具体说，当用其分析含pg/ml浓度范围DNA的单价半成品样品时存在灵敏度不够的问题。

现已能广泛选择DNA的染料，例如嵌入性染料。特别是可用氩激光激发荧光检测的染料最适合用于本发明方法。优选溴化乙锭或其衍生染料，特别是BC公司的EnhanCE染料。宜将过量的该染料加入分离液来染色毛细管柱上的DNA。因此，不需要在注入前使DNA与染料接触。比较性实验显示此法优于将染料加入注入前的样品中，因为此法可产生非常“平滑”的基线和高灵敏度。

采用该染料可增强信号10倍(数据未显示)。嵌入性染料使DNA分子增长从而略为增加了分离时间。峰形增高看来是由于分子电荷改变所致。观察到背景信号稍微升高但恒定。根据这些实验，优选在分离液中加入适合LIF检测的以溴化乙锭衍生物为基础的嵌入性染料，具体说，每毫升分离缓冲液中加入0.1-5μl，优选0.5-1μl的EnhanCE染料。

通过膜(0.22或0.45μm)过滤去除颗粒，超声浴脱气或抽真空浓缩10分钟，然后将染料加入制备的缓冲液中。加染料后不再过滤或脱气，因为染料对这些处理敏感。因此，应均匀混合染料但不要引入空气。最合适的方法是用移液器小心地反复吹吸该溶液。该制品对光也敏感。稀释后约10小时染料会降解从而限制了分离DNA序列的总时间。技术上一次可分离约40份样品，然而每次电泳总时间为40分钟，染料不够稳定。故优选一次检测最多15份样品。

6.7浓缩样品

对于核酸浓度非常低的样品，如某些单价半成品样品，本方法检测核酸的灵敏度仍不够高。

可通过离心滤膜浓缩样品，具体是在提取DNA后，浓缩DNA可显著提高检测灵敏度。提取DNA后样品体积为500μl。CE的最小体积为约10μl。因此，如上文所详述通过离心膜最大可浓缩50倍。然而，由于本方法得到的浓缩液体积不同，有可能不能精确确定浓缩倍数。

改进灵敏度的第二种可能方法是在线浓缩，然后做毛细管电泳[Osbourn等.，“毛细管电泳的在线预浓缩方法(On-line preconcentration methods for capillaryelectrophoresis)”，Electrophoresis 21(2000)，2768-2779；Quirino等，“毛细管电泳中的阳离子和阴离子分析物的样品堆叠法”，Journal ofChromatographyA，902(2000)，119-135]。有二种可能的方法，一种流体动力学方法采用“放大电场的样品堆叠”法使样品聚集(FASS)，或“放大电场的样品注入法”利用电动力学注入使样品聚集(FASI)。

对于FASS，必须将样品溶于导电率比电泳缓冲液本身低的样品缓冲液中，或最简单的例子溶于水中。然后流体动力学注入样品。在样品液与该缓冲液之间的介面，核酸分子在电压作用下向介面加速移动从而使样品聚集。在注入样品之前先短暂塞住毛细管同时注入高浓度缓冲液可增强这种作用。

FASI利用电动力学注射将第一个小瓶中电导率低的样品液注入装满(分离)液的毛细管中。理论上，浓度差别高可导致强聚集。

另一种注入大体积样品的FASS法描述参见[Osboum等，“毛细管电泳的在线预浓缩方法”，Electrophoresis 21(2000)，2768-2779]，该法基于EOF。实验表明此法不适合用于上述有涂层的毛细管，因中其中的EOF不够(数据未显示)。尝试了通过在出口侧施压是否能补偿EOF的缺乏，用此法在反向电压作用下可去除样品栓塞。然而，要找到停止样品聚集的最优时间不能改变电流方向，故难以得到可重复的结果。

进一步实验关注于不用EOF而使样品聚集。

迄今描述的方法适应于预先注入水的样品动电注入。发现此步骤能显著提高本方法的灵敏度。

为最大程度浓缩样品，可联用样品在线聚集动电注入法与膜过滤浓缩样品法。

以下方案描述了样品处理和在导致最佳结果的条件下用动电样品注入进行分析。

用蛋白酶K消化流感疫苗制品加工过程中的样品(如56℃1小时或过夜)，然后提取DNA。离心滤膜(用截留值10kDa的centricon膜)浓缩所得样品(如500μl)。

在以下条件下用毛细管凝胶电泳分离10-25μl样品：

●通过流体动力学方法预先注入水，例如3kPa，5秒，

●通过电动力学注入样品，例如10kV，30秒，

●然后通过流体动力学方法后注入水，例如1kPa，5秒，

●用含DNA染料(如3μl/ml EnhanCE)的分离缓冲液分离样品，例如250kV，35分钟。

在相同条件下每次系列分离开始和结束时同时电泳分子大小标记物。

如上所述，用蛋白酶K处理样品和提取DNA只需用于蛋白含量显著的样品，如B3样品和/或含高浓度盐样品。然而，为更好地比较样品，所有样品应同法处理。按照此方案，完整分析了疫苗制备发酵过程几个步骤的样品。发酵开始时，存在的DNA为基因组DNA，发酵结束时，此DNA受β-丙内酯强烈处理而破坏。因此，出现宽大峰，有时峰宽几分钟，使得难于精确划定DNA片段的大小。

6.8结果分析

可利用时间或迁移率窗口来分析前文所述结果。

优选用迁移率代替时间来鉴定峰。此法可补偿每次电泳所得结果的微小变化。具体说，在依赖时间的峰鉴定时，聚丙烯酰胺网络缓慢水解可导致各实验之间时间轴的轻微倒退。如果各峰偏离了确定它们的时间窗口，就难以鉴定它们。

迁移率是一种能确定带电颗粒在电场中如何移动的定量参数。迁移率高的组分移动比迁移率低组分快。迁移率不恒定，取决于分析时所选的参数，分离参数的变化，如所提供电压的变化或基质缓慢水解，可采用迁移率明确的标准品来补偿补偿。一种先决条件是用缓冲液保证pH稳定。

迁移率的分析需要参比点，可选择第一标准品的峰(72bp)作参比点。

分析软件32karat

可分析与所选大小范围相对应的时间窗口。总结此大小范围内的峰计算出它们的面积。因此，可测定某大小范围DNA占总面积的比例(图3)。

分析含最低浓度DNA的B8样品(用threshold

试验检测＜1ng/ml)时，可测出18-21bp的DNA片段。可用本发明方法显示样品所含的短于21bp的核酸片段。

6.9测定灵敏度介限

分析了相隔1kb大小的DNA片段系列稀释液以测定本法的灵敏度介限。只将信/噪比大于3的峰视为峰。可测得标准品DNA的最低浓度为100pg/ml。不能将这些结果与用单一DNA组分测定的琼脂糖凝胶电泳可检测的最低DNA浓度直接相比。相反，上述1kb标准品含有11种片段，不能定量算出其组成各组分的量。为了能估计出关于最小DNA片段(72bp)的灵敏度，计算出其相应峰面积占总面积的百分比(0.69％)，所测定72bp片段的浓度为约0.7pg/ml。

基于毛细管凝胶电泳方法的灵敏度比琼脂糖凝胶高14000倍！此灵敏度只适用于检测一种长度的DNA片段。这解释了检测含1ng/ml DNA的样品为何需要浓缩步骤。

灵敏度取决于DNA片段的长度，因为较长的片段可嵌入更多的染料导致更强的信号(图5)。

6.10最大程度减少分析费用

在研究过程中调查了不会直接影响分离效果，但极大影响实验成本的几种情况。

所用的最贵试剂是分离液。按厂商(BC公司)的标准方案所提议，采用了2ml贮液小瓶。在调节毛细管温度的同时，通常在室温下将电极和毛细管末端浸入小瓶的分离液中。这可导致缓冲剂快速水解从而丧失筛滤作用。此外，该染料超过一天就不稳定，有给样品带来污染的危险，因而优选每日更换缓冲液小瓶。

发现优选200μl的PCR小瓶用作毛细管凝胶电泳分离液的贮藏瓶。根据所测定的电流，测得每对贮藏分离液的小瓶分离液最佳最多装5次分离用液，而观察到区分能力不降低。一项代表性的计算证明这样可实现显著的节约。因此，装有60ml分离液的试剂盒价格为900C。按厂商提出的方法，可作约150次电泳。用更小的贮液瓶装同样量的分离液可作600次电泳。因此，此种小瓶费用虽低但能有效测定。

毛细管凝胶电泳试剂盒提供多个200μl小瓶的分离液。优选该试剂盒装有合适的染料如EnhanCE染料，和标准品如BC公司的1kb标准品(HaeIII限制酶消化的ΦX-174DNA，含72bp-1,353bp的11种片段)，和任选上述有涂层的毛细管。

6.11故障排除

实验过程中，可能见到散在发生的停电故障。此时，可能不能进行电泳分析。另一问题是分离过程中毛细管中可能形成微小气泡。如果制备分离液中遗漏脱气步骤，这种影响会频繁出现。脱气较长时间可减少此问题发生的频率。分离期间通过在毛细管二端施加约34kPa压力可有效解决此问题。

采用粘稠凝胶的一种危险是溶剂蒸发可导致分离液贮液小瓶盖、毛细管外侧和电极处形成硬痂。贮液小瓶盖上有容纳毛细管的开口，如果此地形成痂，可能导致取回的毛细管在下一次实验中破裂。电极上的沉积物可导致不良的蠕动电流而对峰的分离产生不良影响。因此，推荐每日更换瓶盖、清洁电极和毛细管外侧面。

在实验过程中，观察到样品注入小瓶时可能被稀释(数据未显示)。因此，如果计划对同一份样品作多次检测应提供多份样品。

6.12β-丙内酯处理的影响

研究了β-丙内酯(BPL)是否影响用CGE分离DNA。

疫苗发酵过程中所用的BPL可通过烷化灭活DNA。BPL分子能与DNA的亲核中心反应导致交联和变性。DNA接触BPL较长时间后会出现断裂的单链，也可能丢失单个碱基。如果接触时间足够长，DNA将被片段化丧失其生物学活性。

用BPL处理实验所用的三种大小标记物(10bp、1kb和2kb标准品，见上文)16小时，与疫苗制品相同。观察到DNA的强度均降低(图6)。小浓度峰完全消失。此实验显示BPL不影响DNA的分离特征。只要存在DNA，染料就会嵌入产生信号。较短的片段看来被分解得比较长片段更快。

6.13采用内标更精确分析

采用内标(ISTD)可提高该分析的精确度。注入前每份样品中可加入用作鉴定峰的合适参比物质，如此可消除外部影响。标准品应属于样品的同类物质。为最大程度减少干扰样品，ISTD峰应出现在样品峰之前。第一次实验选择了23个碱基长的引物(ssDNA)证明可被检出。此峰划分的迁移率为“-10.000”，然而其精确值取决于分离参数，例如用不同软件计算可能不同。代数负符号的解释是电极倒置(阳极在入口处)所致。因此，在一示范性实验中，将大小标准品的峰划分为与ISTD相比的相对迁移率。用此法校准后对外部影响的敏感就降低了。ISTD的浓度为10μg/ml，以21kPa流体动力学注入5秒钟(图7)。

6.14总结

对72bp dsDNA片段本发明方法所能达到的检测下限约为9pg/ml，对应于100微微微微微摩尔(10^-21摩尔)，对应于每毫升90210个dsDNA分子，分子量660g/ml。分析只用了100μl。假设电动力学注入样品30秒小瓶中的所有分子均移动进入毛细管中，这样这种大小的dsDNA分子有大约9000个，足以检测出。

详述，在一实施方式中，本发明方法包括以下步骤：

1.优选取样后直接用蛋白酶K于56℃消化样品1小时。或者，将样品贮藏在-20℃或以下直到可以一起处理所有相关样品时。优选如上文所述在存在SDS时用蛋白酶K处理样品。

2.提取样品的DNA(如用从Wako公司购得的DNA提取试剂盒)，然后将其溶于纯水或缓冲液。具体说，浓缩后的样品(DNA)，体积应与提取DNA之前的体积相同。

3.用排除3kDa，优选10kDa大小分子的滤膜，如密里博公司的亲水性纤维素Centricon滤膜(离心)浓缩样品。离心后滤膜上不应看见液体。合适的离心参数是，例如20℃、14000g、15分钟，和20℃、2000g离心3分钟收集浓缩物。

比较性实验显示，如果样品的蛋白质含量可忽略不计(如样品B6-B8)就不需要步骤1。此时，观察到消化与不消化的和提取与不提取DNA的样品之间无差异(数据未显示)。如果盐与其它污染物的含量不干扰分析就不需要步骤2。如果样品的核酸浓度不事先浓缩而不够高不能检测则不需要步骤3。宜用相同方法处理作比较的不同样品。如果要分析的样品是单价半成品样品或作比较的样品，推荐无需蛋白酶K消化和提取DNA，这样可节省费用，每份样品的分析时间可从约3小时减少到约30分钟。

4.如下准备毛细管电泳系统，如BC公司的P/ACE MDQ分子特征分析系统：

--用488nm激光诱导的荧光检测，发射的荧光为520nm，

--毛细管：中性涂层，

--毛细管尺寸：50.2cm，总有效长度约40cm(39cm)，内径100μm，

--新的毛细管用分离液条件化10分钟。

当然，可采用比较系统和毛细管。

5.关于控制软件，应输入以下设置：

--集成模块“标准品CE”，

--根据迁移率鉴定峰，

--样品分离温度20℃，样品贮藏温度4℃，

--达到分离温度后开始电泳，

--用参照通用条件控制电泳

--动力学范围100RFU

--滤膜：常规滤膜

--峰宽16-25

--数据速率4Hz。

6.制备分离缓冲液(如Tris-硼酸盐-凝胶缓冲液，pH8.8-8.9(如购自BC公司，购买冻干品，4-8℃持续搅拌下24小时溶解，4-8℃可稳定30小时)。用0.45μm滤膜纯化所需量的缓冲液，在超声浴中脱气约10分钟。保留2ml分离液不加染料作为洗涤液。其余1ml分离液加入3μl染料，小心用移液器处吹吸混合液至均匀，确保没有引入空气。将分离液分置入200μlPCR小瓶中。该制剂对光敏感可存放10小时。

7.制备标准品稀释液。具体说，如果样品可溶于水，采用纯水。标准品浓度为100ng/ml。推荐用“eCAP 1000dsDNA测试混合物ΦX-174HaeIII”作为大小标记物。在与样品同样的条件下检测标准品，优选在同一天各系列电泳开始和结束时检测。

8.检测样品的以下事项或校准电泳：

--136kPa，用含染料的分离液平衡毛细管5分钟，

--将毛细管两端和电极浸入水中，0kPa洗涤1秒钟，

--21kPa流体动力学注入水5秒钟，

--21kPa流体动力学注入ISTD 5秒钟，

--将毛细管两端和电极浸入水中，0kPa洗涤1秒钟，

--倒置电极(阳极在入口处)10kPa电动力学注入样品30秒钟，

--将毛细管两端和电极浸入水中，0kPa洗涤1秒钟，

--倒置电极(阳极在入口处)12kV分离30分钟，优选每次15个样品，更换分离液小瓶，

--收集数据约30分钟，

--用不含DNA染料的分离液，204kPa洗涤毛细管5分钟，

--将毛细管两端和电极浸入水中，0kPa洗涤1秒钟，

--将毛细管放回水中的开始位置，

--结束。

9.收集数据用32-Karat软件分析。用软件识别分析的每个峰。然而，如需要，可手工集成数据。优选分析疫苗制品加工过程中的样品是否存在4种大小范围的DNA。因此，加入4组DNA，校准后划分成确定的时间窗口/迁移率窗口。这些窗口对应于以下大小DNA的范围：＜200bp、200-500bp、500-1000bp和＞1000bp。计算出峰面积的百分比。

10如果需要，起草报告

可用二种方法检验此法所获数据的再现性。峰鉴定的标准偏差相对百分率为1.28％。面积集成此数值为4.04％。因此，本方法的结果有高度再现性。

6.15错误讨论

测量的系统性变化可用每次测量的内标补偿，因为影响测量的所有条件变化也影响ISTD。检验了此法所得数据的再现性。

必须明白需要计算出内标峰的置信区。10次测量，此峰迁移时间的相对标准偏差为0.24分钟。将此0.24分钟值定义为该软件计算的ISTD时间窗口。将此值引入设置的程序约0.5分钟左右。对于该软件，这意味此峰必须在所定义时间之前或之后0.25分钟出现，否则不分析测量数据。峰鉴定标准偏差的相对百分率很低为1.28％(这意味1000bp大小片段的偏差为±12bp，可忽略不计)。

面积集成的标准偏差相对百分率为4.04％。

因此，本方法的测量结果有高度再现性。

决定用大小标准品校准样品峰与各大小范围的关联。相关系数是对各校准点线性关系的一种衡量，经测定10bp标准品的此系数为0.99，1kb标准品为0.95。这些数值已足够。

6.16样品中DNA的大小分布和浓度

表1提供了5次发酵加工过程中样品核酸大小分布的研究结果。核酸大小的分布见表2。

表1：大小分布为5次发酵的平均值。样品经蛋白酶K处理和DNA提取。DL＝检测介限：9pg/ml。

加工过程中的样品	＜200bp	200-500bp	500-1000bp	＞1000bp
					B1	25％	30％	16％	34％
B3	25％	12％	6％	55％
					B4	79％	29％	5％	4％
B6	69％	60％	＜DL	＜DL

B8

＞99％

＜DL

＜DL

＜DL

提供的大小分布没有考虑样品中DNA的浓度。如上文所述，B8的99％与10ng/ml DNA平均浓度相关，而B1样品的DNA浓度可能高达4000ng/ml。

因此，疫苗制品加工过程中DNA浓度可能降低几个数量级。这种降低当以DNA绝对量表示时更明显(图9)。

二个加工步骤可能同样对这种降低有最显著的贡献。第一个步骤是阳离子交换层析。令人惊奇，第二个步骤是用CTAB处理，因此CTAB处理后宜进行透析。

如前文所述，BPL处理对降低DNA大小贡献最大。通过检测PCR扩增(如β-肌动蛋白)产物，研究了样品中的DNA在BPL处理后是否仍具有生物学活性(数据未显示)。对于这些样品没有一种见到扩增(产物)，表明样品中不存在有功能的完整模板。进一步采用探针作实验，这些探针中的某些针对已知的致癌基因，也表明发酵过程中没有功能性DNA存在(数据未显示)。从而证实了用本发明方法获得的结果。

表2：5次发酵各步骤的DNA大小分布。样品用蛋白酶K处理和提取DNA。DL＝检测介限：9pg/ml。

6.17疫苗遵守的规则

对于每个剂量疫苗，DNA(残留量)的最高标准为100pg，每剂0.5ml疫苗允许的最高DNA浓度是200pg/ml。因为定量分析DNA的灵敏度至少为约9.0pg/ml，本发明提供了用毛细管凝胶电泳对疫苗污染DNA的质控方法。

7.用流体动力学注入样品的毛细管凝胶电泳

7.1电动力学和流体动力学注入样品的比较

发现电动力学(EK)注入DNA样品不能导致样品中的DNA完全注入毛细管中。相反，注意到反复EK注入样品不会显著改变结果，即每次注射样品中只有不明显的一部分DNA被注入，与预期相反，EK注射不会导致毛细管柱浓缩样品中的DNA(数据未显示)。

测试了流体动力学注射是否能注入较高量的样品DNA。测试了几种方法后发现流体动力学法可将样品注入到毛细管有效长度的26％以上中，导致比动电注射更好的结果(图9)。26％的峰高度高于10000(任意单位)，用上述电动力学(90秒，10kV)注入样品的相同实验中，只有194bp峰的峰高度可达到低于10000。(这句话看不懂)

表3：显示图9实验所用的注射条件(近似值)

注射时间[秒]/压力[psi]/[kPa]	长度占窗口的％	HD注入样品[nl]
			6/3/21	1	32.3
12/3/21	2	64.6
			30/3/21	5	161
60/3/21	10	323
			90/3/21	26	646
90/4/28	65	1615
			90/15/105	97	2423

图10显示以流体动力学(3psi/21kPa，3.57分钟或7.5分钟)注入3种浓度(上：1ng/ml，中：100pg/ml，下：10pg/ml)之一的示范性样品dsDNA1000测试混合物(Beckman公司)，加至检测器窗口中毛细管长度的25％和50％作CEG分离的比较。加入25％的分离显示结果良好，分辨率可接受，而加入50％峰的分辨率无论如何不可接受。因为有复杂的因素影响结果的质量，这些结果不是预料的。

7.2用本发明CGE法分析流感疫苗产品的单价半成品按照本发明优选方法分析了3株不同病毒制品的单价半成品中的DNA污染。56℃用蛋白酶K处理样品，真空离心浓缩5倍，按MagNa Pure

(罗氏公司)方法(总NA LV试剂盒

罗氏公司)提取核酸，取1ml样品(溶于50μl样品缓冲液中)用eCap dsDNA 1000试剂盒(Beckman公司)作CGE分析(3psi，21kpa流体动力学注入样品至有效长度的30％)。

对3株病毒和2种浓缩标记(dsDNA 1000测试混合物，Beckman公司，绝对浓度1ng/ml(从上向下数第4)和100pg/ml(下)的DNA分析结果见图11。H1/所罗门株制品含有显著量的长200bp以上的DNA(上)。B/马来西亚株制品含有显著量的短于200bp的DNA和少量长200bp以上的DNA(从上向下数第2)。H3/威斯康辛株制品(从上向下数第3)不含显著量的长200bp以上的DNA，此制品只检测到非常短的DNA片段(除了10bp长度的内标外)。

在同样条件下从添加了200bp、500bp和2000bp DNA片段的布里斯班流感病毒株单价半成品获得的电泳图见图12(上部和中部线条：样品的2次测定，下部线条为也添加了Beckman公司试剂盒的dsDNA 1000，100pg/ml)。

7.3用本发明方法分析细胞(MDCK细胞)的DNA

制备MDCK细胞的提取物用本发明方法处理，包括蛋白酶K处理和MagNa Pure DNA

(罗氏公司)提取。用CGE分析大小不明确的DNA(条件如7.2中所述)(图13)。容易地观察到添加的200bp、500bp和2000bp DNA片段从而得以测定大小分布。

Claims (21)

1.一种分析核酸的存在和/或大小分布的方法，其中用毛细管凝胶电泳分离包含核酸的样品，该方法包括以下步骤：

(i)通过流体动力学法注射将样品注入毛细管有效长度的20-40％；

(ii)分离核酸；

(iii)检测核酸。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸是DNA，更优选基因组DNA和/或DNA的降解产物。

3.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述样品以14-35kPa的压力注入3-4.5分钟。

4.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，该方法还包括在步骤(i)之前用水以流体动力学法预先注入毛细管，优选以1-34kPa的压力注入2-10秒钟。

5.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，该方法还包括在步骤(i)与(ii)之间用水以流体动力学法后注入毛细管，优选以1-34kPa的压力注入2-10秒钟。

6.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述分离在200-275V/cm电压下进行。

7.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，用激光诱导的荧光进行检测。

8.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述样品中添加了至少一种感兴趣的大小明确的核酸。

9.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述分离缓冲液含有适合于检测核酸的染料，优选EnhanCE染料。

10.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，通过毛细管凝胶电泳分离待分析是否存在基因组DNA或其降解产物的样品，包括以下步骤：

(i)以21-28kPa压力，用流体动力学法注射3-4.5分钟，将样品注入毛细管有效长度的约30％；

(ii)在255V/cm下分离核酸；

(iii)用激光诱导的荧光检测核酸；

还包括在步骤(i)之前用水以流体动力学法预先注入毛细管，优选以7kPa的压力注入5秒钟；

还包括在步骤(i)与(ii)之间用水以流体动力学法后注入毛细管，优选以7kPa压力注入5秒钟；

其中在预先注入水之前和/或注入样品后进行洗涤步骤，优选使毛细管两端与水接触；

其中分离缓冲液包含嵌入性染料，优选浓度为每毫升分离缓冲液0.5μl的EnhanCE染料。

11.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，该方法适合检测至少200fg的一种尺寸DNA。

12.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述毛细管的有效长度为39cm，电泳分离时间为40-55分钟，优选约45分钟。

13.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述分离缓冲液是pH 8-9.5，优选pH 8.8的缓冲液，最优选具有所述pH的Tris-硼酸盐缓冲液。

14.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述样品是药物组合物，并且待分析是否存在DNA或其片段，其中所述DNA优选基因组DNA，优选证明该样品包含或不包含含有功能性基因的DNA和/或具有致癌潜能的DNA。

15.如以上权利要求任何一项所述的方法，其特征在于，所述样品用包括以下步骤的方法预处理：

●任选用蛋白酶K消化样品，优选在存在SDS时消化样品；

●提取核酸。

16.一种制备给予哺乳动物的组合物的方法，其中所述组合物样品通过以上权利要求任何一项所述的方法分析。

17.一种分析样品中核酸的存在和/或大小分布的方法，包括用毛细管凝胶电泳分离样品，和用激光诱导的荧光检测核酸，其中所述核酸是基因组DNA和/或DNA的降解产物。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述分析核酸的存在和/或其大小分布是为了确定样品的致癌潜能和/或样品中功能性基因的存在。

19.如权利要求17或18所述的方法，其特征在于，所述样品得自疫苗制品，优选流感疫苗。

20.如权利要求17-19所述的方法，其特征在于，按照权利要求1-15所述的方法分析样品。

21.用以上权利要求任何一项所述方法分析的疫苗。

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