CN115747188A

CN115747188A - 一种Sau DNA聚合酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN115747188A
Application number: CN202211711786.9A
Authority: CN
Inventors: 任黎明; 李娅婕; 张惠丹
Original assignee: Suzhou Qiankang Gene Co ltd; Suzhou Huizhen Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Qiankang Gene Co ltd; Suzhou Huizhen Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-12-29
Filing date: 2022-12-29
Publication date: 2023-03-07

Abstract

本发明公开了一种Sau DNA聚合酶突变体及其应用。所述Sau DNA聚合酶突变体在野生型Sau DNA聚合酶基础上突变获得的，其中，编码所述野生型Sau DNA聚合酶的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述Sau DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；突变位点包括F8、I27、I290、L418、V426中的任意一种或两种以上的组合。本发明通过改变Sau DNA聚合酶的F8、I27、I290、L418、V426五个位点的氨基酸改变得到了聚合酶突变体，提高了3’OH的催化特异性活性，降低了非特异性扩增，提高了重组酶扩增的灵敏度。

Description

一种Sau DNA聚合酶突变体及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学、蛋白质组学技术领域，具体涉及一种Sau DNA聚合酶突变体及其应用。

背景技术

核酸恒温扩增检测是一种新型的分子检测技术，能够从血液或者人体附属物及环境中分析检测特定基因序列，预测疾病、鉴定病毒种类等，对病毒防控有着重要意义。本发明涉及一种Sau DNA聚合酶，该聚合酶是重组酶扩增反应体系中不可缺少的DNA聚合酶，SauDNA聚合酶的最佳工作温度37℃，可以不依赖于加热装置，轻松满足加热条件，对于特殊环境做基因检测有着特殊意义，Sau DNA聚合酶的性能直接影响着重组酶扩增的灵敏度及特异性，从而影响对结果准确定的判断。

天然的野生型Sau DNA聚合酶有着很强的taling活性(末端加尾活性)，能够非特异性的在引物的3’羟基末端添加脱氧核糖核酸，这样减少Sau DNA聚合酶的特异性，使其不能和模板完全匹配，导致扩增序列失真。非特异性产物的扩增会对造成大概率的假阳性，使扩增不能真实反映出模板的序列，从而影响结果的判断。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种Sau DNA聚合酶突变体及其应用，以克服现有技术的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明实施例提供了一种Sau DNA聚合酶突变体，所述Sau DNA聚合酶突变体在野生型Sau DNA聚合酶基础上突变获得的，其中，编码所述野生型Sau DNA聚合酶的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述Sau DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；突变位点包括F8、I27、I290、L418、V426中的任意一种或两种以上的组合。

本发明实施例还提供了一种低末端加尾活性的聚合酶突变体，所述聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明实施例还提供了一种低末端加尾活性的聚合酶突变体，所述聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示、SEQ ID NO:5所示或SEQ ID NO:6所示。

本发明实施例还提供了包含前述聚合酶突变体的试剂、试纸、试剂盒。

本发明实施例还提供了前述聚合酶突变体在重组酶扩增中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明通过改变Sau DNA聚合酶的F8、I27、I290、L418、V426五个位点的氨基酸改变得到了聚合酶突变体，提高了3’OH的催化特异性活性，降低了非特异性扩增，提高了重组酶扩增的灵敏度。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1中Sau DNA聚合酶突变电白电泳结果图；

图2是本发明实施例2中Sau DNA聚合酶突变体taling活性测定图；

图3是本发明实施例3中Sau DNA聚合酶突变体在无模版扩增时RPA扩增荧光曲线图；

图4是本发明实施例4中Sau DNA聚合酶不同突变体RPA扩增产物毛细管检测结果图。

具体实施方式

鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，本发明针对Sau DNA聚合酶的晶体结构做了分析，推断出造成加尾活性的结构域，并通过分子生物学技术对该结构与的氨基酸序列进行了突变，形成多种突变体。通过重组酶扩增进一步验证了突变体对taling活性的影响，经过验证突变后的Sau DNA聚合酶与野生型比较，极大地降低了taling活性，从而提高了重组酶恒温扩增的灵敏度，使重组酶扩增的产物真实反映模板DNA的含量。

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

具体的，作为本发明技术方案的一个方面，其所涉及的一种Sau DNA聚合酶突变体，所述Sau DNA聚合酶突变体在野生型Sau DNA聚合酶基础上突变获得的，其中，编码所述野生型Sau DNA聚合酶基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示，所述Sau DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；突变位点包括F8、I27、I290、L418、V426中的任意一种或两种以上的组合。

在一些优选实施方案中，所述突变位点F8包括F8I、F8G或F8L。

在一些优选实施方案中，所述突变位点I27包括I27V、I27H或I27R。

在一些优选实施方案中，所述突变位点I290包括I290S、I290T或I290W。

在一些优选实施方案中，所述突变位点L418包括L418S、L418T或L418E。

在一些优选实施方案中，所述突变位点V426包括V426L或V426I。

具体的，本发明中的一种Sau DNA聚合酶突变体是以编码野生型Sau DNA聚合酶的DNA序列、野生型Sau DNA聚合酶的蛋白序列为基础，突变体位置包含F8、I27、I290、L418、V426其中的一个或多个位置的突变体的组合。

其中，F8可突变为I、G、L；

I27可突变为V、H、R；

I290可突变为S、T、W；

L418可突变为S、T、E；

V426可突变为L、I。

具体的，本发明中的Sau DNA聚合酶突变体的制备包括以下步骤：

1)根据突变位点设计引物，通过PCR扩增将突变位点的DNA序列改变，并拼接出全长基因序列；

2)将拼接的全长基因序列NdeI和XhoI双酶切，通过T4连接酶克隆在PET-21b载体上。

3)连接产物转化DH5α感受肽细胞中通过涂布氨苄抗性的平板培养；

4)通过PCR筛选阳性克隆。并通过测序验证突变体；

5)将筛选好的阳性克隆转化BL21感受肽细胞，诱导表达；

6)大肠杆菌破碎诱导后的细胞，通过亲和层析色谱和离子交换色谱纯化目的蛋白；

7)对突变体taling活性进行检测；

8)通过重组酶恒温扩增反应，测试突变体的灵敏度。

本发明包含其中的一种或几种组合，通过突变关键位点的氨基酸改变氨基酸的带电荷或疏水性，从而改变聚合酶的空间结构使其减少该位点对脱氧核糖核酸的非特异性结合，提高Sau DNA聚合酶3’OH末端的识别能力，从而降低酶的非特异性识别，提高酶的特异性结合，实现高灵敏度扩增。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种低末端加尾活性的聚合酶突变体，所述聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明实施例的另一个方面还提供了一种低末端加尾活性的聚合酶突变体，所述聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示、SEQ ID NO:5所示或SEQ ID NO:6所示本发明实施例的另一个方面还提供了前述聚合酶突变体在核酸扩增中的用途。

本发明实施例的另一个方面还提供了前述聚合酶突变体在重组酶扩增中的用途。

本发明实施例的另一个方面还提供了包含前述聚合酶突变体的试剂、试纸、试剂盒。

下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。

实施例1：Sau DNA聚合酶的突变和制备

1.Sau DNA聚合酶构建载体

1)根据SEQ ID NO:1合成基因序列并将全基因片段插入载体pET-21b(NdeI和XhoI)载体中。本实施例中使用的是pET-21b表达载体，但不限于次载体。

2)根据突变点F8、I27、I290、L418、V426的位置，修改DNA序列使其对应的氨基酸发生改变，可修改为F8I、G、L；I27 V、H、R；I290 S、T、W；L418S、T、E；V426L、I。不局限于其中的一种或多种突变。

2.Sau DNA聚合酶诱导表达

1)挑取Amp抗性LB固体培养基上的单克隆菌落到150ml/瓶LB液体培养基中并加入150μl 100mg/ml氨苄霉素，置于恒温振动培养箱中200rpm 37℃培养16h；

2)取10ml培养好的菌种接种于1L/瓶LB液体培养基中，并加入1ml 100mg/ml氨苄霉素，封口膜封闭瓶口，置于恒温振动培养箱中200rpm 37℃培养约4h；

3)从1L/瓶LB液体培养菌液中取1ml菌液，用分光光度计监测菌液在600nm波长时的吸收值在0.8-1.0之间时每瓶菌液加入1ml 1M IPTG，将恒温振荡培养箱的设置200rpm16℃培养继续培养16h；

3.Sau DNA聚合酶的纯化

1)称取Sau DNA聚合酶湿菌20g放入200ml玻璃烧杯中；

2)用量桶量取100ml Lysis buffer(Sau-Lysis buffer:50mM Tris-HCl,5％甘油PH:6.0)倒入烧杯中，磁力搅拌器搅拌至无块状菌体；

3)将重悬菌液缓慢倒入高压均质机进样杯中，设置速度：50；压力800-1000bar；开始破碎，接收破碎后液体，12000rpm 4℃离心15min；

4)将上清转移至干净烧杯中，用0.22μm滤膜过滤；

5)用Lysis buffer平衡Q-HP层析柱后，将上清，上柱；

6)上样结束后再次平衡至UV检测值趋于平衡；

7)用Elution buffer(50mM Tris-HCl,5％甘油,1M NaCl PH:6.0)线性梯度洗脱15个柱体积。

8)将洗脱下来的峰收集，过镍柱亲和层析；

9)用binding buffer平衡镍柱亲和层析柱；

10)平衡后将过Q柱收集的蛋白，上样镍柱亲和层析柱；

11)用Elution buffer(50mM Tris-HCl、5％甘油、0.5M NaCl、250mM咪唑PH:7.6)线性梯度洗脱15个柱体积。；

12)将镍柱洗脱出来的峰过凝胶过滤柱。

图1为Sau DNA聚合酶突变体蛋白纯化结果，从电泳图可以看出蛋白纯度大于95％；其中，图1中泳道1：WT野生型；泳道2：F8G、I27 V、I290S、L418S、V426L；泳道3：F8I、I27V、I290T、L418S、V426L；泳道4：F8L、I27V、I290 T、L418S、V426I。

实施例2：对Sau DNA聚合酶突变体的taling活性测定。

Taling活性(加尾活性)本质上是非特异性的在primer 3’羟基末端添加单核苷酸脱氧核糖核酸催化磷酸二酯键的形成。专利CN114317679A中末端转移酶的酶活检测方法，原理就是测定非特异性核苷酸的合成能力，所以本发明专利参考了末端转移酶的酶活检测方法。

1.不同突变体Sau DNA聚合酶：WT野生型；F8G、I27 V、I290S、L418S、V426L；F8I、I27V、I290T、L418S、V426L；F8L、I27V、I290T、L418S、V426I。

2.配制反应体系：

名称	1个反应体积
		M13mp18-619F(5uM)	2ul
dNTPs(5mM each)	2ul
		10×Reaction Buffer	5ul
10×MgCl<sub>2</sub>	5ul
		OliGreen	2ul
M13mp18-619F(5uM)	2ul
		H<sub>2</sub>O	33ul
Total	49ul

振荡混匀，冰上放置。

3.测量

1)取Costar全黑酶标板一块，将配制的反应液分到酶标板中，每孔49ul。

2)用移液器分别取1ul步骤1稀释好的不同突变体的末端转移酶加入到酶标板的反应液中，用涡旋混匀仪混匀。

3)盖上盖子，将酶标板放在恒温培养箱中，设置温度37℃，10min后取出。

4)去掉盖子，将酶标板放在酶标仪上读数，设置温度37℃，激发光480nm，发射光520nm。

如图2从实验结果证实，Sau DNA聚合酶突变体F8I、I27V、I290T、L418S、V426L的非特异性taling活性最低，且远低于野生型。F8、I27、I290、L418、V426的突变位点确实影响了Sau DNA聚合酶的taling活性，对聚合酶3’羟基末端特异性结合有着明显的影响。

实施例3：不同突变体在无模版的重组酶扩增中的测定

RPA反应体系包含終浓度为：100-350ng/ul重组酶UvsX、10-50ng/ul辅助蛋白UvsY、500-100ng/ul单链DNA结合蛋白GP32、0.01-0.5U/μL肌酸激酶CK、1×RehydrationBuffe、1×E-mix、0.5mM dNTP、400nM MPXV RPA-R(如SEQ ID NO:7所示)、400nM MPXV RPA-F(如SEQ ID NO:8所示)、14mM MgOAC、1×SYBR GREEN。将不同突变体F8G、I27 V、I290S、L418S、V426L；F8I、I27V、I290T、L418S、V426L：F8L、I27V、I290T、L418S、V426I1：WT野生型终浓度50-150ng/ul。配制完成后，震荡混匀。置于7500荧光定量PCR仪，温度设置为37℃，30s读一次荧光反应时间30min。

结果如图3无模板RPA扩增荧光曲线，野生型Sau聚合酶有较高的taling活性，无模版时造成了大量的非特异性扩增并产生荧光，而突变体Sau聚合酶taling活性较低，没有产生非特异性扩增，突变体F8I、I27V、I290T、L418S、V426L几乎没有产生荧光信号，与实验2的taling活性测定结果有着惊人的一致性，再次验证实验2的准确性。

其中图3中1代表WT野生型；2代表F8G、I27 V、I290S、L418S、V426L；3代表F8L、I27V、I290T、L418S、V426I；4代表F8I、I27V、I290T、L418S、V426L。

实施例4：不同突变体在有模版时重组酶扩增中的测定

RPA反应体系包含終浓度为：100-350ng/ul重组酶UvsX、10-50ng/ul辅助蛋白UvsY、500-100ng/ul单链DNA结合蛋白GP32、0.01-0.5U/μL肌酸激酶CK、1×RehydrationBuffe、1×E-mix、0.5mM dNTP、400nM MPXV RPA-R(如SEQ ID NO:7所示)、400nM MPXV RPA-F(如SEQ ID NO:8所示)、14mM MgOAC、1000copies的模板。将不同突变体F8G、I27 V、I290S、L418S、V426L；F8I、I27V、I290T、L418S、V426L：F8L、I27V、I290T、L418S、V426I1：WT野生型终浓度50-150ng/ul加到RPA反应体系中。配制完成后，震荡混匀。PCR仪，温度设置为37℃，反应时间30min。反应后毛细管电泳对RPA产物进行电泳检测。(本实施例中的MPXV RPA-R、MPXV RPA-F是根据猴痘模板序列设计的，如SEQ ID NO:9所示)

结果如图4有模板RPA扩增产物毛细管凝胶电泳检测，野生型Sau聚合酶在有模板时扩增产物弥散，条带不单一且有大量杂带产生，而突变体Sau聚合酶taling活性较低，没有产生非特异性扩增，突变体F8I、I27V、I290T、L418S、V426L条带单一，并保持了较高的聚合酶活性。其中，图4中1代表WT野生型；2代表F8G、I27 V、I290S、L418S、V426L；3代表F8I、I27V、I290T、L418S、V426L；4代表F8L、I27V、I290T、L418S、V426I。

此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。

应当理解，本发明的技术方案不限于上述具体实施案例的限制，凡是在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落于本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种Sau DNA聚合酶突变体，其特征在于：所述Sau DNA聚合酶突变体在野生型SauDNA聚合酶基础上突变获得的，其中，编码所述野生型Sau DNA聚合酶的DNA序列如SEQ IDNO:1所示，所述Sau DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；突变位点包括F8、I27、I290、L418、V426中的任意一种或两种以上的组合。

2.根据权利要求1所述的Sau DNA聚合酶突变体，其特征在于：所述突变位点F8包括F8I、F8G或F8L。

3.根据权利要求1所述的Sau DNA聚合酶突变体，其特征在于：所述突变位点I27包括I27V、I27H或I27R。

4.根据权利要求1所述的Sau DNA聚合酶突变体，其特征在于：所述突变位点I290包括I290S、I290T或I290W。

5.根据权利要求1所述的Sau DNA聚合酶突变体，其特征在于：所述突变位点L418包括L418S、L418T或L418E。

6.根据权利要求1所述的Sau DNA聚合酶突变体，其特征在于：所述突变位点V426包括V426L或V426I。

7.一种低末端加尾活性的聚合酶突变体，其特征在于：所述聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

8.一种低末端加尾活性的聚合酶突变体，其特征在于：所述聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示、SEQ ID NO:5所示或SEQ ID NO:6所示。

9.包含权利要求1～8中任意一项所述聚合酶突变体的试剂、试纸、试剂盒。

10.权利要求1～8中任意一项所述聚合酶突变体在重组酶扩增中的用途。