JPH08228800A - ウイルスの分析的分離法 - Google Patents
ウイルスの分析的分離法Info
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- JPH08228800A JPH08228800A JP7300435A JP30043595A JPH08228800A JP H08228800 A JPH08228800 A JP H08228800A JP 7300435 A JP7300435 A JP 7300435A JP 30043595 A JP30043595 A JP 30043595A JP H08228800 A JPH08228800 A JP H08228800A
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 タンパク質部分および／またはヌクレオチド
および／または他のウイルスのような有機または無機の
少量構成物を含む液体試料マトリックス中の、ウイルス
またはウイルス粒子（被検物）の非−破壊的分析的検出
法および／または定量法の提供。 【解決手段】 試料マトリックス中のウイルスまたはウ
イルス粒子をタンパク質部分および／またはヌクレオチ
ドからキャピラリー電気泳動を使用して分離し、そして
同時にそれに伴う電気泳動図を記録する段階を含んでな
るウイルスまたはウイルス粒子の分析法。被検体と指定
された画分を電気泳動図中のウイルスピークとして、特
徴的な最大値の補助で分光光度的解釈により同定する。
より良い同定のために、既知ウイルスまたは既知ウイル
ス粒子の参照試料が試料マトリックスに加えられる。
および／または他のウイルスのような有機または無機の
少量構成物を含む液体試料マトリックス中の、ウイルス
またはウイルス粒子（被検物）の非−破壊的分析的検出
法および／または定量法の提供。 【解決手段】 試料マトリックス中のウイルスまたはウ
イルス粒子をタンパク質部分および／またはヌクレオチ
ドからキャピラリー電気泳動を使用して分離し、そして
同時にそれに伴う電気泳動図を記録する段階を含んでな
るウイルスまたはウイルス粒子の分析法。被検体と指定
された画分を電気泳動図中のウイルスピークとして、特
徴的な最大値の補助で分光光度的解釈により同定する。
より良い同定のために、既知ウイルスまたは既知ウイル
ス粒子の参照試料が試料マトリックスに加えられる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術】本発明は、特にタンパク質部分お
よび／またはヌクレオチドおよび／または他のウイルス
のような有機または無機の少量構成物を含む液体試料マ
トリックス中の、ウイルスまたはウイルス粒子（被検
物）の非−破壊的分析的検出法および／または定量法に
関する。
よび／またはヌクレオチドおよび／または他のウイルス
のような有機または無機の少量構成物を含む液体試料マ
トリックス中の、ウイルスまたはウイルス粒子（被検
物）の非−破壊的分析的検出法および／または定量法に
関する。
【０００２】
【従来の技術】特異的な抗原−抗体相互反応に基づく免
疫学的方法は周知である。例えばELISA（酵素−結合−
免疫−吸着−アッセイ：Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent
Assay)、相補的結合反応、SNT(血清中和試験：Serum N
eutralisation Test)および蛍光−標識抗体のような数
々の応用法は検出法のみが異なる。
疫学的方法は周知である。例えばELISA（酵素−結合−
免疫−吸着−アッセイ：Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent
Assay)、相補的結合反応、SNT(血清中和試験：Serum N
eutralisation Test)および蛍光−標識抗体のような数
々の応用法は検出法のみが異なる。
【０００３】これらの方法の問題点は、ウイルスの免疫
的領域に対する検出反応の高い特異性である。これはウ
イルス粒子の抗原活性と免疫−反応性タンパク質の抗原
活性とを区別することができない。また逆に偽陽性結果
または交差反応性も現れることがある。
的領域に対する検出反応の高い特異性である。これはウ
イルス粒子の抗原活性と免疫−反応性タンパク質の抗原
活性とを区別することができない。また逆に偽陽性結果
または交差反応性も現れることがある。
【０００４】特異的なウイルス活性は通常、次の２つの
結果から測定される： ａ） 標的細胞に対するウイルスの特異的な病原性効果
を確認する。
結果から測定される： ａ） 標的細胞に対するウイルスの特異的な病原性効果
を確認する。
【０００５】例えばここでは感染細胞群の細胞変性、血
球凝集または血球吸着の視覚的観察を挙げることができ
る。
球凝集または血球吸着の視覚的観察を挙げることができ
る。
【０００６】ｂ）例えばウイルス−特異的酵素反応が逆
転写酵素活性を介してレトロウイルスで測定できる。
転写酵素活性を介してレトロウイルスで測定できる。
【０００７】この問題点は定量性が悪いこと、そして天
然宿主への伝達性能に関して試験システムの関連性が不
確実であることである。
然宿主への伝達性能に関して試験システムの関連性が不
確実であることである。
【０００８】分子生物学的方法は次のように要約でき
る。
る。
【０００９】ａ） プローブ診断では、ウイルスヌクレ
オチド配列が特異的な導入遺伝子プローブとのハイブリ
ダイゼーションにより同定される。
オチド配列が特異的な導入遺伝子プローブとのハイブリ
ダイゼーションにより同定される。
【００１０】ｂ）ウイルス遺伝子は制限酵素により生成
される特異的な開裂試料により同定される。
される特異的な開裂試料により同定される。
【００１１】ｃ）ウイルスは特異的遺伝子配列の増幅
（ＰＣＲ）により同定される。
（ＰＣＲ）により同定される。
【００１２】ｄ）ウイルス遺伝子はヌクレオチド配列決
定法により同定される。
定法により同定される。
【００１３】これらの方法はウイルスの同一性について
最大量の情報を包含する。しかしその方法は比較的高価
で、労力を要し、そして定量には非常に適さない。さら
にこれらの分析的方法はウイルスの遺伝型は示すが、表
現型は示さない。
最大量の情報を包含する。しかしその方法は比較的高価
で、労力を要し、そして定量には非常に適さない。さら
にこれらの分析的方法はウイルスの遺伝型は示すが、表
現型は示さない。
【００１４】ウイルス−特異的タンパク質パターンは、
様々な電気泳動法およびクロマトグラフィー的方法を使
用して分離することにより同定できる。免疫的タンパク
質はさらに免疫学的方法（イムノブロット）により認識
できる。タンパク質バンドが分類できるためには、ウイ
ルスは開裂前に大変きれいでなければならない（精製コ
ストがかかる）。すでに分解されているウイルスもまた
正しいパターンを表すことができる。
様々な電気泳動法およびクロマトグラフィー的方法を使
用して分離することにより同定できる。免疫的タンパク
質はさらに免疫学的方法（イムノブロット）により認識
できる。タンパク質バンドが分類できるためには、ウイ
ルスは開裂前に大変きれいでなければならない（精製コ
ストがかかる）。すでに分解されているウイルスもまた
正しいパターンを表すことができる。
【００１５】キャピラリー電気泳動（capillary electr
ophoresis:CE)は比較的新しい分離法であり、この技術
により分析される試料は電気的に高い電場中のキャピラ
リー内で異なる移動速度により分離される。検出は光学
的検出機[1]の使用によりキャピラリー内で直接行われ
る。ＣＥの応用範囲は広範であり、イオン分析、鏡像異
性体の分離、タンパク質分析およびヌクレオチド分析か
ら粒子の分離にまで及ぶ[2]。今までこの技術により個
別の分子または均一な機械的に安定な粒子が調査されて
きただけであった。例えば、キャピラリー電気泳動によ
る組換えリポタンパク質粒子の分離は[3]に記載されて
いる。
ophoresis:CE)は比較的新しい分離法であり、この技術
により分析される試料は電気的に高い電場中のキャピラ
リー内で異なる移動速度により分離される。検出は光学
的検出機[1]の使用によりキャピラリー内で直接行われ
る。ＣＥの応用範囲は広範であり、イオン分析、鏡像異
性体の分離、タンパク質分析およびヌクレオチド分析か
ら粒子の分離にまで及ぶ[2]。今までこの技術により個
別の分子または均一な機械的に安定な粒子が調査されて
きただけであった。例えば、キャピラリー電気泳動によ
る組換えリポタンパク質粒子の分離は[3]に記載されて
いる。
【００１６】高感度の蛍光検出のために、ＤＮＡ／ＲＮ
Ａ−結合染色試薬がＤＮＡおよびＲＮＡ用に成功裏に使
用されている[4,5]。これらの染色法では一本鎖または
二本鎖ヌクレオチドについての選択性の差異、あるいは
ＲＮＡおよびＤＮＡの最大蛍光の差異をある程度示す。
したがって、例えばアクリジンオレンジはＤＮＡについ
ては520nmで、そしてＲＮＡについては650nmで最大の蛍
光発光を示す。ＣＥでの蛍光検出ももっぱら二本鎖ＤＮ
Ａについて記載されている[6]。
Ａ−結合染色試薬がＤＮＡおよびＲＮＡ用に成功裏に使
用されている[4,5]。これらの染色法では一本鎖または
二本鎖ヌクレオチドについての選択性の差異、あるいは
ＲＮＡおよびＤＮＡの最大蛍光の差異をある程度示す。
したがって、例えばアクリジンオレンジはＤＮＡについ
ては520nmで、そしてＲＮＡについては650nmで最大の蛍
光発光を示す。ＣＥでの蛍光検出ももっぱら二本鎖ＤＮ
Ａについて記載されている[6]。
【００１７】結合定数の決定のために、ＣＥを使用する
タンパク質−リガンド相互作用に関する大量の方法が文
献に記載された[7,8]。これらの方法は相互作用に参加
する物質の相互作用を介した移動時間のシフト、あるい
はピーク面積の変化のいずれかに基づく。これは実験的
に以下のように行うことができる。
タンパク質−リガンド相互作用に関する大量の方法が文
献に記載された[7,8]。これらの方法は相互作用に参加
する物質の相互作用を介した移動時間のシフト、あるい
はピーク面積の変化のいずれかに基づく。これは実験的
に以下のように行うことができる。
【００１８】１．相互作用に参加する物質をＣＥ分離前
にインキューベーションし、そして形成した複合体をＣ
Ｅを使用して個々の成分から分離する。
にインキューベーションし、そして形成した複合体をＣ
Ｅを使用して個々の成分から分離する。
【００１９】２．相互作用に参加する物質をＣＥ緩衝液
中に置き、他の参加物質との移動時間のシフトを測定す
る（アフィニティーキャピラリー電気泳動）。
中に置き、他の参加物質との移動時間のシフトを測定す
る（アフィニティーキャピラリー電気泳動）。
【００２０】第１の方法は材料が経済的であり、かつ参
加物質の選択に融通性があるため主に研究された。
加物質の選択に融通性があるため主に研究された。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】本発明はウイルスの分
析的検査の向上を目的とすることに基づき、特にタンパ
ク質部分および／またはヌクレオチドのような有機また
は無機の少量構成物を含む液体試料マトリックス中の、
迅速かつ明確な同定および／または定量を可能にするも
のである。
析的検査の向上を目的とすることに基づき、特にタンパ
ク質部分および／またはヌクレオチドのような有機また
は無機の少量構成物を含む液体試料マトリックス中の、
迅速かつ明確な同定および／または定量を可能にするも
のである。
【００２２】
【課題を解決するための手段】この目的は本発明によ
り、キャピラリー電気泳動法を使用してウイルスまたは
ウイルス粒子を試料中のタンパク質部分および／または
ヌクレオチドから分離する方法を使用して達成され、そ
して同時に電気泳動に付随する電気泳動図が記録され、
そして被検物と認められた画分が電気泳動図中のウイル
スピークとして、特徴的な最大値の補助で分光的な解釈
により同定される。
り、キャピラリー電気泳動法を使用してウイルスまたは
ウイルス粒子を試料中のタンパク質部分および／または
ヌクレオチドから分離する方法を使用して達成され、そ
して同時に電気泳動に付随する電気泳動図が記録され、
そして被検物と認められた画分が電気泳動図中のウイル
スピークとして、特徴的な最大値の補助で分光的な解釈
により同定される。
【００２３】ウイルス粒子は活性または不活性と定義さ
れ、同様にそれらの表面特性により化学的に、分子生物
学的に、または酵素に修飾された粒子と、またはそれら
の構造的造作によりウイルス様であると見なされる。ウ
イルス（ウイルス粒子）は二本鎖または一本鎖のＤＮＡ
またはＲＮＡを含んでもよく、そして外殻または脱外殻
で存在してもよい。分離はウイルスの大きさに依存せ
ず、ウイロイドまたはビリオンもこのように特性決定で
きる。
れ、同様にそれらの表面特性により化学的に、分子生物
学的に、または酵素に修飾された粒子と、またはそれら
の構造的造作によりウイルス様であると見なされる。ウ
イルス（ウイルス粒子）は二本鎖または一本鎖のＤＮＡ
またはＲＮＡを含んでもよく、そして外殻または脱外殻
で存在してもよい。分離はウイルスの大きさに依存せ
ず、ウイロイドまたはビリオンもこのように特性決定で
きる。
【００２４】ウイルスは例えば生物的物質（血清、尿、
細胞、血漿、細胞上清、体液、唾液など）または非−生
物的組成物（水、医薬品、土壌試料など）のような任意
の試料マトリックスから直接的に同定できる。
細胞、血漿、細胞上清、体液、唾液など）または非−生
物的組成物（水、医薬品、土壌試料など）のような任意
の試料マトリックスから直接的に同定できる。
【００２５】同定のためには、既知のウイルスまたは既
知のウイルス粒子の参照試料が試料マトリックスに有利
に加えられる。
知のウイルス粒子の参照試料が試料マトリックスに有利
に加えられる。
【００２６】好ましくはウイルスまたはウイルス粒子は
ＲＮＡ／ＤＮＡ結合性の、分光光度的に同定可能な染色
剤で染色される。もし蛍光染色を使用するならば、特に
高感度を達成でき、これは蛍光分光光度計で検出され
る。
ＲＮＡ／ＤＮＡ結合性の、分光光度的に同定可能な染色
剤で染色される。もし蛍光染色を使用するならば、特に
高感度を達成でき、これは蛍光分光光度計で検出され
る。
【００２７】さらに改良はウイルスまたはウイルス粒子
を、電気泳動的移動時間またはウイルスピークの変化を
生じる特異的抗体とインキューベーションすることから
成る。
を、電気泳動的移動時間またはウイルスピークの変化を
生じる特異的抗体とインキューベーションすることから
成る。
【００２８】新規方法により、ワクチン製造中のウイル
スの生産を測定技術により有利に監視かつ制御できる。
スの生産を測定技術により有利に監視かつ制御できる。
【００２９】別の重要な応用は生物物質、特に体液中で
ウイルスが直接診断できることである。
ウイルスが直接診断できることである。
【００３０】以下の利点は本発明の方法を使用すること
により得られる。
により得られる。
【００３１】現存する分析技術と比較して、キャピラリ
ー電気泳動によるウイルス粒子の分離は、簡単な試料調
製、短時間の分析、正確な定量性能、自動化の可能性、
標準化の可能性、およびさらに情報の質という点で、定
性が可能でなくても完全なウイルスの最めての同定およ
び定量として優れている。
ー電気泳動によるウイルス粒子の分離は、簡単な試料調
製、短時間の分析、正確な定量性能、自動化の可能性、
標準化の可能性、およびさらに情報の質という点で、定
性が可能でなくても完全なウイルスの最めての同定およ
び定量として優れている。
【００３２】これらの利点は特に優れた効果をもつ： ａ）プロセス制御において この方法を使用して、迅速かつ定量的分析ゆえにワクチ
ン製造中にプロセスを監視するだけでなく制御すること
が初めて可能になる。 ｂ）生成物制御において これにより初めて、最終生成物の品質の保証を組成物か
ら保存安定性の管理にいたるまで、ならびに輸送条件の
保証を標準化された方法により行うことができる。
ン製造中にプロセスを監視するだけでなく制御すること
が初めて可能になる。 ｂ）生成物制御において これにより初めて、最終生成物の品質の保証を組成物か
ら保存安定性の管理にいたるまで、ならびに輸送条件の
保証を標準化された方法により行うことができる。
【００３３】ｃ）ウイルスの診断において 本方法を使用して、初めてウイルスが直接検出および同
定できる。これはワクチン製造中の生成物監視、および
生物的物質中にウイルスが存在しないことを確実にする
ための両方で重要である。
定できる。これはワクチン製造中の生成物監視、および
生物的物質中にウイルスが存在しないことを確実にする
ための両方で重要である。
【００３４】ｄ）治療監視において 抗ウイルス性の治療薬を使用するとき、治療結果を直接
的に監視できる。
的に監視できる。
【００３５】ｅ）ウイルスの同定において ウイルスの電気泳動的特性の差別化およびそのキャピラ
リー内での特異的な検出能力から、既知のウイルスを確
認でき、そして未知のウイルスを確立することができ
る。数種（異なる）のウイルス（ウイルスの株）もこの
ように平行して同定できる。
リー内での特異的な検出能力から、既知のウイルスを確
認でき、そして未知のウイルスを確立することができ
る。数種（異なる）のウイルス（ウイルスの株）もこの
ように平行して同定できる。
【００３６】ウイルスおよびウイルス粒子の両方をキャ
ピラリー電気泳動により分離し、直接的に同定し、そし
て新規の分析技術を使用して定量する本方法を、実施例
および曲線測定の例による補助で以下に記載する。
ピラリー電気泳動により分離し、直接的に同定し、そし
て新規の分析技術を使用して定量する本方法を、実施例
および曲線測定の例による補助で以下に記載する。
【００３７】本方法の一般的記載 すでに分離緩衝液で洗浄した、または緩衝液系を満たし
たキャピラリーに、液体状態（溶液、懸濁液）の被検試
料を導入する。直接接触して、または伝導性緩衝液を介
してキャピラリーの両端での液流の移動を確認し、そし
て高電圧を負荷してキャピラリー中に電場を作る。ウイ
ルスは電場中で分離される。キャピラリー内のウイルス
の直接的な同定は、１つ以上の波長のＵＶ吸収を検出す
ることにより行う。ウイルスがタンパク質およびヌクレ
オチドの両方から成るとき、ウイルス−特異的検出は25
6-260nm(ヌクレオチド吸収についての最大)、および21
0、280nm(タンパク質吸収)での検出により可能である。
大変大きなウイルスの場合には、光散乱がUV吸収による
直接的な同定を妨害する(実施例２．３に注意された
い）。しかし既知のウイルスの場合には、光散乱を同定
および定量に使用することができる。キャピラリー内で
の分離緩衝液は、分離およびウイルスの安定性に役立つ
ように調整（ｐＨ値、イオン強度、界面活性剤、添加
剤）される。必要な装置は光学検出器を備えた任意のＣ
Ｅデバイスである。試料はキャピラリーに動電学的、流
体力学的、あるいは吸引注入または圧力付加により導入
される。キャピラリー（溶融シリカキャピラリー、被覆
または非被覆、テフロンまたは任意の他の有機もしくは
無機材料）に関して制限はない。キャピラリーの直径は
分離には無関係であり、そして電気泳動的条件（流動
性、検出能、熱の散逸）にのみ制限される。
たキャピラリーに、液体状態（溶液、懸濁液）の被検試
料を導入する。直接接触して、または伝導性緩衝液を介
してキャピラリーの両端での液流の移動を確認し、そし
て高電圧を負荷してキャピラリー中に電場を作る。ウイ
ルスは電場中で分離される。キャピラリー内のウイルス
の直接的な同定は、１つ以上の波長のＵＶ吸収を検出す
ることにより行う。ウイルスがタンパク質およびヌクレ
オチドの両方から成るとき、ウイルス−特異的検出は25
6-260nm(ヌクレオチド吸収についての最大)、および21
0、280nm(タンパク質吸収)での検出により可能である。
大変大きなウイルスの場合には、光散乱がUV吸収による
直接的な同定を妨害する(実施例２．３に注意された
い）。しかし既知のウイルスの場合には、光散乱を同定
および定量に使用することができる。キャピラリー内で
の分離緩衝液は、分離およびウイルスの安定性に役立つ
ように調整（ｐＨ値、イオン強度、界面活性剤、添加
剤）される。必要な装置は光学検出器を備えた任意のＣ
Ｅデバイスである。試料はキャピラリーに動電学的、流
体力学的、あるいは吸引注入または圧力付加により導入
される。キャピラリー（溶融シリカキャピラリー、被覆
または非被覆、テフロンまたは任意の他の有機もしくは
無機材料）に関して制限はない。キャピラリーの直径は
分離には無関係であり、そして電気泳動的条件（流動
性、検出能、熱の散逸）にのみ制限される。
【００３８】
１．足−および−口腔ウイルスの分離および直接的同定 足−および−口腔ウイルスはピコルナウイルス（Picorn
aviruses)群に属し、４つのウイルスタンパク質から作
られる二十面体表面構造を有する。その直径は約25nmで
ある。その内部に約5000塩基長の一本鎖ＲＮＡがある。
aviruses)群に属し、４つのウイルスタンパク質から作
られる二十面体表面構造を有する。その直径は約25nmで
ある。その内部に約5000塩基長の一本鎖ＲＮＡがある。
【００３９】ウイルスの増殖および単離を表１に要約す
る。
る。
【００４０】表１ 足−および−口腔ウイルスの単離 ウイルス増殖 最高1500 lの発酵カルチャー中のBHK-21懸濁細胞、 細胞溶解後に回収 前精製 低速連続遠心法による生ウイルス懸濁液の前清澄化 不活化 エチレンイミン（ブロモエチレンアミンおよびNaOHから その場で） 濃縮物の調製 PEG沈殿そして初の容量の1/100に再懸濁 参照試料の精製 146S粒子の単離についてはCsCl密度−勾配遠心（全体、不 活化ウイルス） 実施例１．１ 不活化足−および−口腔ウイルスの同定 参照試料（表１に注意されたい）（100μg/ml)を、ヒュ
ーレットパッカード社(firm Hewlett-Packard)のキャピ
ラリー電気泳動装置（3DHPCE型）でキャピラリー電気泳
動により分離した。測定条件は表２に要約した。付随す
る電気泳動図を第１図に示した。6.9分の鋭いシグナル
が210から257nmへの転移に明らかに現れた。このシグナ
ルのUVスペクトルはダイオードアレイ検出器(DAD)によ
り第１図から直接的に記録された。256nmでの最大はヌ
クレオチドに特徴的であり、一方、強い短−波長の最大
そして300nmで徐々に下降するのは、さらなるタンパク
質部分によってのみ説明できる(第２図)。キャピラリー
内で測定されるUVスペクトルは単離されたウイルスのUV
スペクトルと同一であり、そしてその結果ウイルスシグ
ナルの直接的同定に使用できた。第１図の少量構成物は
いずれも同様なUVスペクトルを表さず、それゆえにいか
なる完全なウイルス粒子も表さなかった。
ーレットパッカード社(firm Hewlett-Packard)のキャピ
ラリー電気泳動装置（3DHPCE型）でキャピラリー電気泳
動により分離した。測定条件は表２に要約した。付随す
る電気泳動図を第１図に示した。6.9分の鋭いシグナル
が210から257nmへの転移に明らかに現れた。このシグナ
ルのUVスペクトルはダイオードアレイ検出器(DAD)によ
り第１図から直接的に記録された。256nmでの最大はヌ
クレオチドに特徴的であり、一方、強い短−波長の最大
そして300nmで徐々に下降するのは、さらなるタンパク
質部分によってのみ説明できる(第２図)。キャピラリー
内で測定されるUVスペクトルは単離されたウイルスのUV
スペクトルと同一であり、そしてその結果ウイルスシグ
ナルの直接的同定に使用できた。第１図の少量構成物は
いずれも同様なUVスペクトルを表さず、それゆえにいか
なる完全なウイルス粒子も表さなかった。
【００４１】表２ ＣＥによる足−および−口腔参照試料の直接的同定のための測定条件 キャピラリー： 溶融シリカキャピラリー、内部直径75μm、長さ64.5cm、 検出器まで56cm 電圧: 20kV 緩衝液： Tris(25mmolar)、グリシン(192mmolar)、pH 8.5 温度： 25℃ 検出： DAD 190-600nm、λ1210±8nm、λ2257±8nm 注入： 圧力(20秒×5×103Pa) 注入前の キャピラリーの洗浄：１．NaOH(0.1N、１分、5×104Pa) ２．緩衝液（3分、5×104Pa) 実施例１．２： 複雑な試料マトリックス由来の不活化
足−および−口腔ウイルスの分離および同定 不活化ウイルスは濃縮状態（表１に注意されたい）で、
直接的に同定できた（第３図、表３の測定条件）。予想
どおり、複雑な電気泳動図が210nmに現れた。生物的バ
ックグラウンドは210から257で明らかに低くなり、そし
て鋭く現れるシグナルは有意なヌクレオチド含量を示し
ていた。ウイルスシグナル（矢印）はUVスペクトルを介
して、そして対応する参照試料（図なし）を使用する同
時注入により同定できた。より単純で、かつ直接的な同
定を実施例２．２に示す。
足−および−口腔ウイルスの分離および同定 不活化ウイルスは濃縮状態（表１に注意されたい）で、
直接的に同定できた（第３図、表３の測定条件）。予想
どおり、複雑な電気泳動図が210nmに現れた。生物的バ
ックグラウンドは210から257で明らかに低くなり、そし
て鋭く現れるシグナルは有意なヌクレオチド含量を示し
ていた。ウイルスシグナル（矢印）はUVスペクトルを介
して、そして対応する参照試料（図なし）を使用する同
時注入により同定できた。より単純で、かつ直接的な同
定を実施例２．２に示す。
【００４２】表３ 生の濃縮物由来の足−および−口腔ウイルスの直接的なUV分光光度的同定のた めの測定条件 キャピラリー： 溶融シリカキャピラリー、内部直径50μm、長さ64.5cm、 検出器まで56cm 電圧: 20kV 緩衝液： Tris(25mmolar)、グリシン(192mmolar)、 ドデシル硫酸ナトリウム(50mmolar)、pH 8.5 温度： 25℃ 検出： DAD 190-600nm、λ1210±8nm、λ2257±8nm 注入： 圧力(20秒×5×103Pa) 注入前の キャピラリーの洗浄：１．NaOH(0.1N、１分、5×104Pa) ２．緩衝液（3分、5×104Pa) 実施例１．３：活性な足−および−口腔ウイルスの分離
および同定 ウイルス材料からの参照試料を不活化の前および後で精
製した（表１に注意されたい）。ウイルスの活性はBHK
細胞カルチャー中の滴定により検査した（力値＞107 KI
D50)。両試料（活性および不活化）の146S粒子量を同じ
に調整し、そしてパーキン-エルマー社（firm Perkin E
lmer)からのキャピラリー電気泳動装置(ABI 270 A-HT
型)(測定条件は表４に示す）で分離した。257nmでの検
出では両調製物について比較しうる電気泳動図を表した
(表４)。活性および不活化ウイルスはCEによっては分離
できなかった。不活化剤も足−および口腔ウイルスの内
部RNAと選択的に反応するので、CE分離に決定的な表面
変化条件の変化も期待されなった。
および同定 ウイルス材料からの参照試料を不活化の前および後で精
製した（表１に注意されたい）。ウイルスの活性はBHK
細胞カルチャー中の滴定により検査した（力値＞107 KI
D50)。両試料（活性および不活化）の146S粒子量を同じ
に調整し、そしてパーキン-エルマー社（firm Perkin E
lmer)からのキャピラリー電気泳動装置(ABI 270 A-HT
型)(測定条件は表４に示す）で分離した。257nmでの検
出では両調製物について比較しうる電気泳動図を表した
(表４)。活性および不活化ウイルスはCEによっては分離
できなかった。不活化剤も足−および口腔ウイルスの内
部RNAと選択的に反応するので、CE分離に決定的な表面
変化条件の変化も期待されなった。
【００４３】表４ 活性な足−および口腔ウイルスの参照試料のＣＥ分離に関する測定条件 キャピラリー： 溶融シリカキャピラリー、内部直径50μm、長さ72cm、 検出器まで51cm 電圧: 20kV 緩衝液： Tris(25mmolar)、グリシン(192mmolar)、pH 8.5 温度： 35℃ 検出： UV 257nm 注入： 吸引(5秒×17×103Pa) 注入前の キャピラリーの洗浄：１．NaOH(0.1N、１分、68×103Pa) ２．緩衝液（3分、68×103Pa) 実施例1.1−1.3はこの新しい分析技術が、活性ウイルス
および不活化ウイルス粒子(不活化試料)の両方の直接的
同定に適することを明らかに表している。例えば濃縮さ
れた試料で生じる複雑な試料マトリックスでさえ、分離
を妨害しない。ここでは固体−相の分離材料が無いキャ
ピラリー電気泳動の高い分離効率および分析技術の良好
なマトリックス適合性が、大変有利な効果を及ぼす。こ
の万能な新規方法は、これらの実施例により成功裏に実
証され、そして使用された。ウイルスを新規な分析技術
を使用して直接検出し、そして同定できる。ウイルスシ
グナルのピーク面積はウイルス量に相関し、そしてこの
理由からウイルス濃度の直接的定量に適する。足−およ
び口腔ウイルスの例では、UV吸収がウイルスシグナルの
直接的同定に使用できることを示した。大変大きいウイ
ルスの場合には、光散乱がUV吸収による直接的同定を妨
害する。さらにUV-吸収ウイルスの検出限界はミリリッ
トルあたりマイクログラムの範囲（＞106粒子／ml）な
ので、多くの目的には十分でない。次の章ではこれらの
ウイルスに関しても、特別な検出システムを提供する方
法を紹介する。
および不活化ウイルス粒子(不活化試料)の両方の直接的
同定に適することを明らかに表している。例えば濃縮さ
れた試料で生じる複雑な試料マトリックスでさえ、分離
を妨害しない。ここでは固体−相の分離材料が無いキャ
ピラリー電気泳動の高い分離効率および分析技術の良好
なマトリックス適合性が、大変有利な効果を及ぼす。こ
の万能な新規方法は、これらの実施例により成功裏に実
証され、そして使用された。ウイルスを新規な分析技術
を使用して直接検出し、そして同定できる。ウイルスシ
グナルのピーク面積はウイルス量に相関し、そしてこの
理由からウイルス濃度の直接的定量に適する。足−およ
び口腔ウイルスの例では、UV吸収がウイルスシグナルの
直接的同定に使用できることを示した。大変大きいウイ
ルスの場合には、光散乱がUV吸収による直接的同定を妨
害する。さらにUV-吸収ウイルスの検出限界はミリリッ
トルあたりマイクログラムの範囲（＞106粒子／ml）な
ので、多くの目的には十分でない。次の章ではこれらの
ウイルスに関しても、特別な検出システムを提供する方
法を紹介する。
【００４４】２．ＤＮＡ／ＲＮＡ−結合染色に基づくＲ
ＮＡ／ＤＮＡ特異的検出法を使用するウイルスの同定 ウイルスの直接染色について使用することができるDNA/
RNA-結合染色による方法を以下に記載する。第１章に説
明したウイルスおよびウイルス粒子への分離法の拡大で
は、まず初めに特に複雑な系において、最初からはでき
なくても、シグナルの位置がどのようにかなり容易にな
るかを記載し、次にさらにどのように特性を明らかに
し、そしてどのようにすべての感度が蛍光検出で非常に
上昇するかを記載した。
ＮＡ／ＤＮＡ特異的検出法を使用するウイルスの同定 ウイルスの直接染色について使用することができるDNA/
RNA-結合染色による方法を以下に記載する。第１章に説
明したウイルスおよびウイルス粒子への分離法の拡大で
は、まず初めに特に複雑な系において、最初からはでき
なくても、シグナルの位置がどのようにかなり容易にな
るかを記載し、次にさらにどのように特性を明らかに
し、そしてどのようにすべての感度が蛍光検出で非常に
上昇するかを記載した。
【００４５】このように染色されたウイルスは、CEによ
り他のＤＮＡ／ＲＮＡ−含有成分から分離できる。すな
わち標識ウイルスを直接同定できる。さらにウイルスの
特性はそれぞれ、ＤＮＡまたはＲＮＡ、二本−鎖または
一本鎖の染色に関する選択性を通して達成できる。外殻
または脱外殻ウイルスも膜を貫通する染色剤の通過速度
の差異を通して区別できる。
り他のＤＮＡ／ＲＮＡ−含有成分から分離できる。すな
わち標識ウイルスを直接同定できる。さらにウイルスの
特性はそれぞれ、ＤＮＡまたはＲＮＡ、二本−鎖または
一本鎖の染色に関する選択性を通して達成できる。外殻
または脱外殻ウイルスも膜を貫通する染色剤の通過速度
の差異を通して区別できる。
【００４６】多くの染色剤の取り込み（すべてで10−20
塩基ラジカル）により、蛍光検出は感度が非常に上昇す
る。統計的に最高15,000の染色剤分子がこれにより取り
込まれ、そしてその各々が蛍光シグナルに貢献する。簡
単な計算から、所定のウイルスについて、蛍光検出を使
用する検出限界は粒子より低い。
塩基ラジカル）により、蛍光検出は感度が非常に上昇す
る。統計的に最高15,000の染色剤分子がこれにより取り
込まれ、そしてその各々が蛍光シグナルに貢献する。簡
単な計算から、所定のウイルスについて、蛍光検出を使
用する検出限界は粒子より低い。
【００４７】したがって、染色したウイルスは初めてＣ
Ｅを使用して分離され、特徴的なUV吸収の補助により同
定され、そして蛍光により高感度で検出される。実施例
1.1−1.3の操作に基づく手順を使用して、足-および-口
腔ウイルスをDNA/RNA-結合染色剤で染色し、そしてＣＥ
およびＤＡＤ検出により分析した。染色したウイルスの
長−波長吸収最大は、染色した遊離ＲＮＡまたはＤＮＡ
吸収最大の最初の近似値に相当した。
Ｅを使用して分離され、特徴的なUV吸収の補助により同
定され、そして蛍光により高感度で検出される。実施例
1.1−1.3の操作に基づく手順を使用して、足-および-口
腔ウイルスをDNA/RNA-結合染色剤で染色し、そしてＣＥ
およびＤＡＤ検出により分析した。染色したウイルスの
長−波長吸収最大は、染色した遊離ＲＮＡまたはＤＮＡ
吸収最大の最初の近似値に相当した。
【００４８】染色法の一般的記載 分析する試料を： ａ）DNA/RNA−結合染色剤とインキューベーションし、
そして次に第１章に記載した方法に従い分離および分析
するか、あるいは ｂ）DNA/RNA−結合染色剤を分離緩衝液に加え、そして
ウイルスをキャピラリー中で分離している間に染色す
る。ウイルスと染色剤が結合したDNA/RNAを、特異的UV/
VIS吸収により、または特異的な蛍光の消失および発光
のいずれかにより検出できる。
そして次に第１章に記載した方法に従い分離および分析
するか、あるいは ｂ）DNA/RNA−結合染色剤を分離緩衝液に加え、そして
ウイルスをキャピラリー中で分離している間に染色す
る。ウイルスと染色剤が結合したDNA/RNAを、特異的UV/
VIS吸収により、または特異的な蛍光の消失および発光
のいずれかにより検出できる。
【００４９】実施例 種々のウイルスおよび種々の染色剤を使用する、数多く
の成功裏に使用された検出法の中で、２つの異なるシス
テムを実施例により示す。
の成功裏に使用された検出法の中で、２つの異なるシス
テムを実施例により示す。
【００５０】初めに、染色した足−および−口腔ウイル
スの分離、同定および高感度検出を記載する。
スの分離、同定および高感度検出を記載する。
【００５１】DNA/RNA-結合染色剤での染色を通して、短
−波吸収スペクトスはシフトし、そして可視領域での吸
収の出現が加わった。したがって始めに染色したウイル
スの成功裏の分離を検出するためにUV吸収が使用され、
そしてさらにこのウイルスは特徴的な吸収スペクトルを
介して別個に同定されるべきである。
−波吸収スペクトスはシフトし、そして可視領域での吸
収の出現が加わった。したがって始めに染色したウイル
スの成功裏の分離を検出するためにUV吸収が使用され、
そしてさらにこのウイルスは特徴的な吸収スペクトルを
介して別個に同定されるべきである。
【００５２】もう１つの複雑な因子は、足−および−口
腔ウイルスは一本鎖ＲＮＡを含むが染色用試薬は二本鎖
ＤＮＡのために開発されたという事実から生じる。しか
し、予備調査では、程度は低いが遊離の一本鎖−ＤＮＡ
およびＲＮＡも染色され、そしてＣＥで検出することが
できると示された。
腔ウイルスは一本鎖ＲＮＡを含むが染色用試薬は二本鎖
ＤＮＡのために開発されたという事実から生じる。しか
し、予備調査では、程度は低いが遊離の一本鎖−ＤＮＡ
およびＲＮＡも染色され、そしてＣＥで検出することが
できると示された。
【００５３】実施例２．１：UV検出を使用する染色した
足-および-口腔ウイルスの分離および同定 実施例１．１からの足-および-口腔ウイルスの参照試料
(300μg/ml)を10μg/mlのエチジウムブロミド(例えばR.
P.Haugland、蛍光プローブおよび研究試薬のハンドブッ
ク:Handbook of fluorescent probes and research che
micals、モレキュラープローブズ社：Molecular Probe
s,Inc.1992)とともに、室温で30分間インキューベーシ
ョンし、そして次にCEにより調査した(その条件は表２
に示す）。
足-および-口腔ウイルスの分離および同定 実施例１．１からの足-および-口腔ウイルスの参照試料
(300μg/ml)を10μg/mlのエチジウムブロミド(例えばR.
P.Haugland、蛍光プローブおよび研究試薬のハンドブッ
ク:Handbook of fluorescent probes and research che
micals、モレキュラープローブズ社：Molecular Probe
s,Inc.1992)とともに、室温で30分間インキューベーシ
ョンし、そして次にCEにより調査した(その条件は表２
に示す）。
【００５４】２つシグナルを検出できた（第５図）。CE
でのUV/VISスペクトルを第６図に示す。3.8分のシグナ
ルは、インキューベーションに由来する過剰なエチジウ
ムブロミドを表した（同時注入によっても再確認し
た）。6.9分のピークは200、257(強い)および510（弱
い）nmでの吸収最大を表した。遊離エチジウムブロミド
（495から510nm)からの可視吸収最大の長波長シフト
は、ヌクレオベースへの挿入に関するのが特徴である。
電気泳動図中でのウイルスシグナルの位置は、エチジウ
ムブロミドの挿入により実質的にシフトしなかった（第
１および５図に注意されたい）。
でのUV/VISスペクトルを第６図に示す。3.8分のシグナ
ルは、インキューベーションに由来する過剰なエチジウ
ムブロミドを表した（同時注入によっても再確認し
た）。6.9分のピークは200、257(強い)および510（弱
い）nmでの吸収最大を表した。遊離エチジウムブロミド
（495から510nm)からの可視吸収最大の長波長シフト
は、ヌクレオベースへの挿入に関するのが特徴である。
電気泳動図中でのウイルスシグナルの位置は、エチジウ
ムブロミドの挿入により実質的にシフトしなかった（第
１および５図に注意されたい）。
【００５５】染色したウイルスの分離および同定は、エ
チジウムブロミドの例から成功裏に実証することができ
た。
チジウムブロミドの例から成功裏に実証することができ
た。
【００５６】実施例２．２：染色した足−および−口腔
ウイルスの蛍光検出 実施例１．２からの足−および−口腔ウイルスの濃縮試
料を、1:15に分離緩衝液（表５）で希釈した後、1,1'-
(4,4,7,7-テトラメチル-4,7-ジアザウンデカメチレン)
ビス-4-[3-メチル-2,3-ジヒドロメチル(ベンゾ-1,3-オ
キサゾール)-2-メチリデン]-キノリニウムテトライオジ
ド(YOYO)(1μmolar)とともに30分間、室温でインキュー
ベーションし、そして次にCE（測定条件は表５に示す）
を使用して測定した。唯一の単一シグナルが濃縮物で見
い出された（第７図）。YOYO固有の蛍光は大変小さいの
で、遊離のYOYOは蛍光検出ではもはや検出できなかっ
た。濃縮物からの残りのシグナルはこのヌクレオチド−
特異的検出では見ることができなかった（第３図の同一
試料のUV検出と比較)。移動時間の強いシフトは、キャ
ピラリーの長さおよび強さを変えることにより生じた
(表３および表５に注意されたい）。
ウイルスの蛍光検出 実施例１．２からの足−および−口腔ウイルスの濃縮試
料を、1:15に分離緩衝液（表５）で希釈した後、1,1'-
(4,4,7,7-テトラメチル-4,7-ジアザウンデカメチレン)
ビス-4-[3-メチル-2,3-ジヒドロメチル(ベンゾ-1,3-オ
キサゾール)-2-メチリデン]-キノリニウムテトライオジ
ド(YOYO)(1μmolar)とともに30分間、室温でインキュー
ベーションし、そして次にCE（測定条件は表５に示す）
を使用して測定した。唯一の単一シグナルが濃縮物で見
い出された（第７図）。YOYO固有の蛍光は大変小さいの
で、遊離のYOYOは蛍光検出ではもはや検出できなかっ
た。濃縮物からの残りのシグナルはこのヌクレオチド−
特異的検出では見ることができなかった（第３図の同一
試料のUV検出と比較)。移動時間の強いシフトは、キャ
ピラリーの長さおよび強さを変えることにより生じた
(表３および表５に注意されたい）。
【００５７】表５ 蛍光検出を使用する足−および口腔の参照試料のCE分離に関する測定条件 キャピラリー： 溶融シリカキャピラリー、内部直径50μm、長さ47cm、 検出器まで40cm 電圧: 20kV 緩衝液： Tris(25mmolar)、グリシン(192mmolar)、 ドデシル硫酸ナトリウム(50mmolar)、pH 8.5 温度： 25℃ 検出： LIF(アルゴン) EX 488、EM520nm、 Gain100 注入： 圧力（10秒×103Pa） 注入前の キャピラリーの洗浄：１．NaOH(0.1N、１分、5×104Pa) ２．緩衝液（３分、5×104Pa） 実施例２．３：蛍光検出を使用するorfウイルスの分離
および同定 orfウイルスはパラポックスウイルス群に属する。この
ウイルスは、約140,000塩基対を有する二本鎖DNAから成
り、多数の酵素と一緒にタンパク質外殻(コア)およびさ
らにリポタンパク質外殻中に包含されている。したがっ
ていわゆる外殻ウイルスである。このウイルス粒子は約
400×200×200nmの大きさの煉瓦型であり、したがって
一般的に最大のウイルスに位置する。足−および−口腔
ウイルスとは大変異なる表面構造および大きさから、新
規方法の応用の広さがこの実施例により実証される。
および同定 orfウイルスはパラポックスウイルス群に属する。この
ウイルスは、約140,000塩基対を有する二本鎖DNAから成
り、多数の酵素と一緒にタンパク質外殻(コア)およびさ
らにリポタンパク質外殻中に包含されている。したがっ
ていわゆる外殻ウイルスである。このウイルス粒子は約
400×200×200nmの大きさの煉瓦型であり、したがって
一般的に最大のウイルスに位置する。足−および−口腔
ウイルスとは大変異なる表面構造および大きさから、新
規方法の応用の広さがこの実施例により実証される。
【００５８】ウイルスは以下のように単離された（表
６）：表６ orfウイルスの単離 ウイルス増殖 スタックタンク中のBK-クローン3A 単層細胞；細胞溶解後 に150lのウイルス回収 予備精製 生ウイルス懸濁液の低速連続遠心による前精製 不活化 β-プロピオラクトン 第二精製段階 低速連続遠心 参照試料の精製 ウイルスバンドを単離するために酒石酸ナトリウム中での 密度勾配遠心 ウイルスの大きさから、この大きさではUVでは光散乱が
起こるので直接的なUVスペクトル同定は除外する。さら
にorf試料は、第二精製の後（表６）でもUV検出で非常
に低濃度で存在した。したがってウイルスは蛍光検出で
のみ同定できた。
６）：表６ orfウイルスの単離 ウイルス増殖 スタックタンク中のBK-クローン3A 単層細胞；細胞溶解後 に150lのウイルス回収 予備精製 生ウイルス懸濁液の低速連続遠心による前精製 不活化 β-プロピオラクトン 第二精製段階 低速連続遠心 参照試料の精製 ウイルスバンドを単離するために酒石酸ナトリウム中での 密度勾配遠心 ウイルスの大きさから、この大きさではUVでは光散乱が
起こるので直接的なUVスペクトル同定は除外する。さら
にorf試料は、第二精製の後（表６）でもUV検出で非常
に低濃度で存在した。したがってウイルスは蛍光検出で
のみ同定できた。
【００５９】Baypamun(商標)(バイエル AG社(firm Baye
r AG)から市販されているイムノモジュレーター、不活
化orfウイルスから作成）をYOYO(1μmolar)とともに30
分間、室温でインキューベーションし、そして次にCEを
使用して分離した(測定条件は表５に表すが、分離緩衝
液はTris/ホウ酸、100mmolar、pH8.5)。2.73分に過剰な
YOYOが非常に小さなピークで見られた(第８a図)。9.46
分に、orfウイルスは別個のシグナルとして単離および
検出できた。電気泳動図のこの領域で幅広い吸収がこの
UVにより測定できたので、さらに発生したスパイクはお
そらく試料マトリックスにより引き起こされたものであ
ろう。スパイクはいつもこの測定中に起こった。しかし
スパイクの位置には再現性がなかった。
r AG)から市販されているイムノモジュレーター、不活
化orfウイルスから作成）をYOYO(1μmolar)とともに30
分間、室温でインキューベーションし、そして次にCEを
使用して分離した(測定条件は表５に表すが、分離緩衝
液はTris/ホウ酸、100mmolar、pH8.5)。2.73分に過剰な
YOYOが非常に小さなピークで見られた(第８a図)。9.46
分に、orfウイルスは別個のシグナルとして単離および
検出できた。電気泳動図のこの領域で幅広い吸収がこの
UVにより測定できたので、さらに発生したスパイクはお
そらく試料マトリックスにより引き起こされたものであ
ろう。スパイクはいつもこの測定中に起こった。しかし
スパイクの位置には再現性がなかった。
【００６０】したがって大変大きな外殻ウイルスは蛍光
検出により直接同定できた。さらにシグナルの同定を実
施例３．２に示す。
検出により直接同定できた。さらにシグナルの同定を実
施例３．２に示す。
【００６１】実施例２．４：orfウイルスコアの分離お
よび同定 すでに実施例２ｃの初めに述べたように、orfの大きさ
および濃度がUVの直接的検出を妨害する。さらに外殻ウ
イルスのように、包含されているDNA（コア）を含む内
部タンパク質殻について調査がなされるべきである。
よび同定 すでに実施例２ｃの初めに述べたように、orfの大きさ
および濃度がUVの直接的検出を妨害する。さらに外殻ウ
イルスのように、包含されているDNA（コア）を含む内
部タンパク質殻について調査がなされるべきである。
【００６２】Baypamunは、変性された特性化[9]に従
い、NP-40(1％、1時間、37℃）で震盪することによりリ
ポタンパク質膜を外し、そしてコアは密度勾配遠心（シ
ュクロース36％、PBS 150mmolar、225.000g、１時間）
でペレットにした。このようにして濃縮した試料をYOYO
(1μmolar濃度)とともに30分間、室温でインキューベー
ションし、そして次にDADを使用するCEにより測定した
(測定条件は表２に示した）。257nmの電気泳動図(第９
ａ図）は4.5分に広いバンドを示し、これは過剰なYOYO
であると同定できた。6.4と6.8分の間の3つの強いシグ
ナルの中で、唯一最後のシグナルがYOYOの挿入について
典型的な495nmでの最大吸収を示した（第１０図）。ま
た同一試料を引き続きLIP検出によりさらに調査した。
測定条件は表５に記載のものに相当するが、ドデシル硫
酸ナトリウムを分離緩衝液から省いた（UV検出の緩衝液
と同じ)。UV測定と比較したとき、絶対的な移動時間は
キャピラリーおよび電場の強さの変更により明らかにシ
フトした（第９図）。過剰なYOYOは1.9分の小さなピー
クとして同定できた。３つのUVシグナルのうち、唯一染
色した生成物(コア)が検出できた。さらに蛍光検出によ
り、未染色コアのUV検出と比較した時、感度の上昇が10
4の因子で達成できた。
い、NP-40(1％、1時間、37℃）で震盪することによりリ
ポタンパク質膜を外し、そしてコアは密度勾配遠心（シ
ュクロース36％、PBS 150mmolar、225.000g、１時間）
でペレットにした。このようにして濃縮した試料をYOYO
(1μmolar濃度)とともに30分間、室温でインキューベー
ションし、そして次にDADを使用するCEにより測定した
(測定条件は表２に示した）。257nmの電気泳動図(第９
ａ図）は4.5分に広いバンドを示し、これは過剰なYOYO
であると同定できた。6.4と6.8分の間の3つの強いシグ
ナルの中で、唯一最後のシグナルがYOYOの挿入について
典型的な495nmでの最大吸収を示した（第１０図）。ま
た同一試料を引き続きLIP検出によりさらに調査した。
測定条件は表５に記載のものに相当するが、ドデシル硫
酸ナトリウムを分離緩衝液から省いた（UV検出の緩衝液
と同じ)。UV測定と比較したとき、絶対的な移動時間は
キャピラリーおよび電場の強さの変更により明らかにシ
フトした（第９図）。過剰なYOYOは1.9分の小さなピー
クとして同定できた。３つのUVシグナルのうち、唯一染
色した生成物(コア)が検出できた。さらに蛍光検出によ
り、未染色コアのUV検出と比較した時、感度の上昇が10
4の因子で達成できた。
【００６３】これらの実験により、完全なウイルス（外
殻または脱外殻）だけでなく、変性したウイルス粒子
（これは外殻ウイルスのリポタンパク質膜を除去するこ
とにより生成できる）も直接的に同定できることを証明
できた。
殻または脱外殻）だけでなく、変性したウイルス粒子
（これは外殻ウイルスのリポタンパク質膜を除去するこ
とにより生成できる）も直接的に同定できることを証明
できた。
【００６４】さらにウイスルシグナルの特性化り、さら
に達成した改良法を次章に記載する。
に達成した改良法を次章に記載する。
【００６５】３．抗体との相互作用を通して、キャピラ
リー電気泳動分離中（内）のウイルス粒子のさらなる特
性化特異的抗体（MAB）により、どのように既知のウイ
ルスが明らかに識別できるかの調査を行った。ここでは
CEでのウイルスの分離とウイルスの完全に確立された免
疫学的識別化とを直接組み合わせて利用した。
リー電気泳動分離中（内）のウイルス粒子のさらなる特
性化特異的抗体（MAB）により、どのように既知のウイ
ルスが明らかに識別できるかの調査を行った。ここでは
CEでのウイルスの分離とウイルスの完全に確立された免
疫学的識別化とを直接組み合わせて利用した。
【００６６】方法の一般的記載 分析する試料は： ａ）抗体（MAB、抗血清、抗体の混合物、標識抗体）と
ともにインキューベーションし、そして次に上記記載の
方法に従い分離および分析するか、あるいは ｂ）抗体（MAB、抗血清、抗体の混合物、標識抗体）を
分離緩衝液に加え、そしてウイルスを上記方法に属する
アフィニティーキャピラリー電気泳動で分離および分析
した。
ともにインキューベーションし、そして次に上記記載の
方法に従い分離および分析するか、あるいは ｂ）抗体（MAB、抗血清、抗体の混合物、標識抗体）を
分離緩衝液に加え、そしてウイルスを上記方法に属する
アフィニティーキャピラリー電気泳動で分離および分析
した。
【００６７】抗体（１つまたは複数）とウイルスとの特
異的相互作用は、移動時間のシフトまたはウイルスシグ
ナルの強度の減少を介して検出できた。
異的相互作用は、移動時間のシフトまたはウイルスシグ
ナルの強度の減少を介して検出できた。
【００６８】実施例 以下の実施例では、調査するウイルスを特異的抗体とイ
ンキューベーションし、そして次にCEを使用して分離し
た。抗体−抗原結合の安定性は、それが完全な複合体と
して未変性溶媒中での分離に耐えるに十分なほど大き
い。その結果、異なる分離物からの遊離ウイルスとウイ
ルス−抗体複合体の間の移動時間の差異を測定すること
が可能であった。
ンキューベーションし、そして次にCEを使用して分離し
た。抗体−抗原結合の安定性は、それが完全な複合体と
して未変性溶媒中での分離に耐えるに十分なほど大き
い。その結果、異なる分離物からの遊離ウイルスとウイ
ルス−抗体複合体の間の移動時間の差異を測定すること
が可能であった。
【００６９】実施例３．１：モノクローナル抗体を使用
する移動時間のシフトによるorfウイルスの特性化 実施例２．３からのorf試料（染色剤とインキューベー
ションした後）を、抗−orf抗体(MAB)(2μg/ml)に加え
て混合し、室温でさらに30分間インキューベーションし
た。測定条件は実施例２．３と同一であった。電気泳動
図を第８ｂ図に表す。この電気泳動図は遊離ウイルスの
電気泳動図とは、ウイルスシグナルの位置が異なるだけ
であった（第８図）。orfウイルスの蛍光シグナルはMAB
の結合により9.46から9.34分へシフトし、このシフトは
再現性があった。ウイルスの大きさからはより大きなシ
フトは期待できなかった。このウイルスは一般的に最大
のウイルスに位置するので、この実施例により本方法の
応用の広さを実証できた。シグナルのシフトは観察され
た蛍光シグナルが事実、ウイルス起源であり、かつMAB
が十分な特異性であるときには、シグナルでもorfウイ
ルスと確認できた。次の実施例で、より小さいウイルス
の場合には明らかに大きなシフトが示されるだろう。
する移動時間のシフトによるorfウイルスの特性化 実施例２．３からのorf試料（染色剤とインキューベー
ションした後）を、抗−orf抗体(MAB)(2μg/ml)に加え
て混合し、室温でさらに30分間インキューベーションし
た。測定条件は実施例２．３と同一であった。電気泳動
図を第８ｂ図に表す。この電気泳動図は遊離ウイルスの
電気泳動図とは、ウイルスシグナルの位置が異なるだけ
であった（第８図）。orfウイルスの蛍光シグナルはMAB
の結合により9.46から9.34分へシフトし、このシフトは
再現性があった。ウイルスの大きさからはより大きなシ
フトは期待できなかった。このウイルスは一般的に最大
のウイルスに位置するので、この実施例により本方法の
応用の広さを実証できた。シグナルのシフトは観察され
た蛍光シグナルが事実、ウイルス起源であり、かつMAB
が十分な特異性であるときには、シグナルでもorfウイ
ルスと確認できた。次の実施例で、より小さいウイルス
の場合には明らかに大きなシフトが示されるだろう。
【００７０】実施例３．２：モノクローナル抗体を使用
する移動時間のシフトによる足−および−口腔ウイルス
の特性化 文献から既知のウイルス O1k(O1-カウフボーレン:Kaufb
euren)株に対応する実施例１．１からの参照試料（100
μg/ml)を、種々の抗足−および−口腔 O1 MAB(1-10μg
/ml)、および内部対照としてアントラキノン-1-スルホ
ン酸（2μg/ml)と混合し、そして室温でさらに30分間イ
ンキューベーションし、表２に与えた測定条件下で測定
した。インキューベーションした試料の相対移動時間
（tmr）を、純粋なウイルスのtmrと比較した（その試料
は同様に調製し、そして同一の測定条件で測定した（第
１１ａ図））。暗色の棒は純粋なウイルスのtmrを、そ
して明色の棒は抗体とインキューベーションしたウイル
スのtmrを示す。種々のMABをｘ−軸に対して記録し、そ
して左から右の順序で測定した。暗色の棒ではｔmrに初
めのわずかな下降が明らかであり、これは未だに完全に
平衡化されていなかったキャピラリーが原因であった。
抗体24、37、48および99について、いくらかの注目すべ
きｔmrシフトが観察できた。調査した参照資料はこのよ
うに血清学的にＯ1株と確認できた。シフトの程度はMAB
の親和性の直接的測定ではない。シフトは移動挙動によ
り、および結合した抗体数により決定される。陽性に反
応するMABは、すべて0.05から0.13の間のｔmrシフトを
示した。抗体75は有意なｔmrシフトを生成せず、それゆ
えにこの抗体によるウイルス同定は実証できなかった。
MAB75ならびに足-および-口腔 Ｏ1kの移動時間は大変似
ており、すなわちMAB75はこのウイルス株を認識しな
い。
する移動時間のシフトによる足−および−口腔ウイルス
の特性化 文献から既知のウイルス O1k(O1-カウフボーレン:Kaufb
euren)株に対応する実施例１．１からの参照試料（100
μg/ml)を、種々の抗足−および−口腔 O1 MAB(1-10μg
/ml)、および内部対照としてアントラキノン-1-スルホ
ン酸（2μg/ml)と混合し、そして室温でさらに30分間イ
ンキューベーションし、表２に与えた測定条件下で測定
した。インキューベーションした試料の相対移動時間
（tmr）を、純粋なウイルスのtmrと比較した（その試料
は同様に調製し、そして同一の測定条件で測定した（第
１１ａ図））。暗色の棒は純粋なウイルスのtmrを、そ
して明色の棒は抗体とインキューベーションしたウイル
スのtmrを示す。種々のMABをｘ−軸に対して記録し、そ
して左から右の順序で測定した。暗色の棒ではｔmrに初
めのわずかな下降が明らかであり、これは未だに完全に
平衡化されていなかったキャピラリーが原因であった。
抗体24、37、48および99について、いくらかの注目すべ
きｔmrシフトが観察できた。調査した参照資料はこのよ
うに血清学的にＯ1株と確認できた。シフトの程度はMAB
の親和性の直接的測定ではない。シフトは移動挙動によ
り、および結合した抗体数により決定される。陽性に反
応するMABは、すべて0.05から0.13の間のｔmrシフトを
示した。抗体75は有意なｔmrシフトを生成せず、それゆ
えにこの抗体によるウイルス同定は実証できなかった。
MAB75ならびに足-および-口腔 Ｏ1kの移動時間は大変似
ており、すなわちMAB75はこのウイルス株を認識しな
い。
【００７１】足-および-口腔 Ｏ1kに結合するMABを確認
するために、同じ抗体を足-および-口腔 Ｏ1mと同一の
条件下でインキューベーションし、そして比較により測
定した。（Ｏ1m（Ｏ1−Manisa）は文献から既知の別の
ウイルス株である）。ここでも暗色の棒で、初期のｔmr
に下降が明らかである。MAB（明色棒）とのインキュー
ベーション後に、MAB75だけが0.10の有意なシフトを示
した。したがってこのMABは明らかに足-および-口腔 Ｏ
1mを認識する。足-および-口腔 Ｏ1mおよび足-および-
口腔 Ｏ1kは大変似ているｔmrで検出されるので、ウイ
ルスおよびウイルス−MAB複合体の同様な移動時間によ
る足-および-口腔 Ｏ1kの非−認識は除外する。したが
ってMAB75は抗−足-および-口腔 Ｏ1mとして確認される
ことができ、一方すべての他のMABは足-および-口腔 Ｏ
1kだけを認識する。残りのMABは足-および-口腔 Ｏ1mを
最大0.02シフトさせ、これは第１１ａ図と比較して非-
特異的と見なさなければならない。
するために、同じ抗体を足-および-口腔 Ｏ1mと同一の
条件下でインキューベーションし、そして比較により測
定した。（Ｏ1m（Ｏ1−Manisa）は文献から既知の別の
ウイルス株である）。ここでも暗色の棒で、初期のｔmr
に下降が明らかである。MAB（明色棒）とのインキュー
ベーション後に、MAB75だけが0.10の有意なシフトを示
した。したがってこのMABは明らかに足-および-口腔 Ｏ
1mを認識する。足-および-口腔 Ｏ1mおよび足-および-
口腔 Ｏ1kは大変似ているｔmrで検出されるので、ウイ
ルスおよびウイルス−MAB複合体の同様な移動時間によ
る足-および-口腔 Ｏ1kの非−認識は除外する。したが
ってMAB75は抗−足-および-口腔 Ｏ1mとして確認される
ことができ、一方すべての他のMABは足-および-口腔 Ｏ
1kだけを認識する。残りのMABは足-および-口腔 Ｏ1mを
最大0.02シフトさせ、これは第１１ａ図と比較して非-
特異的と見なさなければならない。
【００７２】上記の測定から、ウイルスおよびウイルス
粒子（不活化ウイルス、コア）は新しく開発された方法
を使用して直接分析でき、そして検出できた。複雑な試
料マトリックス（生の足−および−口腔の濃縮物、Bayp
amun）でさえ、分析を妨害しない。本方法の極めて様々
なウイルスに関する広い応用は、小さなピコナウイルス
（足−および−口腔）、大きな外殻orfウイルスおよび
そのコアの実施例により実証された。ヌクレオチド−特
異的染色試薬により、ウイルスはＵＶおよび蛍光の両方
により特異的に検出できた。これとの関連で、感度の極
端な上昇が観察できた。ウイルスまたはウイルス粒子
は、抗体との複合化により特異的に検出できる。抗体認
識は染色試薬が存在しても証明できた。このように複合
体マトリックス中のウイルス成分の一般的同定の完全な
分析的能力範囲が提供される。したがって本方法は、プ
ロセス制御およびウイルスの診断用の両方にさらに使用
するためにかなりの可能性を有する。
粒子（不活化ウイルス、コア）は新しく開発された方法
を使用して直接分析でき、そして検出できた。複雑な試
料マトリックス（生の足−および−口腔の濃縮物、Bayp
amun）でさえ、分析を妨害しない。本方法の極めて様々
なウイルスに関する広い応用は、小さなピコナウイルス
（足−および−口腔）、大きな外殻orfウイルスおよび
そのコアの実施例により実証された。ヌクレオチド−特
異的染色試薬により、ウイルスはＵＶおよび蛍光の両方
により特異的に検出できた。これとの関連で、感度の極
端な上昇が観察できた。ウイルスまたはウイルス粒子
は、抗体との複合化により特異的に検出できる。抗体認
識は染色試薬が存在しても証明できた。このように複合
体マトリックス中のウイルス成分の一般的同定の完全な
分析的能力範囲が提供される。したがって本方法は、プ
ロセス制御およびウイルスの診断用の両方にさらに使用
するためにかなりの可能性を有する。
【００７３】技術文献 ［１］ Engelhardt, H., Beck, W., Kohr, J.およびSc
hmitt, T. Angew. Chem.1993, 105, 659-680 ［２］ Kuhr, W. G.およびMonning, C.A. Anal. Chem.
1992, 64, 389R-407R ［３］ W.M. HurniおよびW.J. Miller, J. Chromato.
1991, 559, 337-343 ［４］ R. Bartzatt, J. Histotechnol. 1987, 10, 95
-96 ［５］ Haugland, R.P.,蛍光プローブおよび研究試薬
のハンドブック(Larison,K.D.編集)モレキュラープロー
ブズ社 1992 ［６］ Zuh, H., Clark, S.M., Benson, S.C., Pye,
H.S., Glazer, A.N.およびMathies, R.A. Anal. Chem.
1994, 66, 1941-1948 ［７］ Heegaard, N.H.H.およびRobey, F.A. Anal. Ch
em. 1992, 64, 2479-2482 ［８］ Chu, Y.-H., Avila, L.Z., Biebuyck, H.A.お
よびWhitesides, G.M. J.Org. Chem. 1993, 58, 648-65
2 ［９］ Paoletti, E., Rosemund Hornbeak,およびMos
s, B.J. Bio. Chem. 1974, 249, 3273-3280 本発明の主な特徴および態様は次の通りである。
hmitt, T. Angew. Chem.1993, 105, 659-680 ［２］ Kuhr, W. G.およびMonning, C.A. Anal. Chem.
1992, 64, 389R-407R ［３］ W.M. HurniおよびW.J. Miller, J. Chromato.
1991, 559, 337-343 ［４］ R. Bartzatt, J. Histotechnol. 1987, 10, 95
-96 ［５］ Haugland, R.P.,蛍光プローブおよび研究試薬
のハンドブック(Larison,K.D.編集)モレキュラープロー
ブズ社 1992 ［６］ Zuh, H., Clark, S.M., Benson, S.C., Pye,
H.S., Glazer, A.N.およびMathies, R.A. Anal. Chem.
1994, 66, 1941-1948 ［７］ Heegaard, N.H.H.およびRobey, F.A. Anal. Ch
em. 1992, 64, 2479-2482 ［８］ Chu, Y.-H., Avila, L.Z., Biebuyck, H.A.お
よびWhitesides, G.M. J.Org. Chem. 1993, 58, 648-65
2 ［９］ Paoletti, E., Rosemund Hornbeak,およびMos
s, B.J. Bio. Chem. 1974, 249, 3273-3280 本発明の主な特徴および態様は次の通りである。
【００７４】１．試料マトリックス中のウイルスまたは
ウイルス粒子をタンパク質部分および／またはヌクレオ
チドからキャピラリー電気泳動を使用して分離し、そし
て同時にそれに伴う電気泳動図を記録し、そして被検物
と指定された画分を電気泳動図中のウイルスピークとし
て、特徴的な最大値の補助で分光光度的解釈により同定
することを特徴とする、特にタンパク質部分および／ま
たはヌクレオチドおよび／または他のウイルスのような
有機または無機の少量構成物を含む液体試料マトリック
ス中の、ウイルスまたはウイルス粒子（被検物）の非−
破壊的分析的検出法および／または定量法。
ウイルス粒子をタンパク質部分および／またはヌクレオ
チドからキャピラリー電気泳動を使用して分離し、そし
て同時にそれに伴う電気泳動図を記録し、そして被検物
と指定された画分を電気泳動図中のウイルスピークとし
て、特徴的な最大値の補助で分光光度的解釈により同定
することを特徴とする、特にタンパク質部分および／ま
たはヌクレオチドおよび／または他のウイルスのような
有機または無機の少量構成物を含む液体試料マトリック
ス中の、ウイルスまたはウイルス粒子（被検物）の非−
破壊的分析的検出法および／または定量法。
【００７５】２．同定のために、既知ウイルスまたはウ
イルス粒子の参照試料が試料マトリックスに加えられる
ことを特徴とする、上記１記載の方法。
イルス粒子の参照試料が試料マトリックスに加えられる
ことを特徴とする、上記１記載の方法。
【００７６】３．ウイルスおよびウイルス粒子がＲＮＡ
／ＤＮＡ−結合性の、分光光度的に同定可能な染色剤に
より染色されることを特徴とする、上記１または２に記
載の方法。
／ＤＮＡ−結合性の、分光光度的に同定可能な染色剤に
より染色されることを特徴とする、上記１または２に記
載の方法。
【００７７】４．染色が蛍光スペクトロメトリーにより
検出される蛍光染色が使用されることを特徴とする上記
３記載の方法。
検出される蛍光染色が使用されることを特徴とする上記
３記載の方法。
【００７８】５．ウイルスおよびウイルス粒子を、電気
泳動的移動時間にシフトを生じるか、またはウイルスピ
ークに変化を生じる特異的抗体とインキューベーション
することを特徴とする、上記１ないし４のいずれか１つ
に記載の方法。
泳動的移動時間にシフトを生じるか、またはウイルスピ
ークに変化を生じる特異的抗体とインキューベーション
することを特徴とする、上記１ないし４のいずれか１つ
に記載の方法。
【００７９】６．ウイルス製造中のウイルスの生産が、
測定技術により監視され、そして制御されることを特徴
とする上記１ないし５のいずれか１つに記載の方法。
測定技術により監視され、そして制御されることを特徴
とする上記１ないし５のいずれか１つに記載の方法。
【００８０】７．ウイルスが生物物質、特に体液中で診
断されることを特徴とする上記１ないし５のいずれか１
つに記載の方法。
断されることを特徴とする上記１ないし５のいずれか１
つに記載の方法。
【図１】不活化足−および−口腔ウイルス参照試料のキ
ャピラリー電気泳動図を示す図であり、210±8nm(a)お
よび257±8nm(b)で検出。ウイルスシグナルは257nmの検
出での上昇により同定できる。
ャピラリー電気泳動図を示す図であり、210±8nm(a)お
よび257±8nm(b)で検出。ウイルスシグナルは257nmの検
出での上昇により同定できる。
【図２】図１からの不活化足−および−口腔ウイルスの
DADスペクトルを示す図である。
DADスペクトルを示す図である。
【図３】不活化足−および−口腔の濃縮物のキャピラリ
ー電気泳動図を示す図である。210±8nm（a)および257
±8nm(b)での検出。ウイルスを矢印で示す。
ー電気泳動図を示す図である。210±8nm（a)および257
±8nm(b)での検出。ウイルスを矢印で示す。
【図４】不活化(a)および活性(b)足−および−口腔の参
照試料のCE分離の比較を示す図である。257nmでの検
出。
照試料のCE分離の比較を示す図である。257nmでの検
出。
【図５】図１からの染色した不活化足−および−口腔ウ
イルスのCE分離を示す図である。257nm±8nmでの検出。
3.8分でのシグナルは、インキューベーションに由来す
る過剰なエチジウムブロミドと確認できた。ウイルスシ
グナルは染色によりシフトしなかった(第１図と比
較）。
イルスのCE分離を示す図である。257nm±8nmでの検出。
3.8分でのシグナルは、インキューベーションに由来す
る過剰なエチジウムブロミドと確認できた。ウイルスシ
グナルは染色によりシフトしなかった(第１図と比
較）。
【図６】第５図のエチジウムブロミド(a)および染色し
た不活化足−および−口腔ウイルス(b)のDADスペクトル
を表す図である。このように成功裏のウイルス染色が証
明できた。ウイルスシグナルもこれにより特定された。
た不活化足−および−口腔ウイルス(b)のDADスペクトル
を表す図である。このように成功裏のウイルス染色が証
明できた。ウイルスシグナルもこれにより特定された。
【図７】LIF検出を使用した、染色した（YOYO)、図３か
らの不活化足−および−口腔の濃縮物のCE分離を表す図
である。複合体混合物（第３図）の中で、ウイルスだけ
が未だに検出可能であり、そして明らかに高い感度で検
出される。
らの不活化足−および−口腔の濃縮物のCE分離を表す図
である。複合体混合物（第３図）の中で、ウイルスだけ
が未だに検出可能であり、そして明らかに高い感度で検
出される。
【図８】orf-特異的MAB(b)を使用して、インキューベー
ション前(a)および後(b)の不活化orfウイルスのCE分離
の比較を表す図である。ウイルスをYOYOで染色し、そし
てLIFで検出した。
ション前(a)および後(b)の不活化orfウイルスのCE分離
の比較を表す図である。ウイルスをYOYOで染色し、そし
てLIFで検出した。
【図９】YOYOで染色した後のorfウイルスのコアのCE分
離、そして257nm(a)およびLIF検出(b)を表す図である。
257nmの幅広いシグナルは、過剰のYOYOから生じる。異
なる移動時間は異なる分離条件から生じる。
離、そして257nm(a)およびLIF検出(b)を表す図である。
257nmの幅広いシグナルは、過剰のYOYOから生じる。異
なる移動時間は異なる分離条件から生じる。
【図１０】第９図からのYOYOを挿入したorfウイルスの
コアをDADスペクトルを表す図である。LIF検出器(495n
m)のアルゴンレーザーの励起領域中の最大吸収は、挿入
により生成された。
コアをDADスペクトルを表す図である。LIF検出器(495n
m)のアルゴンレーザーの励起領域中の最大吸収は、挿入
により生成された。
【図１１】足−および−口腔 Ｏ1k(a)ならびにMAB無し
（暗色棒）の足−および−口腔 Ｏ1m(b)、ならびに種々
の抗−足−および−口腔 Ｏ1 MAB(明色棒)でインキュ
ーベーションした後の相対移動時間の比較を表す図であ
る。
（暗色棒）の足−および−口腔 Ｏ1m(b)、ならびに種々
の抗−足−および−口腔 Ｏ1 MAB(明色棒)でインキュ
ーベーションした後の相対移動時間の比較を表す図であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロター・ヘルビヒ ドイツ51373レーフエルクーゼン・ハイマ ンシユトラーセ40 (72)発明者 ロベルト・コレア ドイツ51373レーフエルクーゼン・ハイマ ンシユトラーセ59 (72)発明者 ウルフ・ブリユゲマイアー ドイツ42799ライヒリンゲン・ライ−ジー フエン20
Claims (5)
- 【請求項１】 試料マトリックス中のウイルスまたはウ
イルス粒子をタンパク質部分および／またはヌクレオチ
ドからキャピラリー電気泳動を使用して分離し、そして
同時にそれに伴う電気泳動図を記録し、そして被検物と
指定された画分を電気泳動図中のウイルスピークとし
て、特徴的な最大値の補助で分光光度的解釈により同定
することを特徴とする、特にタンパク質部分および／ま
たはヌクレオチドおよび／または他のウイルスのような
有機または無機の少量構成物を含む液体試料マトリック
ス中の、ウイルスまたはウイルス粒子（被検物）の非−
破壊的分析的検出法および／または定量法。 - 【請求項２】 同定のために、既知ウイルスまたはウイ
ルス粒子の参照試料が試料マトリックスに加えられるこ
とを特徴とする、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 ウイルスおよびウイルス粒子がＲＮＡ／
ＤＮＡ結合性の、分光光度的に同定可能な染色剤により
染色されることを特徴とする、請求項１または２に記載
の方法。 - 【請求項４】 染色が蛍光スペクトロメトリーにより検
出される蛍光染色が使用されることを特徴とする請求項
３記載の方法。 - 【請求項５】 ウイルスおよびウイルス粒子を、電気泳
動的移動時間にシフトを生じさせるか、またはウイルス
ピークに変化を生じさせる特異的抗体とインキューベー
ションすることを特徴とする、請求項１ないし４のいず
れか１つに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4438833A DE4438833A1 (de) | 1994-10-31 | 1994-10-31 | Verfahren zur analytischen Trennung von Viren |
| DE4438833.0 | 1994-10-31 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08228800A true JPH08228800A (ja) | 1996-09-10 |
Family
ID=6532112
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7300435A Pending JPH08228800A (ja) | 1994-10-31 | 1995-10-26 | ウイルスの分析的分離法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5723031A (ja) |
| EP (1) | EP0714026B1 (ja) |
| JP (1) | JPH08228800A (ja) |
| AT (1) | ATE257246T1 (ja) |
| DE (2) | DE4438833A1 (ja) |
| ES (1) | ES2214489T3 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2018505689A (ja) * | 2015-02-19 | 2018-03-01 | ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． | キャピラリーゾーン電気泳動を用いたウイルス粒子の定量方法 |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AUPP521298A0 (en) * | 1998-08-12 | 1998-09-03 | Life Therapeutics Limited | Purification of fibrinogen |
| US5965358A (en) * | 1998-08-26 | 1999-10-12 | Genvec, Inc. | Method for assessing the relative purity of viral gene transfer vector stocks |
| AUPP790898A0 (en) | 1998-12-23 | 1999-01-28 | Life Therapeutics Limited | Renal dialysis |
| AUPP790698A0 (en) * | 1998-12-23 | 1999-01-28 | Life Therapeutics Limited | Separation of microorganisms |
| US20050224355A1 (en) * | 1999-12-23 | 2005-10-13 | Brendon Conlan | Removal of biological contaminants |
| WO2000058524A2 (en) * | 1999-03-31 | 2000-10-05 | The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Typing of human enteroviruses |
| AUPP971399A0 (en) | 1999-04-12 | 1999-05-06 | Life Therapeutics Limited | Separation of plasma components |
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